AVALIAÇÃO DA NEUROPROTEÇAO DA VITAMINA B6 NA SEPSE EXPERIMENTAL
TUBARÃO 2016
LUCINEIA GAINSKI DANIELSKI
AVALIAÇÃO DA NEUROPROTEÇAO DA VITAMINA B6 NA SEPSE EXPERIMENTAL
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde.
Orientador: Profa. Fabrícia Cardoso Petronilho, Dra. Coorientador: Profa. Jucélia Jeremias Fortunato
TUBARÃO 2016
LUCINÉIA GAINSKI DANIELSKI
AVALIAÇÃO DA NEUROPROTEÇAO DA VITAMINA B6 NA SEPSE EXPERIMENTAL
Esta Dissertação foi julgada adequada pelo Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde - Mestrado, para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde.
Tubarão, ___ de __________ de 2016.
Orientador: Profa. Fabrícia Petronilho, Dra. Universidade do Sul de Santa Catarina
Profa. Josiane Somariva Prophiro, Dra. Universidade do Sul de Santa Catarina
Prof. Flávio Henrique Reginatto, Dr. Universidade Federal de Santa Catarina
AGRADECIMENTOS
À professora e orientadora Fabrícia Cardoso Petronilho. Por ser todo o apoio e orientação nos caminhos da sepse e por me ensinar o que um mestre deve saber. Por toda amizade e confiança, depositados em mim.
Ao Laboratório de Neurobiologia de Processos Inflamatórios e Metabólicos – Neuroimet da UNISUL, minha casa desde a graduação.
Ao Núcleo de Pesquisa em Autismo, em nome da Profa. Dra. Jucélia Jeremias Fortunato, que me auxiliou nos testes comportamentais. Ao núcleo de Pesquisa em Obesidade, em nome da profa. Dra. Gislaine Tezza Rezin, pelo auxílio nas dosagens do metabolismo energético, e em especial ao alunos do Núcleo de Sepse, pela amizade e suporte para a realização deste trabalho.
Ao Laboratório de Fisiopatologia Experimental- Fiosiopat da UNESC, em nome do Prof. Dr. Felipe Dal-Pizzol, pelo suporte na avaliação da permeabilidade da barreira hematoencefálica.
Ao Grupo de Neurogenômica do Centro de Pesquisas René Rachou/CPqRR/Fiocruz, Minas Gerais, em nome do prof. Dr. Roney S. Coimbra, pelo auxílio com a cromatografia líquida de alta eficiência.
Aos meus pais, Silvio e Janete eternos vitoriosos que sempre me apoiaram em todas as decisões. Com os quais aprendi o mais importante, o amor e o valor de uma família.
À minha irmã Daiane, por ser minha parceira para toda a vida.
À minha vó Anna (Babuxa) que sempre torceu por mim. A minha vovó Emília (in
memorian) que me ensinou a ser guerreira.
Ao Jonatha, meu noivo, eterno namorado e companheiro.
A todos os animais envolvidos neste e em outros trabalhos científicos, os verdadeiros heróis de toda a pesquisa.
Ao Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (CNPq) por propiciar fomento para a realização desta pesquisa.
A Universidade do Sul de Santa Catarina pelo investimento em estrutura física e recursos humanos, base fundamental para formação de profissionais de excelência.
Ao programa de pós-graduação em Ciências da Saúde, o qual proveu os meios necessários para a conclusão do mestrado.
“Seu trabalho vai preencher uma parte grande da sua vida, e a única maneira de ficar realmente satisfeito é fazer o que você acredita ser um ótimo trabalho. E a única maneira de fazer um excelente trabalho é amar o que você faz.” (Steve Jobs)
RESUMO
Introdução: A disfunção neurológica na sepse é causa de elevação da mortalidade de pacientes internados em hospitais. Os pacientes que sobrevivem manifestam alterações no aprendizado e memória. Níveis elevados de quinurenina (KYN) plasmática estão associados com pior prognóstico em pacientes graves. E a vitamina B6 (vit B6) apresenta propriedades anti-inflamatórias e antioxidantes, atuando também como cofator de enzimas da via da quinurenina, contudo a inflamação eleva o seu catabolismo. Objetivos: Avaliar o efeito do tratamento com vit B6 sobre a via da quinurenina, parâmetros neuroinflamatórios e neuroquímicos agudos e alterações cognitivas em longo prazo em modelo pré-clínico de sepse. Métodos: Ratos Wistar machos (250-300 g) submetidos à ligação e perfuração cecal (CLP), com sham como controle, foram divididos em sham+salina, sham+vit B6, CLP+salina e CLP+vit B6 (600 mg/kg, sc). Vinte e quatro horas após, o córtex pré-frontal e hipocampo foram removidos para análises de parâmetros inflamatórios e neuroquímicos agudos. Outro grupo foi acompanhados por 10 dias para avaliação da sobrevida, memória de habituação e reconhecimento de objetos. Resultados: Houve elevação dos níveis de KYN em ambas as estruturas, devido à ativação da enzima indoleamina 2,3-dioxigenase 24h após a indução de sepse. A vit B6 atenuou a ativação da IDO preservando triptofano e diminuindo KYN. Ainda, a vit B6 preveniu a elevação da permeabilidade da barreira hematoencefálica, a infiltração de neutrófilos, diminuiu os níveis de citocinas pró-inflamatórias e de óxido nítrico. A vit B6 exerceu proteção contra o estresse oxidativo, diminuindo a peroxidação lipídica e carbonilação proteica, por elevar a atividade da enzima antioxidante da superóxido dismutase. A vit B6 não melhorou a sobrevida dos animais, todavia melhorou memória e cognição, prejudicadas pela sepse e pela ativação da via da quinurenina. Conclusão: Na sepse a vit B6 é capaz de diminuir a ativação da via da KYN, por diminuir ativação de IDO. Previne a elevação da permeabilidade da barreira hematoencefálica, reduz inflamação e estresse oxidativo em curto prazo, e melhora cognição e memória em longo prazo.
ABSTRACT
Introduction: Neurological dysfunction in sepsis is the cause of increased mortality and impairment in learning and memory in survivors. High levels of kynurenine (KYN) in plasma are associated with worst prognosis in critically ill patients. Vitamin B6 (vit B6) has anti-inflammatory and antioxidant properties, also acts as a cofactor for enzymes of the kynurenine pathway; however inflammation causes its depletion. Aim: To evaluate the effect of treatment with vit B6 on the kynurenine pathway, acute neuroinflammatory and neurochemical parameters and cognitive changes in long-term pre-clinical model of sepsis. Methods: Male Wistar rats (250-300 g) submit to cecal ligation and puncture (CLP) with sham as control were divided into sham+saline, sham+vit B6, CLP+saline and CLP+vit B6 (600 mg/kg, sc). Twenty-four hours later, the prefrontal cortex and hippocampus were removed for analysis of acute neurochemical and neuroinflammatory parameters. Other animals were followed for 10 days to evaluate the survival, habituation and object recognition memory. Results: There were increasing levels of KYN in both brain structures, due to the activation of the enzyme indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) 24h after induction of sepsis. The vit B6 attenuated activation of IDO preserving TRP and KYN decreasing. Also, vit B6 prevented the elevation of BBB permeability, neutrophil infiltration, levels of proinflammatory cytokines and nitric oxide. The vit B6 exerted protection against oxidative stress by decreasing lipid peroxidation and protein carbonyls, raising the antioxidant activity of superoxide dismutase. The vit B6 did not improve the survival of animals, but improved memory and cognition, impaired by the induction of sepsis and activation of kynurenine pathway. Conclusion: The vit B6 can reduce the activation of the kynurenine pathway, prevent elevation of BBB permeability and reduce inflammation and oxidative stress in the short term and protected cognition and long-term memory.
