Caracterização fitoquímica e avaliação da atividade biológica de Cinnamomum zeylanicum Blume (Lauraceae).

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS. Jocelene Filippin Cossetin. CARACTERIZAÇÃO FITOQUÍMICA E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE BIOLÓGICA DE Cinnamomum zeylanicum Blume (LAURACEAE).. Santa Maria, RS 2016.

(2) Jocelene Filippin Cossetin. CARACTERIZAÇÃO FITOQUÍMICA E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE BIOLÓGICA DE Cinnamomum zeylanicum Blume (LAURACEAE).. Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Área de Concentração em Controle e Avaliação de Insumos e Produtos Farmacêuticos, da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM, RS), como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.. Orientadora: Profa. Dra. Melânia Palermo Manfron. Santa Maria, RS 2016.

(3) © 2016 Todos os direitos autorais reservados a Jocelene Filippin Cossetin. A reprodução de partes ou do todo deste trabalho só poderá ser feita mediante a citação da fonte. E-mail: jocelenecossetin@yahoo.com.br.

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(5) “Quando se diz obrigado, se dizem muitas coisas mais, que vêm de muito longe com a origem do indivíduo, e de tão perto como o pulsar do coração".. Pablo Neruda.

(6) AGRADECIMENTOS. Agradeço primeiramente a Deus, por ter me proporcionado caminhos e oportunidades na minha vida para chegar até aqui e com muita fé concluir mais uma etapa. Aos meus pais, pelo apoio e pela compreensão, por muitas vezes não poder estar ao lado deles em momentos de reunião em família, em momentos difíceis na qual mesmo sabendo da importância da minha presença ou mesmo passar fins de semana consecutivos eu não pude estar presente. Tudo isso, com certeza, por estar envolvida na construção desta dissertação, mais uma conquista nossa. A minha irmã, Lu mais que querida, que conseguiu conviver comigo nesses dois últimos anos os quais foram vividos com os mais variados sentimentos. Você foi quem aguentou as minhas chatices e brigas, mas foi também quem esteve sempre presente sendo a pessoa que todo dia quando chegava em casa eu podia conversar, desabafar e compartilhar todas experiências vividas. Minha eterna amiga, meus mais sinceros agradecimentos. Agradeço a minha colega e amiga Camila Cuelho, companheira de longa data, a quem devo boa parte desta conquista. Meus mais sinceros agradecimentos pela amizade que construímos ao longo destes 8 anos e pelo apoio incondicional que sempre me dá. Sem isso, certamente, não teria chegado até aqui. Meu muito obrigado! Agradeço as colegas e amigas do Laboratório, pela amizade, paciência e pelo suporte, tão determinantes para a realização deste trabalho, em especial: Marina, Évelin Iuri, Débora, Rachel, Maiara, Alexandre, Camila, Lucas Juliana, Agradeço também a Rafaela, pelas análises realizadas bem como auxílios e conhecimentos compartilhados sobre o HPLC. Meus mais sinceros agradecimentos. A Maiara, minha IC, a qual foi fundamental na construção deste trabalho, pois a partir do nosso trabalho conjunto e convívio diário conseguimos chegar até o final desenvolvendo-o com muita responsabilidade e dedicação contornando as dificuldades e obstáculos sem deixar que o cansaço nos atingisse. A vera e Rafaela e Rose querida! As suas presenças e Cias. diária além dos seus “bom dias contagiantes”! Aos colegas Pedro Henrique Doleski, Natália Jardin Roberta Rosso, Alessandra Guedes, que ajudaram de alguma forma nesse trabalho. À Profª. Daniela B. Rosa Leal e seus orientados, principalmente Pedro Henrique Doleski e Alessandra Guedes, pela ajuda na indução, tratamento das ratas e demais experimentos, na realização do ensaio in vivo. Meu muito obrigado pela professora Marta Palma Alves e Cristiane de Bona pela contribuição ensino, aprendizagem e espaço físico para a realização dos testes físico químicos da formulação para aplicação tópica. Ao Professor Michel Mansur e seus orientados, principalmente Jonathaline, Elisandra, Luciane, pela ajuda nos experimentos de Citotoxidade e genotóxidade. À Universidade Federal do Pampa (UNIPAMPA) Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, pelo ensino, aprendizagem e espaço físico para a realização de testes. À Universidade Federal de Santa Maria e ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, pelo ensino, aprendizagem e espaço físico para a realização deste trabalho. À professora Melania Palermo Manfrom orientadora por ter confiado no meu trabalho e no meu potencial, pela transmissão de seus conhecimentos, além de ter servido como base sólida para a construção deste trabalho..

(7) RESUMO. CARACTERIZAÇÃO FITOQUÍMICA E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE BIOLÓGICA DE Cinnamomum zeylanicum Blume (LAURACEAE).. AUTORA: Jocelene Filippin Cossetin ORIENTADORA: Melânia Palermo Manfron. Cinnamomun zeylanicum Blume conhecida como canela e pertencente à família Lauraceae, é utilizada na medicina popular para inflamações, reumatismo, infecções cutâneas, dor de cabeça, depurativo do sangue e calmante. O objetivo deste trabalho foi determinar parâmetros físico-quimicos de qualidade da droga vegetal; identificar compostos químicos do metabolismo secundário; desenvolver e caracterizar formulação creme-gel contendo o extrato em diferentes concentrações, bem como investigar atividade antioxidante antimicrobiana, antioxidante e antigenotóxica no extrato das folhas de canela, além de analisar a atividade antiinflamatória avaliando a de dermatite de contato in vivo em formulação creme-gel contendo o extrato desta espécie. Na caracterização físico-quimica, por meio de testes farmacopéicos foi utilizado à droga vegetal seca das folhas de canela, constatando que não houve variação significativa da amostra coletada. No extrato hidroetanólico 70% (EB) das folhas de C. zeylanicum verificou-se presença alcalóides, flavonóides, taninos, saponinas e cumarinas. Por doseamento espectroscópico foram determinados polifenóis, flavonóides e taninos no EB. C. zeylanicum mostrou potencial antioxidante qualitativa por CCD com valor de CE50 e IAA de 12,88µg/mL e 15,91% pelo método DPPH. A atividade antimicrobiana frente à E.coli, K. pneumonia, S. aureus e P. aeruginosa pelo método de microdiluição em caldo e atividade antigenotóxica analisadas em cultura de leucócitos humanos pelos teste de viabilidade e proliferação celular, ensaio cometa e frequência de micronúcleos. As concentrações CzE1 µg/mL e CzE10 µg/mL de extrato reverteram o dano genotóxico causado pelo peroxido de hidrogênio. A Hidróxicumarina e o Cinamaldeido foram identificados por CLAE respectivamente. O creme-gel contendo concentração de 5%, 10% e 15% de extrato apresentou valores de pH (6,0-6,5), características organolépticas, espalhabilidade e viscosidade em conformidade com o preconizado para aplicação tópica. O creme-gel a 5% e 10% apresentou atividade antiinflamatória na dermatite de contato avaliado in vivo pelo modelo de indução de dermatite de contato. Os parâmetros físico-quimicos estabelecidos para C. zeylanicum possibilitam controle de qualidade da droga e extrato apresentou atividades antioxidante, antimicrobiana, antigenotóxica e antiinflamatória.. Palavras-chave: Análise fitoquimica. Estudo químico. C. Zeylanicum. Antimicrobiana. Potencial antioxidante. Citotóxico. Antigenotóxico. Antinflamatório..

