Estudo comparativo da atividade anti-inflamatória dos extratos aquosos de Mikania glomerata (Sprengel) e Mikania laevigata (Schultz Bip ex Baker)

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS

CAMILA DE SOUZA PEREIRA

ESTUDO COMPARATIVO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA DOS EXTRATOS AQUOSOS DE Mikania glomerata (Sprengel) e Mikania laevigata

(Schultz Bip ex Baker)

CAMPINAS 2016

ESTUDO COMPARATIVO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA DOS EXTRATOS AQUOSOS DE Mikania glomerata (Sprengel) e Mikania laevigata

(Schultz Bip ex Baker)

Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Farmacologia

ORIENTADOR: Profª Drª Elen Cristina Teizem Landucci

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA CAMILA DE SOUZA PEREIRA E ORIENTADA PELA PROFª. DRª. ELEN CRISTINA TEIZEM LANDUCCI.

CAMPINAS

ORIENTADOR: PROF. DR. ELEN CRISTINA TEIZEM LANDUCCI

MEMBROS:

1. PROF. DR. ELEN CRISTINA TEIZEM LANDUCCI

2. PROF. DR. ROGERIO CARDOSO DE CASTRO

3. PROF. DR. IVANI APARECIDA DE SOUZA

Programa de Pós-Graduação em Farmacologia da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.

A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.

Dedicatória

que ajudaram a construir este trabalho não é tarefa fácil. O maior obstáculo a que me coloco não é decidir quem incluir, mas decidir quem não aqui mencionar.

Meu maior agradecimento é dirigido aos meus pais, Luiz Carlos e Marinalva, que nunca mediram esforços em busca do contínuo apoio em todos estes anos, ensinando-me, principalmente, a importância da construção e coerência de meus próprios valores. Por estarem sempre presentes, mesmo quando ausentes e me ajudarem a superar com carinho a distância de casa. Por todo amor e carinho que me dedicaram quantas vezes fosse preciso tanto nos dias felizes quanto nos árduos.

Ao meu amor Ronaldo, que sempre apoiou minhas decisões mesmo que cada uma fosse difícil para si próprio. Incentivou diariamente meu crescimento profissional, me ensinando a ter paciência e calma. Principalmente, nunca me deixou esquecer que todo empenho fazia parte de um futuro próspero e merecedor. Sabemos que minha jornada ainda não terminou, mas suas palavras de carinho e o seu companheirismo é que sempre me deram forças para continuar em busca dos meus sonhos.

Agradeço profundamente à minha orientadora Elen, por ter me ensinado a arte de pensar neste trabalho com foco e disciplina, proporcionando-me a fundamentação básica, sem a qual este trabalho não teria sido finalizado. Suas sugestões levaram a sucessivas revisões do texto, cujas eventuais falhas teriam sido mais numerosas se não fosse por sua crítica constante e detalhada. Além de mestre tem a qualidade de amiga/mãe e a isso meu “muito obrigada”.

Agradeço de forma muito carinhosa a atuação dos meus amigos que tornaram essa jornada gratificante e inesquecível. Alberto, Mariana, Julio, Rita, Diana e Edith muito obrigada pelas oportunas manifestações de companheirismo e de encorajamento. Não poderia deixar de agradecer à Glaucia e ao Renan que foram intermédio desse processo. Sempre estiveram de prontidão auxiliando-me e sanando dúvidas com paciência e dedicação.

Em especial quero agradecer aos meus irmãos de coração Sandra, Beatriz, Raphael e Paulo. Com vocês, passei por momentos difíceis, mas acima de tudo, momentos maravilhosos. Obrigada por todo companheirismo nessa amizade e que esta irmandade possa se prolongar além desses anos que passamos juntos dividindo nossas conquistas e também nossas perdas. Devo muito à vocês, pois sei que nesta caminhada, os dias não seriam fáceis se não os tivesse ao meu lado.

À Deus, que nunca nos desampara. Força maior que nos ilumina, dando-nos a calma e a serenidade para seguir em frente com fé. “Tudo posso naquele que me fortalece” (Filipenses, 2:13).

Sem dúvidas há muito mais a quem agradecer. Embora não nomeados, me brindaram com seus inestimáveis apoios em distintos momentos, deixo aqui a minha reconhecida consideração. Ninguém vence sozinho e todos vocês se tornaram co-autores deste trabalho. Muito obrigada!

guaco, estão entre as espécies mais utilizadas na medicina popular, principalmente para o tratamento de doenças inflamatórias do trato respiratório. Atualmente, apenas a M. glomerata é reconhecida na clínica sendo comercializada nas formas de xarope e solução oral. Essas espécies possuem grande similaridade morfológica, composição química e usos medicinais muito parecidos, sendo portanto bastante confundidas e, consequentemente, comercializadas de forma indistinta. A cumarina é considerada um dos marcadores químicos dessas espécies, sendo responsável por importantes atividades terapêuticas à elas atribuídas. Para investigar a possível diferença da atividade anti-inflamatória entre essas espécies e da cumarina, bem como de seus papéis em diferentes processos inflamatórios, foram utilizados os modelos de edema de pata, pleurisia, desgranulação de mastócitos peritoneais e pancreatite aguda em ratos. A M. glomerata inibiu 55,6%, a M. laevigata 70,4% e a cumarina 33,9% do edema formado por carragenina, no último intervalo de tempo medido, em relação ao controle. A M. glomerata inibiu 56,3%, a M. laevigata 68,8% e a cumarina 40% do edema formado por Composto 48/80, no último intervalo de tempo medido, em relação ao controle. A M. glomerata, M. laevigata e cumarina não inibiram a liberação de histamina de mastócitos peritoneais, uma vez que, houve aumento progressivo de liberação de histamina em função da dose de estímulo incubado (50 a 94% de liberação). A M. glomerata não inibiu a migração leucocitária, enquanto a M. laevigata inibiu 23,3%, a cumarina 17,5% e a dexametasona 33,4% desta atividade, em relação ao controle. Não observou-se resultados satisfatórios para pancreatite aguda após tratamento em dose única com os extratos das duas espécies e com cumarina. Em contrapartida, após tratamento crônico, a M.

glomerata inibiu 29,71%, a M. laevigata 45,89% e a cumarina 22,09% o influxo de

neutrófilos no pâncreas. Ainda, a M. glomerata inibiu 65,6%, a M. laevigata 49,6% e a cumarina 54,5% os níveis de amilase sérica, em relação aos respectivos controles. Os resultados mostram que a M. laevigata pode ser um alvo atrativo para o controle farmacológico da inflamação aguda, uma vez que apresenta um potencial anti-inflamatório mais evidente que a própria M. glomerata, espécie padrão. A cumarina possui relevante ação anti-inflamatória, entretanto, temos sugerido que possivelmente ela não seja o único componente responsável pelo efeito terapêutico

Palavras-chave: guaco, Mikania glomerata; Mikania laevigata; cumarina; anti-inflamatórios

are among the species most used in folk medicine, mainly for the treatment of inflammatory diseases of the respiratory tract. Currently, only M. glomerata is recognized in the clinic and marketed in syrup and oral solution forms. These species have great morphological similarity, chemical composition and very similar medicinal uses, being therefore very confused and, consequently, commercialized of indistinct form. Coumarin is considered one of the chemical markers of these species and is responsible for important therapeutic activities attributed to them. To investigate the possible difference between the anti-inflammatory activity between these species and coumarin, as well as their roles in different inflammatory processes, the models of paw edema, pleurisy, peritoneal mast cell degranulation and acute pancreatitis in rats were used. M. glomerata inhibited 55.6%, M. laevigata 70.4% and coumarin 33.9% of the edema formed by carrageenan, in the last measured time interval, relative to the control. M. glomerata inhibited 56.3%, M. laevigata 68.8% and coumarin 40% of the edema formed by Compound 48/80, in the last measured time interval, relative to the control. M. glomerata, M. laevigata and coumarin did not inhibit the release of histamine from peritoneal mast cells, as there was a progressive increase in histamine release as a function of the dose of incubated stimulus (50 to 94% release). M. glomerata did not inhibit leukocyte migration, while M. laevigata inhibited 23.3%, coumarin 17.5% and dexamethasone 33.4% of this activity, in relation to the control. No satisfactory results were observed for acute pancreatitis after single dose treatment with the extracts of both species and with coumarin. In contrast, after chronic treatment, M. glomerata inhibited 29.71%, M. laevigata 45.89% and coumarin 22.09% influx of neutrophils in the pancreas. Still, M. glomerata inhibited 65.6%, M.

laevigata 49.6% and coumarin 54.5% serum amylase levels, in relation to the

respective controls. The results show that M. laevigata may be an attractive target for pharmacological control of acute inflammation, since it has a more evident anti-inflammatory potential than the standard M. glomerata itself. Coumarin has a relevant anti-inflammatory action, however, we have suggested that it may not be the only component responsible for the therapeutic effect of these species. These evaluations highlight the importance of the species M. glomerata and M. laevigata as medicinal herbs.