LISTAS
Lista de siglas e abreviaturas
ANOVA - Análise de variância de uma via ATP- Adenosina trifosfato
BHE - Barreira hematoencefálica Catalase - CAT
CCL-3/MIP- 1-α - Proteína inflamatória de macrófago 1-α
CLP - Ligação e perfuração cecal do inglês “Cecal Ligation and Puncture” cm - Centímetros
DCIP - 2,6-diclorofenol-indofenol EAS - Encefalopatia associada a sepse ERNs- Espécies reativas de nitrogênio EROs - Espécies reativas de oxigênio
FADH2 - Flavina adenina dinucleotídeo reduzida
GPx - Glutationa peroxidase h - Hora
HMGB-1 - Proteína de alta mobilidade box 1 ICAM-1 - Molécula de adesão do tipo 1 i.p. - Intraperitoneal
IRAK-1 - Receptor de IL-1 associado a quinase 1 IDO- Indoleamina-2,3-dioxigenase
IL-1β - Interleucina 1 beta IL-6 - Interleucina 6 INF- - Interferon gama
iNOS - Óxido nítrico sintase induzível
IRAK-1 - Receptor de IL-1 associado a quinase 1 IRAK-4 - Receptor de IL-1 associado a quinase 4 KAT - Quinurenina aminotransferase
kg - Quilogramas KYN - Quinurenina LPS - Lipopolissacarídeo
MyD-88 - Fator de diferenciação mielóide 88 mg - Miligramas
min - Minutos mM - Milimolar
MPO - Mieloperoxidase
NAD - Nicotinamida adenina dinucleotídeo oxidado NADH - Nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzido NF-kB - Fator nuclear kappa B
nm - Nanômetros
NMDA - N-metil-D-aspartato
NO – Óxido Nitríco do inglês “Nitric Oxide” NOS - Óxido nítrico sintase
P5F- Piridoxal 5-fosfato
PAMP’s - Padrões moleculares associados a patógenos s.c.- Subcutânea
SIRS - Síndrome de resposta inflamatória sistêmica SNC - Sistema nervoso central
SOD - Superóxido dismutase
SOFA - medida sequencial rápida de falências orgânicas, do inglês, “quick Sequential Organ
Failure Assessment”
SPSS - Statistical Package for the Social Sciences TDO - Triptofano 2,3 dioxigenase
TLR - Receptores Toll- like TLR-4 - Receptor Toll-like 4
TNF-α - Fator de Necrose Tumoral alfa
TRAF-6 - Receptor de TNF associado ao fator 6 TRP - Triptofano
UTIs - Unidades de Terapia Intensiva Vit B6 - Vitamina B6
Lista de Símbolos α Alfa
k Kappa
% Porcentagem ± Mais ou menos < Menor
Lista de figuras
Figura 1. Esquema representativo da via da quinurenina no encéfalo. ... 18 Figura 2. Vitamina B6 e seus respectivos metabólitos. ... 21 Figura 3. Desenho experimental do estudo.. ... 27 Figura 4. Mecanismos de neuroproteção da vit B6 propostos na disfunção neurológica na sepse………..53
Lista de Gráficos
Gráfico 1 - Concentração de TRP no córtex pré-frontal (A) e hipocampo (B) de ratos
submetidos à sepse polimicrobiana e tratados com vit B6 (600 mg/kg). ... 35 Gráfico 2 - Concentração de KYN no córtex pré-frontal (A) e hipocampo (B de ratos
submetidos à sepse polimicrobiana e tratados com vit B6 (600 mg/kg). ... 36 Gráfico 3 - Razão TRP/KYN no córtex pré-frontal e hipocampo de ratos submetidos à sepse polimicrobiana e tratados com vit B6 (600 mg/kg).. ... 36 Gráfico 4 - Avaliação da permeabilidade da BHE no córtex pré-frontal e hipocampo de ratos submetidos à sepse polimicrobiana e tratados com vit B6 (600 mg/kg).. ... 37 Gráfico 5- Infiltrado de neutrófilos no córtex pré-frontal e hipocampo de ratos submetidos à sepse polimicrobiana e tratados com vit B6 (600 mg/kg). ... 38 Gráfico 6 - Níveis de citocinas pró-inflamatórias TNF-α (A), IL-1β (B) e IL-6 (C) no córtex pré-frontal e hipocampo de ratos submetidos à sepse polimicrobiana e tratados com vit B6 (600 mg/kg)...39 Gráfico 7- Concentração de nitrito/nitrato no córtex pré-frontal e hipocampo de ratos
submetidos à sepse polimicrobiana e tratados com vit B6 (600 mg/kg). ... 40 Gráfico 8 - Peroxidação lipídica (A) e carbonilação proteíca (B) no córtex pré-frontal e hipocampo de ratos submetidos à sepse polimicrobiana e tratados com vit B6 (600 mg/kg). . 41
Gráfico 9 - Atividade das enzimas antioxidantes SOD (A) e CAT (B) no córtex pré-frontal e hipocampo de ratos submetidos à sepse polimicrobiana e tratados com vit B6 (600 mg/kg).. 42 Gráfico 10 - Atividade do complexo I (A), complexo II-III (B) e complexo IV (C) no córtex pré-frontal e hipocampo de ratos submetidos à sepse polimicrobiana e tratados com vit B6 (600 mg/kg)...43 Gráfico 11 - Curva de Kaplan-Meier para análise de sobrevida de animais submetidos sepse polimicrobiana e tratados com vit B6 seguimento de 10 dias. ... 44 Gráfico 12 - Número de crossings no teste de memória de habituação ao campo aberto em ratos submetidos à sepse polimicrobiana e tratados com vit B6 (600 mg/kg) 10 dias após a indução de sepse.. ... 45 Gráfico 13 - Número de rearings na avaliação da memória de habituação em campo aberto em ratos submetidos à sepse polimicrobiana e tratados com vit B6 (600 mg/kg) 10 dias após a indução de sepse. ... 45 Gráfico 14- Índice de reconhecimento de objetos em ratos submetidos à sepse polimicrobiana e tratados com vit B6 (600 mg/kg) 10 dias após a indução de sepse ... 46
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 9
1.1REFERENCIAL TEÓRICO ... 10
1.1.1 Definição e dados epidemiológicos da sepse ... 10
1.1.2 Fisiopatologia da Sepse ... 11
1.2 MECANISMOS DA DISFUNÇÃO NEURÓLOGICA NA SEPSE ... 12
1.2.1 Mediadores pró-inflamatórios e aumento da permeabilidade da BHE... 13
1.2.2 Estresse oxidativo e alterações no metabolismo energético ... 14
1.3 TRIPTOFANO E VIA DA QUINURENINA ... 16
1.4 VITAMINA B6 ... 19 2. OBJETIVOS ... 24 2.1 OBJETIVO GERAL ... 24 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 24 3.MÉTODOS ... 25 3.1 ANIMAIS ... 25 3.2 ASPECTOS ÉTICOS ... 25 3.3 LOCAL DE REALIZAÇÃO ... 25
3.4 MODELO EXPERIMENTAL DE SEPSE ... 25
3.5 GRUPOS EXPERIMENTAIS E TRATAMENTO ... 26
3.6 DESENHO EXPERIMENTAL ... 26
3.7 ANÁLISES DA VIA DA QUINURENINA ... 27
3.7.1 Análise dos níveis de TRP e KYN ... 27
3.7.1.1 Preparo da amostra ………..…...27
3.7.1.2.HPLC-EM ...,28
3.7.2 Atividade enzimática da IDO ... 29
3.8 ANÁLISE DA PERMEABILIDADE DA BHE ... 29
3.9 ANÁLISE DE PARAMÊTROS INFLAMATÓRIOS ... 29
3.9.1 Atividade da mieloperoxidase ... 29
3.9.2 Análise dos níveis de TNF-α, IL-1β e IL-6 ... 29
3.9.3 Concentração de nitrito e nitrato ... 30
3.10 ANÁLISES DE ESTRESSE OXIDATIVO E METABOLISMO ENERGÉTICO ... 30
3.10.2 Análise do dano oxidativo em proteínas ... 31
3.10.3 Atividade da enzima antioxidante SOD ... 31
3.10.4 Atividade da enzima antioxidante CAT ... 31
3.10.5 Avaliação da atividade da cadeia respiratória mitocondrial ... 31
3.11 ANÁLISE DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS ... 32
3.12 ANÁLISE DE SOBREVIDA ... 32
3.13 TESTES COMPORTAMENTAIS ... 32
3.13.1 Avaliação da memória de habituação ao campo aberto ... 33
3.13.2 Avaliação da memória de reconhecimento de objetos ... 33
3.14 ANÁLISES DE DADOS ... 33
4. RESULTADOS ... 35
4.1 A VIT B6 DIMINUI A ATIVAÇÃO DA VIA DA QUINURENINA NA SEPSE ... 35
4.2 A VIT B6 REDUZ A DISFUNÇÃO DA BHE ... 37
4.3 A VIT B6 ATENUA A NEUROINFLAMAÇÃO NA SEPSE ... 37
4.4 A VIT B6 REDUZ O ESTRESSE OXIDATIVO E ALTERAÇÕES DO METABOLISMO ENERGÉTICO CEREBRAL NA SEPSE ... 40
4.5 O TRATAMENTO COM VIT B6 NÃO MELHORA A SOBREVIDA...…….……..44
4.6 A VIT B6 PROTEGE MEMÓRIA E COGNIÇÃO EM RATOS SOBREVIVENTES DE SEPSE...44
5. DISCUSSÃO ... 47
6. CONCLUSÃO... .56
REFERÊNCIAS ... 56
ANEXO ... 71
1. INTRODUÇÃO
A sepse é uma síndrome clínica comum em unidades de terapia intensiva (UTIs), com índices de mortalidade que chegam a 60%1. O desenvolvimento da disfunção orgânica é uma complicação da doença que contribui para a elevação da mortalidade. Ainda, existem evidências de disfunção encefálica aguda e crônica em sobreviventes de sepse que, devido ao seu impacto negativo na qualidade de vida, começa a gerar preocupações relacionadas a políticas de saúde pública 2,3.