(8) ABSTRACT. PHYTOCHEMICAL AND EVALUATION OF BIOLOGICAL EXTRACT Cinnamomum zeylanicum Blume EFFECTS.. AUTHOR: Jocelene Filippin Cossetin ADVISER: Melânia Palermo Manfron. Cinnamomun zeylanicum Blume known as cinnamon and belongs to the Lauraceae family, is used in folk medicine for inflammation, rheumatism, skin infections, headache, blood purifying and soothing. The objective of this study was to determine the physicalchemical parameters of quality of vegetable drug; identifying chemical compounds secondary metabolism; develop and characterize cream-gel formulation containing the extract in different concentrations and investigate antimicrobial antioxidant activity, antioxidant and antigenotoxic the extract of cinnamon leaves, in addition to analyzing the anti-inflammatory activity by evaluating the contact dermatitis in vivo in cream-gel formulation containing the extract of this species. In the physical-chemical characterization through pharmacopoeia tests was used to dry vegetable drug cinnamon leaves, noting that there was no significant variation of the samples. In hydroethanolic extract 70% (EB) of C. zeylanicum sheets verified the presence alkaloids, flavonoids, tannins, saponins and coumarins. For spectroscopic assay were determined polyphenols, flavonoids and tannins in EB. C. zeylanicum showed qualitative antioxidant potential by CCD with EC50 and AAI value 12,88μg / mL and 15.91% by DPPH method. The antimicrobial activity against E.coli, K. pneumonia, S. aureus and P. aeruginosa by the microdilution broth method and analyzed antigenotoxic activity in cultured human leukocytes test for viability and cell proliferation, comet assay, and micronucleus frequencies. Concentrations CzE1 / mL and CzE10 / mL extract reversed the genotoxic damage caused by hydrogen peroxide. The hydroxycoumarin and cinnamaldehyde were identified by HPLC respectively. The cream gel containing a concentration of 5%, 10% and 15% extract had pH values (6.0-6.5), organoleptic properties, viscosity and spreadability in accordance with the recommendations for topical application. The cream-gel 5% and 10% had anti-inflammatory activity in contact dermatitis evaluated in vivo by contact dermatitis induction model. The physical-chemical parameters established for C. zeylanicum enable quality control of drugs and extract showed antioxidant activity, antimicrobial, anti-inflammatory and antigenotoxic.. Keywords: Phytochemical analysis. Chemical study. C. Zeylanicum, Antimicrobial. Antioxidant potential. Cytotoxic. Anti genotoxic. Anti-inflammatory..

(9) LISTA DE FIGURAS. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Figura 1 – Aspecto geral de Cinnamomum zeylanicum Blume ............................................... 22 MANUSCRITO 1: Análise fitoquimica, dosagens de fenólicos, taninos e flavonoides e avaliação das atividades antioxidante, antimicrobiana e antigenotóxica do extrato das folhas de Cinnamomum zeylanicum. Figura 1 – Curva padrão do Ácido Gálico com suas concentrações versus absorbâncias e respectiva equação da reta e coeficiente de correlação. ........................................ 36 Figura 2 – Curva padrão da quercetina com suas concentrações versus absorbâncias e respectiva equação da reta e coeficiente de correlação. ........................................ 37 Figura 3 – Curva padrão da catequina com suas concentrações versus absorbâncias e respectiva equação da reta e coeficiente de correlação. ........................................ 37 Figura 4 – Atividade antioxidante pelo método do DPPH apresentadas pelas imagens luz Visível (A) e pela luz ultravioleta (B) das folhas de Cinnamomum zeylanicum em cromatoplacas. Fase móvel: Clorofórmio: metanol (8,5: 3,5) ......................... 39 Figura 5 – Gráfico da inibição do ácido ascórbico e Quercetina do extrato da folha de Cinnamomum Zeylanicum nas diferentes concentrações de DPPH. ..................... 40 Figura 6 – Efeitos do extrato C. zeylanicum (canela) nos parâmetros antigenotóxicos de leucócitos humanos em cultura expostas a peróxido de hidrogénio. ..................... 44 MANUSCRITO 2: Análise fitoquimica por HPLC-DAD e Desenvolvimento de formulação Creme-gel contendo extrato Cinnamomum zeylanicum Blume (Canela): Avaliação em modelo experimental de dermatite de contato. Figura 1 – Representação do perfil cromatográfico por CLAE-DAD do extrato das folhas de C. zeylanicum e do composto a Hidróxicumarina (A) identificado .................. 66 Figura 2– Representação do perfil cromatográfico por CLAE-DAD do extrato das folhas de C. zeylanicum e do composto a Cinamaldeido (B) identificado. ...................... 66 Figura 3 – Formulção crème-gel base 3 – Creme-gel: após o preparo (A), Creme- gel após 7 dias de analise (B), Creme- gel após 14 dias de analise (C), Creme- gel Após 30 dias de analise.......................................................................................... 69 Figura 4 – Avaliação das formulações [Creme-gel c/extrato 5% (a); Creme-gel c/extrato 10% (b) e Creme-gel c/extrato 15% (c)] nos seguintes tempos determinados: após o preparo (A); após 7 dias de preparo (B); após 14 dias de preparo (C) e após 30 dias de preparo (D) ................................................................................... 69 Figura 5 – Hidrólise do ADP e ATP pela E-NTPDase em linfócitos....................................... 72 Figura 6 – Atividade da E-ADA em linfócitos ....................................................................... 74.

(10) LISTA DE TABELAS MANUSCRITO 1: Análise fitoquimica, dosagens de fenólicos, taninos e flavonoides e avaliação das atividades antioxidante, antimicrobiana e antigenotóxica do extrato das folhas de Cinnamomum zeylanicum. Tabela 1 – Bactérias utilizadas para os ensaios de ação antibacteriana. ................................. 31 Tabela 2 – Parâmetros físico-químicos estabelecidos para o controle de qualidade do extrato das folhas de C. zeylanicum. ...................................................................... 33 Tabela 3 – Resultado da análise fitoquimica do extrato das folhas de Cinnamomum zeylanicum. ............................................................................................................ 35 Tabela 4 – Teores de flavonoides, polifenois e taninos nos extratos bruto de C. zeylanicum. ............................................................................................................ 38 Tabela 5 – Valores de concentração efetiva e índice de atividade antioxidante de extratos de C. zeylanicum .................................................................................................... 41 Tabela 6 – Concentração Microbicida Mínima (CIM) do extrato de C. zeylanicum. ............. 42 MANUSCRITO 2: Análise fitoquimica por HPLC-DAD e Desenvolvimento de formulação Creme-gel contendo extrato Cinnamomum zeylanicum Blume (Canela): Avaliação em modelo experimental de dermatite de contato. Tabela 1 – Composição quali-quantitativa dos creme-gel para a avaliação da eficácia in vivo em modelo de dermatite de contato ............................................................... 62 Tabela 2 – Caracteristicas organolépticas e valores de Ph das formulações semi-sólidas em estudo (n=3) ..................................................................................................... 68 Tabela 3 – Resultados da Viscosidade das formulações semissólidas em estudo. .................. 70 Tabela 4 – Resultados da espalhabilidade das formulações semissólidas em estudo. ............ 71.

