Curso temporal de alterações fisiopatológicas em um modelo de sepse experimental em camundongos: perfil de expressão das enzimas óxido nítrico sintases

Texto

(1)Bettina Tomio Heckert. CURSO TEMPORAL DE ALTERAÇÕES FISIOPATOLÓGICAS EM UM MODELO DE SEPSE EXPERIMENTAL EM CAMUNDONGOS: PERFIL DE EXPRESSÃO DAS ENZIMAS ÓXIDO NÍTRICO SINTASES.. Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Santa Catarina, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Farmacologia.. FLORIANÓPOLIS – SC 2008.

(2) AGRADECIMENTOS. Agradeço ao Prof. Dr. Jamil Assreuy pela confiança em mim depositada, pelos muitos ensinamentos e pela agradável relação de amizade que mantivemos durante esses dois anos de convivência. À coordenação do Programa de Pós Graduação em Farmacologia, pela dedicação em atender às necessidades dos alunos. Ao Prof. Tadeu Lemos, pelo grande auxílio desde o início do curso. Ao Prof. Dr. João Batista Calixto, pela disponibilização de equipamentos importantes para este trabalho. Aos funcionários do Departamento de Farmacologia, pela ajuda prestada. A todos os colegas e amigos do NOLAB, pelo companheirismo e espírito de equipe, mas principalmente pelas boas conversas, risadas, cervejas, almoços e cafés da tarde, que deixam muitas saudades. Em especial à Letícia K. Pacheco, por participar de todos os experimentos sempre com disposição, principalmente durante as cirurgias e coletas de material. À Elaine Anton, pelo valioso auxílio técnico, fundamental à realização dos experimentos de Western blotting. Às demais pessoas diretamente envolvidas na prática deste trabalho, Gustavo, Regina, Daniel, Ângela e Edir, por seu envolvimento em muitos experimentos. À Adriane Madeira, pelo suporte técnico essencial à rotina do laboratório..

(3) Aos colegas da turma de mestrado, mas principalmente à Fernanda Basei, pelas inúmeras conversas de corredor sempre muito produtivas a respeito da técnica Western blotting. À minha família, pelo grande apoio e incentivo em todos os momentos. Ao meu namorado Guilherme pelo companheirismo e muito incentivo desde o meu ingresso no curso de mestrado, além da grande ajuda prestada e especialmente na reta final deste trabalho. À Cristália produtos Farmacêuticos (São Paulo, Brasil), pela doação da heparina utilizada em nossos experimentos. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico pelo apoio financeiro..

(4) LISTA DE FIGURAS. Figura 01 - Curva de sobrevivência de animais submetidos à CLP....................... 21 Figura 02 - Níveis plasmáticos de nitrato + nitrito (NOx) em animais naive, sham e submetidos à CLP................................................................................. 22 Figura 03 - Níveis plasmáticos de uréia e creatinina em animais naive, sham e submetidos à CLP...................................................................................23 Figura 04 - Níveis plasmáticos da enzima transaminase hepática (TGP) em animais naive, sham e submetidos a CLP..............................................24 Figura 05 - Níveis de glicose plasmática em animais naive, sham e submetidos à CLP.........................................................................................................25 Figura 06 - Temperatura corporal de animais sham e submetidos a CLP...............26 Figura 07 - Pressão arterial média em animais sham e submetidos a CLP.............27 Figura 08 - Dosagem da atividade da enzima MPO em pulmão de animais naive, sham e submetidos à CLP.............................................................28 Figura 09 - Extravasamento plasmático, medido pela exsudação de azul de Evans, em animais naive, sham e CLP..............................................................29 Figura 10 - Quantificação da expressão de NOS-1 em pulmão de animais naive, sham e submetidos à CLP......................................................................31 Figura 11 - Quantificação da expressão de NOS-2 em pulmão de animais naive, sham e submetidos à CLP......................................................................32.

(5) Figura 12 - Quantificação da expressão de NOS-3 em pulmão de animais naive, sham e submetidos à CLP......................................................................33 Figura 13 - Comparação da expressão de três isoformas da NOS em pulmão de animais sham e submetidos à CLP........................................................34 Figura 14 - Quantificação da expressão de NOS-1 em coração de animais naive, sham e submetidos à CLP......................................................................35 Figura 15 - Quantificação da expressão de NOS-2 em coração de animais naive, sham e submetidos à CLP......................................................................36 Figura 16 - Quantificação da expressão de NOS-3 em coração de animais naive, sham e submetidos à CLP......................................................................37 Figura 17 - Comparação da expressão de três isoformas da NOS em coração de animais sham e submetidos à CLP.........................................................38.

(6) LISTA DE ABREVIATURAS. CASP. - Introdução de cateter no cólon ascendente. CLP. - Ligadura e perfuração do ceco. EDRF. - Fator relaxante derivado do endotélio. EPM. - Erro padrão da média. HSP. - Proteína de choque térmico. i.p.. - Intraperitoneal. i.v.. - Intravenoso. s.c.. - Subcutâneo. IL-1. - Interleucina-1. IL-6. - Interleucina-6. LPS. - Lipopolissacarídeo. LTA. - Ácido lipoteicóico. MPO. - Mieloperoxidase. NO. - Óxido nítrico. NO2. - Nitrito. NO3. - Nitrato. NOS. - Óxido nítrico sintase. TNF. - Fator de necrose tumoral. PAF. - Fator de ativação plaquetária. PBS. - Solução salina tamponada com fosfato. TGP. - Transaminase pirúvica.

(7) RESUMO A sepse é uma condição de resposta inflamatória sistêmica secundária à infecção, podendo evoluir para falência de múltiplos órgãos, hipotensão arterial refratária a vasoconstritores e finalmente morte. Neste trabalho foi caracterizado o curso temporal do perfil de expressão das três isoformas da óxido nítrico (NO) sintase simultaneamente com diversos parâmetros bioquímicos e fisiológicos em um modelo de sepse experimental (ligadura e perfuração do ceco; CLP) em camundongos. Os níveis plasmáticos de NOx elevaram-se a partir de 6 horas e marcadores de lesão orgânica a partir de 12 horas após a CLP. Os níveis de glicose no plasma aumentaram inicialmente (2 horas) seguidos de hipoglicemia profunda e persistente. O recrutamento de neutrófilos para o pulmão ocorreu a partir de 24. Foi detectada uma hipotensão muito precoce (30 minutos) e retorno aos valores normais por volta de 16 horas. Nenhum aumento de permeabilidade vascular foi detectado em pulmão e coração, enquanto que no coração houve redução e no rim e baço aumento progressivo. A expressão das três isoformas da NOS foi estudada no tecido pulmonar e cardíaco. A NOS-2 mostrou um pico de expressão em 6-12 horas após a cirurgia. A NOS-3 elevou-se 6 horas após a cirurgia e permaneceu elevada até o fim do experimento. Já a NOS-1 só começou a elevar-se 12 horas após a cirurgia. Em conjunto, os resultados encontrados caracterizam o decurso temporal do modelo CLP em camundongos e mostram que a NOS-2 é responsável pela grande produção de NO no início da sepse, mas que as isoformas constitutivas podem desempenhar papel importante nos estágios mais tardios. A correlação da quantidade das três isoformas com os demais parâmetros sugere que o NO da NOS-2 está temporalmente associado com várias alterações da sepse, mas não com outras como a hiperglicemia..

(8) ABSTRACT Sepsis is a systemic inflammatory response secondary to infection, which can evolve to multiple organ failure, hypotension refractory to vasoconstrictors and death. In this work we characterized the time course of the three isorforms of nitric oxide (NO) synthase, simultaneous to biochemical and physiological parameters using an experimental sepsis model (cecal ligation and puncture, CLP) in mice. Plasma NOx levels rose within 6 hours and organ damage markers within 12 hours after CLP. Glucose plasma levels early raised (2 hours) followed by deep and persistent hypoglycemia. Neutrophil recruitment to lung started at 24 hours. Hypotension started early (30 minutes) and blood pressure returned to normal levels around 16 hours. No increase in vascular permeability was detected in lung and heart; it decreased in the heart, and increased progressively in kidney and spleen. Expression of NOS isoforms was studied on lung and heart. NOS-2 expression peaked at 6-12 hours after surgery. NOS-3 levels raised 6 hours after surgery and stayed high until the end of the experiment. NOS-1 began to rise only 12 hours after surgery. Together, these results characterize the time-course of CLP model in mice and show that NOS-2 is responsible for great NO production in early sepsis, but NO from the constitutive isoforms may have an important role on the late stages of sepsis. Correlation of NOS isoforms expression pattern with the other parameters suggests that NO from NOS-2 is temporally associated with many sepsis alterations, but not with others like hyperglycemia..

