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Análise física e química da urina de Trichechus inunguis (Mammalia, Sirenia)

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(1)

Instituto Nacionáí de

Pesquisas da Amazônia - INPA

Universidade Federal do

Amazonas

- UFAM

I

Prosrama Intesrado de Pós-Graduação em Biolosia

I

Tropical e Recursos Naturais - PIPG BTRN

,\steirio da

^®9uisas

Análise física e química da urina dc Trichechus inunguis

(Mammalia,

Sircnia): Valorcs-refcrência para o pcixc-boi da Amazônia

Tatyanna Mariúcha dc Araújo Pantoja

(2)

UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS - UFAM

INSTITUTO NACIONAL

DE

PESQUISAS

DA

AMAZÔNIA

-

MPA

ANALISE física E QUÍMICA DA URINA DE Trichechus inunguis (MAMMALIA,

SIRENIA): VALORES-REFERÊNCIA

PARA O

PEIXE-BOI

DA

AMAZÔNIA.

[fliiÜÕTÊCfl

m m

TATYANNA MARIÚCHA DE ARAÚJO PANTOIA

MANAUS - AM

(3)

UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS - UFAM

INSTITUTO NACIONAL

DE

PESQUISAS

DA

AMAZÔNIA

-

INPA

ANALISE FÍSICA E QUÍMICA DA URINA DE Trichechus inunguis (MAMMALIA,

SIRENIA):

VALORES-REFERÊNCIA

PARA

O

PEIXE-BOI

DA

AMAZÔNIA.

JIBLIUm

TATYANNA MARIÚCHA DE ARAÚJO PANTOJA

ORIENTADOR: DR. FERNANDO CÉSAR WEBER ROSAS

Dissertação apresentada ao programa de

Pós-Graduação em Biologia Tropical e

Recursos Naturais do convênio

INPA/UFAM, como requisito para obtenção do título de mestre em CIÊNCIAS BIOLÓGICAS, curso de

Biologia de Água Doce e Pesca Interior.

Apoio: CNPq,

Projeto Peixe-boi -

Laboratório de Mamíferos Aquáticos / INPA e Fundação de

Medicina Tropical do Amazonas / FMT-AM

(4)

-1-FICHA CATALOGRAFICA

PI 98a Pantoja, Tatyanna Mariúcha de Araújo

Análise física e química da urina de Trichechus inunguis (Mammalia, Sirenia): Valores-referência para o peixe-boi da Amazônia / Tatyanna Mariúcha de Araújo Pantoja. - 2004.

125 f. : il. color.

Dissertação (mestrado)-INPA/UFAM, 2004.

1. Peixe-boi da Amazônia 2. Trichechus inunguis 3. Mammalia - Sirenia 4. Urinálise

5. Fisiologia 6. Medicina 7. Manejo. I. Título

CDD. 599.5509811

SINOPSE

O peixe-boi da Amazônia, Trichechus inunguis (Natterer, 1883) é um mamífero

aquático da Ordem Sirenia e família Trichechidae. É endêmico da Bacia Amazônica e é

classificado atualmente como espécie vulnerável. Visando ao estabelecimento de faixas de

normalidade de parâmetros urinários que pudessem auxiliar no monitoramento de saúde destes animais em cativeiro, foram realizadas urinálises física, química e sedimentológica em

12 machos e 9 fêmeas de peixe-boi da Amazônia de diferentes classes etárias. O uso de tiras

reativas mostrou-se útil para análises rotineiras, mesmo fomecendo resultados qualitativos.

Valores mínimos de glicose, bilirrubina, urobilinogênio, cetonas e proteínas foram

considerados corno o normal para a espécie, enquanto que os parâmetros sangue, nitrito e leucócitos necessitaram ser pesquisados mais acuradamente através da análise microscópica

do sedimento. A maioria dos exames apresentou pH 8,0 e densidade 1,005. Para os níveis de

glicose, uréia, creatinina, ácido úrico e amilase foram estipuladas faixas de normalidade

considerando-se as diferenças estatísticas observadas entre sexos e classes etárias. Os resultados dos parâmetros físicos coloração, aspecto e elementos do sedimento urinário foram registrados em tabelas que poderão servir de dados comparativos para futuras

pesquisas relativas á urinálise em espécies relacionadas.

Palavras-chave; 1. Peixe-boi da Amazônia 2. Trichechus inunguis 3. Mammalia Sirenia 4. Urinálise 5. Fisiologia 6. Medicina 7. Manejo.

(5)

-11 -EPÍGRAFE

1

I

"Tente mover o mundo - o

primeiro passo será mover a si

(6)

111 -DEDICATÓRIA

A meus pais. Sebastião Boanerges

de Araújo {in memorian) e Ana Ferreira de Araújo, que sempre se

esforçaram para me dar a melhor

(7)

- IV -SUMÁRIO i - FICHA CATALOGRÁFICA ii-EPÍGRAFE iii-DEDICATÓRIA V - AGRADECIMENTOS vi - LISTA DE FIGURAS vii — LISTA DE TABELAS viii — RESUMO

ix-ABSTRACT

1 -

INTRODUÇÃO

01

1.1 -

O

PEIXE-BOI

DA

AMAZÔNIA Trichechus inunguis

01

1.2-

ESTRUTURA

E

FUNÇÃO

DOS

RINS DE

MAMÍFEROS AQUÁTIÇOS

04

1.3- URINA

DE

MAMÍFEROS AQUÁTICOS

06

2

-

MATERIAL

E

MÉTODOS

08

2.1 - ANIMAIS UTILIZADOS NESTE ESTUDO 08

2.2- COLHEITA DA URINA 10

2.3 -

ANÁLISE QUÍMICA

11

2.4-ANÁLISE

FÍSICA

18

2.5 - ANÁLISE ESTATÍSTICA. 19 3 - RESULTADOS 20 3.1-PROTEÍNAS 20 3.2-CETONA S 21

3.3 -

UROBILINOGÊNIO

21

3.4 - BRIRRUBINA 22 3.5-p H 23 3.6 - SANGUE (Hemácias) 25

3.7

-

LEUCÓCrrOS

26

3 8 - NITRITO 26

3

9

-

DENSIDADE

ESPECÍFICA

27

(8)

4.17.3-BACTÉRIAS 73

! 4.17.4-CRISTAIS 74

I 4.17.5 - SANGUE (Hemácias) 76

4.17.6-HIFAS 76

5 - SÍNTESE DOS RESULTADOS E CONCLUSÕES 77

6-REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 79

(9)

- V

-AGRADECIMENTOS

Expresso meus sinceros agradecimentos a todas as pessoas com quem convivi nesses dois anos, pois aprendi muito com todas elas.

Primeiramente à minha grande amiga Sandra Beltrán-Pedreros, por ter me "obrigado" a fazer o mestrado, fazendo minha inscrição na última hora. Também à sua maravilhosa família (as pequenas Diana

e Manuella, e o divertido Rosse) que várias vezes me acolheram em sua casa.

Agradeço ao INPA e ao CNPq pela oportunidade e apoio durante o mestrado, e à FMT-AM,

que me

forneceu condições para a realização das análises químicas e de sedimento.

Ao meu orientador, Dr. Fernando César Weber Rosas, pela orientação e estímulo. Muito

obrigada, Fernando, principalmente pela compreensão e ajuda na reta final da realização deste trabalho.

A todos do Laboratório de Mamíferos Aquáticos: Dra. Vera Maria Ferreira da Silva, Anselmo,

Andréa, Carla, Carlinha, Yara, Nildon, S. Raimundo, Dagoberto, Gália Ely (pelas inúmeras caronas ao

Hospital Tropical), Márcia Munick

(minha amiga cor-de-rosa), Shakira, Antônia e todos os estagiários que

passaram pelo laboratório durante a realização de minha pesquisa. Agradecimentos especiais à Monica

Rejany, minha colega de curso,

junto á qual enfrentei vários obstáculos durante o mestrado, amiga com a

qual sei que poderei contar sempre; e principalmente aos tratadores Jeová, Daniel, Nazaré, Raimundo e

Marcelo, sem os quais não haveria conseguido coletar as amostras. A vocês, meu eterno agradecimento

pela forma descontraída, mas ao mesmo tempo responsável e dedicada de me ajudar nessa etapa

fundamental de meu trabalho. Sem vocês eu não teria conseguido.

Na FMT-AM, à toda equipe do laboratório de análises clínicas, que sempre me recebeu com

muito carinho e paciência: Dr. Felipe, Amarildo, Luciana, Érica, Dra. Helena, D. Conceição, D. Tetéia,

Vai, Beth, Leila, Isabel, Jander (Bolinha), e principalmente à Socorro Pontes (por ter me ensinado a

manusear o aparelho em que processei as amostras), Roosevelt, Dra Marilaine Martins (pelo gentil

empréstimo do microscópio e computador para fazer as fotos do sedimento), e finalmente à minha grande

amiga Ângela Maria Fernandes dos Santos, que foi a pessoa que mais me ajudou, fornecendo condições

para a realização das análises químicas e de sedimento. Muito obrigada, Ângela, por ter me concedido

tanto de seu tempo para que esse trabalho pudesse ser realizado.