(11) SUMÁRIO. 1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 12. 2 2.1 2.2 3 3.1 3.2 3.3. OBJETIVOS ............................................................................................................. 14 OBJETIVO GERAL................................................................................................... 14 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ..................................................................................... 14 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................................ 15 PLANTAS MEDICINAIS ......................................................................................... 15 METABÓLITOS SECUNDÁRIOS E ATIVIDADES BIOLÓGICAS ..................... 17 FORMULAÇÕES CONTENDO SUBSTÂNCIAS NATURAIS PARA APLICAÇÃO TÓPICA .............................................................................................. 19 Cinnamomum zeylanicum Blume .............................................................................. 21. 3.4 4 4.1. MANUSCRITOS ...................................................................................................... 24 MANUSCRITO I – ANÁLISE FITOQUIMICA, DOSAGENS DE FENÓLICOS, TANINOS E FLAVONOIDES E AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES ANTIOXIDANTE, ANTIMICROBIANA E ANTIGENOTÓXICA DO EXTRATO DAS FOLHAS DE Cinnamomum zeylanicum. ................................................................................................................ 25 RESUMO ................................................................................................................... 25 1 INTRODUÇÃO....................................................................................................... 26 2 MATERIAL E MÉTODOS..................................................................................... 27 2.1 Coleta do material vegetal .................................................................................... 27 2.2 Obtenção do extrato.............................................................................................. 27 2.3 Parâmetros físico-químicos de qualidade da droga vegetal ................................. 28 2.4 Análise fitoquímica .............................................................................................. 28 2.5 Doseamento de fenólicos, flavonoides e taninos.................................................. 28 2.6 Determinação do potencial antioxidante .............................................................. 29 2.6.1 Atividade antioxidante em CCD ....................................................................... 29 2.6.2 Eficiência antioxidante por espectrofotometria ................................................. 29 2.7 Atividade antimicrobiana ..................................................................................... 30 2.8 Atividade antigenotóxica...................................................................................... 31 2.8.1 Preparação da cultura celular de Linfócitos: ..................................................... 31 2.8.2 Tratamentos das Culturas .................................................................................. 31 2.8.3 Avaliação de parâmetros anti-genotóxicos do extrato em culturas de leucócitos humanos .................................................................................................... 31 2.8.3.1 Proliferação celular e a inviabilidade ............................................................. 32 2.8.3.2 Ensaio cometa................................................................................................. 32 2.8.3.3 Formação dos micronúcleos ........................................................................... 32 2.9 Análise estatística ................................................................................................. 33 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................ 33 3.1 Parâmetros físico-químicos de controle de qualidade da droga vegetal .............. 33 3.2 Análise fitoquímica .............................................................................................. 34 3.3 Doseamento de fenólicos, flavonoides e taninos.................................................. 36 3.4 Potencial Antioxidante ......................................................................................... 38 3.4.1 Potencial antioxidante por CCD ........................................................................ 38 3.4.2 Potencial antioxidante por espectrofotometria .................................................. 40 3.5 Atividade Antimicrobiana .................................................................................... 42 3.6 Atividade antigenotóxica...................................................................................... 44.

(12) 4.2. 3.6.1 Avaliação de parâmetros antigenotóxicos do extrato em culturas de leucócitos humanos .................................................................................................... 44 4 CONCLUSÃO......................................................................................................... 47 5 REFERÊNCIAS BBLIOGRÁFICAS ..................................................................... 47 MANUSCRITO II – Análise fitoquimica por HPLC-DAD e Desenvolvimento de formulação Creme-gel contendo extrato Cinnamomum zeylanicum Blume (Canela): Avaliação em modelo experimental de dermatite de contato. ............. 56 RESUMO ................................................................................................................... 57 1 INTRODUÇÃO....................................................................................................... 58 2 MATERIAL E MÉTODO ....................................................................................... 59 2.1 Coleta do material vegetal .................................................................................... 59 2.2 Obtenção do extrato.............................................................................................. 60 2.3 Condições Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE-DAD) ................. 60 2.4 Preparação da formulação Creme-gel .................................................................. 61 2.5 Caracterização físico-química do creme-gel ........................................................ 62 2.6 Avaliação da eficácia in vivo ................................................................................ 63 2.6.1 Indução de dermatite de contato e tratamento ................................................... 63 2.6.2 Atividade das ecto-enzimas E-NTPDase e E-ADA .......................................... 63 2.6.2.1 Isolamento de células mononucleares ricas em linfócitos.............................. 63 2.6.2.2 Determinação de proteína ............................................................................... 64 2.6.2.3 Atividade da E-NTPDase ............................................................................... 64 2.6.2.4 Atividade da E-ADA ...................................................................................... 64 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................ 65 3.1 Obtenção do extrato.............................................................................................. 65 3.2 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE-DAD) ................................... 65 3.3 Caracterização físico-química do creme-gel ........................................................ 67 3.3.1 Determinação das características organolépticas e pH das formulações semissólidas ................................................................................................................ 67 3.3.2 Avaliação da viscosidade das formulações semissólidas .................................. 69 3.3.3 Avaliação da espalhabilidade das formulações semissólidas ............................ 70 3.4 Determinação das atividades das E-NTPDase e da E-ADA ................................ 71 4 CONCLUSÃO......................................................................................................... 74 5 REFERÊNCIAS BLIOGRÁFICAS ........................................................................ 74. 5. DISCUSSÃO GERAL .............................................................................................. 79. 6. CONCLUSÕES ........................................................................................................ 84 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICA ..................................................................... 86.

(13) 12. 1 INTRODUÇÃO. A utilização de plantas medicinais no Brasil é uma prática comum resultante da forte influência cultural dos indígenas locais miscigenadas, das tradições africanas, oriundas de três séculos de tráfico escravo, e da cultura europeia, trazida pelos colonizadores. A construção da terapia alternativa de cura se deve ao fato da articulação entre os conhecimentos dos indígenas, jesuítas e fazendeiros, que contribuiu para o surgimento de uma bagagem de usos acerca das plantas e suas bases medicinais, que resistiram até a atualidade (MAIOLI et al., 2007; SILVA et al., 2013). As plantas medicinais constituem fontes de substâncias ativas com potencial terapêutico que são usadas para o tratamento de várias doenças na medicina popular. A avaliação dos efeitos farmacológicos dessas substâncias tem sido amplamente explorada a fim de descobrir novos fármacos de origem vegetal e também como uma possível alternativa terapêutica a fármacos que possuem importantes efeitos adversos quando administrados (PATWARDHAN et al., 2004; SAMY et al., 2008). A avaliação da atividade biológica de uma planta inclui a investigação da atividade farmacológica e toxicológica de extratos brutos ou de substâncias isoladas dessas plantas (ROYER et al., 2013). Mas para obterem reconhecimento como medicinais, é necessário que a autenticidade, a integridade e pureza desses extratos ou substâncias sejam comprovadas. Estudos que comprovem a eficácia dos mesmos são escassos e a utilização de produtos naturais na criação animal ainda é pouco explorada (CATALAN et al., 2012). Entretanto, a ciência moderna tem levado em conta os saberes populares, na busca da comprovação da eficácia dos fitoterápicos, para que sejam comercializados e utilizados de maneira segura (MACHADO, 2008). As plantas produzem compostos químicos como parte de suas atividades metabólicas normais. Esses compostos são os metabólitos primários, como açúcar e lipídios, encontrados em todas as plantas, e em metabólitos secundários, encontrados apenas em algumas plantas, sendo compostos não essenciais ao seu funcionamento básico, mas que melhoram suas chances de reprodução e/ou sobrevivência contra predadores. Os metabólitos secundários, ao mesmo tempo em que são tóxicos aos predadores da planta, por exemplo, têm efeitos benéficos quando usados para tratar doenças humanas. Tais compostos são bastante variáveis em estrutura, sendo a maioria, substâncias aromáticas. Os fitoterápicos podem ser mais eficientes que os medicamentos produzidos a partir da síntese química, mas para alcançar essa eficiência a produção dos mesmos devem seguir.