Figura I - Vista adaxial (esquerda) e abaxial (direita) da folha da espécie Mikania

glomerata ... 19

Figura II - Vista adaxial (esquerda) e abaxial (direita) da folha da espécie Mikania

laevigata ... 21

Figura III - Estrutura química da cumarina ... 25 Figura IV - Efeito da administração oral de M. glomerata - 400 mg/kg, M. laevigata - 400 mg/kg (A) e cumarina - 75 mg/kg (B) sobre o edema de pata induzido pela injeção subplantar de carragenina (1 mg/pata). ... 39 Figura V - Efeito da administração oral de M. glomerata - 400 mg/kg, M. laevigata - 400 mg/kg (A) e cumarina - 75 mg/kg (B) sobre o edema de pata induzido pela injeção subplantar de composto 48/80 (3 µg/pata). ... 41 Figura VI - Efeito do tratamento oral com Mikania glomerata - 400 mg/kg (A),

Mikania laevigata - 400 mg/kg (B) e cumarina - 75 mg/kg (C) sob a liberação de

histamina de mastócitos peritoneais ... 43 Figura VII - Efeito do tratamento oral com Mikania glomerata - MG (A) e Mikania

laevigata - ML (B) nas doses de 100, 200 e 400 mg/kg sobre a inflamação induzida

por carragenina (1 mg/cavidade) no modelo de pleurisia ... 45 Figura VIII - Efeito do tratamento oral com cumarina nas doses de 10, 50 e 75 mg/kg sobre a inflamação induzida por carragenina (1 mg/cavidade) no modelo de pleurisia ... 46 Figura IX - Efeito da Dexametasona (0,5 mg/kg, i.p.) em relação a M. glomerata - MG (400 mg/kg, v.o.) e M. laevigata - ML (400 mg/kg) na inflamação induzida por carragenina (1 mg/cavidade) no modelo de pleurisia ... 46 Figura X - Efeito do tratamento oral com Mikania glomerata - MG (400 mg/kg) e

Mikania laevigata - ML (400 mg/kg) sobre o índice do edema pancreático (A),

aumento da atividade de mieloperoxidase (MPO) no pâncreas (B) e no pulmão (C), nível de amilase sérica (D) e aumento de TNF-α no soro (E) de ratos com pancreatite induzida por Tauracolato de sódio (30 mg/kg) ... 48 Figura XI - Efeito do tratamento oral com Cumarina (75 mg/kg) sobre o índice do edema pancreático (A), aumento da atividade de mieloperoxidase (MPO) no

Figura XII - Efeito do tratamento crônico com Mikania glomerata - MG (400 mg/kg) e

Mikania laevigata - ML (400 mg/kg) sobre o índice do edema pancreático (A),

aumento da atividade de mieloperoxidase (MPO) no pâncreas (B) e no pulmão (C), nível de amilase sérica (D) e aumento de TNF-α no soro (E) de ratos com pancreatite induzida por Tauracolato de sódio (30 mg/kg) ... 52 Figura XIII - Efeito do tratamento crônico com Cumarina (75 mg/kg) sobre o índice do edema pancreático (A), aumento da atividade de mieloperoxidase (MPO) no pâncreas (B) e no pulmão (C), nível de amilase sérica (D) e aumento de TNF-α no soro (E) de ratos com pancreatite induzida por Tauracolato de sódio (30 mg/kg) .... 53

Tabela I - Concentrações dos componentes majoritários presentes nos extratos aquosos secos obtidos de amostras das espécies Mikania glomerata e Mikania

laevigata, utilizando-se da técnica de Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência

acoplado a detector de Massa (UHPLC-MS) ... 23 Tabela II - Efeito do tratamento oral com Mikania glomerata (400 mg/kg), Mikania

laevigata (400 mg/kg) e cumarina (75 mg/kg) nos intervalos de tempo medidos no

edema de pata induzido por carragenina (1 mg/pata) ... 39 Tabela III - Efeito do tratamento oral com Mikania glomerata (400 mg/kg), Mikania

laevigata (400 mg/kg) e cumarina (75 mg/kg) nos intervalos de tempo medidos no

edema de pata induzido por composto 48/80 (3 µg/pata) ... 41 Tabela IV - Porcentagem de liberação de histamina de mastócitos peritoneais ... 43 Tabela V - Porcentagem de inibição de leucócitos totais em animais tratados com

Mikania glomerata (200 mg/kg, v.o.), Mikania laevigata (200 mg/kg, v.o.) e cumarina

(75 mg/kg. v.o.) e dexametasona (0,5 mg/kg, i.p.) ... 47 Tabela VI - Efeito do tratamento oral com Mikania glomerata (400 mg/kg), Mikania

laevigata (400 mg/kg) e cumarina (75 mg/kg) sob a atividade de mieloperoxidase no

pâncreas... 51 Tabela VII - Efeito do tratamento oral com Mikania glomerata (400 mg/kg), Mikania

AIEs Anti-inflamatórios Esteroidais ou Glicocorticóides AINEs Anti-inflamatórios Não-Esteroidais

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária CEME Central de Medicamentos

CEMIB Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica CEUA Comitê de Ética em Pesquisa Animal

CONCEA Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal COX-1 Cicloxigenase-1 ou Prostaglandina H2 Sintase

COX-2 Cicloxigenase-2 ou Endoperóxido Prostaglandina Sintase 2 CTMC Mastócitos do Tecido Conjuntivo de Roedores

FDA Food and Drug Administration

H2O2 Peróxido de Hidrogênio HCl Ácido Clorídrico IL-1 Interleucina-1 IL-6 Interleucina-6 IL-8 Interleucina-8 KRP Tampão Krebs-Ringer MPO Enzima Mieloperoxidase NaOH Hidróxido de Sódio

NCI National Cancer Institute

OMS Organização Mundial da Saúde OPT o-phthaldialdehyde

PAF Fator de Ativação Plaquetária

RE Resolução

SBCAL Sociedade Brasileira de Ciência de Animais de Laboratório TNF-α Fator de Necrose Tumoral Alfa

1. INTRODUÇÃO ... 17

1.1 Plantas medicinais ... 17

1.2 Guaco... ... 17

1.2.1 Mikania glomerata ... 18

1.2.2 Mikania laevigata ... 21

1.2.3 Semelhanças e diferenças entre as espécies ... 22

1.3 Cumarina ... 24

1.3.1 Plantas medicinais com cumarina na inflamação ... 26

1.4 Inflamação ... 28 2. OBJETIVOS ... 31 2.1 Objetivo geral ... 31 2.2 Objetivos específicos ... 31 3. MATERIAIS E MÉTODOS ... 32 3.1 Obtenção do extrato ... 32

3.1.1 Coleta do material vegetal ... 32

3.1.2 Processo extrativo ... 32

3.2 Aprovação pelo comitê de ética ... 32

3.3 Animais... 32

3.4 Tratamento ... 33

3.5 Edema de pata ... 33

3.6 Desgranulação de mastócitos peritoneais ... 33

3.6.1 Obtenção de mastócitos peritoneais ... 33

3.6.2 Incubação de mastócitos ... 34

3.7 Pleurisia ... 35

3.7.1 Contagem total de leucócitos ... 35

3.7.2 Contagem diferencial de leucócitos ... 35

3.8 Pancreatite aguda ... 35

3.8.4 Determinação do TNF-α no soro ... 36

3.9 Análise estatística ... 37

4. RESULTADOS ... 38

4.1 Edema de pata ... 38

4.2 Desgranulação de mastócitos peritoneais ... 42

4.3 Pleurisia ... 44 4.4 Pancreatite aguda ... 47 5. DISCUSSÃO ... 54 6. CONCLUSÃO ... 60 7. REFERÊNCIAS ... 61 8. ANEXOS ... 68 8.1 Anexo A ... 68 8.2 Anexo B ... 69 8.3 Anexo C ... 70

1. INTRODUÇÃO

1.1 PLANTAS MEDICINAIS

uso de espécies vegetais é considerado uma das primeiras formas de cuidados da saúde utilizada pelo homem e o seu consumo tem sido significativo nos últimos tempos. Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), aproximadamente 80% da população mundial faz uso de algum tipo de planta como terapia na busca de alívio de algum sintoma desagradável e, desse total, pelo menos 30% o faz por indicação médica1,2,3,4_.

