JODIÊ DO AMARAL SODÁRIO
Estudo do polimorfismo genético de ADH1BR48H e suas
associações ao câncer de cavidade oral
Goiânia 2016
Estudo do polimorfismo genético de ADH1B R48H e suas
associações ao câncer de cavidade oral
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Ciências Ambientais e Saúde da Pontifícia Universidade Católica de Goiás como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Ciências Ambientais e Saúde.
Área de Concentração: Ambiente e Saúde.
Orientadora: Prof.ª Dr.ª. Vera Aparecida Saddi.
Coorientador: Prof. Dr. Cesar Augusto Sam Tiago Vilanova-Costa.
Goiânia 2016
/ Jodiê do Amaral Sodário.-- 2016. 94 f.; il.; 30 cm
Texto em português com resumo em inglês.
Dissertação (mestrado) -- Pontifícia Universidade Católica de Goiás, Programa de Pós-Graduação STRICTO SENSU em Ciências Ambientais e Saúde, Goiânia, 2016 Inclui referências
1. Boca - Doenças. 2. Polimorfismo (Genética). 3.
Oxidorredutases. 4. Boca - Câncer. I.Saddi, Vera Aparecida. II.Pontifícia Universidade Católica de Goiás. III.
Título.
que foram sempre a razão e o caminho. A razão pela minha luta e o caminho de afeto, apoio e abdicação para que esse sonho se concretizasse.
Agradeço primeiramente a Deus, pela saúde, fé e força para superar as dificuldades.
Aos meus pais e irmãos, não só pelo apoio e incentivo que sempre me deram durante minha trajetória, mas principalmente pela amizade, carinho e dedicação.
À minha orientadora Dr.ª Vera Aparecida Saddi, pelas suas orientações e incentivos e pelos momentos de aprendizado.
A esta Universidade, seu corpo docente, direção e administração, principalmente os professores e funcionários do Programa de Pós-Graduação Stricto Senso em Ciências Ambientais e Saúde pelas trocas de informações, conhecimentos e experiências no decorrer do curso, que oportunizaram a janela que hoje vislumbro um horizonte superior.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior pela bolsa de estudos sem a qual, não teria a oportunidade de me dedicar à pesquisa.
A todos os meus colegas de trabalho que se tornaram amigos de vida, gostaria de externar minha satisfação de poder conviver com eles durante a realização dessa pesquisa.
A uma pessoa que se tornou especial durante essa jornada e quero levá-lo pela vida afora: Cesar. Muito obrigado pelo apoio e dedicação e por estar sempre ao meu lado
À minha filha, razão da minha luta e alegria de viver.
Aos pacientes que participaram desse estudo, sem os quais nada disso seria possível.
Figura 1 - Anatomia da Cavidade Oral...13
Figura 2 - Epitélio estratificado pavimentoso não queratinizado...14 Figura 3 - Estimativa do número de novos casos de câncer, segundo o sexo, para a região Centro-Oeste do Brasil, em 2016...17 Figura 4 - Mortalidade por câncer de cavidade oral em homens no Brasil, entre os anos de 1991 e 2010...18 Figura 5 - As várias etapas da progressão do tumor de células escamosas da cavidade oral. (Adaptado de RIVERA, 2015)...22 Figura 6 - Leucoplasia e eritroplasia de língua...24 Figura 7 - Benzopireno do tabaco formando adutos de DNA (ORELLANA, 2015)...27 Figura 8 - Proporção percentual por sexo e região, de pessoas maiores de 18 anos que consomem bebida alcoólica uma vez ou mais por semana...29 Figura 9 - Genoma do HPV com DNA circular de dupla-fita, mostrando a localização dos genes do HPV 16. (Adaptado de D'Abramo e Archambault, 2011)...32 Figura 10 - Oxidação do álcool pelas enzimas ADH e ALDH...35 Figura 11 - Via metabólica do etanol na Carcinogênese de Cabeça e Pescoço...36 Figura 12 – Sobrevida relativa geral de pacientes diagnosticados com carcinoma de
células escamosas da cavidade oral, em Goiânia, no período de 2005 e 2006...56 Figura 13 – Sobrevida relativa, por sexo, de pacientes diagnosticados com carcinoma
de células escamosas da cavidade oral, em Goiânia, no período de 2005 e 2006...57
Figura 14 - Sobrevida relativa de pacientes diagnosticados com carcinoma de células
escamosas da cavidade oral, em Goiânia, no período de 2005 e 2006, que apresentavam hábito de etilismo...
Figura 15 – Sobrevida relativa geral para pacientes diagnosticados com carcinoma de
células escamosas da cavidade oral, em Goiânia, no período de 2006 a 2006, que apresentavam hábito de tabagismo...58
Figura 16 – Sobrevida relativa, por grau de diferenciação tumoral, de pacientes
diagnosticados com carcinoma de células escamosas da cavidade oral, em Goiânia, no período de 2005 e 2006...59
Figura 17 – Sobrevida relativa para pacientes diagnosticados com carcinoma de
células escamosas da cavidade oral, em Goiânia, no período de 2006 a 2006, ajustada ao genótipo...60
ajustada ao genótipo...61
Figura 19 – Sobrevida relativa para pacientes tabagistas diagnosticados com
carcinoma de células escamosas da cavidade oral, em Goiânia, no período de 2006 a 2006, ajustada ao genótipo...62
Tabela 1 - Classificação quanto ao tamanho do tumor primário (T), linfonodos regionais (N) e metástases (M) em câncer de cavidade oral...211
Tabela 2 - Resumo dos artigos selecionados para revisão sistemática com dados
relevantes dos estudos de
caso-controle...399
Tabela 3 - Frequências genotípicas da variante polimórfica ADH1B R48H em pacientes com carcinoma de cabeça e pescoço e em controles sem câncer por estudo41
Tabela 4 - Sequência dos primers utilizados nas Reações em Cadeia da Polimerase...48 8
Tabela 5 - Enzimas de Restrição utilizadas para a genotipagem de SNIPs de ADH...48 8
Tabela 6 - Dados sociodemográficos de controles e de pacientes diagnosticados com carcinoma de células escamosas da cavidade oral em Goiânia, no período de 2005 e 2006...52 Tabela 7 - Dados histopatológicos de pacientes diagnosticados com carcinoma de células escamosas da cavidade oral em Goiânia, no período de 2005 e 2006...54 Tabela 8 - Frequência genotípica dos polimorfismos da variante ADH1B R48H da enzima álcool desidrogenase em pacientes com carcinoma de células escamosas da cavidade oral...55 Tabela 9 - Frequência genotípica dos polimorfismos da variante ADH1B R48H da enzima álcool desidrogenase em pacientes com carcinoma de células escamosas da cavidade oral e de controles saudáveis provenientes da população de Goiânia, Goiás...56 Tabela 10 - Frequência genotípica dos polimorfismos da variante ADH1B R48H da enzima álcool desidrogenase em pacientes com carcinoma de células escamosas da cavidade oral e de controles saudáveis provenientes da população de Goiânia e os hábitos de etilismo e tabagismo...56
ACCG Associação de Combate ao Câncer de Goiás ADH Álcool Desidrogenase
ALDH Aldeído Desidrogenase
CCE Carcinoma de Células Escamosas
CCECP Carcinomas de Células Escamosas de Cabeça e Pescoço CDK4 Quinase dependente de ciclina4
CDK6 Quinasedepentende de ciclina6 DNA Ácido Desoxiribonucléico