(9) SUMÁRIO Lista de Figuras............................................................................................................i Lista de Abreviaturas...................................................................................................iii Resumo.......................................................................................................................iv Abstract......................................................................................................................v I – INTRODUÇÃO.......................................................................................................1 1.1.. Sepse................................................................................................................1. 1.1.1. Definição e epidemiologia.................................................................................1 1.1.2. Fisiopatologia....................................................................................................2 1.1.3. Sepse e óxido nítrico.........................................................................................4 1.2.. Modelos experimentais de sepse......................................................................6. 1.3.. Óxido nítrico sintases (NOS)............................................................................8. II – OBJETIVOS.........................................................................................................11 2.1.. Objetivo geral..................................................................................................11. 2.2.. Objetivos específicos......................................................................................11. III – METODOLOGIA.................................................................................................12 3.1.. Animais...........................................................................................................12. 3.2.. Modelo de septicemia por ligadura e perfuração do ceco (CLP)....................12. 3.3.. Avaliação da sobrevida...................................................................................13. 3.4.. Coleta de sangue e de órgãos........................................................................13. 3.5.. Dosagens bioquímicas no plasma..................................................................13. 3.5.1. Dosagem de glicose......................................................................................13 3.5.2. Dosagem de uréia...........................................................................................14 3.5.3. Dosagem de creatinina...................................................................................14 3.5.4. Determinação dos níveis de nitrato e nitrito (NOx)..........................................15 3.5.5. Dosagem da enzima Transaminase Pirúvica (TGP) plasmática.....................15.

(10) 3.6.. Dosagem da enzima mieloperoxidase (MPO) em pulmão..............................16. 3.7.. Avaliação do extravasamento plasmático.......................................................16. 3.8.. Avaliação da pressão arterial..........................................................................17. 3.9.. Imunoeletroforese...........................................................................................18. 3.9.1. Preparação de amostras................................................................................18 3.9.2. Separação de proteínas e imunodetecção.....................................................18 3.9.3. Stripping de membrana............................................................................20 3.10. Desenho experimental....................................................................................20 3.11. Análise estatística..........................................................................................20 3.12. Compostos e reagentes..................................................................................20 IV – RESULTADOS..................................................................................................22 4.1.. Avaliação da sobrevivência de animais submetidos à cirurgia de. ligadura e perfuração do ceco...................................................................................22 4.2.. Níveis plasmáticos de nitrato + nitrito (NOx)...................................................23. 4.3.. Níveis plasmáticos de uréia e creatinina.........................................................24. 4.4.. Níveis plasmáticos da enzima transaminase pirúvica (TGP)..........................25. 4.5.. Concentração plasmática de glicose..............................................................26. 4.6.. Medida da temperatura corporal...................................................................27. 4.7.. Pressão arterial média (PAM).......................................................................28. 4.8.. Atividade da mieloperoxidase no pulmão......................................................29. 4.9.. Extravasamento plasmático...........................................................................30. 4.10. Expressão das isoformas da NOS em pulmão...............................................31 4.11. Expressão das isoformas da NOS em coração.............................................35 V – DISCUSSÃO......................................................................................................40 VI – CONCLUSÕES.................................................................................................53.

(11) VII – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................54.

(12) I. INTRODUÇÃO 1.1. Sepse 1.1.1. Definição e epidemiologia Um grave problema de saúde pública mundial, a sepse é uma condição caracterizada por infecção grave associada à reação inflamatória sistêmica. No ano de 1991, na Conferência de Consenso feita pelo American College of Chest Physicians and the Society of Critical Care Medicine, foram estabelecidos critérios para a classificação de sepse e doenças similares (Bone et al., 1992). Foi a partir de então que a sepse ficou definida como a situação em que o paciente apresenta resposta inflamatória sistêmica (SIRS) associada a um quadro infeccioso (ver Quadro 1). Esta padronização foi muito importante na clínica, para detecção da fase de evolução da doença em que o paciente se encontra e possibilidade de intervenção terapêutica adequada. SIRS:. Conjunto. de. manifestações. clínicas. à. agressão. orgânica. grave,. necessariamente na ausência de infecção. Presença de dois ou mais dos seguintes sintomas: temperatura >38ºC ou <36ºC; freqüência cardíaca >90 bpm; freqüência respiratória >20 movimentos/minuto; leucometria >12.000/mm3 ou <4.000/mm3, ou ainda, presença de >10% de bastões. Sepse: Situação em que há presença dos sinais e sintomas descritos acima (SIRS) secundários a um processo infeccioso. Sepse Grave: Quadro de sepse associada à disfunção orgânica, hipotensão e hipoperfusão tecidual. Choque séptico: Sepse grave com hipotensão arterial e alteração perfusional persistentes à reposição volêmica adequada. Quadro 1 – Definição de sepse e condições similares, conforme estabelecido na Conferência de Consenso feita pelo American College of Chest Physicians and the Society of Critical Care Medicine, no ano de 1991..

(13) Apesar dos grandes avanços na Medicina Intensiva, a incidência de sepse vem aumentando nos últimos anos, sendo considerada a principal causa de morte em unidades de tratamento intensivo não-coronarianas. Anualmente, em todo o mundo, ocorrem cerca de 18 milhões de casos de sepse grave. No Brasil, a sepse é a doença geradora de maiores custos aos setores públicos e privados. Em 2003 os gastos com pacientes de UTI somaram 17,34 bilhões de reais, o que representa cerca de 30 a 35% dos gastos totais com saúde no país (Andrade et al., 2006). As mais freqüentes fontes de infecção que podem desencadear o desenvolvimento da sepse são de origem pulmonar, abdominal, urinária, cutânea e cateteres vasculares. Os microorganismos causadores são na maioria bactérias, embora uma parcela dos casos seja originada por infecções virais ou fúngicas. O choque séptico é uma complicação em pelo menos 50-60% de bacteremias gramnegativas e de 5-10% bactérias gram-positivas ou fungos.. Acredita-se que o. aumento na incidência da síndrome seja devido ao crescente número de pacientes imunodeprimidos, uso freqüente de procedimentos invasivos, freqüência no uso de antibióticos (geração de mais microrganismos resistentes), além do aumento da expectativa de vida, que aumenta o número de pacientes idosos (Rangel Frausto, 2005). 1.1.2. Fisiopatologia Componentes dos microorganismos estimulam algumas células do sistema imune, desencadeando a reação sistêmica. Os principais são o ácido lipoteicóico (LTA). e. peptideoglicanas,. derivados. de. bactérias. gram-positivas,. e. o. lipopolissacarídeo (LPS), no caso de bactérias gram-negativas (endotoxinas). As toxinas bacterianas são liberadas normalmente quando ocorre um evento de lise da parede celular, como na replicação e na morte celular da bactéria (Opal, 2007)..