(14) 13. estudos prévios relativos aos aspectos botânicos, agronômicos, fitoquímicos, farmacológicos, toxicológicos, e de desenvolvimento de metodologias analíticas. A qualidade dos fitoterápicos vai além de um laudo de análise da matéria- prima vegetal, sendo considerada a estrutura da produção e a adoção de boas práticas de fabricação e de garantia de qualidade das plantas um requisito primordial na obtenção de matérias-primas vegetais e fitomedicamentos de qualidade (KLEIN et al., 2009). Cinnamomum zeylanicum Blume, conhecida como ―canela da-índia‖ e ―canela-doceilão‖ é originária do Sri Lanka e do sudoeste da Índia. O gênero Cinnamomum pertence à família Lauraceae é constituído por aproximadamente 350 espécies (LORENZI; MATOS, 2002). Apresenta odor suave e sabor adocicado levemente picante, usada na perfumaria, na culinária, como corretivo de odores e sabores. O óleo essencial da casca é rico em aldeído cinâmico e das folhas em eugenol usado na preparação de medicamentos (LIMA et al., 2005). Cinnamomum zeylanicum Blume, tem sido utilizada principalmente na medicina popular devido às propriedades antimicrobiana, antiparasitária, anti-inflamatória e antioxidante. Ainda são sugeridos benefícios cardiovasculares através da redução dos níveis sanguíneos de glicose, do colesterol sérico e da pressão sanguínea (RANASINGHE et al., 2013). O uso da casca da planta é indicado como aperiente, antidispéptico, antiflatulento e antiespasmódico (BRASIL, 2011). Ao extrato das folhas são descritas atividades antioxidante, antibiótica e antifúngica (WANG; WANG; YIH, 2008; DIAS, 2009; RANASINGHE et al., 2013). Quase todas as partes da planta têm algum uso culinário ou medicinal. A composição do óleo essencial varia consideravelmente em composição química, assim como em efeitos farmacológicos, conforme a parte da planta que é utilizada. Na raiz o principal constituinte é a cânfora, nas folhas, eugenol e na casca, cinamaldeído (RANASINGHE et al., 2013). Desse modo confere este trabalho realizar outros estudo da espécie C. zeylanicum sendo de grande relevância, tendo em vista a sua composição de substâncias ativas como protótipos para o desenvolvimento de fármacos e como fonte de matérias-primas farmacêutica para prevenção e manejo de doenças..

(15) 14. 2 OBJETIVOS. 2.1 OBJETIVO GERAL. O objetivo principal é estudar fitoquimicamente a espécie Cinnamomum zeylanicum bem como avaliar alguns de seus efeitos biológicos.. 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS  Estabelecer parâmetros fisíco-quimicos de controle de qualidade de C. zeylanicum;  Obter o extrato bruto das folhas de C. zeylanicum para realizar os bioensaios e identificar metabólitos com função terapêutica; . Avaliar o perfil fitoquímico do extrato de C. zeylanicum, quantificando os níveis de polifenois, flavonoides, e taninos;.  Análisar os o compostos fitoquimicos por CLAE;  Avaliar in vitro os efeitos antioxidantes do extrato de C. zeylanicum;  Avaliar a atividade antimicrobiana do extrato de C. zeylanicum pelo método in vitro;  Determinar os efeitos do extrato de C. zeylanicum sobre parâmetros protetores genotoxicológicos em culturas de leucócitos humanos;  Preparar, caracterizar e avaliar a formulação semissólida gel-creme-gel base e as contendo o extrato de C. zeylanicum nas concentrações 5%, 10% e 15%;  Avaliar a eficácia da formulação semissólida contendo o extrato de C. zeylanicum nas concentrações 5%, 10% e 15% em modelo experimental de dermatite de contato e verificar a atividade da NTPDase..

(16) 15. 3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA. 3.1 PLANTAS MEDICINAIS. As plantas medicinais são definidas como aquelas capazes de possuir princípios ativos com potencial terapêutico para o tratamento de diversas patologias de extrema importância para a recuperação e manutenção da saúde (LIMA; 2012). No Brasil, as plantas são utilizadas por aproximadamente 91% da população sendo que 46% da mesma mantêm o cultivo caseiro dessas plantas (ETHUR, 2011; VEIGA JUNIOR, 2008; LIMA; LIMA; DONAZZOLO, 2007). O uso de plantas medicinais para tratamento de várias doenças é oficialmente reconhecido pela Organização Mundial da Saúde (OMS) desde 1978 (OZAKI; DUARTE, 2006). Além disso, de acordo com a OMS, há a necessidade de valorizar o uso de medicamentos à base de plantas sendo que cerca de 70 % da população mundial depende das plantas medicinais como umas das principais formas de acesso aos cuidados básicos de saúde. (BRASIL, 2013b). Assim como outras terapias, as plantas medicinais fazem parte da chamada Medicina Tradicional, a qual se refere a conhecimentos, habilidades e práticas baseadas na teoria, crenças, experiências indígenas e de outras culturas. Essas terapias são usadas pela população na manutenção da saúde e na prevenção, na melhoria ou no tratamento de doenças físicas e mentais, podendo ainda ser chamada de Medicina Alternativa ou Complementar (BRASIL, 2012). Segundo Oliveira e Menini (2012), o estudo de plantas medicinais, a partir de seu emprego pelas comunidades, pode fornecer informações importantes para a elaboração de estudos farmacológicos e fitoquímicos sobre as espécies vegetais. Desta forma, pode-se planejar a pesquisa a partir do conhecimento empírico já existente, muitas vezes, consagrado pelo uso contínuo, que deve ter suas ações comprovadas cientificamente. Além disso, é importante validar a eficiência e garantir a segurança do uso das plantas medicinais, e, por isso, devem-se realizar estudos científicos e clínicos a fim de se obter documentações técnicas e validadas em compêndios oficiais ou publicações indexadas (BRASIL, 2012). Com a realização desses estudos foi possível obter comercialmente vários fármacos, como, por exemplo, o anticancerígeno paclitaxel, o analgésico morfina e o antibacteriano daptomicina. Morrison e Hergenrother (2013) relataram que desde 1960 até 2010, os produtos.

(17) 16. naturais ou derivados semissintéticos de produtos naturais serviram como fonte de 41% dos medicamentos anticancerígenos e 65% dos antibacterianos. Para a realização de pesquisas com plantas medicinais pode-se ter o envolvimento de várias etapas, como: investigações da medicina tradicional e popular (etnofarmacológico), isolamento, purificação e caracterização de princípios ativos (química orgânica, fitoquímica), investigações farmacológicas de extratos vegetais e constituintes químicos isolados (farmacologia), transformações químicas de princípios ativos (química orgânica sintética), estudo da relação estrutura/atividade e dos mecanismos de ação dos princípios ativos (química medicinal e farmacológica) e o desenvolvimento de formulações para a produção de fitoterápicos (MACIEL et al., 2002). Com a realização de alguns estudos citados anteriormente é possível obter um produto terapêutico originário de uma planta medicinal ou de seus derivados, exceto a partir de substâncias isoladas, com finalidade profilática, curativa ou paliativa (PNPIC, 2006). Esse produto é denominado de fitoterápico, sendo que a terapia realizada a partir da utilização de plantas medicinais em suas diferentes preparações, mas não constituídas de suas substâncias isoladas, é caracterizada como fitoterapia. No Brasil, a utilização dos produtos naturais a partir da fitoterapia vem se adequando às necessidades do atendimento primário de saúde (ELDIN; DUNFORD, 2001). Isso é devido à expansão da fitoterapia de uma forma geral, explicado, muitas vezes, pela preferência dos consumidores por tratamentos mais ―naturais‖. Além disso, houve o desenvolvimento de novos métodos analíticos para se obter o controle de qualidade e a crescente avaliação das propriedades farmacológicas das substâncias existentes nas espécies vegetais bem como o desenvolvimento de formas de apresentações dos produtos e o reduzido custo quando se tem produtos de origem vegetal (HOMAR, 2007). As propriedades farmacológicas de interesse das plantas são resultantes de sua composição principalmente devido a sua diversidade molecular e, por isso, tem estimulado a busca pelo conhecimento do seu metabolismo secundário, que é responsável pela síntese dos compostos vegetais dentre os quais são responsáveis, muitas vezes, pelas propriedades medicinais, aromáticas e curativas (ALVES, 2001). Algumas pesquisas têm mostrado prescrições médicas contendo produtos naturais e drogas relacionadas e que são usadas para tratar aproximadamente 87% de todas as doenças humanas (CHIN et al., 2006). Além disso, os metabólitos isolados podem servir como ponto de partida (protótipos) para síntese de novas substâncias através da química sintética moderna (BALUNAS; KINGHORN, 2005)..