No HEMOAM ao Dr. George Cordeiro, Dra. Eliana e Frank, durante a fase inicial de meu

trabalho. E na Prisma Técnica à Norma, Saulo, Thiago e principalmente S. Vanderley pelo carinho e

(10)

Fábio, Raquel, Leila, Janaína, Lucirene, Lene, Sandra e Júlio Daniel, exemplos de pessoas. Amizades as quais nunca esquecerei.

Aos professores do curso de Biologia de Água Doce e Pesca Interior, principalmente ao Dr.

Carlos Edward (pela "luz" com a estatística), e à professora do curso de Entomologia, Dra. Lucille Marilyn

May Kriger D'Amorin Antony (ou Baby), pela amizade e carinho.

A Elaine, Cida, S. Zezinho, Otaide, Carminha, que sempre me atenderam com muito carinho, atenção e paciência.

A todos os amigos da Fundação Alan Kardek, Tia Helena, Ruth, Jesus, Celso, Brota, Itamar, Gadir, Isa, Mauricéia, Raquel, Yolanda, Edmar, S. Okada, S. Sebastião, Antônia, Maira, às crianças do TEI

e especialmente à Sandra, Adilson, Zé Alberto, Dores, Carlos, Júlio Daniel, Artêmis e Samuel. E claro, aos amigos da Colônia: Braulino, Dadá, Paulina, Sabá, Maria, Edna, Vai, Cândida, Leticia, às crianças, e à

tninl. ^erida Tereza. Obrigada a todos vocês pela ajuda e ensinamentos espirituais.

Aos parentes aqui de Manaus: Tio Raimundo, Jô, Sissi, Renata, "S. Creysson", Rayana, Vilmar,

Vivi e principalmente ao meu primo preferido Alisson, pela ajuda na impressão do trabalho.

Aos meus amigos de Belém: Karla, Charle, Lu Alves, Wilton, Bianca, Tânia Barata, Gicelle,

^

Miriã, Ellen, Gleice, Clarisse, Raíiys, Elisa, Ronan, Bit, Ronildon, Rosyvaldo, Rosiane e Wendy e no

Japão (Tommy) que sempre se preocuparam e acreditaram em mim.

Ao Dr. Horácio Higuchi, não só pela ajuda com as refrências e com o abstract, mas

principalmente pela amizade, carinho, compreensão e apoio. Obrigada, Horácio, por sua leal amizade.

A minha família maravilhosa: Papai Bastião (jn memorian). Mamãe Ana, Sandro, Irecê, Gi,

Sandrinho, Suélen, Peleleco, Bambaim Baly, Itinha, Mimico, Carmen, Papai Maurício, Bruno, Igor, Vó Graci e Vô Antônio, Coca e Silvana, pela confiança, colo e orações. Vocês são meu porto seguro.

A minha família durante a redação da dissertação, D.

Lúcia, D.

Sania, Juciléia e Maciel, que me

proporcionaram todo o conforto e que acreditaram em mim.

Aos peixes-bois, por serem animais extraordinariamente dóceis, colaborando assim para a

execução de minha pesquisa. E

indescritível o apego que se toma por esses animais ao se trabalhar com

eles.

Aos espíritos benfeitores, e principalmente ao meu anjo da guarda, que me incutiram força de

vontade e coragem nos momentos em que mais precisei.

E principalmente A Deus, não somente por me ajudar sempre, mas por ter me concedido tudo

que citei acima.

(11)

- VI

-LISTA DE FIGURAS

Figura 01. Mapa da distribuição do peixe-boi da Amazônia (Fonte: F. Rosas (1994),

modificado por T. Pantoja) 02

Figura 02. Peixe-boi da Amazônia {Thchechus immguis Natterer, 1883) (Foto: Arquivo

LMA) 03

Figura 03. Alguns dos animais utilizados no estudo num dos tanques do Laboratório de

Mamíferos Aquáticos nas dependências do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia

(Foto: Fernando Rosas) 08

Figuras 04 A e B. A) Disposição do coletor de urina sob o orificio genital de fêmea de

Thchechus inunguis; B) Espera pela micção (Fotos: Gália Ely de Mattos) 11

Figura 05. Colheita de urina em macho de Thchechus inunguis estimulada por massagem

abdominal (Foto: José Anselmo D'Affonseca Neto) 11

Figura 06. Figura 06. Comparação das cores resultantes nas tiras reativas com a escala de

cores padrão que acompanha o kit URISC

AN™

12

Figura 07. Analisador químico Dimension AR ("Dade Behring") (Fonte:

www.diamonddiagnostics.com) 15

Figura 08. Células epiteliais descamativas encontradas em amostra de urina de fêmea de

Thchechus inunguis registradas como "freqüentes". Aumento de 400x 42

Figura 09. Piócitos encontrados em amostra de urina de macho de Thchechus inunguis

(3

piócitos por campo). Aumento de 400x

44

Figura 10. Bactérias encontradas em amostra de macho de Thchechus inunguis ("Bactéria"

"moderada"). Aumento de 400x 46

Figura 11. Cristais de fosfato amorfo encontrados em amostra de urina de femea de T.

inunguis registrados como

"raros". Aumento de 400x

48

Figura 12. Cristais de fosfato triplo encontrados em amostra de urina de macho de T.

inunguis registrados como raros. Aumento de 400x

48

Figura 13. Cristais de urato amorfo encontrados em amostra de urina de femea de T.

(12)

Figura 14. Cristais de oxalato de cálcio encontrados em amostra de urina de T. inungitis

registrados como "freqüentes". Aumento de 400x 49

Figura 15. Hemácias encontradas em amostra de urina de macho de Trichechus immguis.

Aumento de 400x 53

Figura 16. Hifas encontradas em amostra de urina de macho de Trichechus inungiiis.

(13)

- vil

-LISTA DE TABELAS

Tabela 01. Peixes-bois amostrados discriminados por sexo e classe etária, e suas respectivas

médias de peso entre agosto de 2003 e janeiro de 2004 09

Tabela 02. Itens alimentares consumidos pelos peixes-bois no período de maio de 2003 a

fevereiro de 2004 10

Tabela 03. Pesquisa qualitativa de proteínas por tiras reativas nas amostras de urina de T.

inunguis no período do experimento 20

Tabela 04. Pesquisa qualitativa de cetonas por tiras reativas nas amostras de urina de T.

inunguis no período do experimento 21

Tabela 05. Pesquisa qualitativa de urobilinogênio por tiras reativas nas amostras de urina de

T. inunguis no período do experimento 22

Tabela 06. Pesquisa qualitativa de bilirrubina por tiras reativas nas amostras de urina de T.

inunguis no período do experimento 23

Tabela 07. Valores de pH medidos por tiras reativas nas amostras de urina de T. inunguis no

período do experimento 24

Tabela 08. Detecção qualitativa de sangue (hemácias) por tiras reativas nas amostras de

urina de T. inunguis no período do experimento 25

Tabela 09. Detecção qualitativa de leucócitos por tiras reativas nas amostras de urina de T.

inunguis no período do experimento 26

Tabela 10. Detecção qualitativa de nitrito por tiras reativas nas amostras de urina de T.

inunguis no período do experimento

27

Tabela 11. Densidade específica medida qualitativamente por tiras reativas nas amostras de

urina de T. inunguis no período do experimento

28

Tabela 12. Detecção qualitativa de glicose por tiras reativas nas amostras de urina de T.

inunguis no período do experimento

29

Tabela 13. Médias (med), desvios padrão (dp) e amplitudes (min-max) dos níveis de glicose

na urina de T. inunguis medidos pelo analisador químico "Dimension AR" ("Dade Behring")

(14)

Tabela 14. Intervalo de confiança para os níveis de glicose medidos pelo analisador químico

"Dimension ("Dade Behring") na urina de T. immguis. Onde: n= número de amostras; "-95% e +95%"= intervalo de confiança; min= valor mínimo; max= valor máximo; med=

média e dp= desvio padrão 31

Tabela 15. Médias (med), desvios padrão (dp) e amplitudes (min-max) dos níveis de uréia

na urina de T. inunguis medidos pelo analisador químico "Dimensionai^" ("Dade Behring")

por sexo e classe etária durante os meses do experimento e ao fim do estudo 32

Tabela 16. Intervalo de confiança para os níveis de uréia medidos pelo analisador químico "Dimension AR'' ("Dade Behring") em machos filhotes lactentes, femeas filhotes lactentes,

juvenis, machos sub adultos, fêmeas sub adultas e adultos de T. immguis. Onde: n= número

de amostras; "-95% e +95%"= intervalo de confiança; min= valor mínimo; max= valor

máximo; med= média e dp= desvio padrão 33

Tabela 17. Médias (med), desvios padrão (dp) e amplitudes (min-max) dos níveis de creatinina na urina de T. inunguis medidos pelo analisador químico "Dimension A/í" ("Dade

Behring") por sexo e classe etária durante os meses do experimento e ao fim do estudo 34

Tabela 18. Intervalo de confiança para os níveis de creatinina medidos pelo analisador

químico "Dimension AR" ("Dade Behring") na urina de filhotes lactentes, sub adultos e adultos; machos juvenis e fêmeas juvenis de T. inunguis. Onde: n= número de amostras; "-95,000% e +"-95,000%"= intervalo de confiança; min= valor mínimo; max= valor máximo;

med= média e dp= desvio padrão 35

Tabela 19. Médias (med), desvios padrão (dp) e amplitudes (min-max) dos níveis de ácido úrico na urina de T. inunguis medidos pelo analisador químico "Dimension AR" ("Dade