DST Doença Sexualmente Transmissível E2 Oncoproteína viral precoce 2
E6 Oncoproteína viral precoce 6 E7 Oncoproteína viral precoce 7 E2F Fator de Transcrição
EUCAN Agência Européia de Câncer
Fase G1 Fase pré-síntese de DNA no ciclo celular Fase S Fase de síntese de DNA no ciclo celular GAPDH Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase HAJ Hospital Araújo Jorge
HPV Papilomavírus humano
IARC Do inglês: InternationalAgency for ResearchonCancer (Agência Internacional de Pesquisa sobre o Câncer)
INCA Instituto Nacional do Câncer L1 Oncoproteína viral tardia 1 L2 Oncoproteína viral tardia 2 p53 Proteína 53
pb Pares de bases
PCR Do inglês: Polymerase Chain Reaction (Reação em cadeia da Polimerase)
pRb Proteína retinoblastoma
SNP Single Nucleotide Polymorphism UICC União Internacional Contra o Câncer UVB Ultra Violeta B
1. INTRODUÇÃO ... 14
1.1. O câncer de cavidade oral, aspectos gerais ... 14
1.2. Epidemiologia do câncer de cavidade oral ... 17
1.3. Neoplasias suas nomenclaturas e classificação ... 19
1.4. A carcinogênese ... 22 1.5. Fatores de risco ... 26 1.5.1 Carcinógenos químicos ... 27 1.5.1.1. Tabagismo ... 27 1.5.1.2. Etilismo ... 29 1.5.2. Carcinógenos físicos ... 31
1.5.3. Carcinógenos virais e o Papiloma vírus Humano (HPV) ... 32
1.6. Fatores PROGNÓSTICOS E preditivos ... 34
1.7. Metabolismo do Álcool e o Câncer de Cavidade Oral ... 35
2. JUSTIFICATIVA ... 43 3. OBJETIVOS ... 44 3.1. Objetivo Geral ... 44 3.2. Objetivos específicos ... 44 4. METODOLOGIA ... 45 4.1. Delineamento metodológico ... 45 4.2. População de estudo ... 45
4.3. Seleção dos casos para determinação genotípica de ADH1B por PCR/RFLP... ... 46
4.4. Extração de DNA genômico ... 47
4.5. Detecção e Genotipagem dos Polimorfismos ... 48
4.6. Metodologia de Análise de Dados ... 49
4.7. Critérios de Inclusão ... 49
4.8. Critérios de Exclusão ... 49
5. RESULTADOS ... 51
5.1. Avaliação sociodemográfica de pacientes diagnosticados com CEC de cavidade oral ... 51
5.2. Avaliação clinicopatológica de pacientes diagnosticados com CEC de cavidade oral ... 53
5.3. frequência do polimorfismo R48H no gene ADH1B em portadores de CEC de cavidade oral em goiânia... 54
goiânia. ... 57
6. DISCUSSÃO ... 64
7. CONCLUSÕES... 70
8. REFERÊNCIAS ... 71
Os cânceres de cavidade oral são considerados um problema de saúde pública em todo o mundo e representam a sexta neoplasia mais comum. Os principais fatores de risco incluem o tabaco, álcool, deficiência de micronutrientes e o Papilomavírus humano (HPV). O metabolismo do álcool depende da álcooldesidrogenase (ADH), uma família de enzimas com alta frequência de polimorfismos genéticos, que conferem aos diferentes indivíduos uma grande variação de suscetibilidade aos seus metabólitos. Assim, diferentes polimorfismos genéticos na ADH podem interferir no risco individual ao câncer associado ao etilismo. O objetivo deste estudo caso-controle foi avaliar a frequência de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP: single nucleotide polymorphism) no gene ADH1B em 61 pacientes com câncer de cavidade oral e em 66 controles saudáveis. O estudo empregou métodos moleculares incluindo a reação em cadeia da polimerase (PCR) associada à análise de fragmentos de restrição (RFLP). As frequências obtidas para os polimorfismos genéticos foram calculadas e comparadas nos dois grupos, bem como as possíveis associações entre esses polimorfismos e as características dos tumores. Os resultados mostraram uma maior prevalência desses tumores na população masculina (85,2%), em idades acima de 45 anos (88,5%), tabagistas (85,2%) e etilistas (82,0%). Dentre os fatores prognósticos avaliados, o estádio avançado (III e IV) foi observado em 73,8% dos casos e o comprometimento de linfonodos regionais em 39,3% dos casos. As frequências alélicas para o polimorfismo ADH R48Hno grupo de casos foram G=82,8 e A=17,2%, enquanto no grupo controle foram G=79,4% e A=20,6%. As frequências genotípicas obtidas para o grupo de casos foram AA=16,0%; GA=2,0% e GG=81,0%, enquanto que para o grupo controle, as frequências genotípicas foram AA=15,0%; GA=12,0% e GG=74,0%. A sobrevida global avaliada para o grupo foi de 49,9%. Diferenças significativas nas frequências alélicas e genotípicas não foram observadas entre os grupos e nem entre os aspectos prognósticos avaliados. Dados epidemiológicos do câncer de cavidade oral têm mostrado tendências preocupantes, alertando para a importância de se promover maiores estudos relacionados a este tipo particular de câncer.
Palavras-chaves: Câncer de cavidade oral; etilismo; polimorfismo de nucleotídeo único, álcool desidrogenase.
Oral cavity cancers are considered a public health problem throughout the world and represent the sixth most common cancer. The main risk factors include tobacco, alcohol, micronutrient deficiency and the human papillomavirus (HPV). The metabolism of alcohol depends on the alcohol dehydrogenase (ADH), a family of enzymes with high frequency of genetic polymorphisms that give different individuals a wide range of susceptibility to metabolites. Thus, different genetic polymorphisms in ADH can interfere with the individual risk of cancer associated with alcohol consumption. The aim of this case-control study was to evaluate the frequency of SNP (SNP: single nucleotide polymorphism) in ADH1B gene in 61 patients with cancer of the oral cavity and in 66 healthy controls. The molecular study employed methods including polymerase chain reaction (PCR) associated to restriction fragment analysis (RFLP). The frequencies obtained for the genetic polymorphisms were calculated and compared in both groups, as well as the possible association between these polymorphisms and the characteristics of tumors. The results showed a higher prevalence of these tumors in the male population (74.3%), at ages above 45 years (88.5%), smokers (85.2%) and alcoholic (82.0%). Among the prognostic factors evaluated, the advanced stage (III and IV) was observed in 73.8% of cases and the involvement of regional lymph nodes in 39.3% of cases. Allele frequencies for ADH polymorphism R48H on group of cases were L = 82.8 and A = 17.2%, while in the control group were 79.4% and G = A = 20.6%. The genotypic frequencies obtained for the case group were AA = 16.0%; GA = 2.0% and GG = 81.0%, while for the control group, genotype frequencies were AA = 15.0%; GA = 12.0% and GG = 74.0%. The overall survival evaluated for the group was 49.9%. Significant differences in allele and genotype frequencies were observed between the groups or between the prognostic aspects evaluated. Epidemiological data from the oral cavity cancer have shown worrying trends, stressing the importance of promoting more studies related to this particular type of cancer.