Atualmente, os fitoterápicos são considerados uma modalidade de terapia complementar ou alternativa em saúde em razão da dificuldade no acesso à assistência de saúde para parte da população, que não tem suas demandas e necessidades atendidas. Além disso, há um grande interesse em relação aos perigos do uso abusivo de produtos farmacêuticos sintéticos em comparação aos benefícios do tratamento natural. Ainda, por serem de baixo custo e de fácil acesso, as pessoas vêem na fitoterapia um método de cura e prevenção mais acessível, ao contrário do que ocorre com outros medicamentos5,3,6_.

As plantas medicinais são muito utilizadas para tratar diferentes condições inflamatórias e têm sido reconhecidas como importante fonte de medicamentos terapeuticamente eficazes, uma vez que, são responsáveis por oferecer uma vasta fonte de compostos que podem apresentar diferentes efeitos em humanos. Atualmente, representam a origem de 25% dos fármacos utilizados na clínica. Este fato, deve-se a grande flora mundial e as importantes propriedades terapêuticas a ela atribuídas. Nesse contexto, muitas abordagens vêm sendo utilizadas para analisar o potencial anti-inflamatório de extratos e de substâncias extraídas de plantas e seus derivados, levando ao desenvolvimento de novos compostos4,7_.

1.2 GUACO

O Brasil possui uma flora rica e variada com numerosas espécies de interesse medicinal. O guaco, pertencente à família Asteraceae, é uma das plantas

medicinais brasileiras de maior consumo e destaca-se por ser receitado desde a antiguidade pela medicina popular para problemas respiratórios, onde estudos relacionados à atividade anti-inflamatória justificam seu emprego terapêutico, o que torna esta planta medicinal uma fonte interessante para pesquisa8,9_.

A família Asteraceae compreende, aproximadamente, 1.500 gêneros e 25.000 espécies, no qual está inserido o gênero Mikania sp.. O gênero Mikania sp. compreende cerca de 450 espécies distribuídas principalmente nas regiões tropicais e temperadas da América, com um elemento Pantropical. Para o Brasil são aceitas 203 espécies, sendo que as mais utilizadas na medicina popular para tratamento de afecções respiratórias são Mikania glomerata Sprengel e Mikania laevigata Schultz Bip. ex Baker, conhecidas como guaco10,11,12_.

Das preparações obtidas utilizando o guaco, os extratos aquosos das folhas são de interesse, pois fazem parte de uma antiga tradição na medicina popular. Caracterizam-se por apresentar importantes metabólitos associados aos efeitos terapêuticos dessa planta, sendo a cumarina o principal componente descrito13,12_.

Segundo Muceneeki14_{, extratos aquosos de guaco apresentam pelo} menos duas vezes o nível de cumarina, em comparação com extratos hidroalcoólicos. No entanto, esta informação é contraditória com os resultados de outras investigações. Celeghini15_{, por exemplo, constataram que soluções} hidroalcoólicas de guaco possuem maior capacidade de extração de cumarina do que os extratos aquosos.

Os extratos hidroalcoólicos são as preparações mais comuns a serem comercializadas para fins terapêuticos e a maioria dos ensaios fitoquímicos são realizados utilizando este tipo de extrato. Contudo, com base em estudos quantitativos, os extratos aquosos também apresentam metabólitos associados aos efeitos terapêuticos do guaco, principalmente cumarina12_.

1.2.1 Mikania glomerata Sprengel

A Mikania glomerata (Figura I), pertencente a seção Globosae Robinson do gênero Mikania Willdenow, está incluída na Lista de Medicamentos Fitoterápicos de Registro Simplificado, publicada pela ANVISA em 2008, e oficializada desde 1929 pela Farmacopeia Brasileira I. É conhecida principalmente como guaco, mas é

também denominada popularmente como coração de Jesus, guaco liso, guaco cheiroso, cipó caatinga, erva de cobra e bejuco, conforme a região em que é encontrada8_.

Figura I. Vista adaxial (esquerda) e abaxial (direita) da folha da espécie Mikania

glomerata16_.

Essa espécie possui sua época de florescência de agosto à dezembro e pode ser encontrada na Bahia, Paraguai, noroeste da Argentina e Uruguai. Ocorre nas margens dos rios, crescendo espontaneamente em matas primárias, capoeiras, capoeirões, orla de matas, terrenos de aluvião, várzeas sujeitas a inundações e possui boa adaptação ao cultivo doméstico17_.

É citada como uma espécie de subarbusto silvestre, escandente, com folhagem densa e perene. O caule é descrito como cilíndrico, ramificado, glabro e, quando seco, apresenta fratura fibrosa e aspecto estriado no sentido longitudinal. A planta jovem apresenta coloração verde-claro passando a arroxeada e a cinzento-escura nas partes suberificadas18_.

Segundo descrição da Farmacopéia Brasileira I, as folhas da M.

glomerata apresentam-se subcoriáceas, pecioladas, oval-lanceoladas, acuminadas

no ápice e de base arredondada ou subcordada; medindo de 10 a 15 centímetros de comprimento e 6 a 8 centímetros de largura. Quando secas, as folhas dessa espécies caracterizam-se fracamente aromáticas e sabor amargo19_.

Investigações fitoquímicas revelaram a ocorrência de cumarina, lupeol e ácido isobutiriloxicaurenóico em suas folhas. São encontrados ainda óleos essenciais, entre eles sesquiterpenos e diterpenos do tipo caurano, ácidos caurenóico, grandiflórico, cinamoilgrandiflórico e caurenol. Outros metabólitos secundários como β-sitosterol, friedelina, estigmasterol, taninos hidrolisáveis, flavonóides e saponinas, também estão presentes em sua composição20_.

químico da M. glomerata, sendo o composto responsável pela atividade anti-inflamatória dessa espécie. Juntamente com a cumarina, o ácido caurenoico destaca-se por suas ações farmacológicas, tais como anti-inflamatória e expectorante18,21_.

A M. glomerata é utilizada na cultura popular há séculos devido às propriedades de suas folhas, que incluem ação tônica, depurativa, antipirética e broncodilatadora, além de estimulante do apetite e antigripal. É ainda empregada no tratamento da asma, bronquite e adjuvante no combate à tosse, além do uso contra picada de cobra20,17_.

Apesar de possuir várias indicações terapêuticas populares, as ações broncodilatadora, antitussígena e expectorante foram comprovadas. Outros estudos indicam potencial atividade antialergênica, antimicrobiana, além de atividade analgésica, anti-inflamatória, antioxidante e antidiarréica20_.

Segundo a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), o guaco pode ser utilizado sob as formas de tintura, extrato, xarope e solução oral. Os medicamentos à base de M. glomerata são padronizados com base no teor de cumarina preconizado e de acordo com a resolução RE nº 89 de 16 de março de 2004, que determina a lista de registro simplificado de fitoterápicos no Brasil, a dose diária recomendada para este marcador pode variar entre 0,525 e 4,890 mg18,21_.