Behring") por sexo e classe etária durante os meses do experimento e ao fim do estudo 36 Tabela 20. Intervalo de confiança para os níveis de ácido úrico medidos pelo analisador

químico "Dimension AR"

("Dade Behring") na urina de filhotes lactentes e adultos; machos

juvenis; fêmeas juvenis; machos sub adultos e fêmeas sub adultas de T. inunguis. Onde: n=

número de amostras; "-95% e +95%"= intervalo de confiança; min= valor mínimo; max=

valor máximo; med= média e dp= desvio padrão 37

Tabela 21. Médias (med), desvios padrão (dp) e amplitudes (min-max) dos níveis de amilase na urina de T. inunguis medidos pelo analisador químico "Dimension A/?" ("Dade Behring")

(15)

Tabela 22. Intervalo de confiança para os níveis de amilase na urina de filhotes lactentes e

^ de juvenis, sub adultos e adultos de T. inunguis. Onde: n= número de amostras; "-95% e +95%"= intervalo de confiança; min= valor mínimo; max= valor máximo; med= média e

dp= desvio padrão 39

Tabela 23. Determinação de coloração nas amostras de urina de T. imtnguis no período do

estudo. Onde Incol.=Incolor; Am. Claro=Amarelo claro; Am. Citrino=Amarelo citrino 40

Tabela 24. Determinação de aspecto nas amostras de urina de T. inunguis no período do

estudo 41

Tabela 25. Pesquisa microscópica de células epiteliais nas amostras de urina de T. inunguis

no período do estudo 43

Tabela 26. Pesquisa microscópica de piócitos nas amostras de urina de T. inunguis no

período do estudo

45

Tabela 27. Pesquisa microscópica de bactérias nas amostras de urina de T. inunguis no

período do estudo

47

Tabela 28. Pesquisa microscópica de cristais de fosfato amorfo nas amostras de urina de T.

inunguis no período do estudo 50

Tabela 29. Pesquisa microscópica de cristais de fosfato triplo nas amostras de urina de T.

inunguis no período do estudo 51

Tabela 30. Pesquisa microscópica de cristais de urato amorfo nas amostras de urina de T.

inunguis no período do estudo 52

Tabela 31. Pesquisa microscópica de cristais de oxalato de cálcio nas amostras de urina de

T. inunguis no período do estudo 52

Tabela 32. Pesquisa microscópica de sangue (hemácias) nas amostras de urina de T.

inunguis no período do estudo

54

Tabela 33- Pesquisa microscópica de bifas nas amostras de urina de T. inunguis no período

do experimento

55

Tabela 34. Valores de pH

urinário de alguns animais domésticos, de laboratório, do homem,

e do peixe-boi da Amazônia

59

Tabela 35. Cristais observados na urina do peixe-boi da Amazônia e pH urinários em que

(16)

- vu

-^ RESUMO

O peixe-boi da Amazônia, Trichechus inmguis (Natterer, 1883) é um mamífero aquático da

Ordem Sirenia e família Trichechidae. É endêmico da Bacia Amazônica e está classificado

atualmente como espécie vulnerável. Visando ao estabelecimento de faixas de normalidade de

parâmetros urinários que pudessem auxiliar no monitoramento de saúde destes animais em cativeiro,

foram realizadas urinálises física, química e sedimentológica em doze machos e nove fêmeas de

diferentes classes etárias. As colheitas foram realizadas uma vez por mês nos tanques, durante nove meses, após esvaziamento, dispondo-se recipientes de aço inoxidável sob o orifício genital das fêmeas e aplicando-se massagem abdominal nos machos para estimular a micção. O uso de tiras

reativas da marca URISCAN™ mostrou-se útil para análises rotineiras, mesmo fornecendo apenas

resultados qualitativos. Valores mínimos de glicose (<100 mg/dL), bilirrubina (<0,5 mg/dL), urobilinogênio (0,1 mg/dL), cetonas (<5 mg/dL) e proteínas (<10 mg/dL) registrados pelas tiras reativas foram considerados como o normal para a espécie, enquanto que os parâmetros sangue, nitrito e leucócitos necessitaram ser pesquisados mais acuradamente através da análise microscópica do sedimento. A maioria dos exames apresentou pH 8,0 e densidade 1,005. Utilizando

espectrofotometria colorimétrica foram estipuladas faixas de normalidade para os níveis de glicose,

uréia, creatinina, ácido úrico e amilase, considerando-se as diferenças estatísticas observadas entre

sexos e classes etárias, sendo: a) uma fabca para os níveis de glicose para a espécie (3,5 a 4,2 mg/dL);

b) seis faixas para os níveis de uréia (140,2 a 223,1 mg/dL para machos lactentes; 67,3 a 156,3

mg/dL para fêmeas lactentes; 168,5 a 223,8 mg/dL para juvenis; 124,9 a 176,6 mg/dL para machos

sub adultos; 71,3 a 131,3 mg/dL para fêmeas sub adultas e 129,0 a 173,6 mg/dL para adultos); c)três

faixas para os níveis de creatinina (12,3 a 15,4 mg/dL para filhotes lactentes, sub adultos e adultos;

12 5 a 22,1 mg/dL para machos juvenis e 19,8 a 31,1 mg/dL para fêmeas juvenis); d)

cinco faixas

para os níveis de ácido úrico (3,3 a 4,2 mg/dL para filhotes lactentes e adultos; 3,5 a 5,2 mg/dL para

machos

juvenis; 5,2 a 8,6 mg/dL para fêmeas

juvenis; 3,2 a 4,9 mg/dL para machos sub adultos e 1,7

a 3 1 mg/dL para fêmeas sub adultas); e e)

duas fabcas para os níveis de amilase (7,1 a 12,6 mg/dL

para filhotes lactentes e 4,2 a 5,5 mg/dL para juvenis, sub adultos e adultos). Os resultados dos

parâmetros físicos coloração, aspecto e elementos do sedimento urinário foram registrados em

tabelas que poderão servir de dados comparativos para futuras pesquisas relativas à urinálise em

(17)

- IX

-3 ABSTRACT

The Amazonian manatee, Trichechus immgitis (Natterer, 1883) is an aquatic mammal of

the Trichechidae Family, Order Sirenia. It is endemic to the Amazon Basin and is currently

classified as a vulnerable species. In order to establish normality ranges of urinary parameters to

help monitor the health of this species in captivity, physical, chemical and sedimentological

urinalyses were performed on twelve males and nine females of various age groups. Urine was collected once a month for nine months in the tanks just after being drained, by placing stainless steel containers under the genital slit of females and applying abdominal massages to males in

order to stimulate micturation. The use of dip strips (URISCAN™)

was useflil for routine

analyses, despite only providing qualitativo results. Minimum values ofglucose (<100 mg/dL), bilirubin (<0,5 mg/dL), urobilinogen (0,1 mg/dL), ketones (<5 mg/dL) and proteins (<10 mg/dL)

were considered normal for the species, while the blood, nitrites and leucocytes parameters had to be more accurately surveyed by means of microscopic sediment analysis. The pH and specifíc

gravity values observed in most of the results were 8.0 and 1.005, respectively. Taking into consideration statistical differences observed between the sexes and between age groups, normality ranges were stipulated for glucose, urea, creatinine, uric acid and amylase leveis using colorimetric spectrophotometiy, as follows: (a) a single range for glucose leveis for ali groups (3.5-4.2 mg/dL); (b) six ranges for urea leveis (140.2-223.1 mg/dL for lactating males; 67.3-156.3 mg/dL for lactating females; 168.5-223.8 mg/dL forjuveniles ofboth sexes; 124.9-176.6

mg/dL for subadult males; 71.3-131.3 mg/dL for subadult females; and 129.0-173.6 mg/dL for

adults ofboth sexes); (c) three ranges for creatinine leveis (12.3-15.4 mg/dL for lactating cubs,

subadults and adults ofboth sexes; 12.5-22.1 mg/dL

for juvenile males and 19.8-31.1 mg/dL

for

juvenile females); (d) five ranges for uric acid leveis (3.3-4.2 mg/dL for lactating cubs and

adults of both sexes; 3.5-5.2 for juvenile males; 5.2-8.6 g/dL for juvenile females; 3.2-4.9

mg/dL for subadult males; and 1.7-3.1 mg/dL for subadult females); and (e) two ranges for

amylase leveis (7.1-12.6 mg/dL for lactating cubs ofboth sexes and 4.2-5.5 mg/dL forjuveniles,

subadults and adults of both sexes). Results of physical parameters such as coloration,

appeaiance and elements of urinary sediment were recorded in tables and may be used as

(18)

d

<>

1 - INTRODUÇÃO

1.1-0

PEIXE-BOI

DA

AMAZÔNIA Trichechus imnguis

Os peixes-bois são mamíferos aquáticos, pertencentes à ordem Sirenia, a qual inclui

as famílias Dugongidae e Trichechidae. A primeira está representada pelo dugongo {Diigong

dugon Muller, 1776) como único representante vivo (Marsh et al., 1986). A

segunda, por sua

vez, compreende representantes de três espécies: Trichechus senegalensis Link, 1795 (o

peixe-boi africano); Trichechus manatus Linnaeus, 1758 (o peixe-boi marinho) e Trichechus

zwwwgww Natterer, 1883

(o peixe-boi da Amazônia)

(Husar, 1977; 1978a; b).