(18) 17. Compostos secundários presentes no extrato bruto ou óleo essencial de plantas medicinais podem desempenhar funções importantes em interações planta-patógeno, através da ação farmacológica direta (MELLO et al., 2006; FRANZENER et al., 2007; SILVA et al., 2008), ou indireta, ativando mecanismos de defesa das plantas que venham a ser tratada com estes compostos (SCHWAN-ESTRADA; STANGARLIN, 2005). Com isso, substâncias são sintetizadas no metabolismo secundário das plantas podendo apresentar ação biológica diretamente contra patógenos (SCHWAN-ESTRADA et al., 2003).. 3.2 METABÓLITOS SECUNDÁRIOS E ATIVIDADES BIOLÓGICAS. As plantas medicinais normalmente contêm uma mistura de compostos químicos que podem agir individualmente, de forma aditiva ou de forma sinérgica para curar, por exemplo, uma enfermidade. Em uma planta é possível encontrar substâncias que podem auxiliar na digestão, compostos com ação anti-inflamatória que minimizam o inchaço e a dor, compostos com atividade antibactericida que agem como antibióticos naturais, podendo apresentar ação antioxidante, entre outros (EINBOND et al., 2004; SLOWING; CARRETERO; VILLAR, 1994; LOCHER et al., 1995). Com relação à composição das plantas, os metabólitos primários, por definição, são macromoléculas que se encontram na maioria das células vegetais e são necessários para a vida da planta como os açúcares, aminoácidos, proteínas e os ácidos nucléicos, responsáveis pela sobrevivência do vegetal e que participam dos processos de fotossíntese, respiração e assimilação dos nutrientes. Ainda sobre os constituintes de uma planta, os metabólitos secundários ou micromoléculas são importantes para a sobrevivência e a perpetuação das plantas em seu ecossistema, embora não necessariamente essenciais para o organismo produtor, sendo entre outros, os compostos fenólicos, terpenóides, óleos essenciais e alcaloides. Esses compostos, segundo estudos realizados, são os responsáveis pelos efeitos medicinais ou tóxicos das plantas, estando intimamente associados à estratégia de defesa dos vegetais (SIMÕES et al., 2010). Alguns fatores são diretamente condicionantes para a produção dos metabólitos secundários, bem como aos teores de princípios ativos que podem ser variáveis e estarem distribuídos de forma heterogênea na planta, influenciando, consequentemente na concentração e nas propriedades do produto vegetal. Neste sentido, diversos fatores que influenciam sua variabilidade precisam ser computados, dentre os quais se ressaltam os seguintes: localização geográfica e sazonalidade, como estação do ano, fotoperíodo (tempo e.

(19) 18. intensidade luminosa), temperatura, umidade, altitude, latitude, condições do solo (nutrientes e tipo de solo), além do período do dia da coleta (BRESOLIN; CECHINEL FILHO, 2010; HARAGUCHI; CARVALHO, 2010). No reino Plantae, a produção de metabólitos secundários promove adaptações evolutivas e exerce funções de proteção da espécie e, paralelamente, são estes que são utilizados para restabelecimento e promoção da saúde do ser humano (JIRSCHITZKA et al., 2012). Devido a isso, são atribuídas aos metabólitos secundários bioatividades como antioxidante, anticancerígena e antimicrobiana, propriedades propiciadas pelos vários fitoquímicos como compostos fenólicos, destacando-se os flavonoides, alcaloides, taninos, terpenos (DEWICK, 2002; BAG et al., 2012; JYOTHI; SESHAGIRI, 2012) e também lectinas (COWAN, 1999). A ação antiinflamatória e cicatrizante das plantas estão amplamente. relacionadas. aos. taninos. e. flavonóides. (ONWUKAEME,. 1995;. HOSSEINZADEH; YOUNESI, 2002; MANGA et al., 2004; RANE; MENGI, 2003; SALA et al., 2003; ASONGALEM et al., 2004). Os alcalóides são substâncias de natureza alcalina que possuem um nitrogênio heterocíclico em sua composição. São encontrados em representantes de todos os grupos vegetais, sendo sua maior ocorrência em Angiospermas. Essas substâncias possuem diversas funções. Nos vegetais eles atuam como defesas contra microorganismos e predadores e como protetores contra raios UV. No setor industrial, são reproduzidos a partir de moléculas pré-descobertas, como repelentes para herbívoros, devido a seu gosto amargo; como anticolinérgicos. (escopolamina),. diuréticos. (teofilina),. antitumorais. (vincristina),. antitussígenos (codeína) (SIMÓES, 2010). Os taninos são substâncias secundárias, responsáveis pela adstringência dos vegetais, apresentando massa molecular entre cerca de 500 e 3000 Dalton e são solúveis em água. São classificados tradicionalmente em: taninos hidrolisáveis, encontrados em dicotiledôneas herbáceas e lenhosas; e taninos condensados que ocorrem mais amplamente em gimnospermas e angiospermas (SANTOS; MELO, 2004). Eles atuam como captadores de radicais livres, e tem atividades antimicrobiana, antiviral, antifúngica, anti-diarréica e antiséptica (MONTEIRO et al., 2006a). Apresentam também a habilidade de se ligarem a proteínas precipitando as mesmas, oferecendo defesa a planta contra a herbivoria por dificultar a digestão dos animais (MCSWEENEY, 2001; GURIB-FAKIM, 2006). Os terpenos são substâncias cuja origem biosintética deriva de unidades do isopreno (BRUNETON, 1995). Os esqueletos dos terpenóides são formados pela condensação de um numero variável de unidades isoprênicas. Logo, unidades isoprênicas podem dar origem a.

(20) 19. mono e sesquiterpenos, formados por duas e três unidades de isopreno, respectivamente. Diterpenos são originários da junção de quatro cadeias isoprênicas e os triterpenos são derivados de um composto alifático de 30 carbonos, esqualeno, que dá origem aos diferentes grupos desses compostos, tais como a β-amirina e o β-sitosterol (PETIT; DIAS, 1969). Entre os metabólitos secundários, sobressaem-se os flavonoides, sendo as chalconas as precursoras desta ampla classe de substâncias de origem vegetal com importantes propriedades farmacológicas (BASILE et al., 2000; CUSHNIE; LAMB, 2005). São estruturas onipresentes, comumente encontradas em vinho, própolis, sementes, nozes, frutas e vegetais (BOIK, 2001; SIMÕES et al., 2010; CUSHNIE; LAMB, 2005; SAVOIA, 2012). Alguns exemplos de flavonoides são as catequinas provenientes de Camellia sinensis L., os quais possuem propriedades antitumoral (BOIK, 2001), anti-inflamatória e antiplaquetária, apresentando relevantes benefícios para o sistema cardiovascular (DEWICK, 2002; SIMÕES et al., 2010). Estes compostos fenólicos têm potente capacidade de eliminar radicais livres (COOK; SAMMAN, 1996; MANDALARI et al., 2007), além de apresentarem atividades analgésica, antialérgica e antimicrobiana, de regeneração de cartilagens e ossos (ORHAN et al., 2010; SUGAMOTO et al., 2011) e moduladora do sistema imune (MACHADO et al., 2008). Os potenciais benefícios à saúde propiciados pelos flavonoides também estão associados com a compatibilidade com o meio biótico (CLARDY; WALSH, 2004). Outra atividade relacionada aos flavonóides é sua ação antioxidante devido à presença de hidroxilas aromáticas (VESSALA et al., 2003). Alguns flavonóides como rutina e quercetina, têm mostrado melhores atividades antioxidantes do que o ácido ascórbico que é considerado um potente redutor (SOARES et al, 2005). A ação antioxidante está também relacionada à inibição do óxido nítrico que pode contribuir para as atividades imunoreguladoras e antiinflamatórias encontradas nas plantas (KIM et al., 1999).. 3.3 FORMULAÇÕES CONTENDO SUBSTÂNCIAS NATURAIS PARA APLICAÇÃO TÓPICA. Diante das importantes propriedades farmacológicas já verificadas a partir das plantas, o interesse do mercado nacional por novos medicamentos e inovação tem intensificado a fim de se obter formas farmacêuticas fitoterápicas, incluindo as de uso tópico. Dentre os fitoterápicos com aplicação tópica são citadas na literatura géis contendo Aloe barbadensis para tratamento de acne, Calêndula officinalis formulação de gel e pomada para tratar processos inflamatórios e de cicatrização (MACHADO et al., 2010; ROVERONI-.