Keywords: oral cavity cancer; alcohol consumption; single nucleotide polymorphism, alcohol dehydrogenase.
1. INTRODUÇÃO
1.1. O CÂNCER DE CAVIDADE ORAL, ASPECTOS GERAIS
A cavidade oral estende-se desde a mucosa dos lábios até as dobras
do palato grosso e o vestíbulo exterior, inclui a mucosa dos lábios e as
bochechas. O espaço delimitado pelas gengivas e dentes é a cavidade oral
propriamente dita (Figura 1). Ela também é composta na porção superior, pelo
palato duro e na porção posterior pelo o palato mole. Na porção inferior, estão
a língua e o assoalho da boca. Nas laterais, a porção que se estende desde a
comissura dos lábios até a região retromolar (GALBIATTI et al., 2013).
Figura 1 - Anatomia da Cavidade Oral
A cavidade oral é revestida por epitélio pavimentoso estratificado não
queratinizado na maioria dos sítios anatômicos, mas que mostra queratinização
nas áreas de mucosa aderida e especializada (gengiva, palato duro e dorso
lingual). O tecido conjuntivo subjacente pode estar associado a presença de
tecido muscular estriado esquelético, tecido adiposo, vasos sanguíneos e
nervos (Figura 2). Glândulas salivares menores são frequentemente
observadas no tecido conjuntivo, exceto na gengiva e no terço anterior do
palato duro (GALBIATTI et al., 2013).
Figura 2 - Epitélio estratificado pavimentoso não queratinizado.
Fonte: RANGEL, 2004.
Todas as áreas da cavidade oral apresentam drenagem linfática para o
pescoço, sendo que a primeira estação de drenagem inclui os linfonodos
júgulo-digástricos, júgulo-omo-hioideos, submandibulares e submentonianos
(ou seja, níveis I, II e III). A maior parte dos tumores malignos da cavidade
bucal é constituída pelo carcinoma epidermóide, que se classifica em
histologicamente bem diferenciado, moderadamente diferenciado e pouco
diferenciado (GROPPI, BEGUERET e IRON, 1990).
O câncer de cavidade oral tem um diagnóstico mais tardio,
sintomas imediatos. Grande parte dos cirurgiões-dentistas não se sente segura
para diagnosticar as lesões iniciais de câncer bucal, refletindo uma deficiência
de treinamento adequado. Considerando-se que 10% das malignidades que
ocorrem no corpo humano estejam localizadas na boca (DEDIVITIS et al.,
2004; GALBIATTI et al., 2013), é de grande relevância a conscientização
profissional para o diagnóstico precoce e correto encaminhamento (MARSH,
SUCHAK E MOUTTASIM et al., 2011; WITTEKINDT et al., 2012).
O câncer de cavidade oral pode ser facilmente detectado por exames
relativamente simples e o prognóstico da doença está ligado à fase em que ela
é detectada. A visualização do câncer oral é facilitada pelas características
anatômicas e pela localização da cavidade oral, de forma a dispensar o uso de
instrumentos de alta complexidade tecnológica e dificilmente gerar desconforto
ao paciente (WEI et al., 2010; MARSH, SUCHAK e MOUTASIM et al., 2011).
Pacientes com câncer de cavidade oral são tipicamente homens com
idades acima de 40 anos, com histórico de exposição regular a fatores de risco
como tabaco, álcool, deficiência de micronutrientes e também com história de
infecções pelo Papilomavírus humano (VU e FARAH, 2014).
O tratamento após a confirmação do diagnóstico pode ser muitas vezes
invasivo e causar deformidades faciais, justificando baixa adesão dos
pacientes. O tratamento para essas neoplasias é a cirurgia, associada ou não à
radioterapia. Cirurgia e radioterapia são formas de tratamento para a doença
localizada ou regional (JHAM e FREIRE, 2006). A maioria dos pacientes que
apresentam câncer de cavidade oral é submetida a altas doses de radioterapia
em extensos campos de radiação que podem incluir a cavidade bucal, maxila,
associada a diversas reações adversas como, cáries, mucosite e necrose de
tecidos (SPTCHE, 2002).
A quimioterapia adjuvante ou paliativa é indicada quando as lesões se
apresentam muito grandes ou irressecáveis e tem sido indicada sem que se
tenha verificado redução na taxa de mortalidade ou melhora no prognóstico.
Considerando-se que a quimioterapia apresenta resultados imprevisíveis, no
Reino Unido ela é indicada somente para câncer de cavidade oral no estádio
IV, inoperável ou recorrente (BRENER et al., 2007).
1.2. EPIDEMIOLOGIA DO CÂNCER DE CAVIDADE ORAL
O câncer de cavidade oral é considerado um problema de saúde pública
em todo o mundo. Segundo o Instituto Nacional de Câncer (INCA), a previsão é
de 596 mil novos casos de câncer no Brasil para o ano de 2016. Desses, o
câncer de cavidade oral representa a quinta incidência entre os homens (11,27
para cada 100 mil) e a décima segunda entre as mulheres (3,92 casos para
cada 100 mil), o que corresponde, no total, a 6,7% de todos os casos de câncer
(INCA, 2015).
Estima-se que, em 2016, sejam diagnosticados cerca de 15 mil casos
novos de carcinoma de cavidade oral no Brasil, dos quais 70% a 80% dos
diagnósticos ocorrem em fase já avançada da doença (GALBIATTI et al., 2013;
INCA, 2015).Sem considerar os tumores de pele não melanoma, o câncer da
cavidade oral em homens é o quarto mais frequente nas regiões Sudeste e
Nordeste, enquanto na região Centro-Oeste, é o quinto (Figura 3). Nas regiões
Sul e Norte, o sexto. Para as mulheres, o tumor é o nono mais frequente nas
Centro-Oeste, o câncer de cavidade oral é o 12º mais frequente e, na região
Sul, o 15º (INCA, 2015).
A taxa de incidência do câncer de cavidade oral está aumentando e a
OMS prevê a continuidade desse aumento nas próximas décadas (DASGUPTA
et al., 2012). Dos tumores de boca, 95% são carcinomas espinocelulares
(CEC) e os outros 5% correspondem a sarcomas, linfomas e tumores de
glândulas salivares. Apesar de todos os avanços no diagnóstico e,
principalmente, na terapêutica, com técnicas cirúrgicas radicais, novas drogas
quimioterápicas e radioterapia hiperfracionada e conformacional, o câncer de
cavidade oral continua com um prognóstico desfavorável e com altas taxas de
mortalidade (da SILVA et al., 2011; DASGUPTA et al., 2012).