(14) O principal receptor para LPS presente na membrana das células fagocíticas é o TLR-4, da família dos receptores Toll-like. O reconhecimento do LPS pelo TLR-4 é bastante complexo e depende de moléculas acessórias, como a proteína ligadora de LPS (LBP) e CD14 (receptor de alta afinidade pelo LPS). Após a ativação dos receptores ocorre o recrutamento de proteínas acessórias do citoplasma, como a proteína adaptadora Myd88. O recrutamento dessas proteínas acessórias inicia uma série de reações de fosforilação protéica que culmina na liberação do fator nuclear kappa B (NF-kB) e ativação das proteínas quinases ativadas por mitógeno (MAPK). O resultado é a indução da transcrição de vários genes inflamatórios e produção de diversos mediadores, como o fator de necrose tumoral (TNF), interleucina-1 (IL-1), interleucina-6 (IL-6), fator de ativação plaquetária (PAF) e óxido nítrico (NO), entre outros. Paralelamente, ocorre a ativação de várias cascatas de proteínas plasmáticas, como o complemento, a coagulação e o sistema fibrinolítico (Jean-Baptiste, 2007). Além da liberação de diversas moléculas pró-inflamatórias, alterações hemodinâmicas substanciais participam do agravamento do quadro de sepse. A incapacidade de fornecimento de oxigênio aos tecidos, associado a uma vasodilatação periférica exacerbada, mesmo com manutenção do débito cardíaco, são características do quadro de choque séptico (Parrillo et al., 1990). Com avanço das. complicações. da. doença,. essas. alterações. hemodinâmicas. evoluem. gradualmente para um estado hipodinâmico, caracterizado por baixa resistência vascular periférica e hiporeatividade a vasoconstritores (Matsuda e Hattori, 2007). A complexa interação entre a resposta inflamatória exacerbada e as alterações hemodinâmicas tem como conseqüência o comprometimento da funcionalidade de muitos órgãos e a evolução para o quadro de choque,.

(15) acompanhado de alta mortalidade. As disfunções orgânicas mais comuns são cardiovascular, pulmonar, renal, neurológica, da coagulação e do aparelho digestivo. Para diagnóstico médico, essas alterações são deduzidas, por exemplo, pelo aumento de creatinina e uréia no sangue (falência renal), queda na pressão arterial (cardiovascular), necessidade de ventilação mecânica (pulmonar), e estado de coma na ausência de sedação. Mais tardiamente ocorrem disfunções hepáticas e hematológicas, visto pela alteração na contagem de plaquetas e leucócitos no sangue, e aumento na bilirrubina. Além disso, alterações metabólicas acompanham o. desenvolvimento. da. doença,. como. diagnosticado. por. necessidade. de. insulinoterapia e aumento nos níveis de lactato (David e Faria Neto, 2007, p.9). A possibilidade de evolução para quadros clínicos que diferem muito entre os pacientes é o motivo pelo qual o tratamento da sepse permanece difícil. A terapia farmacológica vigente busca a manutenção da pressão arterial e do débito cardíaco através de reposição de líquido e utilização de agentes inotrópicos e vasopressores. Aliado a isso, o uso de antibióticos é empregado para eliminação do foco infeccioso, após sua identificação (Hollenberg et al., 2004). 1.1.3. Sepse e óxido nítrico O óxido nítrico (NO) é uma molécula gasosa, altamente hidrofóbica e facilmente difusível através de membranas biológicas. É sintetizado a partir de oxigênio molecular e do aminoácido L-arginina por um grupo de enzimas conhecidas como óxido nítrico sintases (NOS). Após sua síntese e liberação, possui um tempo de meia-vida muito curto (5-10 s), rapidamente originando nitrito (NO2) e subseqüentemente nitrato (NO3), ambos os metabólitos estáveis do NO. Trata-se de um gás bastante reativo, cuja liberação resulta em imediatas e variadas reações.

(16) químicas, produzindo efeitos diretos ou indiretos nos sistemas biológicos (Vincent et al., 2000). Uma das ações diretas do NO é sua reação com metais. Diversas proteínas contêm metais em sua estrutura e são, portanto, alvos de interação para o NO, como é o caso da guanilato-ciclase e das NO-sintases. Os efeitos indiretos do NO podem ocorrer através de sua reação com espécies reativas de oxigênio, como o ânion superóxido. Essa reação forma um produto oxidante, o peroxinitrito, responsável por muitas ações originalmente atribuídas ao NO. O NO também possui uma elevada capacidade de interação com grupamentos tióis (R-SH), muito freqüentes em proteínas que contenham resíduos de cisteína. A reação forma Snitrosotióis, considerados estoques endógenos de NO, presentes no plasma e nos tecidos (Assreuy, 2006). As primeiras evidências de que o NO teria um envolvimento na fisiopatologia da sepse vieram com a descoberta de elevados níveis de nitrato e nitrito em pacientes sépticos (Ochoa et al., 1991; Evans et al., 1993). Aliado a isso, a redução no tônus vascular vista após a administração de endotoxinas ou citocinas pró-inflamatórias, e a identificação do fator relaxante derivado do endotélio (EDRF) como NO, levaram às sugestões de que a molécula estaria envolvida em alterações cardiovasculares no choque séptico (Vincent et al., 2000). Nas duas últimas décadas, tornou-se evidente que, na patogênese da sepse, o NO pode atuar de maneira deletéria ou benéfica.. Embora conhecidas as suas propriedades. vasodilatadoras, seus efeitos pró- e antiinflamatórios, bem como oxidantes e antioxidantes, entre outros, têm sido motivo de discussões e controvérsias (Hauser et al., 2005)..

(17) Muitas evidências do papel do NO na sepse vieram de observações de que vários sintomas da síndrome são atenuados pelo uso de inibidores das NOS. Estes normalizam a queda da pressão arterial (Kilbourn et al., 1990), aumentam a sobrevivência (Wu et al., 1995) e atenuam os danos em múltiplos órgãos e a falência circulatória na sepse experimental em ratos (Wu et al., 1996). Foi demonstrado que camundongos knockout para o gene da NOS-2 (uma das isoformas da NOS) respondem melhor a vasoconstritores e sobrevivem melhor em modelos relevantes de sepse (Hollenberg et al., 2000). Há uma grande quantidade de dados indicando o NO como um mediador-chave em alterações cardíacas, vasculares, renais e pulmonares da sepse e do choque séptico (por exemplo, Vincent et al., 2000; Feihl et al., 2001; Iskit e Guc, 2003; Cauwels, 2007). 1.2. Modelos experimentais de sepse A diversidade de características pré-existentes em cada paciente torna o desenvolvimento da sepse um processo bastante complexo e heterogêneo entre os indivíduos afetados. Dada a existência de muitas variáveis para os estudos clínicos, modelos animais são considerados de suma importância para o entendimento dos mecanismos fisiopatológicos envolvidos na sepse. Os experimentos em animais têm contribuído significativamente para a compreensão de muitos aspectos da sepse e do choque séptico, além de servirem como testes preliminares para novas terapias, antes das tentativas clínicas (Rittirsch et al., 2007). O propósito é o emprego de um modelo animal de sepse que reproduza da maneira mais fiel possível o que acontece com os pacientes afetados, com redução nas variáveis experimentais intrínsecas. Por questões práticas, a maioria dos experimentos é realizada em roedores, embora existam pesquisas em cães, coelhos, primatas e inclusive humanos. Os modelos mais freqüentemente utilizados.

(18) são: injeção endovenosa ou intraperitoneal de endotoxinas (LPS) ou patógenos viáveis (bactérias); ligadura e perfuração do ceco (CLP); e introdução de cateter no colon ascendente (CASP). Cada um possui características e aplicabilidades distintas e, obviamente, considerações acerca do modelo escolhido são cruciais à interpretação dos resultados obtidos. As injeções de LPS ou de bactérias viáveis são modelos há muito utilizados devido à simplicidade e alta reprodutibilidade, mimetizando vários efeitos observados em pacientes sépticos. Porém, esses modelos são muito questionáveis pelo fato de produzirem respostas muito rapidamente, e não de maneira gradativa, como ocorre em pacientes (Benjamim, 2001). Apesar de reproduzirem algumas características reais da sepse humana, esses procedimentos não geram o perfil de citocinas característico de pacientes afetados pela síndrome (Remick et al., 2000). Os modelos CLP e CASP envolvem o rompimento de barreiras protetoras do próprio organismo, criando uma situação de sepse polimicrobial, assemelhandose muito ao que acontece na sepse em humanos. No CASP, faz-se a inserção de um cateter no cólon ascendente do intestino do animal, o que leva a um persistente extravasamento do conteúdo fecal para a cavidade peritoneal e conseqüente infecção por bactérias (Maier et al., 2004). A técnica da CLP consiste em laparotomia seguida de exteriorização do ceco, ligadura não obstrutiva da válvula ileocecal e então perfuração da porção cecal obstruída. O processo gera extravasamento do conteúdo cecal para o interior da cavidade peritoneal, o que estabelece infecção pela flora bacteriana e resposta inflamatória do tecido (Ayala et al., 2000)..