O peixe boi da Amazônia é o único sirênio exclusivamente dulcicola (Best, 1984a;

Rosas, 1994). É endêmico da Bacia Amazônica, ocorrendo desde a Ilha de Marajó até as

cabeceiras dos rios da Colômbia, Peru e Equador

(Domning, 1981; Best, 1984a; Rosas, 1991;

1994), sendo rara sua presença nas partes mais altas dos rios Tocantins, Xingu e Tapajós

(Bertram &

Bertram, 1973; Domning, 1981) (Figura 01). Dois fatores que decisivamente

restringem sua ocorrência são a turbulência das águas e a pouca disponibilidade de vegetação

aquática (Best 1984a; Rosas, 1991; 1994).

Através da análise de aminoácidos da proteína aA do cristalino dos olhos destes

animais, pôde-se confirmar sua origem monofilética com as ordens Hyracoidea (hyraxes),

Proboscidea (elefantes) e Tubulidentata ("aardvark") (De Jong &

Zweers, 1980). Dos

mamíferos placentários atuais, os sirênios foram os primeiros a adaptarem-se ao meio

aquático e, entre os mamíferos deste meio, os únicos a praticarem a herbivoria (Best, 1984b).

Podendo atingir até 3m de comprimento total e pesar até 500kg (Ayres &

Best,

1979; Rosas, 1991; 1994), este animal é considerado o menor dos sirênios (Best &

Silva,

1979; Caldwell &

Caldwell, 1985; Rosas, 1991;1994) (Figura 02). A coloração corporal é

geralmente cinza escura (Husar, 1977; Ayres &

Best, 1979; Rosas, 1991; 1994) podendo

variar desta para o negro (Rosas, 1994). Uma das características inerentes à espécie é a

presença de manchas brancas na região ventral (Husar, 1977; Ronald et ai, 1978; Ayres &

Best, 1979; Caldwell &

Caldwell, 1985; Rosas, 1991; 1994), embora possam eventualmente

estar ausentes em alguns indivíduos (Rosas, 1994). Finos pêlos cobrem esparsamente seu

corpo, e grossos pêlos (vibrissas) dispõem-se sobre seus lábios superior e inferior (Husar,

1977 Marshall et ai, 2003). Possuem duas mamas localizadas, cada uma, sob as axilas

(Husar 1977; Rodrigues, 2002) o que pode ter originado o nome Sirenia para a ordem desses

(19)

ò

o fato de suas nadadeiras serem desprovidas de unhas (Husar, 1977; Rosas, 1991; 1994)

inspirou seu nome especifico ("inunguis", do latim, significa "sem unhas") (Rosas, 1991;

1994). 7 \ l VENEZUELA f\ f f • [SUR-W COLOMBIA •CUí\D0f^"7r""^ BRAS I L BOUVIA -fARAGUA UFOJGUA ARGENTINA

Figura 01. Mapa da distribuição do peixe-boi da Amazônia (Fonte: F. Rosas

(1994),

(20)

d

Figura 02. Peixe-boi da Amazônia {Trichechus inunguis Natterer, 1883) (Foto: Arquivo

LMA).

Historicamente, o peixe boi já sofreu forte pressão de caça, constituindo alimento

para populações indígenas e ribeirinhas da região amazônica (Best, 1984a; Rosas &

Pimentel,

2001). Tal impacto aumentou com o início da colonização do Brasil pelos portugueses,

quando sua carne passou a ser intensamente comercializada (Domning, 1982). Mais tarde,

por volta dos anos 40, seu couro passou a ser usado como matéria-prima para a confecção de

artigos industriais, tais como correias e mangueiras (Best, 1984a). O

consumo de sua carne

ainda é praticado pela população ribeirinha local (Rosas, 1994), no entanto em escala bem

menor que no passado, embora não deixe de constituir um dos principais fatores de risco à

integridade das populações naturais deste animal, que é protegido por lei no Brasil desde os

anos 60 (Best, 1984a). Atualmente o pebce-boi da Amazônia possui status de espécie

vulnerável segundo o livro vermelho de espécies ameaçadas da lUCN

(Hilton-Taylor, 2000),

Ao contrário de outros mamíferos aquáticos, sua capacidade de captação de oxigênio

(O2) pelo sangue é baixa, o que limita a duração de seu mergulho (Farmer et ai, 1978). No

entanto, devido ao fato de sua taxa metabòlica ser de apenas 36% da de outros mamíferos

placentários de porte semelhante (Gallivan &

Best, 1981), sua capacidade de mergulho pode

chegar a vinte minutos em situações de ameaça à sua integridade (Gallivan &

Best, 1981;

(21)

<>

períodos de jejum prolongado, quando há pouca disponibilidade de vegetação aquática, principal item de sua dieta (Best, 1983; Gallivan & Best, 1986; Junk & Silva, 1997).

De acordo com Rodrigues (2002) a fêmea de Trichechus imnguis atinge maturidade sexual após passar por vários ciclos estrais inférteis, quando então pode engravidar. A gestação dura cerca de 12 meses (Nascimento ei ai, 2002), dando origem geralmente a um único filhote que pode depender da mãe por mais dois anos (Rosas, 1994), já tendo sido observado em cativeiro um caso em que o filhote foi amamentado por sua mãe por 25 meses

(Silva et al., 2000). Sua reprodução é fortemente influenciada pelo ciclo hidrològico (Best,

1982b; Rosas, 1994) coincidindo, a maioria dos nascimentos, com o inicio da enchente,

quando há aumento na produção de vegetação aquática, que suprirá a demanda energética necessária à fêmea no fim da gestação e no início da lactação (Best, 1982b, Rosas, 1991;

1994; Silva, 1996).

Pesquisas com a espécie abrangem estudos sobre sua distribuição (Domning, 1981; Best & Silva, 1983), anatomia (Beddard, 1897; Husar, 1977; Domming, 1986; Rodrigues,

2002), ecologia (Best, 1981; 1982b; 1983; Sousa-Lima, 1999), fisiologia (Farmer etal., 1978; Ronald, ei al, 1978; Gallivan et al, 1983; Gallivan & Best, 1986; Colares, 1991, Rosas etal,

1999, Colares et al, 2000), biologia (Colares et al, 1990; Rosas, 1991; 1994); nutrição

(Rodriguez-Chacón, 2001); genética (Cantanhede, 2002), e comportamento (Best, 1981;

1983; Castelblanco-Martinez, 2000). Neste último tópico, os estudos na natureza são bastante

limitados pela turbidez das águas, que reduz o campo de observação direta dos animais, bem

como o comportamento críptico da espécie e sua coloração, que tomam as observações destes animais ainda mais casuais (Best, 1984a; Rosas, 1994; Castelblanco-Martinez, 2000; Rosas & Pimentel, 2001). Devido a todos esses fatores, a telemetría constitui excelente método de

estudo de populações naturais de peixes-bois, já que, através dela pode-se conhecer os

habitats preferenciais desses animais, permitindo assim a conservação de suas áreas de uso

(Rosas &

Pimentel, 2001).

1.2 -

ESTRUTURA

E

FUNÇÃO

DOS

RINS DE

MAMÍFEROS AQUÁTICOS

Para manutenção da concentração e volume apropriados dos fluidos corporais que

banham as células, os mamíferos aquáticos dispõem de um delicado sistema responsável pelo

balanço entre a ingestão e excreção de água. Este processo, denominado osmorregulação

(22)

fazem a excreção do excesso de minerais na urina concomitantemente à conservação de água para evitar desidratação. Além disso, mantêm os fluidos corporais em homeostase osmótica mesmo durante o mergulho, quando há redução de sua função cardiovascular, comprometendo vários processos fisiológicos (Perrin et ai, 2002).

Os rins drenam excretas unicamente do sangue (Storer et ai, 2000) e são compostos

por milhões de unidades funcionais fundamentais, os néffons, que são responsáveis pela

transformação do filtrado plasmático sangüíneo em urina, a qual possui toxinas metabòlicas e excesso de minerais a serem excretados do corpo (Kantek Garcia-Navarro, 1996; Perrin et al, 2002). O principal produto de excreção nitrogenado excretado pelos rins dos mamíferos é a uréia, sendo os animais pertencentes à classe Mammalia considerados ureotélicos (Storer et al, 2000).

Os rins dos mamíferos constituem órgãos pares, com formato semelhante a um grão

de feijão, situados junto à parede dorsal do abdome. De sua margem côncava mais interna sai o hilo renal, por onde saem os ureteres, estes originados na pelve renal, que é um espaço oco comum formado pela união dos cálices renais (ápices das pirâmides renais) (Kantek Garcia-Navarro, 1996). Seccionando-se longitudinalmente um rim pode-se evidenciar uma camada

mais externa (córtex) que envolve uma mais interna (medula) (Gaskin, 1972; Storer et ai,

2000; Kantek Garcia-Navarro, 1996; Stanton & Koeppen, 1998; Perrin et al, 2002).