Os medicamentos fitoterápicos a base de Mikania glomerata vem sendo utilizados em larga escala na rede de saúde pública tendo em vista o seu baixo custo, eficácia e toxicidade aceitável11_.

O extrato fluido de M. glomerata, preparado conforme método preconizado pela Farmacopéia Brasileira I, na dose única de 5 a 10 mL/kg, v.o., não causa mortalidade em ratos. Contudo, na administração de 20 mL/kg, v.o., apresentou efeito letal em 40% dos animais, no período de observação de 24 horas22,23_.

Estudos utilizando o extrato hidroalcoólico de M. glomerata, administrados em ratos no ciclo espermatogênico, não apresentaram alterações na ingestão alimentar, corpo e peso do órgão reprodutor, produção de gametas e níveis de testosterona sérica. A ausência de efeitos mutagênicos e de problemas de fertilidade também foi observada quando avaliado número de embriões implantados, reabsorção e corpo lúteo, acasalamento, gestação, perda de pré-implantação, índices de reabsorção, desmame e número de descendentes11,12_.

No relatório da Central de Medicamentos - CEME, do Ministério da Saúde, consta que o xarope de guaco apresenta completa inocuidade e seguridade, ação broncodilatadora e efeito antitussígeno23_.

1.2.2 Mikania laevigata Schultz Bip ex. Baker

A Mikania laevigata (Figura II), também pertencente a seção Globosae Robinson do gênero Mikania Willdenow, teve sua monografia incluída apenas em 2005, no sexto fascículo da Farmacopéia Brasileira IV, e ainda não é reconhecida pelos órgãos oficiais de saúde. Recebe a denominação popular de guaco, mas é também conhecida como guaco do mato, cipó caatinga, cipó sucuriju, coração de Jesus, erva de cobra, guaco de cheiro, guaco liso, guaco verdadeiro e guape, dependendo da região em que é encontrada16_.

Figura II. Vista adaxial (esquerda) e abaxial (direita) da folha da espécie Mikania

laevigata16_.

É uma espécie nativa do continente sulamericano que floresce nos meses de agosto a novembro. Habita as margens das matas litorâneas em condições de sombreamento parcial nas encostas da Serra do Mar. Ocorre desde o estado de São Paulo até o Rio Grande do Sul em altitudes de 0 a 800 metros. É de clima subtropical, quente e úmido, devendo-se evitar regiões de clima frio, podendo ser cultivada a pleno sol ou em sombreamento parcial16,11_.

Possui porte subarbustivo e hábito de trepadora volúvel. Seu caule é cilíndrico, lenhoso, de coloração castanha acinzentada nas partes mais velhas e verde clara nas partes próximas às pontas16_.

A Farmacopeia Brasileira IV descreve suas folhas como simples, glabras a olho nu, coriáceas, escuras quando secas, com lâminas ovaladas a lanceoladas, eventualmente apresentando um ou mais dentes laterais e levemente assimétricas. Variabilidade de forma é encontrada por vezes no mesmo ramo. As lâminas medem

de 6,0 cm a 15,0 cm de comprimento e 4,0 cm a 6,5 cm de largura24_.

Investigações fitoquímicas identificaram a presença de cumarina, ácido cinamoilgrandiflórico, ácido caurenóico e estigmasterol. Além destes, também foram isolados os compostos seringaldeído, ácido trans-o-cumárico e sesquiterpenos como β-cariofileno, germacreno D, e biciclogermacreno25_.

A Farmacopéia Brasileira IV descreve a cumarina como o marcador químico da M. laevigata, assim como em M. glomerata. Esse metabólito exala um odor característico em M. laevigata, espécie que demonstra possuir maior concentração de cumarina que a M. glomerata24,26_.

Na medicina popular, as folhas de M. laevigata são utilizadas sob a forma de xarope contra resfriados, bronquites e tosses crônicas. Assim como a M.

glomerata, é utilizada para o tratamento de diversos tipos de doenças em que sejam

benéficas ações broncodilatadora, anti-inflamatória, antiespasmódica, no tratamento das úlceras gástricas, entre outros. Além disso, as informações disponíveis na literatura trazem relatos de toxicidade muito baixa ou mesmo ausente25,11_.

Ensaios pré-clínicos avaliando o extrato hidroalcoólico de M. laevigata em dose única, subcrônica e crônica, demonstraram ausência de toxicidade e de alterações nas funções hepática, renal, pancreática e hematológicas em ratos

machos e fêmeas11_.

A infusão de M. laevigata, avaliada na atividade mutagênica em

Salmonella typhimurium, através de doseamento microssômico, indicou alta

porcentagem de inibição desta atividade27_.

1.2.3 Semelhanças e diferenças entre as espécies

A Mikania glomerata é, muitas vezes, utilizada e comercializada de forma indistinta à Mikania laevigata. Este fato está relacionado, principalmente, com a distribuição geográfica destas espécies, uma vez que ocorrem com frequência no mesmo local, possuem grande similaridade morfológica, composição química e usos medicinais muito parecidos, sendo, portanto, bastante confundidas28,11_.

Antigamente, os ervanários baseavam-se apenas na morfologia externa para reconhecer as plantas. Levando isso em consideração, afirmavam que a M.

laevigata poderia ser considerada como sucedânea do guaco oficial, ou seja, da M.

No entanto, atualmente, já é comprovado que espécies pertencentes a um mesmo gênero podem apresentar diferenças na constituição química e com isso influenciar diretamente a eficiência terapêutica da planta28,29_{. Em prova disso, os} extratos aquosos obtidos das amostras de M. glomerata e M. laevigata utilizados nesse estudo foram analisados por nosso grupo e apresentaram os constituintes químicos descritos a seguir (Tabela I).

Tabela I. Concentrações dos componentes majoritários presentes nos extratos aquosos obtidos de amostras das espécies Mikania glomerata e Mikania laevigata, utilizando-se da técnica de Cromatografia Líquida de Ultra Alta Eficiência acoplado a detector de Massa (UHPLC-MS).

Compostos M. glomerata (mg/g) M. laevigata (mg/g)

Cumarina (m/z 147) 0,023 13,46 Ác. o-cumárico (m/z 163) - 2,55 Ác. caurenóico (m/z 301) 0,121 - Ác. grandiflórico (m/z 317) 0,146 0,673 Ác. clorogênico (m/z 353) 2,56 - Ác. dicafeoilquínico (m/z 515) 1,48 - Ác. tricafeoilquínico (m/z 677) 0,303 - - Não detectado

Pode-se observar que há diferenças na constituição química dessas espécies. A cumarina foi detectada nas duas espécies estudadas, porém sua presença encontra-se em maior concentração em M. laevigata. Para M. laevigata foi detectado também o ácido o-cumárico, precursor da cumarina, que não é encontrado em M. glomerata. Em contrapartida, o ácido caurenóico, que também é considerado composto responsável por importantes atividades terapêuticas do guaco, é detectado apenas em M. glomerata.

As diferenças entre os teores de cumarina nestas plantas podem estar relacionadas com genótipos diferentes, entretanto, os erros de identificação de M.

glomerata não podem ser excluídos, uma vez que, sua anatomia foliar pode ser

semelhante à M. laevigata como resultado de fatores ambientais30_.

Ademais, a Mikania laevigata difere da Mikania glomerata pelo forte odor de cumarina que apresenta e pela forma das folhas. A lâmina foliar de M. laevigata possui maior comprimento do que largura, as folhas são lanceoladas a estreitamente

ovaladas, às vezes levemente lobadas, com base obtusa e os dentes laterais, quando presentes, são pouco evidentes; enquanto que em M. glomerata, as medidas de comprimento e largura são muito próximas, as folhas são ovaladas a deltóides, pronunciadamente lobadas, com base cordada ou às vezes truncada e os dentes laterais são muito evidentes. Diferem também quanto à época de floração24,9,23_.

Outra diferença é a consistência foliar, porém com caráter mais subjetivo. Na M. laevigata é geralmente coriácea, ao passo que as folhas de M. glomerata são subcoriáceas. As folhas de M. laevigata apresentam-se biconvexas, diferindo neste aspecto daquelas de M. glomerata23_.