Figura 3 - Estimativa do número de novos casos de câncer, segundo o sexo, para a região
Centro-Oeste do Brasil, em 2016.
Fonte: INCA, 2015.
No Brasil, a mortalidade, em homens, é representada graficamente por
uma linha ascendente (Figura 4). Na primeira década do século 21, as taxas de
e 0,70 para cada 100.000 mulheres e o incremento da mortalidade tende a
aumentar em uma taxa anual de 0,72% (MELO et al, 2010, AQUINO et al.,
2015). A sobrevida em cinco anos para o câncer de cavidade oral continua
baixa, em torno de 48% para a sobrevida global e 57% para a sobrevida
específica por sexo (BONFANTE et al., 2014).
Figura 4 - Mortalidade por câncer de cavidade oral em homens no Brasil, entre os anos de
1991 e 2010.
Fonte: IARC, 2012.
1.3. NOMENCLATURAS DAS NEOPLASIAS E CLASSIFICAÇÃO
A forma de se nomear as neoplasias malignas obedece à origem
embrionária do tecido. Os tecidos originários do folheto mesodérmico são, por
convenção, acrescidos do sufixo -sarcoma, provavelmente por seu aspecto
carnoso e com pouquíssimo tecido estromal de sustentação (HAMPERL,
2013). O aspecto macroscópico lembra muito carne de peixe por sua
de gordura, os lipossarcomas; neoplasias malignas de tecido muscular liso, os
leiomiossarcomas, e assim por diante (RIVA et al., 2015; KAINSBAK, HANSEN
e DUEHOLM, 2015).
O folheto ectodérmico origina os tecidos de revestimento externo e o
sistema nervoso central, assim como o folheto endodérmico, o tecido de
revestimento interno do organismo. Dessa forma, neoplasias derivadas de tais
folhetos são chamadas de carcinomas. Por exemplo, adenocarcinomas
(adenos: glândula) e carcinoma espinocelular (espinos: epitélio estratificado).
Normalmente, os carcinomas são acompanhados pela designação dos órgãos
de origem, como, por exemplo, adenocarcinoma do cólon, carcinoma
espinocelular do colo do útero, carcinoma de células transicionais da bexiga,
carcinoma espinocelular de hipofaringe, etc (DEVITA, HELLMAN e
ROSENBERG, 2009).
A União Internacional Contra o Câncer (UICC) juntamente com outros
orgãos internacionais, como a Organização Mundial da Saúde, juntaram
esforços a partir de 1950 para uniformizar e disseminar a classificação de
tumores malignos. Em 1982, chegou-se a um consenso para a publicação do
Suplemento da Classificação TNM, que uniformizou a classificação através de
explanações detalhadas com exemplos práticos (EISENBERG, 2004).
A classificação pelo Sistema TNM apresenta uma descrição precisa da
extensão anatômica aparente da doença. Um tumor com quatro graus de T,
três graus de N e dois graus de M terá 24 categorias TNM. Com a finalidade de
tabulação e análise, exceto em grandes séries, é necessário condensar essas
categorias em número conveniente de estádios TNM (Tabela 1). Onde T é
(no caso do câncer de cavidade oral, os linfonodos são os cervicais) e M à
metástase a distância (outros órgãos e tecidos adjacentes). Para se chegar ao
diagnóstico T, é necessário exame físico e diagnóstico por imagem, assim
como em N e M (EISENBERG, 2004).
Tabela 1 - Classificação quanto ao tamanho do tumor primário (T), linfonodos regionais (N) e
metástases (M) em câncer de cavidade oral.
T1 < 2 cm
T2 > 2 até 4 cm
T3 > 4 cm
T4a Invasão cortical óssea, músculos profundos extrínsecos da língua, seios maxilares, pele
T4b Invasão espaço mastigador, lâminas pterigóides, base do crânio, artéria carótida interna
N1 Homolateral, único, < 3 cm
N2
(a) Homolateral, único, > 3 até 6 cm
(b) Homolateral, múltiplo, < 6 cm
(c) Bilateral, contralateral, < 6 cm
N3 > 6 cm
MX Presença de metástase à distância não pôde ser avaliada
M0 Ausência de metástase à distância
1.4. A CARCINOGÊNESE
A partir da década de 70, pesquisas genética vieram mostrar o que
realmente acontece no interior do núcleo celular e, em especial, de uma célula
neoplásica. Genes que regulam a proliferação celular e o desenvolvimento das
células normais (protoncogenes) começaram a ser identificados e estudados
mais profundamente. Atualmente, muitos deles já estão fortemente
relacionados à gênese de neoplasias (ALAMA et al., 2009; ALBERTS et al.,
2010)
Muitos modelos foram propostos, buscando explicar os primeiros passos
da carcinogênese. O modelo da iniciação/promoção é o que mais têm se
mostrado confiável. Neste modelo, uma única célula, ou raramente mais
células, em meio a um tecido aparentemente normal, são alteradas
genotipicamente por fatores preditivos ou de risco (FRESHSNEY, 2007;
ALBERTS et al., 2010).
Atualmente, sabe-se que grande parte das neoplasias resulta da
interação entre fatores genéticos e ambientais, sendo a contribuição
exclusivamente genética responsável por apenas 5% de todos os tumores e o
restante pode ser atribuído a fatores ambientais que atuam em conjunto com a
suscetibilidade genética (FERREIRA e ROCHA, 2010).
A carcinogênese oral é um processo complexo, em que estão envolvidas
várias alterações que se iniciam nos queratinócitos. Essas alterações, se
devem a processos citogenéticos, nos cromossomos e epigenéticos, no DNA,
que modificam o controle do ciclo celular, bem como a expressão dos fatores
proliferação celular (NOCHT 1, CDKN2A, STAT3) e apoptose (p53) (RIVERA,
2015).
O epitélio oral normal possui uma camada basal com células
proliferativas e outras camadas de células mais diferenciadas (Figura 5). Os
fatores de risco como o álcool, o tabaco e o HPV atingem a camada basal
levando a lesões celulares que podem ser reparadas ou então levando essas
células a apoptose. No entanto, há situações em que essas células não
morrerão e irão acumular mutações. Essas mutações incidem principalmente
nos oncogenes e genes supressores de tumor, que irão alterar as
características das células (BURKHART e SAGE, 2008;DESHPANDE et al,
2005) .
Figura 5 - As várias etapas da progressão do tumor de células escamosas da cavidade oral.
(Adaptado de RIVERA, 2015).
Os principais supressores tumorais são as proteínas RB e TP53; eles
operam como chaves complementares que regulamas decisões celulares para
integra sinais extracelulares diversificados e as fontes intracelulares, em
resposta, decidem se a célula deve prosseguir através do seu ciclo de
crescimento e divisão, assim como TP53 sinaliza para apoptose
celular(HANAHAN, 2011).