(21) 20. FAVARETTO; LODI; ALMEIDA, 2009). Géis e cremes foram desenvolvidos com Curcuma longa ou com Hamamellis virginiana para tratar prurido, dermatite, inflamação e acne; Cordea verbenaceae para o tratamento de inflamações (SILVA; COUTO; BRESOLIN, 2012). Também foram estudados géis contendo Sechium edule para a avaliação da atividade antibacteriana e antifúngica (ORDÕNEZ et al., 2009). Além disso, Symphytum officinale foi verificado para o tratamento de osteoartrite a partir de cremes (SMITH; JACOBSON, 2011). Independentemente da forma farmacêutica a ser testada há sempre uma preocupação com o controle de qualidade e a garantia de segurança e eficácia dos fitoterápicos pretendidos (SILVA; COUTO; BRESOLIN, 2012). Nesse sentido, a obtenção de formas farmacêuticas derivadas de matéria-prima vegetal necessita de um planejamento inicial, com a finalidade de planejar o manejo adequado da matéria-prima vegetal e demais excipientes de acordo com as especificações dos mesmos, além da determinação sequencial das ações de transformação tecnológica e monitoramento dos pontos e metodologias de controle de qualidade mais apropriadas segundo as legislações e normatizações vigentes, para o desenvolvimento de fitoterápicos (TOLEDO et al., 2003; OLIVEIRA et al., 2007). Além disso, no caso de fitoterápicos, a escolha apropriada da forma farmacêutica e da via de administração requer considerações prévias a cerca da eficácia e segurança do marcador químico ativo presente na planta medicinal ou derivado intermediário, de modo que, durante a transformação do material vegetal em um produto tecnicamente elaborado, o fitoterápico, a qualidade seja assegurada pela preservação da integridade química e farmacológica do(s) marcador (es) químico(s) da planta, garantindo a constância de sua ação biológica e a segurança de sua utilização, além de valorizar seu potencial terapêutico (TOLEDO et al., 2003; OLIVEIRA et al., 2007; FERREIRA; LEITE, 2008). A partir disso é importante realizar o desenvolvimento de novos medicamentos com atividade terapêutica a partir de substâncias naturais visto que esses produtos de plantas em sua maioria genuinamente nacionais apresentam além da eficácia, também, segurança e que por isso devem ser amplamente estudados. A exemplo a espécie Cinnamomum zeylanicum composta por um grande grupo de substâncias química e que pode ser uma fonte promissora de matéria-prima vegetal para um fitoterápico. Dessa forma, faz-se necessário o entendimento desses compostos, pois é a partir deles que é obtida grande parte das atividades farmacológicas atribuídas ao gênero Cinnamomum..

(22) 21. 3.4 Cinnamomum zeylanicum Blume. O gênero Cinnamomum, pertencente à família Lauraceae, compreende cerca de 250 espécies distribuídas na Índia, China, Sri Lanka e Austrália, sendo conhecidas popularmente pelo nome de canela. É cultivada também em países tropicais da América do sul, como o Brasil, onde as maiores plantações encontram-se nas regiões Sul e Sudeste (CASTRO, 2010). É uma arvore que apresenta aproximadamente 15 m de altura, composta por folhas com formato oval-longo que são utilizadas extensivamente como especiarias em alimentos ou para produzir óleos essenciais, apresentando um sabor picante que exala um odor caracteristico quando esmagadas e flores com coloração esverdeada. Cinnamomum zeylanicum composto majoritariamente pelo cinamaldeído bem como β-cariofileno, linalol e outros terpenos. Cinamaldeído é o principal constituinte do óleo essencial extraído das casca de canela e fornece o odor e sabor característico da espécie, sendo utilizada como aditivos alimentares e aromatizadores dos alimentos, fazendo parte da lista da Food and Drog Administration como ‖Generally Recognized as Safe-GRAS que designa compostos seguros para seu uso e que não apresentam efeitos potencialmente adversos à saúde humana. (RANASINGHE et al., 2013). Com relação aos compostos são encontrados na folha, o acetato de cinamila, o eugenol, e anetol. Na raiz, o principal constituinte é a cânfora, sendo que na casca, o cinamaldeído é o principal da espécie (JANTAN et al., 2002; JANTAN et al., 2004). C. zeylanicum, canela-do-ceilão como é conhecido também, possui sinonímia de Cinnamomum verum. A sua casca quando seca contém 1,2% de óleo volátil, sendo 60% constituído pelo cinamaldeído. Esse óleo possui aroma característico de aldeído cinâmico e sabor picante e adocicado. A Cinnamomum cássia, canela-da-china é menos aromático que a canela do ceilão e possui aroma característico de mucilagem, seu sabor é levemente adocicado. Com relação à casca quando seca contém 1% de óleo volátil, constituído de 70% a 90% de trans-cinamaldeído (BRASIL, 2010)..

(23) 22. Figura 1 – Aspecto geral de Cinnamomum zeylanicum Blume. Fonte: Autora.. C. zeylanicum apresenta a partir de sua composição química atividades farmacológicas como antimicrobiana, antiparasitária, anti-inflamatória e antioxidante. Ainda são atribuídos benefícios cardiovasculares devido à redução dos níveis sanguíneos de glicose, do colesterol sérico e da pressão sanguínea (RANASINGHE et al., 2013).O uso da casca dessa planta é indicado como aperiente, antidispéptico, antiflatulento e antiespasmódico (BRASIL, 2011). A partir do extrato das suas folhas são descritas atividades antioxidante, antibiótica e antifúngica. (WANG; WANG; YIH, 2008; DIAS, 2009; RANASINGHE et al., 2013). Estudos realizados têm demonstrado efeitos de diferentes alimentos funcionais na Síndrome Metabólica (SM) e seus componentes (colesterol, triglicerídeos, glicose, pressão arterial, etc.) sendo a canela (Cinnamomum sp.) um destes alimentos. Isso é devido aos polifenóis encontrados na canela que podem melhorar os componentes da SM e reduzir os riscos de fatores associados com diabetes e doenças cardiovasculares. Experimentos em indivíduos com SM, Diabetes Mellitus (DM) tipo 2 e síndrome dos ovários policísticos, demonstram efeitos benéficos relacionados à glicose, insulina, lipídios e antioxidantes quando foi utilizado o extrato aquoso de canela. Além disso, efeitos na composição da massa corporal magra e na resposta inflamatória também foram verificados (ANDERSON, 2008). Além disso, a partir do óleo volátil das cascas e folhas de Cinnamomum verum foi verificado a atividade antibacteriana frente às cepas de E.coli O157:H7, Salmonella Typhimurium, Staphylococcus aureus e Listeria monocytogenes. Um estudo demonstrou.

(24) 23. diferença quantitativa nos perfis inibitórios pelo óleo obtido pelas diferentes partes da planta, sendo o óleo da casca mais efetivo que o óleo volátil obtido das folhas. Isso pode ser explicado a partir da análise fitoquímica da composição do óleo que revela uma diferença qualitativa nos teores dos compostos, uma vez que, nas folhas, o eugenol (63%) apresenta-se como a substância majoritária, diferentemente do óleo das cascas que apresenta cinamaldeído (87%) (OUSSALAH et al., 2007). Análises realizadas com o extrato das folhas de Cinnamomum verum demonstraram a capacidade antioxidante e a de eliminação de radicais livres. Isso foi observado em um estudo, em que a intensa atividade antioxidante frente a radicais livres, especialmente pelo método de DPPH (125 µg/3mL) e ABTS (concentrações acima de 75 µg/1,1 mL), resultou em um promissor uso frente a inibição da peroxidação lipídica em emulsões de ácido linoleico (MATHEW; ABRAHAM, 2006). Sendo assim, a canela, a qual é utilizada como um agente aromatizante em alimentos ou chá pode atuar, também, como um potente antioxidante, podendo ser utilizada em indivíduos que têm doenças relacionadas ao estresse oxidativo (RANJBAR et al., 2006). Um estudo de revisão sobre plantas medicinais descreve C. zeylanicum como sendo uma espécie que foi e continua sendo de grande relevância, tendo em vista a sua composição de substâncias ativas como protótipos para o desenvolvimento de fármacos e como fonte de matérias-primas farmacêutica para prevenção e manejo de doenças cardiovasculares, hipertensão, diabetes e devido a suas propriedades antioxidantes (RAHMATULLAH et al., 2009). Nesse sentido, faz-se importante o conhecimento dos principais compostos, pois é a partir deles que é obtida grande parte das atividades farmacológicas atribuídas ao gênero Cinnamomum. Além disso, a realização de estudos in vitro e in vivo como métodos alternativos para avaliação biológica assegurando a eficácia e segurança para uso de formulações e medicamentos fitoterápicos contendo substâncias naturais como a canela (BARRY, 2004)..