(19) A CLP é um dos modelos de sepse e choque séptico mais amplamente utilizado. Em relação ao modelo CASP, possui a vantagem de requisitar procedimentos cirúrgicos bastante simples. Uma característica importante da CLP é a possibilidade da reprodução de diferentes estágios de complexidade da sepse (através da variação do número de perfurações no ceco), o que o torna útil para diferentes fins experimentais (Hubbard et al., 2005). 1.3. Óxido nítrico sintases (NOS) São conhecidas três principais isoformas de NOS: NOS-1, também chamada neuronal (nNOS); NOS-2, conhecida como NO-sintase induzida (iNOS); e NOS-3, ou endotelial (eNOS). As isoformas NOS-1 e NOS-3 são comumente designadas constitutivas, ao passo que a NOS-2 é considerada a isoforma induzível da NOS (isto é, somente expressa após estimulação das células). Há discordâncias em relação a essa nomenclatura, uma vez que o RNA mensageiro da NOS-2 foi encontrado constitutivamente nos tecidos cardíaco (Cohen et al., 2003) e pulmonar (Kan et al., 2004). Além disso, NOS-1 e NOS-3 podem ter sua expressão aumentada em algumas respostas inflamatórias (Boissel et al., 2004; Dekker et al., 2002). Sugere-se que as três isoformas podem apresentar características induzíveis ou constitutivas, conforme os diferentes tecidos em que estão expressas (ver Dudzinki et al, 2006). A isoforma NOS-1 foi primeiramente descoberta em tecidos neurais, porém é também encontrada em músculo esquelético, na camada adventícia de alguns vasos sanguíneos, no epitélio pulmonar, e nos sistemas gastrointestinal e geniturinário. A NOS-2 foi inicialmente caracterizada em macrófagos ativados, mas já foi descrita em inúmeros tipos celulares ativados, inclusive monócitos, neutrófilos, eosinófilos, hepatócitos, células do músculo liso vascular, miócitos, epitélio e células.

(20) endoteliais. A NOS-3 foi a enzima originalmente encontrada como responsável pela produção do fator relaxante derivado do endotélio (Furchgott e Zwadzki, 1980). Além de. expressa. em endotélio. vascular,. encontra-se. em plaquetas. e. cardiomiócitos (Dudzinki et al, 2006). Cada uma das três isoformas é produto de um gene distinto, embora compartilhem cerca de 50 a 60% de seqüência idêntica. A despeito de muitas similaridades em propriedades químicas e enzimáticas, diferentes propriedades catalíticas são características que as diferenciam. NOS-1 e NOS-3 são ativadas pela calmodulina, requerendo concentrações micromolares de cálcio para exercer atividade catalítica. A NOS-2 é classificada como independente de cálcio, por necessitar níveis da ordem de nanomolar (100 nM, equivalente ao nível basal intracelular). Outra diferença é que as enzimas NOS-1 e NOS-3 produzem e liberam NO em quantidade nanomolar por curto período de tempo (segundos a minutos), enquanto a NOS-2 o faz em maiores quantidades, em micromolar, durante períodos mais longos (Alderton et al., 2001). Quanto ao papel das diferentes isoformas da NOS na sepse, há muitos estudos abordando a expressão diferencial de NOS-2 em modelos animais (Cunha et al., 1994; Borutaite et al., 2005; Barth et al., 2006). Até o momento pouco se sabe da regulação das isoformas constitutivas durante o desenvolvimento da síndrome. Já foi demonstrado aumento de expressão de NOS-1 e NOS-3 em músculo esquelético após a injeção de LPS em ratos (El-Dwairi et al., 1998). Animais knockout para NOS-3 que receberam LPS, em comparação a animais normais submetidos ao mesmo modelo, tiveram melhora na pressão arterial e menor mortalidade, além de redução na expressão da NOS-2 em alguns órgãos (Connelly.

(21) et al., 2005). Em relação a NOS-1, a inibição ou deleção da enzima causa piora na mortalidade em animais submetidos ao modelo CLP (Chui et al., 2003). Apesar de demonstrado que as isoformas constitutivas da NOS possuem algum papel no desenvolvimento da sepse, ainda há muito para ser esclarecido a esse respeito. Especialmente no modelo CLP em camundongos, muito utilizado para estudos pontuais, há carência trabalhos que mostrem o comportamento das principais isoformas da NOS durante a sepse simultaneamente com a avaliação de parâmetros de gravidade..

(22) II. OBJETIVOS. 2.1. Objetivo geral O objetivo principal deste trabalho foi avaliar, num decurso temporal, diversos parâmetros bioquímicos e fisiológicos simultaneamente com o perfil de expressão das três isoformas da enzima óxido nítrico sintase durante a sepse, em um modelo de ligadura e perfuração do ceco em camundongos.. 2.2. Objetivos específicos Como objetivos específicos, este trabalho propõe-se a avaliar os seguintes parâmetros em animais sépticos, em diferentes tempos após a realização da CLP: a). Geração de óxido nítrico e surgimento de alterações hemodinâmicas. b). Ocorrência de lesão orgânica e alterações metabólicas. c). Alterações na permeabilidade vascular em diferentes leitos. d). Perfil de expressão das isoformas da enzima óxido nítrico sintase, nos tecidos cardíaco e pulmonar..

(23) III. METODOLOGIA. 3.1.. Animais Foram utilizados camundongos Swiss fêmeas com idade entre 3 e 4 meses. (30 - 40 g), fornecidos pelo Biotério Central da Universidade Federal de Santa Catarina e mantidos no Biotério Setorial do Departamento de Farmacologia até o momento da realização dos experimentos. Os animais foram mantidos em local com temperatura ambiente controlada (22 ± 2ºC) e ciclo claro/escuro (12/12 h) com livre acesso a ração e água. Todos os procedimentos realizados foram aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA/UFSC) e estão de acordo com as Diretrizes de Cuidados com Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde, dos Estados Unidos da América (NIH; EUA). 3.2.. Modelo de septicemia por ligadura e perfuração do ceco (CLP) Os. animais. foram anestesiados. com. uma. mistura. de. cetamina/. tribromoetanol (25/375 mg/kg; i.p.). Em seguida foram submetidos a uma laparoscopia com incisão de aproximadamente 1 cm, através da qual o ceco foi localizado e completamente exposto. Abaixo da válvula íleo-cecal foi feita uma ligadura não-obstrutiva e, a seguir, o ceco foi perfurado uma única vez de maneira transfixante com agulha 18G. Após a perfuração, o ceco foi levemente pressionado para assegurar a saída do conteúdo cecal, e então recolocado na cavidade abdominal. A musculatura e a pele foram suturadas em uma única camada, com linha de seda estéril. Imediatamente após a cirurgia, os animais receberam 1 ml de solução salina (s.c.) para reposição fluídica (Benjamim et al.,. 2000) e foram. mantidos em ambiente aquecido até a completa recuperação da anestesia (1 a 2 horas). Os animais controle (falso-operados; sham) passaram pelos mesmos.