Em mamíferos marinhos, os rins são caracterizados por serem reniculados

(multilobulados), nos quais cada renículo (lobo) possui todos os componentes de um rim

metanéfnco (Dierauf & Gulland, 2001). Cada renículo funciona como um rim em miniatura,

com córtex, medula e suprimento sangüíneo próprios (Slijper, 1984; Hoezel, 2002). Tal estrutura renal aumenta a capacidade de retenção de água, já que os mamíferos marinhos são

hiposmóticos em relação ao meio. O

número de renículos varia de centenas a milhares e nem

todos estão sempre em ação, a não ser que haja demanda excessiva de função renal (Harrison

&

King, 1980). O

número ativo varia de acordo com as condições ambientais, sendo maior

em espécies marinhas e menor em estuarinas.

Peixes-bois são encontrados tanto em águas doces quanto marinhas, e apesar de não

possuírem rins lobulados, apresentam estruturas renais que são indicativas de habilidade em

conservar água via concentração de urina (Maluf, 1989). Sperber (1944)

descreveu os rins de

T. manatus e T. senegalensis como intermediários entre rins com córtex contínuo e medula

dividida, e os rins reniculados. Nestas espécies, os rins mais pareceriam com rins reniculados,

com 6 a 11 papilas medulares. Maluf

(1989) considerou-os com córtex contínuo envolvendo

(23)

adjacentes, produzindo a aparência de lobulação em adultos. Para Harrison & King (1980) a indicação de lobulação é unicamente superficial, e Petit (1924a apud Ronald et al., 1978) observou, num rim de T. senegalensis, lobulação interna distinta, caracterizada por invasões de substância cortical circundando os cálices. Em adultos o córtex corresponde a

aproximadamente 57% da massa renal, no entanto, em filhotes pode chegar a 68%, já a

medula constitui cerca de 43% da massa renal (Maluf, 1989).

Os rins dos sirênios dispõem-se sobre a superfície tendinosa do diafragma (Dierauf & Gulland, 2001), com sua extremidade posterior alcançando as últimas costelas (Murie,

1872). Beddard (1897) observou, em T. inunguis, hilo localizado lateralmente. Murie (1872)

descreveu o hilo de Trichechus spp. como superficial. Os ureteres possuem diâmetro uniforme, e em fêmeas, eles prendem-se ao redor do como uterino, passam por baixo da artéria hipogástrica e, por fim, entram numa pequena e semiglobular bexiga (Murie, 1872).

1.3 -

URINA

DE

MAMÍFEROS AQUÁTICOS

Kooyman & Drabek (1968) estudaram a composição do sangue, leite e urina em

Leptonychotes weddelli (foca de Weddell) com o objetivo de verificar se tais fluidos exibiam compensação por perda de água ocorrida durante a lactação. Observaram que mesmo

perdendo muita água durante a lactação, as fêmeas não sofrem desidratação a ponto de haver

um aumento notável na concentração de sua urina. Schmidt-Nielsen et ai. (1959) realizaram

experimentos para avaliar os efeitos que a alimentação e o mergulho causam sobre a função

renal em Phoca vitulina L. (foca do porto). Observaram que o transporte ativo de uréia não é

muito pronunciado em seu tecido renal, o que conferiria a essa espécie pouca habilidade de

concentrar uréia.

Smith (1936) registrou a uréia como produto nitrogenado predominante na urina,

notando também a presença de quantidades consideráveis de amônia, creatinina e creatina ao

realizar observações sobre a taxa de formação de urina, de excreção de fosfato, cloreto,

sulfato, cálcio e magnésio em Phoca vitulina. Bentley (1963)

publicou uma nota descrevendo

a composição urinária de Megaptera nodosa (baleia corcunda) em

jejum por pelo menos três

meses, incluindo valores de sódio, potássio e uréia, além de avaliar a concentração urinária.

Le Bas (2003) determinou o pH urinário, os títulos plasmáticos e urinários de

(24)

\

Para avaliar o efeito do jejum e da lactação sobre a osmolaridade, eletrólitos, zinco,

proteína, uréia, ácido úrico, fosfatase alcalina e ácido ascórbico, Schweigert (1993) analisou

amostras de sangue e urina de Halichoerus grypus (foca cinzenta) durante a época de reprodução, observando baixos níveis de uréia no plasma e na urina durante o jejum,

indicando o baixo catabolismo protéico neste período.

Para o aumento do conhecimento fisiológico, a pesquisa do fluido urinário pode ser útil na determinação do estado de saúde de animais em cativeiro. Neste contexto, a urinálise

vem a ser ferramenta útil para a realização deste estudo, que procura viabilizar dados que

ajudem no monitoramento de saúde, ampliação de conhecimentos sobre a fisiologia da espécie, e embasamento científico que possa servir de subsídio para futuras pesquisas fisiológicas com o peixe-boi da Amazônia.

Há poucos dados sobre as características, colheita e produção de urina em

mamíferos aquáticos (Bossart et al, 2001) e quase nada se sabe sobre a composição urinária do peixe-boi da Amazônia. As únicas informações sobre a urina da espécie são provenientes de análises conduzidas por Best (dados não publicados) há mais de vinte anos com sete

exemplares de T. inunguis cativos no Laboratório de Mamíferos Aquáticos (LMA) do

Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA). À guisa de dar continuidade a esta

pesquisa fundamental para o acompanhamento do quadro de saúde destes animais, este

trabalho se propõe à determinação de faixas de normalidade para os parâmetros urinários analisados na urina de peixes-bois da Amazônia em cativeiro, através de urinálise física,

(25)

; S

02 - MATERIAL E MÉTODOS

2.1- Animais utilizados neste estudo

Para o estudo foram utilizados peixes-bois cativos em tanques do Laboratório de Mamíferos Aquáticos (LMA) do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA) (Figura 03). A caracterização da urina foi feita utilizando somente peixes-bois que não

apresentassem nenhuma patologia aparente, com o propósito de estabelecer uma faixa de normalidade de seus parâmetros urinários.

Figura 03. Alguns dos animais utilizados no estudo num dos tanques do Laboratório de

Mamíferos Aquáticos nas dependências do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia

(Foto; Fernando Rosas).

O desenho experimental constou da urinálise de 21 animais, sendo 12 machos e 9

fêmeas, separados nas seguintes classes etárias: Filhotes lactentes (O a 2

anos). Jovens (3 a 5

anos), Sub adultos

(6 a 9

anos) e Adultos

(mms

de 10 anos). A

tabela 01 discrimina os

peixes-bois amostrados por sexo e classe etária, e apresenta suas respectivas médias de peso no

(26)

Tabela 01. Peixes-bois amostrados discriminados por sexo e classe etária, e suas respectivas médias de peso entre agosto de 2003 e janeiro de 2004.

^

Sexo

Classe Etária Nome Peso (kg)

Filhotes lactentes Nanica 59,2

(0-2 anos) Barreirinha 76,6 Urucará 78,3 Juvenis Manaòs 90,8 Fêmeas (3-5 anos) Adana Baré 91,4 102,5 Sub adulto (6-9 anos) Cunhataí 188,5 Adultos Tukano 276,3

(mais de 10 anos) Gambá 339,3

Filhotes lactentes Piraí 36,6

(0-2 anos) Tua 98,2 Juvenis (3-5 anos) Tapajós Xibò Mapixari 71,4 126,5 131,0 Machos Sub adultos Erê Guarany 107,0 129,8 (6-9 anos) Anamã Puru 132,5 140,8 Adultos (mais de 10 anos) Arandu Tupy Yanomama 209,3 216,0 346,0

A Tabela 02 lista os itens aiimentares consumidos pelos peixes-bois entre maio de

2003 (um mês antes do inicio das colheitas de urina) e fevereiro de 2004 (último mês da

amostragem). Deve-se salientar que tais itens também constaram da dieta dos filhotes

lactentes, além da dieta láctea (Nanica, Barreirinha e Piraí) ou leité materno (Tua), e que as

(27)

para juvenis, quando foram transferidas das piscinas de filhotes para um dos tanques maiores

finalizando assim seu período de amamentação.

Tabela 02. Itens alimentares consumidos pelos peixes-bois no período de maio de 2003 a

fevereiro de 2004.

Mês Itens alimentares

MAI/03 Abóbora, alface, beterraba, capim-colônia, cenoura, feijão, maxixe, pepino, repolho,

tomate

JUN/03 Beterraba, capim-colônia, cará, cenoura, feijão, maxixe, muriru pajé, pepino, repolho,

tomate

JUL/03 Abóbora, beterraba, capim-colônia, cenoura, feijão, maxbce, pepino, repolho, tomate AGO/03 Abóbora, alface, capim-colônia, cenoura, maxixe, muriru pajé, pepino, repolho, tomate

SET/03 Abóbora, alface, capim-colônia, cenoura, feijão, maxixe, muriru pajé, pepino, repolho,

tomate

OUT/03 Alface, batata, beterraba, capim-colônia, feijão, maria-mole, maxbce, muriru pajé,

pepino, repolho, tomate

NOV/03 Abóbora, alface, beterraba, capim-colônia, feijão, maxixe, muriru pajé, pepino,

repolho, tomate

DEZ/03 Alface, beterraba, capim-colônia, feijão, maxixe, pepino, repolho, tomate

JAN/04 Abóbora, alface, beterraba, capim-colônia, feijão, maxixe, pepino, repolho, tomate

FEV/04 Abóbora, alface, beterraba, capim-colônia, couve, feijão, maxixe, pepino, repolho,

tomate

2.2 - Colheita da urina

A colheita de urina foi realizada uma vez por mês nos tanques, após esvaziamento,

com auxílio de recipientes de aço inoxidável. Os mesmos foram dispostos sob o orifício

genital das fêmeas e aguardava-se a micção (Figuras 04 A e B). No caso dos machos, estes

foram mantidos de lado e realizada massagem abdominal para estimular a micção (Bossart et

ai, 2001)

(Figura 05). Somente quando não foi possível se coletar por meio de massagem é

que se dispunha o recipiente sob o orifício genital dos machos, aguardando a micção, de

maneira análoga ao procedimento realizado com as fêmeas. A retirada dos recipientes era

feita cuidadosamente para que não houvesse extravasamento de amostra, evitando assim seu

(28)

•>

»

Figuras 04 A e B. A) Disposição do coletor de urina sob o orifício genital de femea de Trichechus inungvis; B) Espera pela micção (Fotos: Gália Ely de Mattos).