Na sepse, a disfunção encefálica de caráter agudo é conhecida como encefalopatia associada à sepse (EAS) e manifesta-se em até 70% dos pacientes, sendo associada a um pior prognóstico4. A EAS é uma manifestação comum dos pacientes com sepse, e sua fisiopatologia está intimamente relacionada à inflamação sistêmica, onde há produção exacerbada de citocinas pró-inflamatórias e agentes oxidantes, gerando alterações na barreira hematoencefálica(BHE), bem como desordens de neurotransmissores, além da disfunção mitocondrial 5,6.
Uma das vias que pode estar relacionada com a progressão do dano neurológico na sepse é a via da quinurenina (KYN). Em pacientes críticos foi identificada elevação dos níveis de KYN às custa da depleção de triptofano (TRP) plasmático 7,8. O TRP é convertido a KYN por ação da enzima indoleamina 2,3 dioxigenase (IDO), sendo que uma das características marcantes desta enzima é seu potencial de ativação na presença de citocinas pró-inflamatórias, como as liberadas durante a sepse. Na sequência da via da KYN, existem outras enzimas que regulam a geração de diversos metabólitos neurotóxicos, como a quinurenina aminotransferase (KAT) e a quinureninase. Sabe-se que a vit B6 atua como cofator dessas enzimas e, desta forma poderia modular a produção de intermediários metabólicos que tem capacidade pró-oxidantes 9.
Além do seu papel como cofator, a vit B6 desempenha outras importantes funções, como a modulação da resposta inflamatória e do estresse oxidativo10. A diminuição dos níveis plasmáticos de vit B6 está associada com a elevação do estresse oxidativo, alterações do sistema imunológico, bem como distúrbios no metabolismo de glicose11–13, além do seu catabolismo elevado em doenças inflamatórias10. Por outro lado, níveis adequados de vit B6 estão correlacionados positivamente com maiores níveis de enzimas antioxidantes14,15. Dessa forma, a administração de vit B6 poderia ser importante na regulação das respostas fisiopatológicas geradas pela sepse.
A EAS e as alterações manifestadas em longo prazo nos sobreviventes, ainda ocasionam elevada mortalidade após a alta hospitalar, bem como maiores gastos com saúde pública, na tentativa de recuperação da qualidade de vida desses indivíduos 16. Desse modo, faz-se necessário identificar os mecanismos fisiopatológicos associados às alterações neurológicas agudas e que poderão contribuir para o entendimento das alterações manifestadas em longo prazo. Assim, o presente trabalho teve como objetivo avaliar o efeito do tratamento com vit B6 sobre a via da KYN, parâmetros neuroinflamatórios e neuroquímicos agudos e alterações cognitivas em longo prazo em modelo pré-clínico de sepse.
1.1 REFERENCIAL TEÓRICO
1.1.1 Definição e dados epidemiológicos da sepse
A sepse é uma doença caracterizada por anormalidades fisiológicas geradas por uma infecção. Estas anormalidades estão relacionadas à geração de uma resposta inflamatória sistêmica exacerbada que causa dano tecidual e gera as manifestações clínicas observadas nos pacientes. A sepse pode ocorrer em todas as idades e por infecções de qualquer tipo, ocupando a décima posição em causa de morte geral e o primeiro lugar em causa de mortes nas UTIs do mundo 17. Além da elevada mortalidade, existem evidências crescentes de limitações físicas, psicológicas e cognitivas em longo prazo nos pacientes que sobrevivem à sepse 4,18.
Seguindo o primeiro consenso de sepse, datado do final da década dos anos 1980, esta doença era definida como uma resposta inflamatória sistêmica frente a uma infecção, iniciando um processo gradual de dano tecidual, onde a disfunção múltipla de órgãos é a sua mais séria expressão. Para o seu diagnóstico usava-se os critérios da síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SIRS) associada a uma infecção. Ou seja, avaliava-se o estado inflamatório do paciente, no entanto sabe-se que a sepse está relacionada também a outros aspectos fisiopatológicos, como a disfunção orgânica, por exemplo. Dessa forma, usar apenas critérios de SIRS levava a avaliação de apenas um aspecto da doença 19, excluindo os outros aspectos fisiopatológicos da doença.
No terceiro consenso publicado no início de 2016, a sepse passou a ser definida como a disfunção de órgãos com potencial risco de vida causada por uma resposta desregulada do
hospedeiro frente à infecção20. Em outras palavras, a sepse passa a ser definida como um processo infeccioso com a presença de disfunção orgânica. Com a nova definição, extinguiu-se a nomenclatura extinguiu-sepextinguiu-se grave, que identificava a extinguiu-sepextinguiu-se associada à disfunção orgânica, mantendo-se apenas os termos sepse e choque séptico, este último utilizado quando há hipotensão refratária a reposição volêmica e uso de vasopressores.
Associado a isso, recomendou-se diagnosticar a disfunção orgânica através do escore quick-SOFA, que é a medida sequencial rápida de falências orgânicas, que analisa frequência respiratória, pressão sanguínea sistólica e alterações do estado mental20. A disfunção orgânica é característica acentuada da sepse, quanto maior o número de órgãos em falência pior o prognóstico do paciente, onde cada órgão em disfunção representa um acréscimo de 15-20% na mortalidade 21. Uma das disfunções orgânicas na sepse que vem ganhando maior número de evidências é a disfunção neurológica, uma vez que representa elevação da mortalidade em curto e longo prazo 22.
No Brasil, a incidência total de sepse é de 55%, com mortalidade em torno de 33,9% com 32% dos pacientes manifestando alterações neurológicas ainda na UTI 33-36. Dados internacionais mostram que entre os sobreviventes, 70% manifestam comprometimento cognitivo agudo, e outros 45% apresentam alterações cognitivas por até um ano após a alta hospitalar 55, o que gera diminuição na qualidade de vida 23-25.
1.1.2 Fisiopatologia da Sepse
A fisiopatologia da sepse está relacionada com a interação entre o hospedeiro e microorganismo infectante 26. Dessa forma o envolvimento dos componentes do sistema imune, da via de coagulação, das células do parênquima e do sistema endócrino leva a uma resposta imune e metabólica exacerbada caracterizando a complexa fisiopatologia da sepse46. A resposta imune inflamatória disparada por moléculas de patógenos é amplificada por mediadores endógenos, como citocinas, mediadores lipídicos, NO e espécies reativas de oxigênio (EROs) 27.
O lipopolissacarídeo (LPS) e o ácido lipoteicóico são componentes da parede bacteriana das bactérias gram negativas e gram positivas, respectivamente, sendo os principais ativadores da resposta inflamatória do hospedeiro, caracterizados como padrões moleculares associados a patógenos (PAMP’s) 28. As células do sistema imune inato, como neutrófilos, macrófagos e células dendríticas, possuem receptores para o reconhecimento de PAMP’s,
denominados de receptores de reconhecimento de padrões, dentre os mais relacionados com a resposta imune na sepse estão os receptores da família Toll like (TLR) 29.
O receptor do tipo Toll like 4 (TLR-4) é o responsável pelo reconhecimento de LPS e sua ativação leva a uma cascata de sinalização que promove a transcrição de genes responsáveis pela resposta inflamatória contra agentes infeciosos. Após o estímulo do TLR-4 há ativação de moléculas adaptadoras dentro do citoplasma. Dentre estas moléculas, o fator de diferenciação mielóide (MyD-88) é responsável por se associar com o domínio citoplasmático do TRL, levando a fosforilação de receptor de IL-1 associado a quinase 1 (IRAK-1) pela receptor de IL-1 associado a quinase 4 (IRAK-4). Isso leva a indução do recrutamento do receptor de TNF associado ao fator 6 (TRAF-6), que por sua vez, ativa o fator nuclear kappa B (NF-kB), fazendo com que este seja translocado para o núcleo, onde exerce sua função na transcrição de genes de citocinas pró-inflamatórias 30,31.
A transcrição de genes relacionados à resposta inflamatória, permite a exacerbação da inflamação, ocasionando alterações na circulação sistêmica, gerando vasodilatação e hipotensão, resultando em alterações na microcirculação e distúrbios na cascata da coagulação, além de ativar a produção de EROs e NO. Estes eventos comprometem a hemostasia celular e há hipóxia citopática podendo ocorrer apoptose celular 32. Todas estas alterações em tecidos periféricos podem ser potencializados, e serem responsáveis, pelo menos em parte, pela disfunção neurológica na sepse.
1.2 MECANISMOS DA DISFUNÇÃO NEURÓLOGICA NA SEPSE
Com a exacerbação da resposta imune e inflamatória na sepse, o encéfalo está entre os órgãos a sofrer disfunção33. A EAS é observada em infecções por diferentes patógenos, sendo que não há necessidade da presença do microrganismo no encéfalo para que ocorram as alterações neurológicas identificadas 34.