(24) procedimentos, não sofrendo, contudo, ligadura e perfuração no ceco. Os animais naive não passaram por nenhum procedimento cirúrgico. 3.3.. Avaliação da sobrevida A observação da sobrevida após a cirurgia foi feita por 4 dias. No decorrer. desse período os animais foram mantidos em local com temperatura ambiente controlada (22 ± 2ºC) e ciclo claro/escuro (12/12 h) com livre acesso a ração e água. Ao final do período de 4 dias os animais ainda vivos foram sacrificados por inalação de CO2. 3.4.. Coleta de sangue e de órgãos Para coleta das amostras de sangue e órgãos os animais foram. anestesiados com uma mistura de cetamina/tribromoetanol (25/375 mg/kg; i.p.). Adicionalmente, cada animal recebeu 15 UI de heparina por via i.p. Após abertura da cavidade torácica, aproximadamente 1 ml de sangue foi coletado por punção cardíaca em tubo contendo fluoreto de sódio, 3 mg/ml de sangue. O sangue coletado foi então centrifugado por 15 minutos a 3.000 g para separação do plasma. O plasma e os diferentes órgãos coletados foram imediatamente congelados e armazenados em freezer -70º C até o momento das análises. 3.5.. Dosagens bioquímicas no plasma. 3.5.1 Dosagem de glicose A concentração de glicose no plasma foi determinada através do kit Bioclin (K082; Belo Horizonte, MG). O kit utiliza uma metodologia na qual a glicose é oxidada pela enzima glicose-oxidase, com geração de ácido glucônico e peróxido de hidrogênio.. Este último, em presença da enzima peroxidase, reage com 4-. aminoantiprina e fenol, formando um cromógeno avermelhado cuja intensidade de.

(25) cor é proporcional à concentração de glicose. Utilizou-se 2 µl de amostra para um volume final de reação de 200 µl. As dosagens foram realizadas em placas de 96 poços para leitura da absorbância a 550 nm em um leitor de placas. Os valores foram calculados com base em um fator de calibração e expressos em mg/dl de glicose. 3.5.2. Dosagem de uréia A dosagem de uréia no plasma foi determinada através do kit Bioclin (K047, Belo Horizonte, MG). Basicamente, a uréia é hidrolisada pela enzima urease, com formação de íons amônio (NH4+) e dióxido de carbono (CO2). Em pH alcalino, a amônia origina um composto esverdeado, cuja intensidade de cor é proporcional à concentração de uréia na amostra analisada. . Utilizou-se 1 µl de amostra para um volume final de reação de 200 µl. As dosagens foram realizadas em placas de 96 poços para leitura da absorbância a 630 nm em um leitor de placas. Os valores foram calculados com base em um fator de calibração e expressos em mg/dl de uréia. 3.5.3. Dosagem de creatinina A determinação da concentração de creatinina nas amostras de plasma foi realizada através do kit Bioclin (K016, Belo Horizonte, MG). Em meio alcalino, a creatinina reage com o ácido pícrico, formando um complexo de cor amareloavermelhada, que é medido fotometricamente (absorbância a 490 nm). Com adição de um reagente ácido o pH é diminuído e a cor referente à creatinina é desfeita, permanecendo apenas a cor devida aos cromogênios, também registrada por absorbância a 490 nm . Por diferença entre as leituras obtidas no pH alcalino e no pH ácido obtém-se o valor real da concentração de creatinina nas amostras..

(26) Utilizou-se 20 µl de amostra para um volume final de reação de 200 µl. Os valores são calculados com base em um fator de calibração e expressos em mg/dl de creatinina. 3.5.4. Determinação dos níveis de nitrato e nitrito (NOx) A determinação da concentração plasmática de NOx foi feita pela redução enzimática de nitrato para nitrito pela enzima nitrato redutase, conforme descrito por Granger et al. (1990). Para o ensaio, as amostras de plasma foram diluídas 1:2,5 em água de Milli-Q e desproteinizadas pela adição de sulfato de zinco (20%). Para conversão de nitrato a nitrito, as amostras foram incubadas a 37ºC durante 2 horas, em presença da enzima nitrato redutase expressa em Escherichia coli cultivada em meio anaeróbico. Após o período de incubação as amostras foram centrifugadas para a remoção da bactéria, sendo 100 µl do sobrenadante misturados com o mesmo volume de reagente de Griess (1% sulfanilamida em 10 % de ácido fosfórico/0,1% de alfa-naftil-etilenodiamina em água de Milli-Q) em placas de 96 poços. Foi realizada a leitura da absorbância a 540 nm num leitor de placas. Nestas condições a conversão de nitrato para nitrito foi maior que 90% e, portanto, não foi realizada nenhuma correção dos resultados. Os valores foram obtidos por regressão linear a partir de uma curva-padrão de nitrito e expressos como µM de NOx. 3.5.5. Dosagem da enzima Transaminase Pirúvica (TGP) plasmática A atividade da TGP plasmática foi mensurada pelo uso do kit Bioclin (K035, Belo Horizonte, MG). A reação da enzima com seu substrato tem como resultado a geração de piruvato, que reage formando um composto de cor. Em pH alcalino, a aintensidade de coloração formada é diretamente proporcional à quantidade de.

(27) piruvato, que por sua vez é em função da atividade enzimática. Utilizou-se 5 µl de amostra para um volume final de reação de 200 µl. As dosagens foram realizadas em placas de 96 poços para leitura da absorbância a 490 nm em um leitor de placas. Os valores foram calculados com base em um fator de calibração e expressos em U/ml de TGP. 3.6.. Dosagem da enzima mieloperoxidase (MPO) em pulmão O recrutamento de neutrófilos para o pulmão foi quantificado indiretamente,. através da medida da atividade enzimática da MPO. Os órgãos foram homogeneizados em solução de tampão fosfato de sódio (80 mM; pH 5,4) contendo brometo de hexadeciltrimetilamônio (HTAB; 0,5 %, p/v). O homogenato resultante foi então centrifugado (20 min, 10.000 g, 4°C) e o sobrenadante foi utilizado para o ensaio de determinação da atividade da enzima MPO. Para o ensaio enzimático foi utilizada uma alíquota de 25 µL do sobrenadante.. A. reação. enzimática. foi. desenvolvida. na. presença. de. tetrametilbenzidina (1,6 mM) e H2O2 0,5 mM (em solução tampão fosfato 80 mM; pH 5,4) por 3 minutos em um volume final de 200 µL. A absorbância foi medida em um leitor de placa a 630 nm (Ultra microplate reader EL 808, Biot-Tek Instruments, INC., EUA). A quantidade de proteína total foi estimada pelo método de Bradford e os valores foram apresentados na forma de unidades de densidade óptica (D.O.) / mg de proteína. 3.7.. Avaliação do extravasamento plasmático Cada animal recebeu uma injeção intravenosa do corante Azul de Evans. (60 mg/kg) 2 horas antes da coleta dos órgãos de interesse. Nos horários de coleta, os animais foram previamente exsanguinados através de perfusão. Para isso, uma agulha de escalpe conectada a um reservatório contendo solução salina (NaCl.

(28) 0,9%) a 37ºC, mantido a aproximadamente 1 metro de altura, foi inserida no ventrículo esquerdo do animal. Para possibilitar o escoamento de sangue um pequeno corte foi feito no átrio direito, de maneira a possibilitar a perfusão completa do animal. Os órgãos coletados foram cortados em pequenos pedaços e incubados em solução aquosa de formamida (1/1, v/v) por 48 h a 37°C. A densidade óptica do sobrenadante foi medida a 630 nm em um espectrofotômetro (modelo U-2001, Hitachi, Japão) e a concentração de Azul de Evans foi determinada através de regressão linear, a partir de uma curva com concentrações conhecidas do corante. Os resultados foram expressos em Azul de Evans (µg/ml) / mg de tecido úmido. 3.8.. Avaliação da pressão arterial Para a medida da pressão arterial, os animais foram anestesiados com uma. mistura de cetamina/ tribromoetanol (25/375 mg/kg; i.p.). Após anestesia, os camundongos foram posicionados em decúbito dorsal sobre uma mesa cirúrgica aquecida (37º C). Em seguida, a artéria carótida esquerda foi localizada e cuidadosamente separada do nervo vago e dos tecidos adjacentes. O fluxo sanguíneo da carótida foi interrompido na extremidade distal através de ligadura com fio de sutura, enquanto que o fluxo da extremidade proximal foi temporariamente interrompido através de compressão com uma pinça curva. Um pequeno corte foi realizado na região medial da porção da artéria carótida clampeada, servindo como via de inserção de um cateter de polietileno (Angiocath, nº 19), devidamente heparinizado. O catéter foi firmemente amarrado na artéria e conectado ao transdutor de pressão (Mikro-Tip®, Millar Instruments, Inc., Huston, Texas, EUA) acoplado a um Powerlab 8/30 (AD Instruments Pty Ltd., Castle Hill, Austrália). Os valores de pressão arterial média (PAM) foram registrados em um.