(25) 24. 4 MANUSCRITOS. MANUSCRITO I. . Análise fitoquimica, dosagens de fenólicos, taninos e flavonoides e avaliação das atividades antioxidante, antimicrobiana e antigenotóxica do extrato das folhas de Cinnamomum zeylanicum.. - Manuscrito a ser submetido à revista “Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences”.. MANUSCRITO II.  Análise fitoquimica por HPLC-DAD e Desenvolvimento de formulação Creme-gel contendo extrato de Cinnamomum zeylanicum Blume (Canela): Avaliação em modelo experimental de dermatite de contato. - Manuscrito a ser submetido à revista “Journal of Pharmacy and products”..

(26) 25. 4.1 MANUSCRITO I ANÁLISE FITOQUIMICA, DOSAGENS DE FENÓLICOS, TANINOS E FLAVONOIDES E AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES ANTIOXIDANTE, ANTIMICROBIANA E ANTIGENOTÓXICA DO EXTRATO DAS FOLHAS DE Cinnamomum zeylanicum. COSSETIN, F. J.1; COSSETIN, F. L.1; MAZIERO, M.1; CUELHO, C.1; DORNELLES, R. C.1; MANFRON, M. P.1 1 Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, RS, Brazil. *1476, Venâncio Aires Street, 1476 - apartment 409. ZIP CODE: 97015-190. Neighborhood: City Centre. Santa Maria, Rio Grande do Sul, Brazil. e-mail: jocelenecossetin@yahoo.com.br. Parents: Joselino Cossetin and Clarilene Fátima Filippin Cossetin. RESUMO Cinnamomum zeylanicum é uma espécie pertencente à família Lauraceae e é conhecida popularmente como canela sendo utilizada na medicina popular como antimicrobiano, antiparasitária, anti-inflamatório e antitérmico. O objetivo deste trabalho foi realizar a caracterização físico-química e investigar as atividades antioxidante, antimicrobiana e antigenotóxica nas folhas desta espécie. Na caracterização físico-quimica, por meio de testes farmacopéicos foi utilizado droga vegetal seca e não houve variação significativa da amostra coletada. Na extração hidroetanólica (70%), o rendimento do extrato bruto (EB) foi de 22,94%. O EB das folhas de C. zeylanicum apresentou compostos do metabolismo secundário como. alcalóides,. saponinas,. flavonoides,. taninos. e. cumarinas.. Por. doseamento. espectroscópico foram determinados polifenóis, flavonoides e taninos no EB. C. zeylanicum apresentou atividade antioxidante qualitativamente por CCD por apresentar manchas amarelas que caracterizam a atividade antioxidante do extrato e quantitativamente um valor de CE50 e IAA de 12,88µg/mL e 15,91% pelo método DPPH. Além disso, a espécie apresentou, também, atividade antimicrobiana frente à E. coli, K. pneumonia, S. aureus e P. aeruginosa pelo método de microdiluição em caldo e atividade antigenotóxica analisadas em cultura de leucócitos humanos pelos teste de viabilidade e proliferação celular, ensaio cometa e frequência de micronúcleos. Nestes últimos testes, todas as concentrações CzE1 µg/mL e CzE10 µg/mL de extrato demonstraram que reverteram o dano genotóxico causado pelo peroxido de hidrogênio. Portanto, os parâmetros físico-químicos estabelecidos para C. zeylanicum possibilitam controle de qualidade da droga dessa espécie, e esta apresentou atividades, antioxidante, antimicrobiana e antigenotóxica. Palavras-chave: Lauraceae. Controle físico-quimica. Extrato. Canela..

(27) 26. 1 INTRODUÇÃO As plantas medicinais constituem fontes de substâncias ativas com potencial terapêutico usado no tratamento de doenças. A avaliação dos efeitos farmacológicos pode ser usada como estratégia para descobrir novos fármacos de origem vegetal. Estas podem ser processadas e administradas de diversas formas, tais como, por exemplo, xaropes, infusões, óleos essenciais, pomadas, bálsamos, comprimidos ou cápsulas, sendo indicadas para ajudar a combater patologias crônicas e agudas, como, por exemplo, doenças cardiovasculares, inflamações ou problemas gástricos. Estas plantas são ricas em vários compostos, tais como, flavonóides, taninos, etc., sendo que muitos deles apresentam propriedades antioxidantes (BENZIE; WACHTEL, 2011). Vários estudos têm evidenciado os potenciais antioxidantes e antimicrobianos de uma grande variedade de frutas e de vegetais (TAGURI et al., 2006; ASOLINI et al., 2006). O consumo frequente de frutas e vegetais tem sido associado à baixa incidência de doenças degenerativas, tais como câncer, doenças cardíacas, inflamatórias e do sistema imunológico, além de disfunções neurológicas e de cataratas. Esses fatos estão relacionados com a presença de vários compostos antioxidantes nas frutas e nos vegetais (TAGURI et al., 2006; ASOLINI et al., 2006). Os antioxidantes têm como função impedir que os radicais livres danifiquem as células e os tecidos (FOGLIANO et al., 1999). Na indústria alimentícia, o uso de antioxidantes não é recente; no entanto, nota-se uma tendência em substituir antioxidantes artificiais por naturais (AMAROWICZ et al., 2004). As principais classes de antioxidantes que podem estar presentes naturalmente nos alimentos são os compostos fenólicos (ácidos fenólicos, flavonoides e taninos), carotenoides, tocoferóis, ácido ascórbico e seus derivados (VELIOGLU et al., 1998; AMAROWICZ et al., 2004). A atividade antibacteriana de vários polifenóis e extratos de plantas também foram avaliados em estudos farmacêuticos e em alimentos (TAGURI et al., 2006; AHN et al., 2007). Alguns compostos fenólicos tais como os de sálvia, alecrim, tomilho, lúpulo, coentro, cravo e manjericão são conhecidos por possuírem efeitos antimicrobianos contra patógenos alimentares (AHN et al., 2007). A OMS estima que 80% da população em países em vias de desenvolvimento utilize a medicina tradicional à base de plantas como fonte primária para tratar e controlar diferentes patologias (TAMAYO, 2006). Contudo, há que ter em conta que as plantas medicinais não podem ser utilizadas para o tratamento de todas as patologias e em qualquer paciente, e que.