As células epiteliais alteradas, ou mutadas, se tornam instáveis, com
uma alta taxa de replicação e disformidade. Essas células se acumulam em
regiões chamadas campos de pré-cancerização, levando a lesões neoplásicas
malignas. Nessa etapa, elas passam a ser autossuficientes e ilimitadas, com
capacidade de evadir a apoptose e infiltrar tecidos adjacentes. Esse processo
de metástase ocorre principalmente devido a perda de E-caderina, moléculas
de aderência, que ligam uma célula a outra (FELLER et al., 2013).
As lesões neoplásicas ou desordens potencialmente malignas são
divididas em dois tipos de lesões precursoras, as leucoplasias e as eritroplasias
(Figura 6) (TANAKA, TANAKA e TANAKA, 2011). A Organização Mundial de
Saúde (OMS) define leucoplasia como uma placa branca e é um termo
puramente clínico. A leucoplasia é mais frequente em homens na meia idade.
Menos de 1% dos homens com idade inferior a 30 anos têm leucoplasia, mas a
prevalência aumenta consideravelmente, chegando a 8% em homens com
idade superior a 70 anos (WARNAKULASURIYA e JOHNSON et al., 2007) A
eritroplasia, assim como a leucoplasia, é um termo puramente clínico e se
refere a manchas vermelhas na cavidade oral (também é empregada em
lesões do pênis). Ela não está relacionada a condições inflamatórias e sua
frequência é maior em homens mais velhos (WARNAKULASURIYA e
Figura 6 - Leucoplasia e eritroplasia de língua.
(Adaptada de Secretaria Estadual de Saúde da Paraíba,2015).
Quando essas lesões apresentam alterações nos queratinócitos basais e
parabasais são chamadas de displasias leves, a atipia em nível médio é
chamada de displasia moderada; quando as alterações são estendidas para a
camada mais superficial, é denominada displasia avançada e carcinoma in situ
(a atipia compreende a região da base do tecido à superfície). Cerca de 1%
das lesões evolue para a malignidade. Isso ocorre principalmente na
eritroplasia (NEVILLE, 2009).
Quer seja por polimorfismos em um único nucleotídeo (SNP) ou
deleções cromossômicas múltiplas e mutações gênicas, uma única célula
alterada, que adquire propriedades de proliferação e imortalidade, é capaz de
dar início à formação de um tecido tumoral (OLIVIERI et al., 2009).
Estima-se que mais de 80% das neoplasias malignas tenham origem à
partir de estímulos ambientais. Dentre estes estímulos, podemos destacar a
exposição aos carcinógenos químicos, representando a grande maioria;
carcinógenos físicos e vírus associados ao câncer, como o caso do HPV, o
1.5. FATORES DE RISCO
Exposições ocupacionais, tabagismo, ingestão de álcool, hábitos
dietéticos e microrganismos parecem influir na incidência de aberrações
cromossômicas, neoplasias e câncer. Os fatores de risco mais envolvidos na
etiologia do câncer de cavidade oral são o fumo e o consumo excessivo de
álcool (HASHIBE et al., 2008; LIANG et al., 2012).
Existem evidências substanciais de que os carcinomas de células
escamosas (CEC) são etiologicamente relacionados com o uso de tabaco, de
betel ou com o consumo excessivo de álcool ou destilados. Porém, alguns
pacientes desenvolvem CEC mesmo sem terem hábitos de tabagismo ou
etilismo, ou predisposição genética ao câncer. Há aproximadamente três
décadas, foram descobertas as primeiras evidências de que agentes
infecciosos poderiam também ser agentes etiológicos para o câncer. A
presença de genoma do Papilomavirus humano (HPV) em associação com
CEC, demonstrou o efetivo envolvimento viral no desenvolvimento de
determinados cânceres, principalmente dos carcinomas ano-genitais e de
cabeça e pescoço (MARRON et al., 2010; PINTO et al., 2011, LIANG et al.,
2012).
Além da significativa incidência e mortalidade, o câncer oral pode
originar impactos negativos na qualidade de vida dos indivíduos, acarretando
problemas na deglutição, fala, bem como, desfigurações faciais relevantes que
podem gerar sérios problemas na vida social dos indivíduos (CONWAYet al.,
2010).
As condições socioeconômicas são muitas vezes ignoradas na
situação socioeconômica (SSE) e a doença. Mesmo após ajuste para fatores
de risco como tabagismo e etilismo, ainda há um efeito residual das condições
sociais sobre o risco de câncer oral (CONWAYet al., 2010; MELO et al., 2010).
1.5.1 CARCINÓGENOS QUÍMICOS
Os carcinógenos químicos podem agir como agentes iniciadores,
promotores ou ambos, dependendo das propriedades químicas de cada um ou
de seus metabólitos, assim como o seu mecanismo de lesão celular. Existe a
necessidade de se salientar que a fase de iniciação é conhecida por sua
irreversibilidade, enquanto a subsequente fase de promoção pode se reverter
ou não. Temos como exemplos de carcinógenos químicos os nitritos,
benzopirenos, aflotoxina B1, benzeno, asbestos, nitrosoaminas, medicamentos
(muitos quimioterápicos e hormônios), além do fumo ou tabaco e do álcool
etílico, quando utilizado cronicamente (GONSEBATT, 2007; FEDMAN, 2013).
1.5.1.1. TABAGISMO
A fumaça do cigarro é uma mistura complexa composta de mais de 4000
substâncias, das quais, pelo menos, 150 são os principais componentes que
podem formar adutos advindos da adição direta de duas ou mais moléculas
diferentes (Figura 7)resultando em um único produto de reação contendo todos
os átomos de todos os componentes iniciais com o material genético
(REZENDE et al., 2008; CHEDID et al., 2008).
Existem dois tipos de tabagismo, o ativo e o passivo. Sendo que o ativo
é caracterizado pelo uso direto de derivados do tabaco. Já o passivo é
derivados do tabaco, por indivíduos não fumantes que convivem com fumantes
(HASHIBE et al., 2008).
Figura 7 - Benzopireno do tabaco formando adutos de DNA (ORELLANA, 2015).
O tabagismo é um fator de risco independente, apresentando risco
relativo até oito vezes maior do que nos não fumantes. Segundo a Organização
Mundial de Saúde (OMS), o tabagismo passivo é a terceira maior causa de
morte evitável do mundo, subsequente ao tabagismo ativo e ao consumo
excessivo de álcool (MARRON et al., 2010).
Os efeitos mutagênicos resultantes do uso de tabaco apresentam
resultados contraditórios. Embora alguns autores tenham observado aumento
na frequência de aberrações cromossômicas estruturais em fumantes,
resultados negativos também foram documentados. A técnica de citogenética
com hibridização (in situ Hybridization) se mostrou útil na detecção de
técnica de citogenética molecular observou-se aumento significativo na
frequência de translocações cromossômicas em fumantes (FEDMAN, 2013).