(29) computador (sistema operacional Windows XPTM, Microsoft Corporation, EUA) por um software de integração Chart5TM. 3.9.. Imunoeletroforese. 3.9.1. Preparação de amostras Os tecidos foram homogeneizados em tampão mantido a 4ºC, composto por Hepes 50 mM, MgCl2 1 mM, EDTA 10 mM e Triton X-100 1% , pH 6,4. No momento da homogeneização foram adicionados ao tampão os seguintes inibidores de proteases: aprotinina 2 µg/ml, leupeptina 10 µg/ml, inibidor de tripsina do feijão de soja (SBTI) 10 µg/ml e PMSF 1 mM. Os homogenatos foram centrifugados a 4ºC por 40 minutos, 14.000 g. Após a centrifugação, foi coletado o sobrenadante de cada amostra e deste foi separada uma alíquota para dosagem de proteínas. Ao restante do sobrenadante, foi adicionado tampão de amostra 5X concentrado (glicerol 3 M, mercaptoetanol 2 M, SDS 13 mM, NaOH e azul de bromofenol). As amostras foram fervidas por 5 minutos e permaneceram armazenadas a -20ºC até o momento do uso. A concentração de proteínas de cada amostra foi determinada através do método de Bradford (Bradford, 1976). 3.9.2. Separação de proteínas e imunodetecção As proteínas (75 µg/poço) foram separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE). Foram utilizados um gel de separação (acrilamida 8%, bis-acrilamida 0,2%, Tris 375 mM, SDS 0,1%, TEMED 0,06% e persulfato de amônia 0,04%; pH 8,8) e um gel de entrada (acrilamida 4%, bis-acrilamida 0,09%, Tris 125 mM, SDS 0,1%, TEMED 0,08% e persulfato de amônia 0,03%; pH 6,8). A eletroforese foi realizada a 4ºC com corrente máxima de 25 mA por placa e voltagem fixa de 140 V, por aproximadamente 2.

(30) horas e trinta minutos, utilizando-se tampão de corrida composto de glicina 192 mM, Tris 12,5 mM e SDS 1%, numa cuba (Amersham, Buckinghamshire, UK). Após a eletroforese, os géis foram equilibrados por 15 minutos sob agitação em tampão de eletrotransferência (tris 48 mM, glicina 39 mM, pH 8,3). Membranas de polifluoreto de vinilideno (PVDF) foram imersas em metanol 100%, lavadas com água destilada e também mantidas em tampão de transferência. As proteínas foram transferidas do gel para a membrana num aparato de eletrotransferência (sistema semi-dry, Amersham, Buckinghamshire, UK), no sentido do pólo negativo para o positivo, a uma corrente constante de 0,8 mA/cm2 de membrana e voltagem máxima de 15 V. Em seguida as membranas foram coradas (vermelho de Ponceau 0,2%, ácido tricloroacético 3%) para visualização das proteínas e verificação do conteúdo total (loading) dos poços. Após lavagens em PBS/Tween (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, KH2PO4 1,5 mM, Na2HPO42H2O 20 mM, Tween-20 0,05%) para a retirada do excesso do corante, iniciou-se o bloqueio de sítios não-ocupados nas membranas. Para tanto, foi feita uma incubação com PBS contendo leite desnatado 5% por 1 hora a temperatura ambiente e, após lavagens em PBS/Tween, outra incubação de 1 hora em PBS contendo gelatina 2%. Em seguida as membranas foram novamente lavadas e então incubadas com anticorpos específicos anti-NOS1 (diluído 1:1000 em PBS/Tween), anti-NOS2 (1:500 em PBS/Tween) ou anti-NOS3 (1:1000 em PBS/Tween) durante a noite a 4ºC. Após lavagens em PBS/Tween as membranas foram incubadas com anticorpo anti-IgG conjugado com peroxidase (diluído 1:3000 em PBS/Tween) por 1 hora em temperatura ambiente. O excesso de anticorpo foi retirado através de lavagens em PBS/Tween e PBS para então realizar-se a revelação. através. de. kit. de. quimiluminescência. (ECL-Amersham®,. Buckinghamshire, UK). As medidas de imunoconteúdo das proteínas de interesse.

(31) foram determinadas pela densitometria das bandas, através do programa Scion Image®. 3.9.3. Stripping de membrana Para remoção de anticorpos primários as membranas foram incubadas por 30 minutos sob agitação, em temperatura ambiente em uma solução contendo Tris 65 mM, SDS 2% e mercaptoetanol 100 mM, pH 6,8. Posteriormente as membranas foram lavadas em PBS e seguiram para o bloqueio e imunodetecção com anticorpos específicos. 3.10. Desenho experimental A coleta de material para análises foi feita nos seguintes tempos, após a cirurgia: 6, 12, 24 e 36 horas. Esse protocolo foi o mesmo para animais sham e sépticos em todos os experimentos realizados, com exceção das medidas de glicemia e de extravasamento plasmático (onde foram acrescentadas as coletas em 2 e 4 horas após a CLP). 3.11. Análise estatística Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média (EPM). A análise estatística foi realizada por análise de variância (ANOVA) de uma ou duas vias, seguida, quando apropriado, pelo teste de Dunnet (comparações com o grupo controle). Os resultados foram considerados significativos quando p < 0,05. 3.12. Compostos e reagentes As seguintes substâncias foram utilizadas neste estudo: cetamina (Parke Davis, São Paulo, SP, Brasil); tribromoetanol (Sigma Chemical Co. St Louis, MO, EUA); heparina sódica (gentilmente cedida por Cristália Produtos Farmacêuticos, São Paulo, SP, Brasil); fluoreto de sódio (Merck, São Paulo, SP, Brasil); PMSF (fenilmetanosulfonilfluoreto, Sigma), aprotinina, leupeptina, SBTI, Tween-20, alfa-.

(32) naftil-etilenodiamina (Sigma); anticorpos policlonais anti-NOS1, anti-NOS2 e antiNOS3 (todos 200 µg/ml, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA); anticorpo antiIgG de coelho (Amersham Biosciences, UK)..

(33) IV. RESULTADOS 4.1. Avaliação da sobrevivência de animais submetidos à cirurgia de ligadura e perfuração do ceco Os resultados mostrando a sobrevivência dos grupos CLP e sham estão mostrados na Figura 1. Para a obtenção dos resultados, a observação dos animais foi feita a cada 12 horas, durante três dias. A morte de 50% dos animais sépticos aconteceu no tempo médio de dois dias. Ao final do terceiro dia, menos de 25% do total de animais operados ainda estavam vivos. Nenhum dos animais do grupo sham morreu durante o período. Além disso, sinais clínicos da instalação do quadro de sepse (piloereção, sangramento ocular, prostração e atonia muscular) foram observados apenas em animais CLP.. Sham. Sobrevivência (%). 100. CLP 75 50 25 0 0. 12. 24. 36. 48. 60. 72. Tempo (horas). Figura 1 – Curva de sobrevivência de animais submetidos à CLP. Após a cirurgia e recuperação da anestesia, os animais foram mantidos com livre acesso a água e ração. Os animais do grupo sham foram submetidos à anestesia e laparotomia, mas sem ligadura e perfuração do ceco. Os dois grupos foram observados a cada 12 horas, durante três dias. Esta é uma curva representativa, construída através da observação de 10 animais por grupo experimental..