Mesmo existindo diferenças entre essas espécies, observa-se que as mesmas são pouco expressivas e por isso dificultam a identificação farmacobotânica, principalmente quando é realizada por leigos para uso popular. Além disso, muitas vezes, as folhas não apresentam-se inteiras e com as inflorescências quando colhidas, desta forma, a diferenciação microscópica é apontada como um passo determinante nesse processo26_.

Ainda, segundo estudos comparativos da composição química das espécies M. glomerata e M. laevigata, a cumarina ocorre em abundância em suas folhas, por isso é considerada um de seus marcadores químicos. No entanto, acredita-se que as concentrações presentes em cada espécie sejam diferentes, seja por características próprias ou pelas condições de cultivo e coleta a que são submetidas30_.

1.3 CUMARINA

A cumarina é um cristal branco à temperatura ambiente, de aroma semelhante ao da baunilha, com ponto de fusão entre 68 e 70°C, massa molecular de 146,15 g/gmol, ponto de ebulição entre 297 - 299 °C e densidade aparente de 0,7 g/mL. É descrita como um composto solúvel em etanol, clorofórmio, éter dietílico e óleos, e pouco solúvel em água. Apresenta em sua molécula um anel aromático fundido em um anel de lactonas condensado (Figura III) 31_.

Figura III. Estrutura química da Cumarina.

As cumarinas são abundantemente distribuídas no reino vegetal e evidenciam várias atividades biológicas, sendo o representante mais simples a 1,2-benzapirona. A cumarina 1,2-benzapirona é uma importante substância que confere identidade ao guaco e existe uma relação entre ela e a ação farmacológica desta planta. Por esta razão, tem sido utilizada como um marcador químico em apresentações farmacêuticas. Acredita-se que esta substância seja formada durante o processamento da planta, através da lactonização do ácido o-cumárico por ação enzimática e pelo calor32_.

A cumarina presente no guaco exala um odor característico após a folha ser esfregada, fragmentada, seca ou fervida. Essa característica ocorre principalmente na Mikania laevigata, espécie que demonstra possuir maior concentração dessa importante substância21_.

Muitos trabalhos evidenciam que as cumarinas têm várias atividades biológicas. As mais comuns são atividades anti-neoplásica e efeitos narcótico, sedativo, espasmolítico, anticoagulante, analgésico, regulador hormonal e vasodilatador. Ainda, alguns autores sugerem que, devido a sua atividade vasodilatadora, as cumarinas podem ser utilizadas no tratamento da impotência masculina. Para que ocorra ereção, as artérias do pênis precisam dilatar-se para aumentar o fluxo de sangue21_.

A cumarina também é capaz de inibir a migração de neutrófilos para o local afetado. Desta forma, o efeito anti-inflamatório do guaco pode ocorrer devido à inibição da produção de citocinas pró-inflamatórias no local de inflamação. Além disso, estudos têm apontado a cumarina como uma substância potencial para o tratamento de cancro, com atividade de inibição do crescimento e a morte celular em várias linhas de células cancerígenas, não mostrando toxicidade no sistema reprodutor em ratos Wistar machos33,32_.

O teor de cumarina é muito variável, depende da espécie usada, do processo de secagem, da parte usada da planta, da idade da planta, da fotoperiodicidade incidente no cultivo, da época do ano da colheita desta planta, do tempo de estocagem da apresentação farmacêutica, da forma de preparo do extrato

através da relação droga e solvente, do processo de extração, do tipo de solvente empregado e dos processos para concentração23_.

Identificar o teor de substâncias ativas, principalmente compostos importantes como a cumarina, nas partes da planta a serem utilizadas é essencial, uma vez que essas substâncias são responsáveis por desencadear os efeitos biológicos da planta, bem como podem promover efeitos tóxicos ao organismo, quando utilizadas em excesso20_.

A toxicidade da cumarina foi estudada pela FDA (Food and Drug

Administration) e o NCI (National Cancer Institute) devido ao uso desses metabólitos

em alta escala para perfumes (fixadores e realçadores), cosméticos e fragrâncias e realçadores de aromas para alimentos. O estudo foi conduzido com ratos e camundongos onde observaram-se evidências de efeitos carcinogênicos e nefropáticos. Entretanto, segundo trabalhos, o rato é um animal impróprio para avaliação da segurança da exposição de seres humanos as cumarinas. Ao contrário do que acontece com ratos e camundongos, onde doses altas de cumarina podem produzir toxicidade e carcinogenicidade, há pouca evidência de toxicidade induzida pela cumarina em seres humanos, quando são administradas doses até 1900 vezes maiores do que aquelas obtidas de fontes dietéticas e de cosméticos21_.

Alguns estudos identificaram como manifestação de toxicidade da cumarina, a fitofotodermatite, uma reação epidérmica caracterizada por erupções bolhosas, hiperpigmentação, eritema e formação de vesícula. No entanto, essa reação de fototoxicidade depende da concentração dos compostos cumarínicos existentes no vegetal em questão e, também, da hipersensibilidade individual35 _.

Em animais, não foi detectado nenhum sintoma de alergia em 100 % dos testes. Em seres humanos com problemas dermatológicos, também não foi observado nenhum sintoma de rejeição à cumarina. Testes clínicos preliminares em pacientes com alergias a fragrâncias não demonstraram nenhuma sensibilidade à cumarina, mas, em uma segunda batelada de testes, 1 % dos pacientes apresentou reações alérgicas35_.

1.3.1 Plantas medicinais com cumarina na inflamação

Além da Mikania glomerata e da Mikania laevigata, outras plantas possuem a cumarina como ativo e são amplamente utilizadas na medicina popular

para tratamento de gripes, resfriados, tosses e outras doenças inflamatórias. As famílias mais citadas na literatura, pelo conteúdo em cumarinas, são: Asteraceae, Apiaceae, Rutaceae, Fabaceae, Oleaceae, Moraceae e Thymeleaceae. Especificamente com relação às furanocumarinas, estas já foram isoladas e identificadas nas seguintes famílias: Amaranthaceae, Asteraceae, Cyperaceae, Dipsacaceae, Goodeniaceae, Guttiferae, Leguminosae, Moraceae, Pittosporaceae, Rosaceae, Rutaceae, Samydaceae, Solanaceae e Apiaceae21_.

A cumarina escoparona, isolada da erva chinesa Artemisia scoparia (Compositae), reduz o recrutamento de células inflamatórias de forma dose-dependente, diminui a produção de citocinas, inibe a sinalização celular de fatores de transcrição pró-inflamatórios e modula a função de macrófagos e linfócitos. Cumarinas como umbeliferona, esculetina, fraxetina e daphnetina são inibidores das enzimas 5-LOX e COX-2, vias do metabolismo do ácido araquidônico, importantes no processo inflamatório35_.

É relevante mencionar ainda a existência das espécies vegetais Torresea

cearensis (cumaru), Justicia pectorali (chambá), Eclipta alba (agrião), Pterodon polygaliflorus (sucupira) e Hybanthus ipecacuanha (falsa ipeca), encontradas no

nordeste brasileiro, que são utilizadas na medicina popular para o tratamento de doenças respiratórias. Em todas elas a cumarina está presente em seu metabolismo secundário. Estudos avaliaram as propriedades anti-inflamatória, antinociceptiva e broncodilatadora dessas espécies e todas apresentaram-se ativas. Esses dados podem ser mais um indicativo da importância da cumarina, presente em M.

glomerata e M. laevigata, frente suas atividades farmacológicas36,17_.

Além dessas espécies, a cumarina também está presente em

Chenopodium ambrosioides (mastruz), Lippia alba (erva-cidreira), Mentha piperita

(hortelã), Ocimum gratissimum (alfavaca), Cinnamomum aromaticum (canela), no própolis e em frutas como morango, cereja, damasco, cumaru, entre diversas outras37,36_.