Em um estudo recente de caso controle, feito com a população
brasileira, foi inferido um aumento do risco para câncer de cavidade oral de
7,8% para homens e 5,8% para mulheres fumantes, quando comparados com
não fumantes (MOURA et al., 2014).
1.5.1.2. ETILISMO
O uso do álcool vem aumentando consideravelmente em toda a
população. Trazendo consequências primárias, na vida do indivíduo que
ingere, e secundárias, entre familiares e amigos e terciários para a sociedade,
com o aumento dos custos com cuidados de saúde e perda de produtividade.
Para alguns, essas consequências são somente leves desconfortos associados
a dores de cabeça, falta e atenção, vermelhidão. Para outros, especialmente
para os que bebem excessivamente, as manifestações são mais severas,
incluindo danos teciduais. O mais oneroso desses efeitos adversos é o
desenvolvimento de câncer (PÖSCHL e SEITZ, 2004).
Nem todos os cânceres têm promoção e progressão idênticas e muitas
hipóteses têm sido propostas para explicar os mecanismos que relacionam o
consumo de álcool e o desenvolvimento de câncer, principalmente de cabeça e
pescoço. Relacionando sinergicamente fatores enzimáticos, alterações na
microbiota da cavidade oral que pode aumentar a quantidade de acetaldeído e
Figura 8 - Proporção percentual por sexo e região, de pessoas maiores de 18 anos que
consomem bebida alcoólica uma vez ou mais por semana.
Fonte: INCA, 2015.
Estudos realizados em diferentes populações dos Estados Unidos, Ásia
e Europa demonstram um aumento do risco para desenvolvimento de câncer
de cavidade oral, relacionado ao consumo do álcool (LIPPMAN e HONG, 2001;
BOEING et al., 2002; BIAZEVIC et al., 2006, BOEHM et al., 2010, DASGUPTA
et al., 2012).
O alto consumo de álcool pela população brasileira, principalmente na
região Centro-oeste que tem uma média maior que a média brasileira (Figura
8), tem sido relacionado a diferentes tipos de câncer e com o aumento,
estatisticamente significante, na frequência de linfócitos com aberrações
cromossômicas numéricas e estruturais. Isso ocorre mesmo após longos
períodos de abstinência sugerindo uma ação do álcool na capacidade de
O alcoolismo é um dos mais bem estabelecidos fatores etiológicos do
câncer da faringe e da laringe. O consumo deste pode causar problemas
agudos e crônicos, distúrbios psicossociais, doença hepática crônica,
neuropatias periférica ou central, distúrbios da coagulação, síndrome de
abstinência, que inclui tremores, distúrbios visuais, taquicardia, ansiedade e
agitação. Sendo assim é importante uma avaliação cuidadosa dos itens
referidos e da possibilidade do afastamento do paciente do álcool impedindo
um pós-operatório tumultuado e a trágica cumplicidade da infusão alcoólica
parenteral ou enteral que, sem dúvida, favorece a formação de fístulas nos
pacientes submetidos às cirurgias na faringe, na laringe e na hipofaringe
(GARCIA et al, 2010; da SILVA et al., 2011; CHUANG et al., 2012).
1.5.2. CARCINÓGENOS FÍSICOS
Os carcinógenos físicos são mais bem representados pelas radiações,
que agem como iniciadoras do processo neoplásico, por causarem lesão direta
no DNA da célula exposta. A medula óssea é o maior alvo dos efeitos
deletérios das radiações, acompanhado pela tireoide. A exposição aguda ou
contínua à radiação pode provocar leucemias, linfomas e neoplasia maligna da
tireoide, entre outras patologias. A exposição à radiação solar, além de
provocar queimaduras na pele, pode provocar alterações pré-neoplásicas e
neoplásicas na mesma, principalmente pela ação dos raios UVB (LIANG et al.,
1.5.3. CARCINÓGENOS VIRAIS E O PAPILOMA VÍRUS HUMANO (HPV)
Acredita-se que os carcinógenos virais são responsáveis por cerca de
30% das neoplasias malignas humanas induzidas por fatores ambientais. Tais
vírus produzem rotineiramente quadros infecciosos, mas também podem levar
a um processo de iniciação de uma ou de toda uma população de células em
um determinado tecido indiretamente. Eles podem produzir a supressão de
mecanismos de defesa imunológica contra tumores, como no caso, provável,
do HIV. Está claro para a medicina que a maior incidência de alguns tipos de
linfoma, sarcoma de Kaposi e lesões malignas de canal anal em portadores
desse vírus (BISHT e BIST, 2011).
A infecção pelo HPV resulta em hiperplasia, papilomatose e lesões
verrucosas em células escamosas que podem evoluir para tumores primários
benignos, autolimitados. Existem aproximadamente 160 tipos conhecidos de
HPV, alguns deles, porém, são conhecidos como de alto risco oncogênico,
incluindo os HPVs 16, 18, 33 e 52, que induzem lesões com elevado risco de
progressão ao Carcinoma Cervical. Adicionalmente, estudos recentes apontam
especificamente a relação entre a infecção por HPV de alto risco e o
desenvolvimento de câncer cervical (BOSH et al., 2012).
Os HPVs são pequenos vírus de DNA circular, dupla fita, pertencentes à
família Papoviridae que infectam células de pele e mucosas (Figura 9). O
genoma do HPV está organizado em três segmentos gerais de diferentes
tamanhos. Uma região longa de controle, uma região de expressão precoce E
(do inglês, early) e a região de expressão tardia L (do inglês, late) (LIM et al.,
2007). A oncoproteína viral E6 pode formar um complexo com a proteína
dos pontos de checagem da fase G1/S mesmo em células com dano em seu
DNA. Por sua capacidade de manipular reguladores transcricionais, a proteína
E2 do vírus permite a transcrição e replicação do genoma viral a despropósito
da integridade do genoma do hospedeiro. Isso leva a alterações na expressão
de genes vitais e ao estado mutado da célula. Tem-se relacionado a questão
da existência de HPV em tumores de cabeça e pescoço e sua relevância
prognóstica (FERRAZ et al., 2012).
Figura 9 - Genoma do HPV com DNA circular de dupla-fita, mostrando a localização dos genes
do HPV 16. (Adaptado de D'ABRAMO e ARCHAMBAULT, 2011).
A infecção persistente por papilomavírus humano (HPV) de alto risco
tem sido associada ao carcinoma cervical. Uma fase obrigatória no
desenvolvimento deste câncer é a integração do DNA viral ao DNA das células
hospedeiras (LIMBERGER et al, 2012). A integração viral promove a
degradação do gene E2 do papilomavírus humano e leva a um aumento
descontrolado das oncoproteínas E6 e E7. Estas proteínas virais de
Rb. Inativação da proteína p53 é o resultado de vários fatores incluindo
mutação no gene para p53 (HONG, 2010).