Figura 05. Colheita de urina em macho de Trichechus inunguis estimulada por massagem

abdominal (Foto: José Anselmo D'AíFonseca Neto).

2.3 - Análise química

A análise química utilizando-se tiras reativas (URISCAN™)

foi realizada logo após

a colheita de cada amostra. As tiras consistem em pequenos quadrados de papel absorvente,

presos a uma tira de plástico, e impregnados com substâncias químicas que, em contacto com

a urina produzem alteração cromática (Strasinger, 1996). Para a realização das análises

apenas uma tira por vez foi retirada, com o cuidado de segurá-la pela "tira de plástico" para

que não houvesse interferência nos reagentes pelo contacto com a pele. O recipiente, após a

retirada de cada tira, foi imediatamente tampado para que as tiras restantes não sofressem

alterações em seus reagentes pela exposição prolongada à umidade do ar. A tira foi

(29)

d

mergulhada na urina fresca por cerca de dois segundos, e depois passada lateralmente sobre papel absorvente para a retirada do excesso de urina. Após cento e vinte segundos (para leucòcitos) e sessenta segundos (para os demais parâmetros), foi feita a comparação das cores resultantes na tira com a escala de cores padrão fornecida juntamente com o kit (Figura 06) e anotados os resultados em formulário (Anexo 01).

spi ■ ■ ■ ■■

- f *

maamm

Figura 06. Comparação das cores resultantes nas tiras reativas com a escala de cores padrão

que acompanha o kit URISCAN^'^.

Os parâmetros analisados pelas tiras reativas foram; proteínas, cetonas, urobilinogênio, bilirrubina pH, sangue (hemácias), leucòcitos, nitrito, densidade específica

(que na verdade é considerada um parâmetro físico) e glicose. Os princípios químicos das

reações na tiras reativas para cada parâmetro foram os seguintes:

Proteínas

O

teste é baseado na mudança de cor do indicador tetrabromofenol azul na presença

de proteína. A reação positiva é indicada pela mudança de cor do amarelo para o verde. A

sensibilidade para o teste de proteínas é de 10 a 1000 mg/dL

(Bula URISCAN^

Urine Strip).

Cetonas

O teste é baseado no desenvolvimento de mudanças de cor variando do rosa claro

para uma leitura negativa ao marron quando o ácido acetoacético (acetona físiológica) reage

com o nitroprussideo. A sensibilidade é de 5 a 100 mg/dL

(Bula URISCAN™ Urine Strip).

(30)

Urobilínogênío

reação de Erlich

Urobílinogênio + p-dímetílaminobenzaldeído ^ condensação

meio ácido

O teste é baseado na reação de Erlich, na qual o para-dimetilaminobenzaldeído reage

com o urobílinogênio. As cores variam do bege, passando pelo rosa claro ao rosa escuro. A

sensibilidade é de 0,1 a 12 mg/dL

(Bula URISCAN™ Urine Strip).

'A

Bilirrubina

reação de acoplamento

Bilirrubina + composto diazônio ►

meio ácido

azocorante

O teste é baseado no acoplamento da bilirrubina com a dicloroanilina diazotada num

meio extremamente ácido, resultando numa cor que pode conter várias tonalidades de rosa ao

violeta. A sensibilidade é de 0,5 a 3,0 mg/dL (Bula URISCAN™ Urine Strip).

pH

Este teste é baseado num princípio indicador duplo que resulta numa extensa faixa

de cores que varia do laranja, passando pelo amarelo e verde ao azul. A sensibilidade

compreende os valores de 5,0 a 9,0 (Bula URISCAN™ Urine Strip).

Sangue (hemácías)

Heme

H2O2 + cromogênio cromogênio oxidado + H2O

Atividade da Peroxídase (colorido)

O teste é baseado na atividade pseudo-peroxidativa da hemoglobina, a qual catalisa a

reação do hiperóxido de cumena e orto-toluidina. A cor resultante varia do amarelo passando

pelo verde ao azul escuro. A aparência de manchas verdes na área reagente indica a presença

(31)

A

7) ' s

de eritrócitos intactos na urina. Este teste tem a sensibilidade de 10 a 250 RBCV|iL(Bula

URISCAN™ Urine Strip).

Leucócitos

esterase (WBC) composto de díazônío

substrato éster ► substrato - álcool ^ corante violeta

O teste se baseia na formação de cor, que varia do bege (leituras negativas) ao róseo.

Esta última ocorre com a liberação de esterase de cloroacetato de naflol AS-D ligada a uma ligação éster, por meio da ação hidrolítica da esterase, seguida de um acoplamento com sal de diazônio, de modo a formar uma azotintura colorida. Este teste tem a sensibilidade de 25 a

500 WBC^/nL. (Bula URISCAN™ Urine Strip).

Nitrito

Nitrito + ácido p-arsanflico

► composto de diazônio

► azocorante

reação de acoplamento

O teste depende da conversão do nitrato (derivado da dieta) ao nitrito pela ação de

bactérias gram-negativas na urina. No pH ácido da área reagente, o nitrito na urina reage com

o ácido para-arsanilico para formar um composto diazônio. Este, por sua vez, acopla-se com

a N-l-Naftiletileno-diamina dihidroclorida produzindo uma coloração rosa indicando a

presença de nitrito na amostra de urina (Bula URISCAN™ Urine Strip).

Densidade específica

O teste é baseado na mudança de pH pela troca do certos íons poliméricos em

relação à concentração iônica. Na presença do indicador azul de bromotimol as cores variam

do azul esverdeado em urinas com baixa concentração iônica, passando pelo verde e seus

• RBC = do inglês, Red blood cells (células vermelhas do sangue, hemácias)

(32)

tons até o amarelo em urinas com concentração iônica crescentes. A sensibilidade é de 1,000

a 1,030 (Bula UIUSCAN™ Urine Strip).

Glicose

glicose oxidase

glicose + O2 ► ácido glucônico + H2O2

H2O2 + cromogênio (2 r)

peroxidase

H2O2 + cromogênio oxidado ( )

Este teste é baseado numa reação enzimática seqüencial dupla. Uma enzima, a

glicose oxidase, cataliza a formação do ácido glucônico e peróxido de hidrogênio pela

oxidação da glicose. A segunda enzima, a peroxidase, cataliza o peróxido de hidrogênio por meio do cromogêneo de iodato de potássio. O nível de oxidação do cromogêneo determina a cor a ser observada, que varia entre o azul, passando pelo verde e seus tons até o marrom. A

sensibilidade é de 100 a 2000 □ mg/dL (Bula URISCAN™ Urine Strip).

Além da utilização das tiras reativas URISCAN™, utilizou-se também

espectrofotometria colorimétrica por meio do analisador químico 'Uimension AR (Dade

Behring)" (Figura 07), disponibilizado pela Fundação de Medicina Tropical do Amazonas

(FMT/AM) para determinar os teores de glicose, uréia, creatinina, ácido úrico e amilase na

urina dos peixes-bois.

Figura 07, Analisador químico Dimension AR ("Dade Behring") (Fonte:

www. diamonddiagnostics. com).

(33)

As amostras de urina foram centrifugadas a 3000 RPM por 5 minutos e então

colocadas no analisador químico que, por meio de cartuchos de reagentes 'T)imension® Dade

Behring" processou as amostras, calculou os resultados e os imprimiu automaticamente. Os princípios químicos dos cartuchos para cada parâmetro foram os seguintes:

Glicose

HK

glicose + ATP —^ glicose-6-fosfato + ADP MG^

G-6-PHD

glicose-6-fosfato + NADP ^ fosfogluconolactone + NADPH

A hexoquinase (HK) cataliza a fosforilação da glicose pela adenosina-5-trifosfato

(AT?)

a glicose-6-fosfato, que entãò se oxida a 6-fosfogluconolactona pela

glicose-6-fosfato-desidrogenase (G-6PDH) com simultânea redução do fosfato de dinucleotídeo nicotinamida-adenina (NADP). Um mol de NADP reduz-se a um mol de NADPH por cada mol de glicose

presente. A absorbância devida ao NADPH

(e a conseqüente concentração de glicose) é

medida utilizando uma técnica bicromática de ponto final (340 e 383 nm). O analisador

calculou e imprimiu automaticamente a concentração de glicose em mg/dL

(Bula do cartucho

de reagente

'Dimension® Dade Behring" para glicose).