Em estudo comparativo entre os extratos de M. glomerata, Justicia

pectoralis (anador) e Torresea cearensis (cumaru), identificou-se a presença de

cumarina na composições química das três espécies avaliadas. Além disso, soluções de cumarina, em diferentes concentrações, foram utilizadas no estudo comparando os resultados com os extratos das plantas. Todos os extratos e a solução de cumarina provocaram broncodilatação em traquéia isolada de cobaia de

forma dose-dependente. Os resultados obtidos sugerem que a cumarina pode ser, em parte, a substância responsável pela ação observada com os extratos das três plantas estudadas23,39_.

1.4 INFLAMAÇÃO

A inflamação é uma resposta do organismo a um estímulo lesivo, que se manifesta de maneira esteriotipada, independente da natureza do agente lesivo, caracterizando-se por alterações morfofuncionais da microcirculação na área lesada envolvendo células, tecidos, vasos sanguíneos e linfáticos. As variações podem ocorrer dependendo do agente lesivo, intensidade das características do tecido ou órgãos afetados, da espécie animal e da coexistência de estados patológicos39,40_.

Pode ser desencadeada por agentes químicos, físicos ou microorganismos patógenos e ocorre em tecidos vascularizados envolvendo o recrutamento e ativação de mediadores químicos. Esses mediadores podem ser plasmáticos (fatores do complemento e bradicinina) ou celulares (histamina, serotonina, prostaglandinas, leucotrienos, PAF, citocinas) e são responsáveis por desencadear uma série de alterações vasculares e celulares com o intuito de promover o reparo tecidual41_.

A reação inflamatória é localizada, transitória e auto limitada. Após seu desencadeamento, observa-se uma primeira fase (denominada fase aguda) na qual ocorrem fenômenos vasculares e celulares que finalmente culminam com o surgimento dos cinco sinais cardeais da inflamação: calor, rubor, tumor, dor e perda da função do tecido ou órgão afetado42_.

A reação inflamatória está ainda intimamente ligada ao processo de reparo tecidual, onde o tecido lesado é substituído por células da mesma linhagem daquelas lesadas ou por células do tecido conjuntivo (tecido cicatricial), ou ainda, através da combinação desses fenômenos. A substituição do tecido original pelo cicatricial pode eventualmente comprometer a função do órgão e, dependendo da extensão da substituição, pode ocasionar a perda da função43_.

Quando o processo inflamatório agudo não é completamente resolvido e persiste, ele progride para a inflamação crônica, que predispõe o hospedeiro a uma série de doenças crônicas, tendo como principais características a proliferação de vasos e a presença de células mononucleares como linfócitos, plasmócitos e

macrófagos44_.

A inflamação sistêmica constitui uma parte da “resposta de fase aguda” mas com formação exacerbada de mediadores químicos sistêmicos cujos alvos principais são o fígado e hipotálamo. As citocinas IL-1, IL-6, TNF, IL-8 são os principais mediadores sistêmicos e suas ações sistêmicas são mediadas pelas prostaglandinas e, portanto, inibidas por anti-inflamatórios não-esteroidais.Quando esta resposta é auto-limitada ou controlada por tratamento, a inflamação é inibida, retorna ao normal em dias ou semanas, podendo, de outra maneira, persistir ou recidivar, levando a fase crônica da inflamação, como ocorre em neoplasias e infecções crônicas45,46,47_.

Quando as células inflamatórias são estimuladas ou lesadas, os eicosanóides (também mediadores químicos) passam a atuar. Normalmente, o ácido araquidônico encontra-se "inerte" na membrana celular, mas a partir de qualquer estímulo lesivo a fosfolipase A2 passa a agir sobre os fosfolipídeos de membrana, liberando o ácido araquidônico e o fator de ativação de plaquetas (PAF). O ácido araquidônico é metabolizado pela ciclooxigenase (COX-1 e COX-2) originando as prostaglandinas e tromboxanos ou pela 5-lipoxigenase originando os leucotrienos. O PAF, por sua vez, é liberado por ação da fosfolipase A2, dando origem ao liso-PAF que produz o PAF. Esses mediadores são responsáveis por uma série de alterações vasculares na inflamação como a vasodilatação, aumento da permeabilidade vascular e quimiotaxia, e quando ativados tendem a potencializar a ação de outros

mediadores41_.

Muitos fármacos anti-inflamatórios atuam, pelo menos em parte, interferindo na síntese dos eicosanóides, sendo os principais representados pelos antiinflamatórios não-esteroidais (AINEs) e pelos glicocorticóides48_.

Os anti-inflamatórios não-esteroidais (AINEs) constituem uma das classes de fármacos mais difundidas em todo mundo, abrangendo diferentes especialidades no mercado global, utilizados no tratamento da dor aguda e crônica decorrente do processo inflamatório. Agem com o intuito de minimizar as respostas inflamatórias indesejáveis, bloqueando a enzima cicloxigenase, interrompendo a formação de tromboxanos, prostaciclinas e prostaglandinas, o que leva ao bloqueio dos efeitos inflamatórios48,49_.

A terapia com glicocorticóides é empregada em diversas situações, incluindo doenças inflamatórias e auto-imunes, câncer e transplantes de tecidos.

Dentre as doenças inflamatórias, as aplicações mais típicas incluem asma, rinite alérgica, dermatite atópica, artrite reumatóide e doença inflamatória intestinal. A sua principal ação sobre o processo inflamatório é inibir a enzima Fosfolipase A2 diminuindo a concentração do ácido araquidônico para ser processado pelas cicloxigenases e lipoxigenases e, assim, ao mesmo tempo, inibe ambas as vias48,49_.

Os glicocorticóides inibem tanto as manifestações precoces quanto as tardias da inflamação, ou seja, não inibem apenas o rubor, calor, dor e edema iniciais, mas também os estágios posteriores, da cicatrização e reparação da lesão, e as reações proliferativas observadas na inflamação crônica41_.

Na atualidade, existem mais de 50 AINEs diferentes no mercado, porém nenhum deles é ideal para controlar ou reduzir adequadamente os sinais e sintomas da inflamação, uma vez que, praticamente todos que estão disponíveis no mercado atual, sobretudo os “clássicos”, apresentam efeitos indesejáveis significativos. Os glicocorticóides, embora eficazes, também apresentam muitos efeitos colaterais relacionados principalmente com sua função hormonal endógena, o que limita seu uso crônico48,41

.

A busca de novos compostos anti-inflamatórios tem sido prioridade das indústrias farmacêuticas e os fatores determinantes para este interesse são, principalmente, os efeito colaterais que apresentam, abrindo espaço para novos compostos mais seguros. As plantas podem ser fontes para o estudo e a descoberta de compostos biologicamente ativos, essenciais não apenas para novas terapias, mas também como matéria-prima para drogas semi-sintéticas e como compostos iniciadores para o desenvolvimento de medicamentos sintéticos, utilizados como anti-inflamatórios e analgésicos50_.

Esperamos com este estudo contribuir para a compreensão da possível diferença entre a atividade anti-inflamatória da Mikania glomerata, Mikania laevigata e da cumarina, bem como de seus papéis em diferentes processos inflamatórios. A elucidação destes parâmetros se torna essencial para a busca de uma maior racionalização do uso de fitoterápicos e a busca de novos compostos eficazes.

2. OBJETIVO

2.1 Objetivo Geral

Avaliar comparativamente a atividade anti-inflamatória dos extratos aquosos de Mikania glomerata e Mikania laevigata, utilizando a cumarina como controle positivo, através de modelos experimentais de inflamação aguda em ratos.

2.2 Objetivos Específicos

 Avaliar o efeito dos extratos e da cumarina sob o aumento da permeabilidade vascular estimulada através do modelo experimental de edema de pata induzido por carragenina e composto 48/80.

 Avaliar o efeito dos extratos e da cumarina sob a liberação de histamina a partir da desgranulação de mastócitos peritoneais estimulada por composto 48/80.

 Avaliar o efeito dos extratos e da cumarina sob a migração de leucócitos através do modelo experimental de pleurisia induzida por carragenina.

 Avaliar o efeito dos extratos e da cumarina sob importantes parâmetros de inflamação avaliados na pancreatite aguda induzida por Tauracolato de sódio.