Os sintomas identificados em pacientes com EAS são altamente variáveis. Nos estágios iniciais da doença, há deficiência de atenção e de concentração, gerando confusão e desorientação. A progressão dos sintomas é caracterizada pela rigidez paratônica, diminuição da consciência e coma 35. Por conseguinte, a presença de disfunção neurológica aguda é determinante para o comprometimento cognitivo exibido em longo prazo 18.
Embora existam melhoras na função cognitiva entre os primeiros seis meses após a alta hospitalar, as alterações podem persistir por até seis anos37. Estudos clínicos evidenciaram que a gravidade de declínio funcional e cognitivo encefálico, em longo prazo,
aumentam significativamente após a sepse. Pacientes apresentam alterações na velocidade de processamento mental, na memória, atenção e nas habilidades espaço-visuais 36.
Da mesma forma, em modelo pré-clínico de sepse foi identificada disfunção da memória e aprendizagem, com início em 10 dias, persistindo por até um mês após a sepse 38. A homeostasia do encéfalo pode ser comprometida pelo aumento da permeabilidade da BHE, exacerbação da reposta pró-inflamatória e estresse oxidativo in situ, aliados à disfunção mitocondrial e alterações em neurotransmissores 39.
1.2.1 Mediadores pró-inflamatórios e aumento da permeabilidade da BHE
Após a interação entre patógeno e as células do hospedeiro, há liberação de interleucinas IL-1, IL-6 e TNF-α, IL-8 e proteína inflamatória de macrófago 1-α (CCL-3/MIP- 1-α), bem como prostaglandinas, tromboxanos e leucotrienos que desencadeiam várias reações no organismo do paciente. Estes mediadores podem causar efeitos autócrinos, parácrinos e até mesmo endócrinos e que contribuem para a fisiopatologia da disfunção neurológica na sepse 40.
Os mediadores inflamatórios podem sinalizar o SNC por rotas diferentes: via ativação das fibras nervosas do sistema nervoso autônomo através do nervo vago; passando livremente pelos órgãos circunventriculares, ou difundindo-se através da BHE 41. Com isso as citocinas periféricas podem migrar para regiões cerebrais relacionadas à memória e cognição, como o córtex pré-frontal e o hipocampo, além do córtex total e hipotálamo 42. Sua presença nestas regiões encefálicas pode levar a apoptose e insuficiência bioenergética neuronal, bem como interferências no metabolismo oxidativo 43,44, resultando em lesão cerebral e edema do tecido axonal 45–47.
Outro importante mecanismo está relacionado a capacidade que as citocinas têm de elevar a expressão de metaloproteinases de matriz extracelular (MMPs), enzimas da classe das proteases zinco-dependentes. Estas enzimas podem ser secretadas por leucócitos periféricos, astrócitos e micróglias. Na sepse, as MMP-2 e MMP-9 têm o potencial de degradar as junções entre as células endoteliais da BHE a partir de 12h, mantendo-se por até 48h após indução de sepse, especialmente no hipocampo 48, o que leva ao aumento de permeabilidade desta barreira encefálica. Ainda, evidências sugerem que há aumento de expressão de molécula de adesão do tipo 1 (ICAM-1), promovendo rolamento e infiltração de leucócitos na microvasculatura cerebral do hipocampo, estriado, córtex total e córtex pré-frontal por até 24h após a indução de sepse experimental 49,50.
Com o comprometimento da integridade da BHE, citocinas pró-inflamatórias e outras substâncias da circulação periférica levam a ativação microglial, com consequente liberação de EROs e mediadores inflamatórios in situ, contribuindo para a progressão da neuroinflamação e consequentemente maior dano celular na BHE alterando ainda mais sua permeabilidade já comprometida devido a sua resposta frente as alterações periféricas 51. Ao mesmo tempo, células gliais, como microglia, macrófagos perivasculares e astrócitos interagem com a BHE, podendo causar respostas que potencializam a elevação de sua permeabilidade na direção encéfalo-sangue periférico 52,53.
1.2.2 Estresse oxidativo e alterações no metabolismo energético
A mitocôndria é a organela responsável pelo aproveitamento da maior parte da energia livre provinda da oxidação dos nutrientes, para isso há necessidade do funcionamento do ciclo de Krebs, do fluxo de elétrons na cadeia transportadora e da ação da fosforilação oxidativa 54. Resumidamente, piruvato e/ou ácidos graxos livres entram na mitocôndria, onde são convertidos em acetilcoenzima A. Esta se insere no ciclo de Krebs que, via nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzido (NADH) e flavina adenina dinucleotídeo reduzido (FADH2),
doando elétrons para os complexos I e II da cadeia respiratória mitocondrial, respectivamente. Os elétrons passam então do complexo I e II, para o complexo III, e deste para o complexo IV, onde o oxigênio (O2) é o aceptor final. Os prótons que atravessam a membrana interna
mitocondrial criam um gradiente eletroquímico permitindo que a geração de adenosina trifosfato (ATP) pela ATP sintase. A ATP é em seguida, transportada para o citosol, podendo transferir energia para diversos processos metabólicos 55.
Por um evento chamado escape de elétrons na cadeia respiratória mitocondrial, cerca de 1 a 2 % de todo o O2 utilizado na respiração celular forma EROs 56,57. Cabe ressaltar que as
células imunes como macrófagos e neutrófilos também produzem espécies reativas por ação da enzima mieloperoxidase (MPO) há formação de ácido hipocloroso, que se dissocia no íon hipoclorito possuindo ação microbicida 58. Na mitocôndria, os complexos mitocondriais I, II e III são capazes de se auto-oxidar e produzir semiquinona, uma molécula que tem capacidade de transferência direta de elétrons para o O2 formando o radical superóxido (O-2•) 59. A enzima
antioxidante SOD converte o O-2• em peróxido de hidrogênio (H2O2) e O2 molecular.
Novamente, a ação de outra enzima antioxidante, a catalase, transforma o H2O2 em àgua e O2 60
. Quando não ocorre ação eficiente da catalase (CAT), o H2O2 é capaz de atravessar
do íon ferro (reação de Fenton), ou na presença de O-2• (reação de Haber-Weiss). Esta última
espécie reativa, o OH•, é considerada a molécula com maior potencial de causar danos celulares, pois não existe mecanismo de eliminação enzimático específico para ela 60. Além das enzimas SOD e CAT, existe a glutationa peroxidase (GPx), que atua sobre peróxidos em geral, utilizando a glutationa como co-fator 61.
Enquanto as ERO’s compreendem as espécies derivadas de O2, o termo ERNs
refere-se a substâncias reativas derivadas de nitrogênio. O principal reprerefere-sentante é o NO, que, em sistemas biológicos, tende a se concentrar em ambientes lipofílicos, como membranas e domínios hidrofóbicos das proteínas58. Fisiologicamente, o NO pode atuar como um importante segundo-mensageiro, sendo que durante a sepse está implicado na inflamação e principalmente geração de espécies reativas62.
A formação de NO, envolve um processo de oxidação do aminoácido L-arginina através da redução do O2 molecular, gerando citrulina e NO 63. Existem três isoformas de
enzimas óxido nítrico sintase (NOS) responsáveis pela formação de NO, sendo que as isoformas endotelial e neuronal são constitutivas, e a isoforma induzível (iNOS), como o próprio nome sugere, pode ser induzida em processos inflamatórios, estando estreitamente relacionada com a elevação das concentrações de NO na disfunção neurológica na sepse 64.
Quando presente em altas concentrações, o NO reage diretamente com O2 para
produzir dióxido de nitrogênio (NO2•), conhecido por ser um importante inicializador de
lipoperoxidação 65. Além disso, ao reagir com O-2• produz peroxinitrito (ONOO-), um produto
altamente oxidante, instável e com tempo de meia-vida curto. Este é capaz de oxidar ou nitrar outras moléculas, além de ser capaz de produzir o OH• e NO2•, que, como já mencionado, tem
alta capacidade oxidante 66.
Todas estas moléculas reativas derivadas de oxigênio ou nitrogênio citadas são capazes de causar dano oxidativo em lipídios, proteínas, ácidos nucléicos e carboidratos comprometendo a homeostasia celular 67. Dessa forma, quando há desequilíbrio entre a produção de espécies reativas e a ação do sistema antioxidante, caracteriza-se o processo chamado de estresse oxidativo 68. O encéfalo humano tem propriedades que o tornam mais propenso ao estresse oxidativo. Sua alta necessidade energética faz com que cerca de 20% de todo o O2 disponível seja utilizado em suas funções metabólicas, isso permite maior escape de
elétrons e consequentemente elevação na formação de espécies reativas 69. Do mesmo modo, suas células são abundantes em ácidos graxos poli-insaturados e este órgão tem baixas concentrações de defesas antioxidantes enzimáticas, comparando-o com órgãos periféricos, o que favorece a ação dos mecanismos tóxicos do O2 57.