A proteína E7 promove a degradação do pRb (proteína do
retinoblastoma), gene supressor de tumores, causando uma desregulação no
controle do ciclo celular, e consequentemente, o aumento da proliferação
celular (HONG, 2010).
1.6. FATORES PROGNÓSTICOS E PREDITIVOS
Fatores prognósticos são parâmetros possíveis de serem mensurados
no momento do diagnóstico e que servem como preditor da sobrevida do
paciente. O conhecimento dos fatores prognósticos é de fundamental
importância na determinação dos programas terapêuticos. Uma terapia
baseada em uma avaliação prognóstica possibilita a aplicação das diferentes
modalidades terapêuticas utilizadas no tratamento do câncer com a intensidade
e a efetividade adequadas e individualizadas para aquele paciente específico
(ABREU e KOIFMAN, 2002).
O comportamento biológico do CEC de cavidade oral é incerto, pois há
um grande número de tumores que em estádio inicial mostram um
comportamento biológico agressivo com metástase regional precoce e morte.
Ao contrário, tumores em estádio avançado podem lentamente metastizar-se e
esses pacientes, depois do tratamento, obtêm longos períodos livres de doença
(MONTORO et al., 2008).
Devido a essa incerteza de evolução, novas pesquisas passaram a
buscar fatores que pudessem influenciar o prognóstico. Esses fatores podem
e hábitos, como tabagismo e etilismo), ao tumor (sítio, estádio, espessura do
tumor, histopatologia e expressão de certos marcadores moleculares) e ao
tratamento (tipo de tratamento, terapia adjuvante). O estudo desses fatores
prognósticos visa a um melhor entendimento do comportamento biológico do
tumor, com isso, será possível traçar uma estratégia específica de tratamento
para cada paciente, sendo que receberão tratamento mais agressivo aqueles
que tiverem piores evoluções (CONWAY et al., 2010).
Sabe-se que a presença de metástase cervical é o fator mais importante
para o prognóstico em CEC de cavidade oral, provocando uma redução de
50% na sobrevida dos pacientes. O estadiamento TNM, o grau histológico, as
margens de segurança, entre outros fatores para prognósticos têm papel
incerto. Até mesmo o estadiamento TNM, ferramenta muito utilizada para
indicar prognóstico, não seria capaz de predizer o comportamento biológico
individual. O grau histológico tem valor prognóstico controverso, existindo, no
entanto, trabalhos que mostram que o carcinoma pouco diferenciado é mais
propenso a gerar metástase cervical, a ter maior probabilidade de apresentar
margens comprometidas e a associar-se à diminuição na sobrevida
(MONTORO et al., 2008, CONWAY et al., 2010)
1.7. METABOLISMO DO ÁLCOOL E O CÂNCER DE CAVIDADE ORAL
O álcool pode atuar como um cofator cancerígeno solubilizando outras
substâncias cancerígenas, como as encontrados no tabaco. Como também o
seu metabólito acetaldeído pode atuar diretamente como um agente
cancerígeno por ser um componente altamente reativo e tóxico, capaz de
reparação de DNA que provocam mutações genéticas. O acetaldeído é o
primeiro produto do metabolismo do etanol e o principal carcinógeno envolvido
no câncer relacionado ao uso de álcool. O etanol é oxidado para acetaldeído
por vários caminhos e que a álcool desidrogenase desempenha o papel
principal nesse processo (GARCIA et al. 2010).
A biotransformação de xenobióticos (substâncias estranhas ao nosso
organismo como o álcool) consiste no processo de conversão lipofílica para
hidrofílica. Quando essas substâncias se tornam hidrofílicas, elas podem ser
excretadas facilmente através da urina. Essa reação é catalisada por várias
enzimas através da hidrólise, redução e oxidação. O mecanismo da
metabolização ou biotransformação do álcool (Figura 10) se inicia com a
oxidação para aldeídos pela álcooldesidrogenase (ADH), que é oxidado
posteriormente, para ácido acético pela aldeído desidrogenase (ALDH).
Figura 10 - Oxidação do álcool pelas enzimas ADH e ALDH.
(Adaptados de PARKINSON e OGILVIE, 2008).
A mucosa bucal não é o principal local para a degradação do álcool, mas
alguma quantidade é absorvida e metabolizada em nível tecidual durante a
deglutição. O álcool é convertido pela enzima álcool desidrogenase (ADH) em
acetaldeído, e este em acetato pela enzima aldeído desidrogenase (ALDH)
(Figura 11). Posteriormente, o acetato chega até diferentes partes do
organismo, onde pode ser utilizado para produzir energia ou outras moléculas
promoveria uma maior produção de acetaldeído, pois permite um maior
acúmulo microbiano em que algumas bactérias conseguem degradar o álcool
para acetaldeído (HOMANN et al., 2006).
A capacidade individual de metabolizar o álcool para acetaldeído é
determinada principalmente pelos genes que codificam as enzimas ADH. O
acúmulo de acetaldeído pode ser devido a um aumento da atividade da ADH
conferida por polimorfismos presentes nessa enzima (CHANG, STRAIF E
GUHA et al. 2012).
Figura 11 - Via metabólica do etanol na Carcinogênese de Cabeça e Pescoço
(Adaptado de CHANG, STRAIF e GUHA, 2012).
A família de ADH é composta por sete isoenzimas que são codificadas
por diferentes genes, sendo elas distribuídas em 5 classes. (Classe I: ADH1A,
AD1B, AD1C; Classe II: ADH4; Classe III: ADH5; Classe IV: ADH7; Classe V:
ADH6). Todos os genes ADH estão localizados no braço longo do cromossomo
arginina pra histidina no aminoácido 48 (R48H) resulta em haplótipos com
diferentes taxas de metabolização. A ADH1B é expressa principalmente nas
glândulas suprarrenais e no fígado (BOEING et al, 2002).
Em 1968, Wartburg e Schuerch descreveram uma ADH atípica em
fígados humanos, a diferença observada foi a atividade da enima com pH 10,8
e pH 8,8. Em 1975, Stamatoyannopoulos e colaboradores encontraram uma
frequência de 85% para a isoforma atípica do ADH1B em japoneses através da
migração mais rápida durante eletroforese. Essa variante tinha seis vezes mais
atividade no pH 8,8 levando a conclusão de que os japoneses tinham mais
sensibilidade ao álcool devido ao aumento da formação de acetaldeído pela
isoforma atípica de ADH1B. Em 1984, Jornvall e colaboradores mostraram que
as formas típica e atípica de ADH1B se diferenciam somente por um único
aminoácido substituído no éxon 3 do gene numa posição em que o grupo
pirofosfato se liga na coenzima NAD(H), em que a forma típica contém arginina
no aminoácido 48 e a forma atípica contém histidina no aminoácido 48.
O fígado é um dos principais prejudicados pelo consumo de álcool, que
provoca determinados tipos de esteatoses, cirroses e hepatites. Estando o
fígado incapacitado de depurar toxinas, estas se manteriam no sangue e
poderiam afetar outros tecidos a distância, por exemplo, a mucosa bucal.