Uréia

urease

uréia + H2O ^ 2NH3 + CO2

GLDH

NH3 + a-KG + NADH ► L-glutamato + NAD

A enzima urease hidrolisa especificamente a uréia em amoníaco e anidrido

carbônico. O amoníaco é então utilizado pela enzima glutamato desidrogenase (GLDH) para

a formação de aminas de redução de a-cetoglutarato (a-KG) com oxidação concomitante do

dinucleotídeo nicotinamida-adenina reduzido (NADH). A troca na absorbância nos 340 nm

(34)

amostra e é medida através de técnica cinética bicromática (340-383 nm). O analisador calculou e imprimiu automaticamente a concentração de uréia em mg/dL (Bula do cartucho de reagente 'T)imension® Dade Behring" para uréia).

Creatinina

NaOH

Creatinina + picrato -► cromóforo vermelho

'.V

Na presença de uma base forte como o NaOH, o picrato reage com a creatinina para formar um cromóforo vermelho. O aumento da absorbância a 510 nm devido à formação

deste cromóforo é diretamente proporcional à concentração de creatinina na amostra e é

medida utilizando uma técnica cinética bicromática (510 nm, 600 nm). Para evitar interferências pela presença de bilirrubina, esta é oxidada por ferrocianuro potássico. O analisador calculou e imprimiu automaticamente a concentração de creatinina em mg/dL (Bula do cartucho de reagente 'Dimension® Dade Behring" para creatinina).

Ácido úríco

uncase

Ácido úrico + 2 H2O + O2

-► alantoína + H2O + CO2

O ácido úrico, que absorve luz a 293 nm, é convertido pela uricase à alantoína, a

qual não é absorvida a 293 nm. A troca de absorbância a 293 nm devido ao desaparecimento

do ácido úrico é diretamente proporcional à concentração de ácido úrico na amostra e é

medida utilizando uma técnica bicromática de ponto final (293 e 700 nm). O analisador

calculou e imprimiu automaticamente a concentração de ácido úrico em mg/dL (Bula do

cartucho de reagente 'T)imension® Dade Behring" para ácido úrico).

(35)

Amilase

amilase

CNPG3 ► CNP + CNPG2 + G3 + glicose

A a-amilase catalisa a hidrólise de um substrato sintético definido, 2-cloro-4-nitrofenil-a-D-maltotriosido (CNPG3), para formar 2-cloro-4-nitrofenol-a-D-maltosido

(CNPG2), maltotriosa (G3) e glicose. Depois de uma incubação de 70 segundos a 37°C,

mede-se a absorbância devida à formação de 2-cloro-4-nitrofenol (CNP) mediante uma técnica cinética bicromática (405, 577 nm). O analisador calculou e imprimiu automaticamente a atividade da amilase em U/L (U=unidades amiloliticas) (Bula do cartucho

de reagente 'T)imension® Dade Behring" para amilase).

2.4 - Análise fisica

A análise fisica consistiu da observação de coloração, aspecto, densidade e sedimento nas amostras de urina. A análise de coloração e aspecto foram feitas a olho nu,

concomitantemente à análise do sedimento, sendo feita sempre sob boa fonte de luz para

facilitar sua visualização e caracterização (Strasinger, 1996). A terminologia usada para o

registro da coloração urinária foi: incolor, amarelo claro, amarelo citrino e avermelhado;

quanto ao aspecto, este foi registrado como: límpido, semi turvo e turvo. Como dito

anteriormente, apesar de a densidade específica ser considerada um parâmetro fisico, esta foi

analisada juntamente com outros parâmetros químicos seguindo o método já descrito para as tiras reativas.

Para análise do sedimento urinário as amostras foram centrifugadas para que

houvesse deposição dos elementos sólidos no fundo do tubo. O sobrenadante foi estocado e o

remanescente sólido foi disposto entre lâmina e laminula para análise em microscópio óptico

sob aumento de lOx e 40x. Para registro dos elementos presentes no sedimento urinário, convencionou-se a contagem destes elementos por campo visual, sob aumento de lOx. Para a

quantificação de leucócitos e hemácias, estes foram contados em cinco campos visuais e

então calculada a média entre eles para cada amostra urinária. Para células epiteliais e

cristais, estes foram registrados como ausentes, raros (apenas alguns elementos por campo

visual), freqüentes (metade do campo visual contendo estes elementos) ou numerosos

(36)

■A

(elementos preenchendo todo o campo visual). Às bactérias, convencionou-se registrá-las

como: ausente, discreta (poucas bactérias por campo visual), moderada (metade do campo visual contendo bactérias) e aumentada (bactérias preenchendo todo o campo visual). Para as hifas, estas foram registradas como presentes ou ausentes. Pouca luz foi usada para facilitar a

pesquisa dos elementos do sedimento urinário (Bossart et al., 2001; Kantek Garcia-Navarro,

1996). As leituras do sedimento foram registradas nos formulários de colheita (Anexo 01) de

cada animal com os demais resultados obtidos.

2.5 - Análise estatística

O pequeno tamanho amostrai não permitiu a aplicação de testes estatísticos mais

robustos, e por isso as análises estatísticas aplicadas foram de cunho mais descritivo,

principalmente para os resultados obtidos qualitativamente pelas tiras reativas. Para estes

dados (proteínas, cetonas, urobilinogênio, bilirrubina, pH, sangue (hemácias), leucócitos,

nitrito, densidade específica e glicose) e para os dados resultantes da análise de coloração,

aspecto e sedimento foram montadas tabelas por sexo e classe etária com os valores

compreendidos nas tiras para cada parâmetro e sua ocorrência no decorrer do experimento.

Para análise dos parâmetros quantificados pelo aparelho Dimension AR 'T)ade

Behring" (glicose, uréia, creatinina, ácido úrico e amilase), obteve-se a média, desvio padrão

e amplitude (valores mínimo e máximo). Em seguida, aplicou-se teste í (0,05) para verificar

se havia diferenças significativas entre os sexos em cada classe etária. Apenas para as classes

etárias que não apresentaram diferença significativa entre machos e fêmeas aplicou-se

ANOVA para verificar se as classes etárias diferiam estatisticamente entre si. De posse dos

grupos cujos valores não apresentaram diferença estatística significativa, aplicou-se intervalo

de confiança (95%) para determinação da faixa de normalidade de cada parâmetro. Para a

realização dessas análises estatísticas, foi utilizado o programa Statistica 6.0.

(37)

3 - RESULTADOS

Ao todo foram realizados 188 exames, 108 deles em amostras de urina de machos e

80 em amostras de urina de fêmeas, pois, no mês inicial de coleta (junho) não se conseguiu

colher urina de uma fêmea juvenil (Adana).

3.1 - Proteínas

Os níveis de proteínas indicados pelas tiras reativas foram mínimos (<10 mg/dL) e

constantes ao longo do experimento, tanto para machos e fêmeas, como para as diferentes

classes etárias. (Tabela 03).

Tabela 03. Pesquisa qualitativa de proteínas por tiras reativas nas amostras de urina de T.

imnguis no período do experimento.

Classe

etária

Proteínas

[mg/dL] Jun/03 JuI/03

Período do experimento

Ago/03 Set/03 Out/03 Nov/03 Dez/03 Jan/04 Fev/04 N" exames <10 10 +(4) +(4) +(4) +(4) +(4) +(2) +(2) +(2) +(2) Filhotes Lactentes (n=4) 30 100 300 1000 28 <10 10 +(6) +(7) +(7) +(7) +(7) +(9) +(9) +(9) +(9) Juvenis (n=7) 30 100 300 1000 70 <10 10 +(5) +(5) +(5) +(5) +(5) +(5) +(5) +(5) +(5) Sub Adultos (n=5) 30 100 300 1000 45 <10 10 +(5) +(5) +(5) +(5) +(5) +(5) +(5) +(5) +(5) Adultos (n=5) 30 100 300 1000 45

(38)

3.2 - Cetonas

Os níveis de cetonas medidos nas amostras de urina também foram constantes em

100% das amostras, tanto para machos como para fêmeas nas diferentes classes etárias, e sempre corresponderam ao mínimo detectável pelas tiras reativas (<5 mg/dL) (Tabela 04).

Tabela 04. Pesquisa qualitativa de cetonas por tiras reativas nas amostras de urina de T. imnguis no período do experimento.

Classe etária

Cetonas

[mg/dL] Jun/03 Jul/03 Ago/03

Periodo do experimento

Set/03 Out/03 Nov/03 Dez/03 Jan/04 Fev/04 exames

<5 +(4) +(4) +(4) +(4) +(4) +(2) +(2) +(2) +(2) Filhotes 5 Lactentes (n=4) 10 50 100 28 <5 +(6) +(7) +(7) +(7) +(7) +(9) +(9) +(9) +(9) Juvenis (n=7) 5 10 50 100 70 <5 +(5) +(5) +(5) +(5) +(5) +(5) +(5) +(5) +(5) Sub Adultos (n=5) 5 10 50 100 45 <5 +(5) +(5) +(5) +(5) +(5) +(5) +(5) +(5) +(5) Adultos (n=5) D 10 50 100 45

Valor de "n entre parenteses

3.3 - Urobilinogênio

Os valores de urobilinogênio detectados nas amostras de urina de machos e de

fêmeas não variaram ao longo do experimento e apresentaram valor mínimo medido pelas

tiras reativas (0,1 mg/dL)

(Tabela 05).