Ainda, considerando a ação das espécies reativas, é provável que as proteínas constituintes dos complexos proteicos presentes na cadeia respiratória mitocondrial, bem como seu material genético, possam ser danificados comprometendo a produção energética 70. Alguns trabalhos corroboram que a disfunção mitocondrial pode levar a disfunção múltipla de órgãos na sepse 71,72. No encéfalo, evidências de estudos pré-clínicos mostram que o hipocampo apresenta alterações na atividade dos complexos I e II entre 12h e 24h após a sepse, podendo persistir por até 96h72. No córtex pré-frontal também foi demonstrado aumento da atividade dos complexos III e IV em 10 dias após a sepse73. Assim, as alterações na atividade dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial podem levar a produção de níveis inadequados de ATP, comprometendo a homeostasia das células encefálicas74. Igualmente, há evidências de estresse oxidativo nas horas iniciais após a sepse (6, 24 e 48h), e que associada a disfunção mitocondrial pode contribuir para o aparecimento da disfunção neurológica aguda 75.
Tratamentos com abordagem antioxidante estão sendo testados, e dados pré-clínicos apontam para o uso promissor de derivados de selênio para minimizar o dano oxidativo e mitocondrial encefálico 76. Ainda, o tratamento com a associação de n-acetilcisteína e deferoxamina 77 ou guanosina 78 foram eficazes em atenuar o dano oxidativo agudo, resultando em melhoria de funções cognitivas em longo prazo.
1.2 TRIPTOFANO E VIA DA QUINURENINA
A inflamação e o estresse oxidativo gerados pela sepse são capazes de alterar diferentes sistemas neurotransmissores, como o serotoninérgico, glutamatérgico e colinérgico. Estas alterações contribuem para o entendimento da fisiopatologia das alterações neurológicas em pacientes com sepse 79,80. Um dos precursores da via serotoninérgica é o aminoácido essencial TRP, todavia, na presença de processos inflamatórios, apenas 5% deste aminoácido é direcionado para esta via, os outros 95% seguem outra rota de degradação, que é a via da KYN 81. Além da própria KYN, os metabólitos gerados pela via da KYN podem estar envolvidos nos mecanismos que induzem a lesão neurológica em doenças inflamatórias 9.
O TRP é um aminoácido aromático essencial, com peso molecular de 204 dáltons, presente no leite, carnes, ovos, chocolate, bananas, tâmaras e amendoim. Depois de ser absorvido no trato gastrointestinal, 10% do TRP circula livre e os outros 90% ligado à albumina. Para atingir o encéfalo o TRP é transportado por um sistema que também transporta aminoácidos ramificados e aromáticos. Desse modo, a concentração de TRP no encéfalo
depende da ingesta diária, da porcentagem livre no sangue e da quantidade de aminoácidos que irão competir pelo mesmo transportador na BHE 82.
No encéfalo, a via de KYN ocorre de forma completa nos macrófagos perivasculares e microglias 83,e parcialmente nos astrócitos e nos neurônios 84. O primeiro passo da via da KYN é a conversão de TRP em N-formil-L-quinurenina pelas enzimas IDO e triptofano 2,3-dioxigenase (TDO) (Figura 1). A n-formil-L-quinurenina é rapidamente convertida pela formamidase à KYN, o metabólito central da via. A partir da KYN, três diferentes enzimas formam três ramificações da via.
A primeira ramificação é a conversão de KYN a ácido quinurênico por ação de enzima quinurenina aminotransferase (KAT) 85. A segunda ramificação envolve a conversão de KYN a ácido antranílico por ação da quinureninase; este ácido é posteriormente metabolizado a ácido 3-hidroxiantranílico pela enzima antranilato 3-monoxigenase. Na última ramificação, a quinurenina monooxigenase produz 3-hidroxiquinurenina, que é metabolizado a ácido 3-hidroxiantranílico pela enzima quinureninase. A 3-hidroxiquinurenina também pode ser metabolizada pela KAT a ácido xanturênico ou ser auto-oxidado. O ácido 3-hidroxiantranílico é convertido pela ácido 3-3-hidroxiantranílico oxigenasse a 2-amino-3-carboximuconato semialdeído. O 2-amino-3-2-amino-3-carboximuconato semialdeído é convertido a ácido picolínico pela carboxilase picolínica, ou ser convertido por ciclização a ácido quinolínico, que através da conversão por fosforibosiltransferases formando nicotinamida (NAD) 86.
A enzima IDO é expressa em diferentes tipos de células, incluindo a microglia, sendo potencialmente induzida por mediadores pró-inflamatórios 9 como o IFN-γ, TNF-α, IL-1β e IL-6, e isso pode ser importante para EAS, pois existem evidências da desregulação da via do TRP na sepse, associada a elevação de mediadores pró-inflamatórios característica da sepse. A atividade da IDO já foi mostrada elevada na sepse severa e choque séptico estando associada com maior mortalidade 8.
O excessivo catabolismo do TRP pela via da KYN está envolvido com a progressão da sepse e com a baixa sobrevida de pacientes 87. Outro estudo mostrou que a disfunção cerebral aguda durante a doença crítica está relacionada com a elevação dos metabólitos tóxicos da via da KYN no plasma 88,89. Em modelo pré-clínico de choque endotóxico por LPS, a administração de TRP atenuou o estresse oxidativo no encéfalo 90 e em órgãos periféricos 91.
Figura 1. Esquema representativo da via da KYN no encéfalo. Na via as enzimas, IDO e TDO convertem o triptofano a N-formil-L-quinurenina que gera a KYN (metabólito central da via) por ação da formamidase. Então se formam três ramos distintos do metabolismo. No primeiro ramo a KAT (1) produz ácido quinurênico. No segundo ramo, a quinureninase (2) forma o ácido antranílico, o qual é metabolizado pela antranilato monoxigenase a ácido hidroxiantranílico. No terceiro ramo (3), a quinurenina aminotransferase produz a hidroxiquinurenina, que é metabolizada pela quinureninase ácido hidroxiantranílico. A 3-hidroxiquinurenina também é metabolizada pela KAT para formar o ácido xanturênico. O ácido 3-hidroxiantranílico é convertido pela enzima ácido 3-hidroxiantranílico oxigenase a 2-amino-3-carboximuconato semialdeído. Este último pode sofrer ciclização não enzimática para ácido quinolínico que, através da conversão por fosforibosiltransferase resulta na formação de NAD+. Fonte: Adaptado de Bohár Z, Toldi J, Fülöp F, Vécsei L., 2015 85.
A KYN, por sua vez, tem participação em processos de estresse oxidativo, exibindo propriedades anti e pró-oxidantes 92. Fisiologicamente, no SNC, 40% da sua produção é local, enquanto que o restante é derivado da circulação sanguínea, devido sua facilidade em
KAT KAT Quinurenina aminotransferase 1 2 3
atravessar a BHE, todavia, sabe-se que em processos neuroinflamatórios esse percentual pode ser diferente pela elevação da produção in situ 93. Em pacientes, há associação entre a elevação da KYN sanguínea com a elevação da mortalidade em 28 dias de seguimento, sendo este um indicativo de ativação da via da KYN, e consequentemente maior gravidade da doença crítica 94.
O ácido quinurênico é descrito como um antagonista dos receptores N-metil-D-aspartato (NMDA) 95 e é capaz de eliminar EROs 96. Em modelo animal de choque séptico, o uso do inibidor atenuou os níveis de TNF-α, NO e da proteína de alta mobilidade box 1 (HMGB-1), importantes mediadores na toxicidade do LPS 97. Com essas ações em conjunto é possível que, em processos de neuroinflamação, ele possa atuar como um agente neuroprotetor.
O ácido antranílico tem efeitos inibitórios no ciclo do ácido cítrico e nos complexos I e III da cadeia respiratória mitocondrial, interferindo assim na função mitocondrial 98. O A 3-hidroxiquinurneina é considerada um agente neurotóxico in vivo, por sua capacidade de sofrer oxidação formando ERO’s como o O
-2• e H2O2, o mesmo é relatado para o ácido
3-hidroxiantranílico que também está propenso a auto-oxidação, além de induzir apoptose em monócitos/macrófagos 99. O ácido xanturênico parece exercer efeitos similares aos anteriores, todavia o mecanismo de sua ação ainda não está completamente identificado 100.