(34) 4.2. Níveis plasmáticos de nitrato + nitrito (NOx) Os animais sépticos, já a partir do tempo de 6 horas após a CLP, apresentaram níveis plasmáticos de NOx bastante elevados em comparação aos grupos sham e naive. O aumento foi cerca de 4 a 5 vezes os valores basais e essa condição persistiu até o tempo de 36 horas após a cirurgia. Como os valores obtidos para animais sham não apresentaram variação entre os diferentes períodos de tempo, os resultados desses animais foram agregados em um único grupo. O mesmo foi repetido para os subseqüentes parâmetros analisados. Nenhuma alteração foi observada nas dosagens plasmáticas de Nox do grupo sham em relação ao naive (Figura 2).. 120. NOx (µM). 100 80. *. *. *. 12 h. 24 h. 36 h. *. 60 40 20 0 Naive Sham. 6h. CLP Figura 2 – Níveis plasmáticos de nitrato + nitrito (NOx) em animais naive, sham e submetidos à CLP. Nos tempos mostrados após a cirurgia, amostras de sangue foram coletadas por punção cardíaca e centrifugadas para obtenção do plasma. A concentração plasmática de NOx foi determinada por conversão de nitrato a nitrito, seguida da reação de Griess. Os resultados representam a média ± EPM de 5-8 animais por grupo experimental. A comparação estatística foi feita através da análise de variância (ANOVA) de uma via, seguida do teste de Dunnet. *p < 0,05, em relação ao grupo naive.. 4.3. Níveis plasmáticos de uréia e creatinina.

(35) Com o objetivo de avaliar a possível ocorrência de dano renal após a indução de sepse, foram dosadas as concentrações de creatinina e uréia presentes no plasma dos animais em estudo. Camundongos submetidos à CLP apresentaram aumento nos níveis de uréia (Figura 3A) e creatinina (Figura 3B), em comparação ao grupo de animais naive. Uma elevação significativa nas concentrações plasmáticas de ambos os metabólitos ocorreu a partir de 12 horas após a realização da cirurgia. Os níveis de uréia e creatinina permaneceram elevados nos tempos posteriores, representando, respectivamente, cerca de 3 e 2 vezes os níveis encontrados em animais naive. O grupo sham não apresentou alterações significativas.. A. B. *. *. *. 75 50 25 0. 1.0. Creatinina (mg/dl). Uréia (mg/dl). 100. 0.8. *. *. 12 h. 24 h. *. 0.6 0.4 0.2. Naive Sham 6 h. 12 h. 24 h. CLP. 36 h. Naive Sham. 6h. 36 h. CLP. Figura 3 – Níveis plasmáticos de uréia (A) e creatinina (B) em animais naive, sham e submetidos a CLP. Nos tempos mostrados após a cirurgia, amostras de sangue foram coletadas por punção cardíaca e centrifugadas para obtenção do plasma. As concentrações plasmáticas de uréia e creatinina foram determinadas por ensaio enzimático colorimétrico. Os resultados representam a média ± EPM de 5-9 animais por grupo experimental. A comparação estatística foi feita através da análise de variância (ANOVA) de uma via, seguida do teste de Dunnet. *p < 0,05, em relação ao grupo naive..

(36) 4.4. Níveis plasmáticos da enzima transaminase pirúvica (TGP) Em relação ao grupo naive, animais CLP apresentaram aumento nos níveis plasmáticos da enzima nos tempos de 12 e 24 horas após a cirurgia, retornando aos níveis basais no tempo de 36 horas (Figura 4).. 200. TGP (U/ml). 175. *. *. 150 125 100 75 50 Naive Sham 6 h. 12 h. 24 h. 36 h. CLP Figura 4 – Níveis plasmáticos da enzima transaminase hepática (TGP) em animais naive, sham e submetidos a CLP. Nos tempos mostrados amostras de sangue foram coletadas por punção cardíaca e centrifugadas para obtenção do plasma. A atividade da TGP plasmática foi determinada por ensaio enzimático colorimétrico. Os resultados representam a média ± EPM de 6-7 animais por grupo experimental. A comparação estatística foi feita através da análise de variância (ANOVA) de uma via, seguida do teste de Dunnet. *p < 0,05, em relação ao grupo naive.. 4.5. Concentração plasmática de glicose Animais sépticos desenvolvem uma profunda hipoglicemia observada a partir de 6 horas após a cirurgia. Com o objetivo de detectar em que momento ocorriam alterações da glicemia, foram feitos experimentos com o intuito de avaliar esse parâmetro em momentos ainda mais iniciais após a indução de sepse. Conforme mostrado na Figura 5, inicialmente de forma muito precoce há uma hiperglicemia nos animais operados, seguida de uma queda muito acentuada dos níveis glicêmicos..

(37) *. Glicose (mg/dl). 400. *. 300 200. *. 100. *. *. *. 12. 24. 36. 0 N. Sh. 2. 4. 6. CLP (horas). Figura 5 – Níveis de glicose plasmática em animais naive (N), sham (Sh) e submetidos à CLP. Nos tempos mostrados, amostras de sangue foram coletadas por punção cardíaca e centrifugadas para obtenção do plasma. A concentração plasmática de glicose foi determinada por ensaio enzimático colorimétrico. Os resultados representam a média ± EPM de 3-8 animais por grupo experimental. A comparação estatística foi feita através da análise de variância (ANOVA) de uma via, seguida do teste de Dunnet. *p < 0,05, em relação ao grupo naive.. 4.6. Medida da temperatura corporal Através da medida da temperatura em animais sépticos e sham (Figura 6), pôde-se observar a ocorrência de um período de hipotermia (~34ºC) em animais CLP, se comparados ao grupo sham (~36ºC). A queda de temperatura ocorreu no tempo de 24 horas após a realização da cirurgia, sendo que em 36 horas os valores de temperatura encontrados foram próximos aos normais..

(38) Temperatura (ºC). 38. Sham CLP. 36. *. 34. 32 0. 12. 24. 36. Tempo (horas). Figura 6 – Temperatura corporal de animais sham e submetidos a CLP. Após a cirurgia e recuperação da anestesia, os animais foram mantidos com livre acesso a água e ração. A temperatura dos animais foi medida através do uso de um termômetro auricular. Os resultados representam a média ± EPM de 3-6 animais por grupo experimental. A comparação estatística foi feita através da análise de variância (ANOVA) de duas vias com medidas repetidas. *p < 0,05, em relação ao grupo sham.. 4.7. Pressão arterial média (PAM) Para avaliar as condições hemodinâmicas de camundongos submetidos à CLP, foi mensurada a PAM desses animais em diferentes tempos após a cirurgia. Nota-se a ocorrência de uma hipotensão acentuada (~55 mmHg) em animais operados, quando em comparação ao grupo sham (~75 mmHg), nos tempos de 30 minutos e 8 horas após a cirurgia. Em 16 horas, os valores de PAM já retornaram aos valores normais..

(39) PAM (mmHg). 85 75 65. *. *. 0,5 h. 8h. 55 45 35 Sham. 16 h. CLP. Figura 7 – Pressão arterial média em animais sham e submetidos a CLP. Após anestesia, os camundongos foram posicionados em decúbito dorsal sobre uma mesa cirúrgica aquecida (35–36º C). A artéria carótida esquerda foi localizada e nela foi inserido um catéter acoplado a um transdutor de pressão conectado a um equipamento de análise de pressão arterial. Os resultados representam a média ± EPM de 3-6 animais por grupo experimental. A comparação estatística foi feita através da análise de variância (ANOVA) de uma via. * p < 0,05, em relação ao grupo sham.. 4.8. Atividade de mieloperoxidase no pulmão O influxo de neutrófilos para o pulmão de animais sépticos foi bastante elevado, conforme indica a dosagem da atividade da enzima mieloperoxidase (MPO). Em animais CLP, a atividade da enzima encontra-se aproximadamente 2 vezes maior do que o encontrado em animais naive, nos tempos de 24 e 36 horas após a cirurgia. Os animais falso-operados não apresentaram aumento signifiativo na atividade da enzima (Figura 8)..

(40) MPO (D.O./ mg proteína). 1.2. * *. 0.9 0.6 0.3 0.0 Naive Sham. 6h. 12 h. 24 h. 36 h. CLP Figura 8 – Dosagem da atividade da enzima MPO em pulmão de animais naive, sham e submetidos à CLP. Nos tempos mostrados, amostras de pulmão foram coletadas e imediatamente congeladas. Após homogeneização e centrifugação, foi realizado o ensaio enzimático colorimétrico. Os resultados representam a média ± EPM de 4-6 animais por grupo experimental. A comparação estatística foi feita através da análise de variância (ANOVA) de uma via, seguida do teste de Dunnet. *p < 0,05, em relação ao grupo naive.. 4.9. Extravasamento plasmático Através do extravasamento do corante Azul de Evans, inferiu-se a ocorrência de exsudação plasmática em diferentes órgãos (Figura 9). No coração de animais CLP (Figura 9A) houve uma redução no extravasamento plasmático, em relação aos animais naive, apenas no tempo de 2 horas após a cirurgia. No pulmão (Figura 9B) não foram observadas alterações deste parâmetro em nenhum dos tempos estudados. No baço (Figura 9E) e no rim (Figura 9D) o extravasamento foi maior em animais operados a partir de 4 horas depois da cirurgia, enquanto que no fígado (Figura 9C) houve aumento apenas no tempo de 12 horas. No fígado e no rim, animais sham apresentaram aumento em relação ao grupo naive..