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Obtenção do Extrato

3.1.1 Coleta do Material Vegetal

Os extratos aquosos foram obtidos a partir da coleta de folhas jovens, maduras e sadias das duas espécies e em igual proporção, provenientes da Área de Cultivo Experimental do Instituto de Biologia (IB-Unicamp). As folhas foram mantidas em nitrogênio líquido, para cessar todos os processos biológicos do tecido.

3.1.2 Processo Extrativo

De acordo com o que é preconizado pela Farmacopéia Brasileira I, amostras de 60 g das folhas de cada espécie foram pulverizadas em infusão com 300 mL de água purificada milli-Q®_{. Em seguida, as amostras foram aquecidas a 60} ºC em banho de ultrassom por 30 minutos, filtradas e o solvente purificado por liofilização, dando origem aos extratos secos.

3.2 Aprovação pelo Comitê de Ética

Para este trabalho foram aplicados os Princípios Éticos da Experimentação Animal, tendo sido aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal da Universidade Estadual de Campinas (CEUA-Unicamp), sob os protocolos nº 3509-1 e 3863-1 e realizado seguindo as recomendações éticas da Sociedade Brasileira de Ciência de Animais de Laboratório (SBCAL) e da legislação brasileira (Lei Federal nº 11.794 de Outubro de 2008), em conjunto com as diretrizes para experimentação animal estabelecidas pelo Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA).

3.3 Animais

Foram utilizados ratos machos da linhagem Wistar, pesando entre 180 e 220 g, provenientes do Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica (CEMIB-Unicamp). Os animais foram mantidos em salas com temperatura controlada (24 ºC), umidade em torno de 60%, em ciclos de claro/escuro (12/12 h) e com ração (Purina®_{) e água ad libitum no biotério do Departamento da Farmacologia da}

Faculdade de Ciências Médicas da Unicamp.

3.4 Tratamento

Os animais foram tratados via oral, através da técnica de gavagem, em um volume final de 500 µL, 1 hora antes de iniciar os procedimentos. Na pancreatite aguda, os animais foram tratados durante 7 dias consecutivos, uma vez ao dia, na parte da manhã e sempre no mesmo horário.

Os extratos foram dissolvidos em solução salina estéril 0,9 % nas doses de 100, 200 e 400 mg/kg, e a cumarina (Sigma Aldrich® _{- C4261) foi dissolvida em} óleo de milho nas doses de 10, 50, 75 e 100 mg/kg. Os animais controle foram tratados de acordo com o veículo utilizado.

Empregou-se também o anti-inflamatório esteroidal Dexametasona na dose de 0,5 mg/kg (Decadron® _{- 2 mg/mL, injetável) como anti-inflamatório de} referência, via intraperitoneal.

3.5 Edema de Pata

Os animais, anestesiados superficialmente por via inalatória com Isoflurano (1 a 2%), foram submetidos à injeção subcutânea na região subplantar da pata traseira esquerda com Carragenina 1 mg/pata (Lambda tipo IV, Sigma Aldrich®₎ ou com Composto 48/80 3 µg/pata (Sigma Aldrich®_{) no volume total de 0,1 mL, como} descrito por Winter44_{. O volume basal da pata foi medido através de} hidropletismômetro (Modelo 7150, Ugo Basile™, Itália) imediatamente antes da injeção do agente flogístico e em intervalos regulares de 60, 120, 180 e 240 minutos quando o agente flogístico utilizado foi a carragenina ou em 15, 30, 60, 90 e 120 minutos quando foi o composto 48/80. Os resultados foram expressos como a variação do volume da pata (mL) em relação ao valor basal.

3.6 Desgranulação de Mastócitos Peritoneais

3.6.1 Obtenção de mastócitos peritoneais

Os animais foram anestesiados via inalatória com Isoflurano (1 a 2%) e submetidos a exsanguinação através dos vasos cervicais para injeção de 10 mL de

tampão Krebs-Ringer (KRP; pH 7,3) na cavidade peritoneal. A cavidade peritoneal foi massageada para que a solução fosse uniformemente espalhada por toda cavidade. Em seguida, o lavado peritoneal foi coletado em tubos de polipropileno e centrifugado a 300 g por 5 minutos, 4 ºC. O sobrenadante foi desprezado e o precipitado ressuspendido com Krebs-Ringer em um volume final de 1 mL. A suspensão celular foi acrescentada em Percoll (3,6 mL de Percoll + 0,4 mL de Hanks) e misturada delicadamente. Após 10 minutos, foi centrifugada à 150 g por 25 minutos, 4 ºC. O sobrenadante foi novamente desprezado, lavado com 5 mL de Krebs-Ringer e centrifugado à 300 g por 5 minutos, 4 ºC. O sobrenadante foi desprezado e ressuspendido com Krebs-Ringer em volume final de 1 mL. A partir dessa suspensão final, foi realizada a contagem total e diferencial de células. Para a contagem total foi utilizada alíquota de suspensão celular e solução de Turk (1:10) em câmara de Neubauer. Para a contagem diferencial as lâminas foram preparadas em citocentrífuga e coradas em May-Grunwald-Giemsa.

3.6.2 Incubação de mastócitos

Foram adicionados alíquotas de 0,5 mL da suspensão de mastócitos e 0,4 mL de solução Krebs-Ringer aos tubos, previamente rotulados, e colocados em estufa à 37 ºC por 10 minutos. Após, foram adicionados 0,1 mL de solução Krebs-Ringer ou composto 48/80 como estímulo, mantendo-se um volume final de 1,0 mL. Os tubos foram novamente incubados em estufa à 37 ºC por 30 minutos. Após a incubação, as células foram centrifugadas (300 g, 10 minutos) e separadas (sobrenadante e precipitado) para a determinação de histamina. Aos tubos de sobrenadante foram adicionados 0,1 mL de HCl 1 N e aos tubos de precipitado 1 mL de HCl 0,1 N. Esses tubos foram aquecidos a 100 ºC por 10 minutos. Após 5 minutos de resfriamento, foram adicionados 300 µL de NaOH e 80 µL de OPT 1%. Após 4 minutos, foi adicionado 150 µL de HCl 3 N. Em uma placa de ELISA, foram adicionados 200 µL da solução final aos poços e a leitura foi imediatamente feita por fluorescência em 450 nm e 360 nm. As concentrações de histamina foram determinadas quantificando-se a radioatividade liberada e expressa como % do conteúdo total de histamina. Todos os valores obtidos foram corrigidos subtraindo-se o valor de liberação espontânea em ausência de estímulos.

3.7 Pleurisia

Os animais, anestesiados via inalatória com Isoflurano (1 a 2%), foram submetidos à injeção ao nível do sexto espaço intercostal esquerdo com carragenina 1 mg/cavidade pleural, no volume total de 0,1 mL. Os animais foram deixados em recuperação e após 4 horas foram exsanguinados, a parede torácica aberta e a cavidade pleural lavada com 1 mL de PBS. O exsudato foi removido por aspiração, sendo descartados exsudatos contaminados com sangue. A partir dos exsudatos colhidos foram realizadas contagem total e diferencial de leucócitos.

3.7.1 Contagem total de leucócitos

Para a contagem total de leucócitos, utilizou-se uma alíquota de 10 µL do exsudato pleural com adição de 200 µL de solução de Turk (1:20) para lise das hemáceas. A leitura foi realizada em câmara de Neubauer, a partir 4 quadrantes externos.

3.7.2 Contagem diferencial de leucócitos

Para a contagem diferencial de leucócitos, utilizou-se corante de May-Grunwald-Giemsa que foi gotejado sobre as lâminas de exsudatos secos previamente preparadas em Cytospin. A leitura das lâminas foi realizada em microscópio óptico utilizando-se óleo de imersão. As células foram classificadas como neutrófilos, eosinófilos e células mononucleares.