Ainda há a formação do ácido quinolínico, que é metabolizado a NAD 101. O ácido quinolínico atua como agonista dos receptores NMDA, além disso, também pode elevar a liberação de glutamato pelos neurônios e inibir sua recaptação pelos astrócitos, contribuindo duplamente para a excitotoxicidade exercida pela ativação desses receptores102. O processo de exitotoxicidade está relacionado com a produção de EROs dependente da ativação do receptor de NMDA. Com a ativação sustentada dos receptores NMDA, há elevação do influxo de cálcio intracelular, ativando vias de produção de EROs e ERNs 103 e com a interação entre esses radicais, a geração de peroxinitrito 104. O ácido quinolínico não é capaz de atravessar a BHE, dessa forma a neurotoxicidade exercida por ele é em função da produção in situ 105.
1.4 VITAMINA B6
A grande maioria das reações enzimáticas celulares necessita de coenzimas para atingirem sua atividade máxima. Dessa forma, a baixa disponibilidade de determinada coenzima pode influenciar na concentração final de um produto, bem como resultar no acúmulo de substrato. A vit B6 é uma molécula com grande versatilidade, apresentando
efeitos anti-inflamatórios, antioxidantes, além de ser um importante cofator na formação de serotonina e na via da quinurenina108.
Vit B6 é o nome genérico usado para piridoxina, piridoxal, e piridoxamina e suas respectivas formas fosforiladas, piridoxina 5-fosfato, piridoxal-5-fosfato (P5F) e piridoxamina 5-fosfato suas formas ativas no organismo (Figura 2). A enzima piridoxal quinase é quem catalisa a fosforilação das formas não-fosforiladas da vit B6 às seus ésteres de fosfato, sendo o P5F a forma ativa mais frequentemente encontrada no organismo 106. Sua ação como cofator é necessária em mais de 100 reações enzimáticas, atuando em reações de transaminação, como no catabolismo de aminoácidos, no ciclo da ureia e síntese de aminoácidos não essenciais. Nas descarboxilações, onde há geração de aminas biologicamente ativas, ainda atua na gliconeogênese, na síntese de esfingolipídios e de neurotransmissores, como a serotonina 107,108. Na via serotoninérgica o TRP é convertido a 5-hidroxitriptofano pela triptofano hidroxilase e 5- hidroxitriptofano descarboxilase na presença de vit B6 109.
No Brasil, existem 59 produtos com 77 diferentes apresentações à base de cloridrato de piridoxina disponíveis no mercado farmacêutico 110. A administração de vit B6 em humanos é realizada inicialmente em casos de deficiência, devido a sua característica hidrossolúvel a vit B6 não exerce toxicidade a partir da ingestão dietética. Mas existem relatos de casos de neuropatia sensorial periférica, principalmente em tratamentos com doses maiores que 1000mg por dia. Os sintomas nesse caso incluem dor e dormência das extremidades e, em casos graves, dificuldade para caminhar 111.
Existem valores de referência que podem ser adotados para se avaliar o estado nutricional de vitamina B6, sendo que sua concentração plasmática total deve ser maior que 40nmol/L 112. Os níveis indicados pela Organização Mundial da Saúde para a ingesta diária de vit B6 é de 0,1 a 1,0mg/dia para lactentes e crianças e de 1,3mg/dia para adolescentes. Para adultos a ingesta diária deve ser igual ou superior a 1,3mg/dia, e em populações especiais, como gestantes e lactantes a ingesta deve chegar a 2,0mg/dia 113. Os níveis de vit B6 devem ser mantidos pela ingestão de alimentos, como carnes, grãos integrais, legumes, bananas e nozes. Dessa forma deficiências dessa vitamina são raros normalmente ocorrem em conjunto com a deficiência de todas as vitaminas do complexo B 114.
Figura 2. Vitamina B6 e seus respectivos metabólitos. Interconversão metabólica da piridoxina, piridoxal e piridoxamina e os seus respectivos ésteres de fosfato. Sendo o P5F a principal forma ativa da vit B6. Fonte: Adpatado de Spinneker A et al, 2007 115.
Antes da absorção, os ésteres de fosfato da vit B6, devem ser hidrolisados por fosfatases, sendo então absorvidos no jejuno superior e no íleo 115. A maior reserva de vit B6 está nos músculos e fígado, sendo transportada pela albumina na corrente sanguínea e liberada nos tecidos, onde desempenha suas funções 116. As formas não fosforiladas de vit B6 entram no sistema nervoso central (SNC) através da BHE e da barreira hematoliquórica, pelo mecanismo de difusão facilitada sendo fosforiladas para exercer suas diferentes atividades 117. Níveis plasmáticos diminuídos de vit B6 foram identificados em diversas doenças inflamatórias, como artrite reumatóide, doença cardiovascular, doença inflamatória intestinal e obesidade 118,119. Processos inflamatórios podem elevar a demanda metabólica por vit B6 causando sua depleção e dessa forma prejudicando outras reações metabólicas dependentes de vit B6120. Esta vitamina tem papel importante nas respostas imunes e inflamatórias, evidencias demonstram que os linfócitos podem usá-la como coenzima em seu metabolismo 121. Todavia o mecanismo exato da depleção da vit B6 durante o processo inflamatórios ainda não é totalmente conhecidos 122.
O catabolismo da vit B6 durante a inflamação explicaria os achados clínicos, que descrevem níveis diminuídos de vit B6 em pacientes hospitalizados 11,13,120. Outros estudos, destacam a relação inversamente proporcional da concentração plasmática de vit B6 com a concentração de marcadores inflamatórios, como citocinas123–127. A administração de vit B6 tem promovido resultados promissores, como por exemplo, elevação na contagem de linfócitos, o que indica maior atividade da resposta imune dos pacientes 15. A ingestão adequada de vit B6 protege contra a inflamação, e em casos de depleção de seus níveis pela presença de algum processo inflamatório, ela exerce papel importante na recuperação do paciente 128.
Além das atividades relacionadas com a diminuição do processo inflamatório a vit B6 pode exercer proteção contra o estresse oxidativo, atuando como um antioxidante. Em pacientes foi demonstrado que níveis mais elevados de vit B6 no plasma estavam associados com melhor atividade da enzima antioxidante SOD14. O mecanismo exato da sua função antioxidante ainda não foi confirmado, mas evidências apontam para ações comuns a outras moléculas com capacidade antioxidante. Os compostos que compõe o grupo da vit B6 atuam como quelantes do O2 molecular 129.
A piridoxamina por sua vez é capaz de inibir a formação de produtos finais de lipoperoxidação avançada, por reação com o malondialdeído, principal molécula formada pela oxidação lipídica 130,131. A depleção dos níveis de vit B6 está relacionada ao aumento da peroxidação lipídica e diminuição das defesas antioxidantes em pacientes 132. Todas as três forma de vit B6 são eficazes em prevenir a formação de EROs e peroxidação lípidica em cultura de monócitos133 além disso o P5F atua como coenzima na síntese da glutationa reduzida a partir de cisteína 134.
Além das funções anti-inflamatórias e antioxidantes a vit B6 possui um papel importante na via da KYN. O P5F age como cofator para enzimas quinurenina aminotrasnferase e quinureninase, desse modo variações na concentração de vit B6 influenciam na formação dos metabólitos desta via 135.
Restrições de vit B6 afetam mais proeminentemente a atividade da enzima quinureninase e resultam na mudança do metabolismo da 3HK e formação de NAD para a produção de ácido quinurênico e ácido xanturênico. A elevação dos níves de ácido xanturênico provoca a depleção de vit B6 uma vez que é capaz de inibir a enzima piridoxal quinase que catalisa a formação de P5F 105,136. A redução na disponibilidade de P5F limita a produção de NAD, diminuindo seu efeito de feedback negativo na enzima IDO, assim sendo a
diminuição dos níveis de NAD induz ativação de IDO e consequentemente mantém elevados os níveis de KYN 137.
Por outro lado, níveis adequados de P5F poderiam contribuir para a manutenção dos níveis de NAD garantindo a formação de ácido quinurênico (atividade neuroprotetora) e limitando a formação dos intermediários neurotóxicos138. Em resumo a via da KYN pode estar envolvida na potencialização da disfunção neurológica na sepse, e a vit B6 pode apresentar efeitos neuroprotetores interessantes na devido a sua versatilidade fisiológica e metabólica.