(41) Azul de Evans (µg/ml) /mg tecido. A. 60. 60. 50. 50. 40. 40. 30. 30. *. 20. 20. 10. 10. 0. 0. N. Sh. B. 2h. 4h. N. 6h 12h 24h 36h. Sh. 2h. 4h. CLP. Azul de Evans (µg/ml) /mg tecido. CLP. C. 75. 75. D. *. 60. *. 60. *. *. 45. 6h 12h 24h 36h. *. 45. *. *. *. 30. 30 15. 15 0. 0 N. Sh. 2h. 4h. 6h 12h 24h 36h. N. CLP. Sh. 2h. 4h. 6h 12h 24h 36h. Azul de Evans (µg/ml) /mg tecido. CLP. 120. E. 100. *. 80. *. *. *. *. 60 40 20 0 N. Sh. 2h. 4h. 6h 12h 24h 36h. CLP. Figura 9 – Extravasamento plasmático, medido pela exsudação de Azul de Evans, em animais naive (N), sham (Sh) e CLP. Azul de Evans foi injetado duas horas antes de cada tempo mostrado, os animais foram perfundidos e os órgãos coletados para realização do procedimento. Painel A: Coração; Painel B: Pulmão; Painel C: Fígado; Painel D: Rim; Painel E: Baço. Os resultados representam a média ± EPM de 4-8 animais por grupo experimental. A comparação estatística foi feita através da análise de variância (ANOVA) de uma via, seguida do teste de Dunnet. *p < 0,05, em relação ao grupo naive..

(42) 4.10. Expressão das isoformas da NOS em pulmão A quantificação da expressão de NOS-1, NOS-2 e NOS-3, em pulmão está mostrada nas Figuras 10, 11 e 12, respectivamente. A NOS-1 teve sua expressão aumentada em animais CLP, em quase duas vezes quando comparada ao grupo naive, somente nos tempos de 24 e 36 horas após a cirurgia. A expressão de NOS2 foi extremamente aumentada em animais CLP, em comparação ao grupo naive. A quantificação indicou aumento que chega a cerca de 5 vezes, no tempo de 12 horas, diminuindo nos tempos posteriores e retornando aos níveis normais em 36 horas. A expressão de NOS-3 foi significativamente maior em animais CLP, em relação ao naive, a partir de 6 horas, persistindo esse aumento até 36 horas depois da cirurgia. O aumento na expressão de NOS-3 foi cerca de 1,5 vezes o valor encontrado no grupo naive. Os animais sham não apresentaram aumento significativo na expressão das enzimas.. Para melhor comparação, a Figura 13. mostra as variações na expressão das três isoformas da NOS, em mesma escala, em animais sham e CLP..

(43) A Naive Sham. 6h. 12 h. 24 h. 36 h. CLP. B Unidades arbitrárias. 2.5. *. *. 24 h. 36 h. 2.0 1.5 1.0 0.5 Naive Sham 6 h. 12 h. CLP. Figura 10 – Quantificação da expressão de NOS-1 em pulmão de animais naive, sham e submetidos à CLP. As proteínas (75 µg) foram separadas em gel de acrilamida/bisacrilamida 8% (SDS-PAGE) e eletrotransferidas para uma membrana de PVDF. Após o bloqueio as membranas foram incubadas com anticorpos específicos e em seguida com anticorpo secundário conjugado à peroxidase. A revelação foi feita por quimioluminescência e a densitometria das bandas medida através do programa Scion Image®. Os resultados estão expressos em vezes de aumento em relação ao grupo naive, e representam a média ± EPM de 3-5 animais por grupo experimental. A comparação estatística foi feita através da análise de variância (ANOVA) de uma via, seguida do teste de Dunnet. *p < 0,05, em relação ao grupo naive..

(44) A Naive Sham 6 h. 12 h. 24 h. 36 h. CLP. Unidades Arbitrárias. B 7. *. 6. *. *. 5 4 3 2 1 0 Naive Sham. 6h. 12h. 24h. 36h. CLP. Figura 11 – Quantificação da expressão de NOS-2 em pulmão de animais naive, sham e submetidos à CLP. As proteínas (75 µg) foram separadas em gel de acrilamida/bisacrilamida 8% (SDS-PAGE) e eletrotransferidas para uma membrana de PVDF. Após o bloqueio as membranas foram incubadas com anticorpos específicos e em seguida com anticorpo secundário conjugado à peroxidase. A revelação foi feita por quimioluminescência e a densitometria das bandas medida através do programa Scion Image®. Os resultados estão expressos em vezes de aumento em relação ao grupo naive, e representam a média ± EPM de 3-4 animais por grupo experimental. A comparação estatística foi feita através da análise de variância (ANOVA) de uma via, seguida do teste de Dunnet. *p < 0,05, em relação ao grupo naive..

(45) A. Naive Sham. 6h. 12 h. 24 h. 36 h. CLP. Unidades Arbitrárias. B 2.0. 1.5. *. *. *. 24 h. 36 h. *. 1.0. 0.5 Naive Sham 6 h. 12 h. CLP. Figura 12 – Quantificação da expressão de NOS-3 em pulmão de animais naive, sham e submetidos à CLP. As proteínas (75 µg) foram separadas em gel de acrilamida/bisacrilamida 8% (SDS-PAGE) e eletrotransferidas para uma membrana de PVDF. Após o bloqueio as membranas foram incubadas com anticorpos específicos e em seguida com anticorpo secundário conjugado à peroxidase. A revelação foi feita por quimioluminescência e a densitometria das bandas medida através do programa Scion Image®. Os resultados estão expressos em vezes de aumento em relação ao grupo naive, e representam a média ± EPM de 3-5 animais por grupo experimental. A comparação estatística foi feita através da análise de variância (ANOVA) de uma via, seguida do teste de Dunnet. *p < 0,05, em relação ao grupo naive..

(46) Unidades Arbitrárias. 7. NOS 1. 6. NOS 2. 5. NOS 3. 4 3 2 1 0 Sham. 6h. 12 h. 24 h. 36 h. CLP. Figura 13 – Comparação da expressão de três isoformas da NOS em pulmão de animais sham e submetidos à CLP. As proteínas (75 µg) foram separadas em gel de acrilamida/bis-acrilamida 8% (SDS-PAGE) e eletrotransferidas para uma membrana de PVDF. Após o bloqueio as membranas foram incubadas com anticorpos específicos e em seguida com anticorpo secundário conjugado à peroxidase. A revelação foi feita por quimioluminescência e a densitometria das bandas medida através do programa Scion Image®. Os resultados estão expressos em vezes de aumento em relação ao grupo naive, e representam a média ± EPM de 3-5 animais por grupo experimental.. 4.11. Expressão das isoformas da NOS no coração A NOS-1 (Figura 14) teve sua expressão aumentada em animais CLP, em cerca de três vezes os valores basais (naive), no tempo de 36 horas após a cirurgia. A expressão de NOS-2 (Figura 15) no coração de animais CLP aumentou em aproximadamente 8 vezes no tempo de 6 horas. O nível de expressão de NOS-2 reduz-se nos tempos subseqüentes, chegando a valores próximos aos normais no tempo de 36 horas. A expressão de NOS-3 (Figura 16) foi também maior em animais CLP, em relação ao naive, embora em proporções bem menores. Um aumento significativo na expressão da enzima foi visto em 36 horas, representando pouco menos de duas vezes o valor encontrado em animais naive. O grupo sham.