(39)

í.i Classe etária Urobilinogênio [mg/dL] Jun/03 Jul/03 Ago/03 Período do experimento Set/03 Out/03 Nov/03 Dez/03 Jan/04 Fev/04 N® exames Filhotes Lactentes (n=4) 0,1 1 4 8 12 +(4) +(4) +(4) +(4) +(4) +(2) +(2) +(2) +(2) 28 0,1 1 4 8 12 +(6) +(7) +(7) +(7) +(7) +(9) +(9) +(9) +(9) Juvenis (n=7) 70 Sub Adultos (n=5) 0,1 1 4 8 12 +(5) +(5) +(5) +(5) +(5) +(5) +(5) +(5) +(5) 45 0,1 1 4 8 12 +(5) +(5) +(5) +(5) +(5) +(5) +(5) +(5) +(5) Adultos (n=5) 45 Valor de "n entre parenteses 3.4 - Bilirrubina Excetuando-se um exame realizado em um macho juvenil (Mapixari) no mês de

julho e

dois exames

realizados em

dois machos

sub adultos

(Erê e

Guarany) no

mês de

novembro, que resultaram em 0,5 mg/dL, os demais valores de bilirrubina obtidos para o restante dos machos e fêmeas foram o mínimo detectável pelas tiras reativas (<0,5 mg/dL)

(Tabela 06).

22

(40)

Tabela 06. Pesquisa qualitativa de bilirmbina por tiras reativas nas amostras de urina de T. inunguis no período do experimento.

Classe Bilimíbina Período do experimento

etária [mg/dLl Jun/03 Jul/03 Ago/03 Set/03 Out/03 Nov/03 Dez/03 Jaii/04 Fev/04 exames

Filhotes Lactentes (n=4) <0,5 0,5 1,0 3,0 +(4) +(4) +(4) +(4) -K4) +(2) +(2) +(2) +(2) 28 Juvenis (n=7) <0,5 0,5 1,0 3,0 +(6) +(6) +(1)M +(7) +(7) +(7) +(9) +(9) +(9) +(9) 70 Sub .Adultos (n=5) <0,5 0,5 1,0 3,0 +(5) +(5) +(5) +(5) +(5) +(3) +(2)" +(5) +(5) +(5) 45 <0,5 -K5) +(5) +(5) -K5) +(5) +(5) +(5) +(5) +(5) Adultos (n=5) 0,5 1,0 3,0 45 ^ = macho

Valor de "n" entre parênteses

3.5-pH

O

pH medido pelas tiras reativas na urina do peixe boi da Amazônia variou de 5,0 a

9,0. O pH 8,0 foi o mais observado nas amostras (n=132), diferindo apenas em fêmeas

lactentes, cujo pH medido na maioria das amostras (n=4)

foi 6,0. A

tabela 07 apresenta os

níveis de pH observados no decorrer do experimento para machos e fêmeas, por classe etária,

respectivamente.

(41)

ÍN T e (/) o ON í C/3 s s [Jh Classe etária pH Juii/03 Jul/03 Ago/03 Periodo do experimento Set/03 Out/03 Nov/03 Dez/03 Jaii/04 Fev/04 N® exames 5,0 Filhotes Lactentes 6,0 7,0 +(1) +(1) +(1) +(1) +(1) 18 (n=2) 8,0 9,0 +(1) +(1) +(2) +(1) +(1) +(1) H2) ■^(2) +(2) 5,0 Juvenis (n=3) 6,0 7,0 8,0 9,0 +(3) +(3) +(1) +(2) +(3) +(2) +(1) +(2) +(1) +(3) -♦-(3) +(3) 27 5,0 Sub Adultos 6,0 7,0 +(1) +(1) +(1) +(1) 36 (n=4) 8,0 9,0 +(3) +(1) +(4) +(3) +(4) +(2) +(3) +0) +(1) ■•■(3) +(1) +(4) 5,0 Adultos (n=3) 6,0 7,0 8,0 9,0 +(2) +(1) +(2) +(1) +(1) +(2) +(3) +(2) +(1) ■Kl) -K2) +(2) +a) +0) +(3) 27 5,0 Filhotes Lactentes (n=2) 6,0 7,0 8,0 9,0 +(1) +(1) +(2) +(1) +(1) +(1) +(1) -K2) 10 5,0 +(1) +(1) Juvenis (n=4) 6,0 7,0 8,0 9,0 +(1) +(1) +(1) +(4) +(1) +(1) +(2) +(1) +(3) +(3) +(2) +(4) +(4) +(2) +(1) +(4) HD +(2) 43 5,0 Sub Adultos 6,0 7,0 09 (n=l) 8,0 9,0 +(1) +(1) +(1) +(1) +(1) +(1) -^(1) -í-d) -^(1) 5,0 Adultos (n=2) 6,0 7,0 8,0 9,0 +(2) +(2) +(l) +(1) +(2) +(l) +(1) +(2) ■^(1) ■^(1) +(2) +(1) 18 "Valor de "n" entre parenteses 24

(42)

3.6 - Sangue (hemácias) A detecção de sangue (hemácias) pelas tiras reativas compreendeu os valores <10, 10 e 50 RBC/pL, sendo que o valor 10 RBC/pL foi observado na maioria dos exames (n=163) tanto de machos quanto de femeas das diferentes classes etárias (Tabela 08). Tabela 08. Detecção qualitativa de sangue (hemácias) por tiras reativas nas amostras de urina de T. imnguis no período do experimento. Sexo Classe Sangue Período do experimento N" etária [RBC/fiL] Jun/03 juyo3 Ago/03 Set/03 Out/03 Nov/03 Dez/03 Jan/04 Fev/04 exames Filhotes Lactentes (n=2) <10 10 50 250 +(2) +(2) +(2) +(1) +(1) +(1) +(1) +(2) +(1) +(1) +(1) +(1) +(1) +(1) 18 <10 +(1) +(1) II 3, Juvenis (n=3) 10 50 250 +(1) +(2) +(3) +(2) +(3) +(2) +(3) +(3) +(3) +(3) 27 2 Sub Adultos (n=4) <10 +(1) •s n 2 10 50 250 +(4) +(4) +(3) +(1) +(4) +(4) +(4) +(4) +(3) +(4) 36 <10 Adultos (n=3) 10 50 250 +(3) +(3) +(3) +(3) +(3) +(3) +(3) +(3) +(3) 27 Filhotes Lactentes (n=2) <10 10 50 250 +(1) +(1) +(2) +(2) +(2) +(1) +(1) * * * * 10 <10 +(3) +(1) +(2) ON II Juvenis (n=4) 10 50 +(3) +(4) +(4) +(1) +(4) +(6) +(5) +(6) +(4) 43 250

i

r<U b Sub Adultos (n=l) <10 10 50 250 +(1) +(1) +(1) +(1) +(1) +(1) +(1) +(1) +(1) 09 Adultos (n=2) <10 10 50 250 +(1) +(1) +(2) +(1) +(1) +(1) +(1) +(2) +(2) +0 +(1) +(1) +(1) +(1) 18 Valor de "n" entre parenteses * nos meses em questão as femeas Nanica e Barreirinlia passaram da classe etária filhote lactente para a classe juvenil 25

(43)

3.7 - Leucócitos

A quantidade de leucócitos nas amostras não excedeu 25 WBC/nL, sendo que, na maioria delas (n=170) foram detectados menos que 25 WBC/iiL, tanto para machos como para fêmeas das diferentes classes etárias (Tabela 09).

Tabela 09. Detecção qualitativa de leucócitos por tiras reativas nas amostras de urina de T inunguis no período do experimento.

Classe Leucócitos Período do experimento N"

etária [WBC/íiL] Juii/03 Jul/03 Ago/03 Set/03 Out/03 Nov/03 Dez/03 Jan/04 Fev/04 exames

<25 -K2) +(4) -K4) -K4) -K4) ■K2) -K2) ■K2) -K2) Filhotes Laaentes (n=4) 25 75 500 -KD^ -Kl)' 28 Juvenis (n=7) <25 25 75 500 -K4) +(2)" -K2) +(2)" +(3)^ -K7) -K7) -K7) -K9) -K9) ■K9) ■K9) 70 Sub Adultos (n=5) <25 25 75 500 ■K4) -Kl)" ■K3) -KD" ■Kl)' -K4) ■Kl)" ■K5) ■K5) -K5) ■K5) ■K5) -K5) 45 Adultos (n=5) <25 25 75 500 -K4) ■Kl)' ■K2) +(3)" ■K4) ■Kl)' -K5) ■K5) ■K5) ■K5) -K5) •K5) 45 = macho ^ = fêmea 3.8 -Nitrito

A detecção de nitrito pelas tiras reativas foi variável nos machos ao longo do

experimento. Apesar da ausência de nitrito ter sido detectada na maioria das amostras de

machos (n=73), em alguns meses foi detectado nitrito em pelo menos metade deles (Tabela

10). A pesquisa de nitrito nas amostras de fêmeas, por sua vez, seguiu um padrão ao longo do

experimento, indicando ausência nas urinas analisadas, excetuando-se as amostras dos meses

de julho e outubro de uma fêmea adulta (Tukano) (Tabela 10).

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