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar o efeito do tratamento agudo com vit B6 sobre a ativação da via da quinurenina, parâmetros neuroinflamatórios e neuroquímicos agudos e nas alterações cognitivas em longo prazo em modelo pré-clínico de encefalopatia associada à sepse.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Quantificar os níveis de TRP e KYN no córtex pré-frontal e hipocampo de ratos 24h após a indução de sepse por CLP e tratamento com vit B6;
Avaliar a ativação da enzima IDO no córtex pré-frontal e hipocampo de ratos 24h após a indução de sepse por CLP e tratamento com vit B6;
Analisar o efeito do tratamento com vit B6 sobre a permeabilidade da BHE no córtex pré-frontal e hipocampo 24h após a indução de sepse por CLP;
Investigar o efeito do tratamento com vit B6 sobre os níveis de MPO no córtex pré-frontal e hipocampo, 24h após a indução de sepse por CLP;
Avaliar o efeito do tratamento com vit B6 sobre os níveis de citocinas TNF-α, IL-1β e IL-6, no córtex pré-frontal e hipocampo 24h após a indução de sepse por CLP; Avaliar o efeito do tratamento com vit B6 sobre a concentração de nitrito e nitrato
no córtex pré-frontal e hipocampo 24h após a indução de sepse por CLP;
Aferir o efeito do tratamento com vit B6 sobre o dano oxidativo em lipídios e proteínas, atividade das enzimas antioxidantes SOD e CAT no córtex pré-frontal e hipocampo de ratos 24h após a indução de sepse por CLP;
Avaliar o efeito do tratamento com vit B6 sobre a atividade dos complexos I, II-III e IV da cadeia respiratória mitocondrial no córtex pré-frontal e hipocampo de ratos 24h após a indução de sepse por CLP e tratamento com vit B6;
Determinar a sobrevida de ratos após a indução de sepse por CLP e tratamento com vit B6;
Avaliar a memória de habituação em campo aberto e memória de reconhecimento de objetos 10 dias após a indução de sepse por CLP e tratamento com vit B6;
3. MÉTODOS
3.1 ANIMAIS
Foram necessários 120 ratos machos da linhagem Wistar (Rattus norvegicus), com 60 dias de idade e pesando de 250 a 300g, fornecidos pelo biotério da Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul. Todos foram agrupados em número de quatro animais por caixa e mantidos em ciclos claro-escuro de 12 horas a uma temperatura de 23±1°C, com água e ração ad libitum no Biotério de Manutenção da Universidade do Sul de Santa Catarina (UNISUL). Com base em estudos prévios em modelos animais, para uma diferença de até 20% nos parâmetros a serem analisados entre os grupos, com uma variância de no máximo 10% entre as médias, calculou-se o seguinte número de animais por grupo, 6 animais para os testes de níveis de TRP e KYN, dosagens de estresse oxidativo, parâmetros inflamatórios e avaliação da permeabilidade da BHE e 12 animais para cada grupo para os testes comportamentais, considerando um erro alfa de 0,05 e poder de 80%.
3.2 ASPECTOS ÉTICOS
A utilização dos animais ocorreu mediante aprovação do protocolo experimental pela Comissão de Ética no Uso de Animais da UNISUL sob nº 15.012.4.03.IV (Anexo I) e atendeu a Diretriz Brasileira para o Cuidado e a Utilização de Animais para fins científicos e didáticos – DBCA-2013139
.
3.3 LOCAL DE REALIZAÇÃO
O procedimento experimental foi realizado no Biotério e no Laboratório de Neurobiologia de Processos Inflamatórios e Metabólicos – Neuroimet, UNISUL, Tubarão, Bloco da Saúde.
3.4 MODELO EXPERIMENTAL DE SEPSE
O modelo CLP consiste na ligação e perfuração do ceco, ocorrendo extravasamento de conteúdo fecal para a cavidade abdominal, gerando assim uma resposta imune exacerbada induzida por esta infecção polimicrobiana intra-abdominal 140. Os animais foram anestesiados com cetamina (80mg/kg) e xilazina (10mg/kg) via intraperitoneal (i.p.) e, submetidos à
laparotomia mediana abdominal. O ceco foi ligado abaixo da junção íleo-cecal com fio seda 3-0, perfurado com uma agulha número 14G e gentilmente comprimido até a extrusão de conteúdo fecal. Como controle, foram utilizados animais submetidos à laparotomia, sem ligação ou perfuração cecal, denominados sham. Os planos cirúrgicos foram fechados e os animais observados por 2h no pós-operatório. Todos os animais receberam salina na concentração de 50 mL/kg imediatamente após o procedimento. No tempo zero e 12 h após a cirurgia todos receberam antibioticoterapia com ceftriaxona (30 mg/kg) por via subcutânea (s.c). Ainda, a cada seis horas receberam dipirona sódica (80 mg/kg, s.c.) para analgesia pós-operatória. De acordo com estudos de validação do método de CLP, as taxas de sobrevivência após a cirurgia devem ser de 100% no grupo sham e entre 45-50% no grupo em que foi induzido sepse.
3.5 GRUPOS EXPERIMENTAIS E TRATAMENTO
Os animais foram randomizados em quatro grupos experimentais: sham+salina, sham+ vit B6, que caracterizam os grupos controle sem a doença, CLP+salina e CLP+vit B6. No tempo zero após a cirurgia, os animais receberam 600 mg/kg de vitamina B6 (via s.c.) ou soro fisiológico, de acordo com o grupo experimental a qual pertenciam 141.
A vit B6 na forma de cloridrato de piridoxina foi adquirida da Fagron distribuidora de insumos farmacêuticos (São Paulo-SP). Segundo a Farmacopéia Brasileira 142 o cloridrato de piridoxina, apresenta peso molecular de 205,64 e nome químico 5-hidro-6-metil-3,4-piridinadimetanol. Sua fórmula química é C8H11NO3.HCL, sendo solúvel em água e
praticamente insolúvel em éter.
3.6 DESENHO EXPERIMENTAL
Devido ao número de análises e a necessidade de realização de procedimentos exclusivos para avaliação de determinados parâmetros como, por exemplo, a permeabilidade da BHE e os testes comportamentais, o estudo foi desenvolvido em 3 etapas distintas (Figura 3), caracterizando assim três diferentes experimentos:
Experimento 1: Parâmetros neuroquímicos agudos (n=6). No tempo de 24h após a cirurgia, o córtex pré-frontal e o hipocampo foram isolados para avaliação de parâmetros inflamatórios, de estresse oxidativo e marcadores da via da KYN.
Experimento 2: Avaliação da permeabilidade da BHE (n=6). Os animais foram submetidos à avaliação da permeabilidade da BHE no tempo de 24h após a cirurgia, quando
uma solução de azul de Evans (2%) foi administrada. Córtex pré-frontal e hipocampo foram isolados para análise.
Experimento 3: Avaliação de sobrevida e testes comportamentais (n=12). Outro grupo foi acompanhados durante 10 dias na análise de sobrevida. Os testes comportamentais foram realizados nestes animais, no 10º, 11º e 12º dia após a cirurgia.
Figura 3. Desenho experimental do estudo. Inicialmente os animais foram divididos em quatro diferentes grupos, pertencendo aos grupos sham os animais controle e aos grupos CLP os animais submetidos a sepse polimicrobiana. Imediatamente após a cirurgia os animais receberam vit B6 (600 mg/kg) ou soro fisiológico (0,9%) no mesmo volume. Vinte e quatro horas após este procedimento foram colhidas amostras para o experimento 1 onde avaliamos paramêtros neuroquímicos agudos. No experimento 2 avaliamos a permeabilidade da BHE e no experimento 3 avaliamos sobrevida bem como comportamento animal ao final do período de 10 dias. As amostras coletadas foram armazenadas em freezer com temperatura de -80ºC até o momento da realização das análises.
3.7 ANÁLISES DA VIA DA QUINURENINA 3.7.1 Análise dos níveis de TRP e KYN 3.7.1.1 Preparo da amostra
Três volumes de metanol resfriados foram adicionados às amostras (50 ul de amostra + 150 ul de metanol), foram então centrifugadas a 14xg, durante 10 minutos (4°C). Os compostos hidrofóbicos (ácidos graxos e proteínas) foram removidos do sobrenadante utilizando uma resina C18 ativada. A resina C18 foi previamente ativada por condicionamento com 300 µl de solvente (75% de metanol) por duas vezes, seguido por centrifugação a 14xg, durante 10 min (temperatura ambiente). A resina C18 ativada foi adicionada às amostras na proporção de 1/5 da massa da amostra (10mg), agitada em vórtex e centrifugada como acima. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo e o solvente foi removido em um SpeedVac. As amostras foram reconstituídas no mesmo volume de água
purificada, transferidas para frascos de polipropileno de 100 ul e colocadas num amostrador automático refrigerado (5°C) até que 20 µl fossem injetados no sistema de Cromatografia líquida acoplada a espectrômetro de massa (HPLC-EM) no mesmo dia 143.
3.7.1.2 HPLC-EM
Padrões para TRP e KYN foram obtidos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) com 96% de pureza. A análise de HPLC-EM foi realizada em um sistema de cromatografia liquída de alta eficiência Nexera (UHPLC) (Shimadzu, Kyoto, Japan) acoplado a espectroscopia de massa de ionização por eletrospray de alta eficiência de quadrupolo-tempo de voo (ESI-QTOF) maXis ETD (Bruker, Billerica, MA) e controlado pelo software Compass 1.5 (Bruker).