(28) 27. não estão isentas de efeitos secundários, nem de contraindicações e interações (FERREIRA; PINTO, 2010). Cinnamomum zeylanicum Blume, conhecida popularmente como canela-da-Índia, espécie usada mundialmente na perfumaria e na culinária, como corretivo de odores e sabores, sendo seu óleo essencial usado na preparação de alguns medicamentos. Partes da planta (casca, frutos e folhas) apresentam propriedades estimulante, tônica, carminativa e antiespasmódica (ALMEIDA, 1993). Na canela, a constituição química varia significativamente em relação às distintas partes da planta, a casca é rica em aldeído cinâmico e a folha é fonte de eugenol (KOKETSU et al., 1997). O eugenol foi citado em diversos trabalhos como inibidor do crescimento microbiano (FARIA et al., 2006; LEMOS et al., 2005; PEREIRA et al., 2004), apresentando interesse como matéria-prima em síntese de produtos naturais biologicamente ativos e produtos farmacêuticos. Segundo Santurio e colaboradores (2007), o óleo essencial extraído da canela apresenta um potencial antimicrobiano significativo frente a bactérias e fungos. Dentro deste contexto, a presente pesquisa experimental foi desenvolvida com objetivo preparar um extrato hidroalcoólico apartir das folhas de C. zeylanicum, visando determinar parâmetros físico-quimicos de qualidade da droga vegetal e caracterizar os compostos químicos do metabolismo secundário. Como também Investigar a atividade antioxidante, antimicrobiana e antigenotóxica no extrato bruto de C. zeylanicum. 2 MATERIAL E MÉTODOS. 2.1 Coleta do material vegetal. Aproximadamente 600 g de folhas foram coletadas da espécie C. zeylanicum na cidade de Cruz Alta, na localidade de Capão Grande, Latitude -28° 45' 34" Sul e longitude 53° 32' 07" Oeste nos meses de junho e julho de 2013. Uma amostra está depositada no herbário do Departamento da Biologia (SMDB) UFSM sob-registro 16.750.. 2.2 Obtenção do extrato. As folhas de C. zeylanicum foram secas em estufa de ar circulante à temperatura de aproximadamente de 40ºC e reduzido a pó, por meio de moinho de facas. O extrato hidroalcoólico (70%) das folhas foi obtido por maceração com renovação de solventes por um.

(29) 28. período de 30 dias. O extrato foi concentrado em evaporador rotatório e liofilizado. Calculouse o rendimento total do extrato, de acordo com a fórmula (1): Re = (Pext /Pfolhas) x 100. (1). Onde: Re = Rendimento total do extrato (%); Pext = Peso do extrato seco (g); Pfolhas = Peso das folhas secas moídas (g).. 2.3 Parâmetros físico-químicos de qualidade da droga vegetal O controle de qualidade da droga (material estranho, determinação de água, índice de intumescência, conteúdo total de cinza e cinza insolúvel em ácido) foi realizado em triplicata, de acordo com a Farmacopeia Brasileira (2010).. 2.4 Análise fitoquímica. A avaliação fitoquímica preliminar foi analisada conforme Moreira (1979) e Costa (1982) com modificações por reações de caracterização de metabolitos secundários com reagentes específicos e por cromatografia em camada delgada (CCD). Foram cromatografadas em Sílica gel GF254 e eluidas com solventes específicos para cada grupo químico a serem identificados. Para a caracterização dos grupos de metabólitos foi utilizado método específicos. Os alcalóides foram avaliados a partir de Reações de Wagner, Dragendorff; antraquinonas (heterosídeos livres e Antraquinônicos); flavonoides (Shinoda, Salkowiski e teste de espuma); taninos (cloreto férrico e acetato de chumbo) e cumarinas (KOH/Solução alcóolica).. 2.5 Doseamento de fenólicos, flavonoides e taninos. O doseamento dos polifenóis foi determinado pelo método de Folin – Ciocalteau, conforme Chandra e Meija (2004) modificado, utilizando como padrão ácido gálico. As leituras das amostras foram feitas com espectrofotômetro Shimadzu UV 1021, a 730nm e em triplicata. A concentração de polifenois foi determinada por interpolação da absorbância da.

(30) 29. amostra com a curva de calibração obtida com o padrão e expressos em miligramas de equivalentes de ácido gálico por grama de extrato vegetal. Os flavonoides foram dosados de acordo com Rio (1996) modificado, utilizando como padrão rutina. As leituras das amostras foram realizadas em espectrofotômetro Shimadzu UV1021, a 425 nm e em triplicata. Os taninos foram quantificados pelo método da vanilina 4% em solução metanólica de acido clorídrico, utilizando como padrão catequina conforme Agostini-Costa e colaboradores (1999). As leituras das amostras, em triplicata, foram realizadas em espectrofotômetro Shimadzu UV1021, a 490 nm. A concentração de taninos foi determinada por interpolação da absorbância da amostra com a curva de calibração obtida com o padrão e expressos em miligramas de equivalentes de catequina por grama de extrato vegetal. 2.6 Determinação do potencial antioxidante O potencial antioxidante foi avaliado in vitro frente ao radical livre 1, 1-difenil-2picrilhidrazil. (DPPH),. por. CCD. (qualitativamente). e. por. espectrofotometria. (quantitativamente). 2.6.1 Atividade antioxidante em CCD A atividade antioxidante de C. zeylanicum foi avaliada a partir da aplicação do extrato em cromatoplacas de alumínio (Sílica gel GF254) e eluidas em sistema de eluente (Clorofórmio: metanol; 8,5: 3,5). Como referência de atividade antioxidante foi empregado ácido cafeico, quercetina e rutina. Após a eluição e evaporação total do eluente, nebulizou-se a cromatoplaca com solução de DPPH 0,004% em metanol. A cromatoplaca foi armazenada no ambiente escuro por 30 min a temperatura ambiente e, após, fez-se a leitura, que é caracterizada pela formação de manchas amareladas comparáveis com as observadas pelo padrão (CHOI et al., 2002). 2.6.2 Eficiência antioxidante por espectrofotometria O potencial antioxidante foi avaliado pelo método fotocolorimétrico do DPPH, de acordo com Choi e colaboradores (2002). Prepararam-se soluções do extrato, do DPPH e do padrão acido ascórbico em etanol. As leituras das soluções foram feitas em triplicata em espectrofotômetro Schimadzu UV (518nm). A porcentagem de inibição do radical DPPH pelas amostras foi calculada de acordo com a equação (2):.

(31) 30. AAO% = 100 – [(Abs da amostra- Abs do branco) x100/ Abs.controle negativos.]. (2). A concentração eficiente (CE50) é a quantidade de antioxidante necessária para decrescer a concentração inicial de DPPH em 50%. A partir de uma curva (regressão), plotando-se na abscissa as concentrações da amostra e na ordenada, a proporção da atividade antioxidante (AAO%). Os dados foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade, utilizando-se o programa computacional SIGMASTAT 2.0. O índice de atividade antioxidante (IAA) foi calculado correlacionando-se a massa de DPPH (µg. mL-1) com CE50 (µg.mL-1) conforme Equação (3): IAA =[mDPP/ CE50] mDPPH: massa de DPPH e CE50: Concentração efetiva.. (3). 2.7 Atividade antimicrobiana Para a avaliação da atividade antimicrobiana do extrato utilizou-se o método de microdiluição em caldo de acordo como Clinical and Laboratory Standards CLSI M7A6 (2003) para bactérias. Os inóculo em solução salina 0,85% foram preparados pelo método espectrofotométrico, resultando em suspensão 5x105 UFC/mL para bactérias. Foram realizadas diluições seriadas nas concentrações de extrato 1.000 µg/ml até 2mg/mL em dimetilsulfóxido no extrato bruto. Os testes foram realizados em microplacas estéreis de poliestireno em meio ao caldo Muller-Hinton para bactérias. As cavidades das placas de microdiluição contendo 100 µL do extrato vegetal foram inoculadas com 100 µL de suspensão bacteriana. A cavidade do controle positivo continha 0,1 mL do inóculo e 0,1mL do meio, sem extrato. Os ensaios foram realizados em duplicata. As placas foram incubadas por um período de 24h a 35-37°. Após o período de incubação, observou-se o crescimento microbiano indicado pelo aparecimento de turvação. Através deste método, determinou-se a menor concentração da amostra vegetal capaz de inibir o crescimento microbiano, chamada de concentração Inibitória Mínima (CIM). A avaliação da atividade antibacteriana in vitro, foi realizada com cepas ATCC e isolados clínicos obtidos no Hospital Universitário de Santa Maria (HUSM) (tabela 1)..