3.8 Pancreatite Aguda

Os animais foram anestesiados com Tiopental Sódico (40mg/kg) pela via intraperitoneal (i.p.) e submetidos à laparotomia e incisão mediana na região abdominal. O ducto pancreático foi canulado via transduodenal com tubo de polietileno de 1 mm de diâmetro externo. Em seguida, foram infundidos 0,3 mL de Tauracolato de sódio 30 mg/kg, sob um fluxo constante de 60 segundos. A porção hepática do ducto foi obstruída através de pinça hemostática, antes da infusão, para evitar refluxo para o fígado. Os animais foram suturados e após período de 4 horas sacrificados, quando o sangue, pâncreas e pulmão esquerdo foram coletados.

(2) infiltrado neutrofílico pancreático e pulmonar, (3) elevação da amilase sérica e (4) TNF-α no soro.

3.8.1 Medida do Edema Pancreático

O índice do edema pancreático foi calculado pela razão entre o peso úmido e o peso seco do tecido pancreático. Para isso, os tecidos foram removidos e deixados em estufa a 90 ºC para secagem por toda uma noite.

3.8.2 Determinação da Atividade de Mieloperoxidase (MPO) no Pâncreas e Pulmão

Foram coletadas amostras de pâncreas e pulmão esquerdo, pesadas e cortadas em pedaços pequenos e mantidas em tubos teste na presença de 100 µL de tampão fosfato (50 mM, pH 6.0 contendo 0,5% de HTAB). As amostras foram homogeneizadas durante 15 segundos e alíquotas de 1 mL do homogenato foram centrifugadas por 2 minutos em velocidade máxima. Os sobrenadantes obtidos foram submetidos à análise da atividade da mieloperoxidase, conforme descrito a seguir. Em uma placa de ELISA, 10 µL de sobrenadante foram adicionados a 200 µL de solução de dihidrocloreto de o-dianisidina (0,167 mg/mL preparada em tampão fosfato de potássio 50 mM contendo 0,005% de H2O2). As alterações nos valores de absorbância a 460 nm foram registrados em intervalos de 30 segundos durante 5 minutos. A atividade da MPO foi avaliada em 1 µmol de peróxido/minuto à 25 ºC.

3.8.3 Determinação da amilase sérica

A concentração de α-amilase no soro foi avaliada utilizando-se kit comercial para a dosagem desta enzima conforme indicação do fabricante (LaborLab, Guarulhos, SP, Brasil). Esse método baseia-se na hidrólise de um substrato específico (2-cloro-4-nitrofenil-galacto piranosil maltodiose) pela enzima α-amilase, produzindo o cloronitrofenol, que absorve em 405 nm. A atividade da enzima é diretamente proporcional à velocidade de aparecimento da cor.

3.8.4 Determinação do TNF-α no soro

A concentração do TNF-α foi determinada no soro dos animais através de kit comercial, segundo as instruções do fabricante (R&D Systems, EUA).

3.9 Análise Estatística

Os resultados foram expressos como média ± erro padrão das médias (E.P.M.) de n experimentos. As comparações estatísticas foram realizadas utilizando-se (1) o teste t de Student para comparações envolvendo apenas 2 grupos, e (2) análise de variância (ANOVA) de uma via, seguido pelo pós-teste de Bonferroni para múltiplas comparações. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando Software GraphPad Prism 5.0. Os valores de p<0,05 foram considerados significativos.

4. RESULTADOS

4.1 Edema de Pata

Os animais foram previamente submetidos a tratamento oral utilizando diferentes doses dos extratos e da cumarina. Para os extratos foram utilizadas doses de 100, 200 e 400 mg/kg e para a cumarina doses de 50, 75 e 100 mg/kg. Observou-se que as doses testadas apresentaram perfil semelhante, possibilitando a identificação de uma dose de escolha em concentração suficiente para produzir um efeito rápido e duradouro.

A injeção de carragenina (1 mg/pata) na região subplantar da pata esquerda traseira dos animais, induziu um edema de pata prolongado com pico máximo em 2 horas, caracterizado por inchaço e aumento da permeabilidade vascular local.

Os animais tratados com Mikania glomerata (400 mg/kg) apresentaram redução significativa do edema formado, 3 horas após a injeção do agente edematogênico, enquanto os animais tratados com Mikania laevigata (400 mg/kg) apresentaram essa mesma atividade já em 2 horas após a indução do edema, em relação ao controle (solução salina estéril 0,9%). Os animais tratados com cumarina (75 mg/kg) apresentaram redução significativa do edema formado, 2 horas após a injeção do agente edematogênico, em relação ao controle (óleo de milho) (Figura IV).

É interessante observar que os tratamentos avaliados promovem redução significativa do edema de pata em diferentes tempos, onde a M. laevigata destacou-se por iniciar essa atividade 1 hora antes que a M. glomerata.

Na Tabela II, podemos observar que o tratamento oral com os extratos e a cumarina, promoveram uma inibição progressiva do edema de pata formado, onde a Mikania glomerata reduziu o edema em 55,6% (n=5; p<,05), a Mikania laevigata em 70,4% (n=5; p<0,05) e a cumarina em 33,9% (n=5; p<0,05), no último intervalo de tempo medido, em relação aos respectivos controles.

A M. laevigata mostrou reduzir o edema em proporção significativamente (p<0,05) superior à M. glomerata, na última hora medida.

0 60 120 180 240 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 Controle M. glomerata M. laevigata *# *# # Tempo (min) E d e m a ( m L ) 0 60 120 180 240 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 Controle Cumarina * * * Tempo (min) E d e m a ( m L )

Figura IV. Efeito da administração oral de M. glomerata - 400 mg/kg, M. laevigata - 400 mg/kg (A) e cumarina - 75 mg/kg (B) sobre o edema de pata induzido pela injeção subplantar de carragenina (1 mg/pata). O edema foi expresso como o aumento do volume da pata (mL) comparado ao valor basal. Cada ponto representa a média ± E.P.M. de 5 animais por grupo. ANOVA de uma via, seguido pelo pós-teste de Bonferroni. p<0,05 comparado com o controle. ~ MG vs ML.

Tabela II. Efeito do tratamento oral com Mikania glomerata (400 mg/kg), Mikania

laevigata (400 mg/kg) e cumarina (75 mg/kg) nos intervalos de tempo medidos no

edema de pata induzido por carragenina.

Inibição (%)

Tratamento 1 h 2 h 3 h 4 h

M. glomerata 7,69 6,97 51,3* _55,6*

M. laevigata 7,69 27,9* _59,4* _70,4*

Cumarina 13,9 28,6* _31,1* _33,9*

Os resultados representam a porcentagem (%) de inibição do edema em relação ao controle, nos respectivos tempos medidos; (* _{p<0,05 comparado ao controle).}

*

~ A)

A participação dos extratos e da cumarina no edema de pata foi estudada utilizando outro agente flogístico, o composto 48/80 (3 µg/pata). Este agente promoveu um edema de pata prolongado com pico máximo em 30 minutos, caracterizado por inchaço e aumento da permeabilidade vascular local, sendo medido em tempos diferentes, mais precoces que os avaliados com carragenina.

Os animais tratados com Mikania glomerata (400 mg/kg) apresentaram atividade significativa na redução do edema formado em 90 minutos, enquanto os animais tratados com Mikania laevigata (400 mg/kg) reduziram essa mesma atividade já em 30 minutos, após a injeção de composto 48/80, em relação ao controle (solução salina estéril 0,9 %). Os animais tratados com cumarina (75 mg/kg), por sua vez, apresentaram redução significativa do edema formado, 60 minutos após a injeção do agente edematogênico, em relação ao controle (óleo de milho) (Figura V).

Os tratamentos avaliados apresentaram redução do edema de pata em diferentes tempos, assim como ocorreu utilizando-se carragenina. A M. laevigata apresenta redução do inchaço, 1 hora antes que a M. glomerata.

Na Tabela III, podemos observar que o tratamento oral com os extratos e a cumarina, também desencadearam uma inibição progressiva do edema de pata formado, onde a Mikania glomerata reduziu o edema em 56,3% (n=5; p<0,05), a

Mikania laevigata em 68,8% (n=5; p<0,05) e a cumarina em 40% (n=5; p<0,05) no