Um volume de 50 µl dos padrões e amostras foi injetado numa coluna Shimadzu Shim-Pack XR-ODSIII (C18, 2.2 µm, 80 Å, 2.2 x 200 mm) a 30ºC sob um fluxo de 200 μl/min. A eluição de TRP e KYN foi alcançada com as fases móveis A e B (ácido fórmico 0.1% em água e metanol, respectivamente) como segue: 0-1 min 3%B, 1-17 min 3-30%B, 17-18 min 30-100%B, 18-23 min 100%B. Os espectros de massa foram adquiridos no modo íon positivos entre m/z 40-300 e com uma taxa de espectro de 0.5 Hz. Parâmetros de íon-fonte foram definidos para 500 V placa final, tensão capilar de 4500 V, pressão de nebulização de 2.0 bar, 8.0 L/min e 200°C de fluxo de gás seco e temperatura da fonte iónica, respectivamente. As configurações de resfriamento de íon foram otimizadas para a sensibilidade na faixa m/z mencionada usando 10 mM de formato de sódio em 50% de 2-propanol como solução de calibração.
A calibração de massa foi conseguida pela infusão inicial de íons-fonte de 20 µl solução de calibração e a recalibração após a aquisição dos dados brutos. As misturas padrão foram injetadas em um intervalo de concentração entre 0,8-1000 ng/ml em solução salina, para se obter as curvas de calibração para cada composto. Entre as amostras, misturas padrão individuais com 100 ng/ml de cada metabólito foram injetados para monitorar a estabilidade do sistema.
A calibração, bem como os dados das amostras foram pós-processados e analisados através do software QuantAnalysis (Bruker) que extrai os cromatogramas iónicos de alta resolução dos metabolitos alvo listados e integra os picos cromatográficos nas janelas de tempo de retenção de acordo com as curvas de calibração gravadas dos respectivos compostos padrão. Os fatores de curva de regressão, dentro dos gamas de concentração relativas foram
de 0,995 ou maior. A identificação de TRP e KYN nas amostras foi confirmada pelos seus monoisotópico massas (m/z (calc.) ± 0.005 Da), os tempos de retenção cromatográfica e, se detectáveis, os seus fragmentos em-fonte.
3.7.2 Atividade enzimática da IDO
A atividade da enzima IDO, no córtex pré-frontal e no hipocampo foi determinada dividindo-se a concentração de TRP pela concentração de KYN nas respectivas estruturas 144.
3.8 ANÁLISE DA PERMEABILIDADE DA BHE
A análise da permeabilidade da BHE foi avaliada usando-se o índice de extravasamento do corante Azul de Evans 145 24 h após o tratamento com vit B6. O corante foi administrado em uma concentração de 2% p/v em tampão fosfato, por via intravenosa (3 mL/kg). Após 90 min da administração do corante, os animais foram perfundidos com 250 mL de soro fisiológico, através do ventrículo esquerdo, com uma pressão de 110 mmHg até obtenção de fluido de perfusão incolor do átrio direito. A avaliação quantitativa foi realizada em leitora de microplaca, onde o aumento da permeabilidade da BHE foi indicado pela elevação da intensidade de fluorescência do azul de Evans no hipocampo e córtex pré-frontal. A unidade de medida utilizada foi ng/mg tecido.
3.9 ANÁLISE DE PARAMÊTROS INFLAMATÓRIOS 3.9.1 Atividade da mieloperoxidase
A atividade da MPO é um indicativo do infiltrado de neutrófilos tecidual. Brevemente, o tecido encefálico foi homogeneizado (50 mg/ml) em 0.5% de brometo de hexadeciltrimetilamônio e centrifugado a 15.000 xg durante 40 min. Ao sobrenadante foi adicionada uma solução de tetrametilbenzidina (1.6 mM) e 1 mM H2O2. A atividade da MPO
foi mensurada espectrofotometricamente em 650 nm a 37oC e expressa em atividade de MPO (U/mg proteína)146.
3.9.2 Análise dos níveis de TNF-α, IL-1β e IL-6
As concentrações de TNF-α, IL-1β e IL-6 foram determinadas através da técnica de ELISA em leitor de microplacas. Inicialmente em uma placa com 96 poços, foram
adicionados 100 µl/poço do branco, padrão ou das amostras, procedendo-se à incubação da placa por 2 horas à temperatura ambiente em agitador tipo Kline com baixa rotação. Após esse período foi adicionado 100 µl de reagente de detecção A, e incubado por 1 hora a 37ºC. Lavou-se 3 vezes a placa com uma solução de lavagem. Depois desse procedimento, adicionou-se 100µl do reagente B em cada poço, seguindo uma incubação de 30 minutos. Repetiu-se o procedimento de lavagem por 5 vezes. Então se adicionou 90 µl de 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidina em cada poço, incubando a placa por 20 minutos a 37ºC, esse procedimento gera uma coloração azul, ao final da incubação foi adicionado rapidamente a solução de parada de reação, e a leitura pontual foi realizada em leitora de microplaca, a 450 nm. A unidade de medida utilizada foi pg/mg de proteína -1.
3.9.3 Concentração de nitrito e nitrato
A concentração de nitrito/nitrato foi avaliada espectrofotometricamente usando o reagente de Griess [1% sulfanilamida em 5% ácido fosfórico e 0.1% N-1- N-dicloridrato de (1-naftil)-etilenodiamina em água purificada] e cloreto de vanádio (III) como previamente descrito 147. Uma curva padrão é realizzada simultaneamente com as amostras e a absorbância foi medida a 550 nm. Os resultados da concentração de nitrito e nitrato foram expressos em nmol/mg de proteína.
3.10 ANÁLISES DE ESTRESSE OXIDATIVO E METABOLISMO ENERGÉTICO 3.10.1 Análise do dano oxidativo em lipídios
A técnica de formação de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) durante uma reção ácido-aquecida, como descrita previamente é usada como índice de dano oxidativo em lipídios 148. Brevemente, 250 µl de amostra homogeneizada foram precipitados com ácido tricloroacético a 10%, ao sobrenadante foi adicionado ácido tiobarbitúrico (0,67%). Seguido por incubação protegida da luz, em banho–maria a 100ºC durante 30 min. Leitura da absorbância foi realizada em 535 nm usando 1,1,3,3-tetrametoxipropano como padrão externo. Os resultados foram expressos em equivalentes de malodialdeído (nmol/mg de proteína). TBARS foi determinado pela absorbância a 535 nm, utilizando 1,1,3,3-tetrametoxipropano como padrão externo. Os resultados foram expressos como equivalentes de malondialdeído nmol/mg de proteína.
3.10.2 Análise do dano oxidativo em proteínas
O dano oxidativo em proteínas foi determinado pela reação dos grupamentos carbonilados com dinitrofenilhidrazina. As proteínas foram precipitadas por adição de ácido tricloroacético a 20%, o precipitado é dissolvido e então adicionado dinitrofenilhidrazina. Incuba-se por uma hora em temperatura ambiente, após esse período redissolve-se as amostras com 1 mL de NaOH 3% e incuba-se em banho-maria por 30 min á 60ºC. A leitura é realizada a 370 nm, com resultados expressos como carbonilação proteica por nmol/mg de proteína 149.
3.10.3 Atividade da enzima antioxidante SOD
A atividade da SOD foi medida com base em sua capacidade de inibir espontaneamente a oxidação da adrenalina em adrenocromo 150. A SOD presente na amostra compete pelo radical O2- diminuindo a oxidação da adrenalina. Dessa forma a velocidade de
formação do adrenocromo em um meio de reação contendo glicina-NaOH (50 mM em pH 10,2) e adrenalina (60 mM), indica a atividade da SOD, a variação de absorbância é medida em 480nm. Uma unidade de SOD produz aproximadamente 50% de auto-oxidação de adrenalina. Os resultados foram expressos como U/mg de proteína.
3.10.4 Atividade da enzima antioxidante CAT
A atividade da catalase é diretamente proporcional à taxa de decomposição do H2O2.
A reação utiliza o método que emprega peróxido de hidrogénio (H2O2) que deve ser
convertido pela CAT em H2O e O2 151.O tecido cerebral foi homogeneizado em tampão de
fosfato 50 mmol/ L (pH 7,0), e a suspensão resultante foi centrifugada a 3000rpm durante 10 min. Uma alíquota de 100 µl da amostra (20 µl) foi adicionada a 1000 µl da mistura de substrato. A mistura de substrato continha 0,3 ml de peróxido de hidrogênio em 50 ml de tampão ao fosfato 0,05 M (pH 7,0). Absorbâncias foram registradas em 240 nm nos tempos 0, 30 e 60 segundos após o início da reação. Uma curva padrão foi estabelecida utilizando catalase purificada (Sigma, MO) em condições idênticas. Os resultados foram expressos em U/mg de proteína.
3.10.5 Avaliação da atividade da cadeia respiratória mitocondrial
A atividade do complexo I foi avaliada pela taxa de NADH-dependente da redução do ferricianeto152. No meio de reação foi adicionado tampão fosfato de potássio 100 mM,