Existe ainda a possibilidade de uma menor disponibilização de vitaminas, pois
essas são processadas no fígado (CARRARD et al, 2007).
Estudos realizados em diferentes populações dos Estados Unidos, Ásia
e Europa (Tabela 2) demonstram um aumento do risco para desenvolvimento
GARFINKEL, 1990; CHYOU et al., 1995; KJAERHEIM et al., 1998; MURATA
et al., 1996; BOEING H. et al.,2002).
Tabela 2 - Resumo dos artigos selecionados para revisão sistemática com dados relevantes
dos estudos de caso-controle.
Referência País Ano
Nº de casos cabeça/ pescoço Nº de casos Cavidade oral/orofaringe Nº de controles Metodologia utilizada Asakage Japão 2007 96 53 642 PCR/RFLP Hashibe Europa e América Latina 2008 3800 1790 5200 PCR/Taqman Garcia Brasil 2010 207 157 244 PCR/RFLP Wei Texas 2010 1110 893 1129 PCR/RFLP Ji Coréia do Sul 2011 225 68 301 PCR/Taqman Chung Taiwan 2014 258 21 276 PCR/ Sequenom MassARRAY
Os valores para as frequências genotípicas variaram principalmente
entre as populações caucasianas e asiáticas. O genótipo GG variou de 13, 3%
para população asiática a 95,4% para caucasianos. Em relação ao genótipo
heterozigoto GA a frequência oi de 38,7% a 4,6%, sendo a menor frequência
na população caucasiana e a maior na população asiática. O estudo feito com
a população brasileira de Garcia, os padrões de frequências seguem o mesmo
dos achados na população caucasiana. O genótipo AA é mais frequente na
população asiática (60,1%) quando comparado aos estudos com população
A variante rs1229984 (ADH1B) A/A é conhecida por metabolizar o etanol
40 vezes mais rápido do que o rs1229984 comum (ADH1B) G/G, fornecendo
suporte para erradicação mais rápida de etanol e, portanto, menor exposição, o
que pode explicar ser fator protetivo (GARCIA et al., 2010). O álcool
metabolizado rapidamente para acetaldeído, esta relacionado a diminuição de
seu consumo, justamente por aumentar a quantidade de acetaldeído sistémico
que pode causar sintomas adversos, tais como náuseas, rubor facial e
aumento de frequência cardíaca (IARC., 2011).
Essa relação de rubor facial e aumento da frequência cardíaca é
conhecida como efeito Bohr e representa um fator crucial para a maior
descarga de oxigênio pela hemoglobina. Ela ocorre devido a presença de
níveis mais altos de CO2 e prótons (H+) nos capilares de tecidos em
metabolismo ativo promovendo a liberação de O2 da hemoglobina, o efeito
recíproco também ocorre nos capilares dos alvéolos do pulmão, a alta
concentração de O2 libera CO2 e H+ da hemoglobina. Essa intensificação na
liberação de oxigênio pela hemoglobina em razão de maior acúmulo de
coprodutos do metabolismo tecidual, assim como maior produção de calor por
unidade de músculo levam à maior vasodilatação das arteríolas que irrigam os
músculos ativos aumentando a perfusão sanguínea muscular (PRADO, DIAS E
TROMBETTA, 2006).
ADH1B pode influenciar também o consumo de álcool, podendo ser um
fator de risco para o desenvolvimento de dependência de álcool. Em que o
polimorfismo, leva ao rubor induzido pelo álcool através de mecanismos
moleculares que incluem acúmulo de acetaldeído e liberação de histamina.
dopaminérgica e do sistema límbico cortical, em que uma ampla gama de
neurotransmissores modulam pra a liberação desses fatores de recompensa
(MAYIELD, HARRIS e SCHUKUIT, 2008).
Tabela 3 - Frequências genotípicas da variante polimórfica ADH1B R48H em pacientes com
carcinoma de cabeça e pescoço e em controles sem câncer por estudo
Referência
Casos Controles
Resultados encontrados G/G G/A A/A G/G G/A A/A
Asakage
(2007) 19,8 29,2 51 1,8 34,7 60,1
Alelo GG mais prevalente no grupo casos que nos controles, aumenta o risco para câncer quando relacionado aos que consomem muito álcool.
Hashibe
(2008) 86,5 6,2 0,3 84 11 0,5
O modelo codominante foi significativamente associado ao menor risco para câncer nos três estudos que o artigo engloba, efeito protetor quando associado ao alto consumo de álcool.
Garcia
(2010) 94,2 5,8 - 87,3 11,9 0,8
Alelo AA foi associado com diminuição do risco para câncer (fator de proteção).
Wei
(2010) 95,4 4,6 - 95,2 4,6 0,2
Não houve associação entre os genótipos e o risco para câncer de cavidade oral e orofaringe.
Ji
(2011) 13,3 38,7 48 5 37,2 57,8
Alelo GG aumentou
significativamente o risco para câncer, principalmente para o grupo que consumiu elevada quantidade e com idade entre 45-60 anos.
Chung
(2014) 27,2 30,4 42,4 9,6 42,5 47,9
Maior risco de câncer para indivíduos que possuem alelo GG e consomem álcool.
Assim como, as enzimas mutadas podem produzir níveis mais elevados
de acetaldeído, diminuindo o risco para dependência. As enzimas que
metabolizam o álcool mais rapidamente aumentam os níveis de acetaldeído,
que está relacionado a dores de cabeça, náuseas e rubor facial. O que faz com
que o individuo pare de ingerir o álcool mais rapidamente (WALL et al., 2005 e
JI et al., 2011).
Tendo em vista a alta mortalidade por câncer de cavidade oral e poucos
estudos relacionados aos polimorfismos nos genes que metabolizam o álcool, e
os seus mecanismos de ação, principalmente na população brasileira, que é
extremamente heterogênea. Este estudo torna-se relevante para traçar novas
2. JUSTIFICATIVA
A relação do polimorfismo em ADH1B R48H, com carcinomas de
cavidade oral vêm sendo demonstrada por diversos estudos no mundo. No
Brasil e nos demais países da América do Sul, esses estudos ainda são raros e
não demonstram claramente a frequência desses polimorfismos, bem como
seu total mecanismo de ação. No que concerne à região Centro-Oeste, não há
estudo desta natureza publicado. Assim, compreender melhor a relação das
alterações genéticas, principalmente nas enzimas responsáveis por
metabolizar os xenobióticos e o álcool, e carcinomas de cavidade oral é
fundamental para estratégias de prevenção, bem como o estabelecimento de
3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GERAL
• Avaliar as possíveis associações entre o polimorfismo do gene ADH1B
R48H e o câncer de cavidade oral em pacientes de atendidos em
Goiânia – GO.
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Descrever os principais aspectos sociodemográficos, clínicos e
histopatológicos dos casos de carcinomas de cavidade oral.
• Comparar a frequência do polimorfismo ADH1B R48H em um grupo de
pacientes com câncer de cavidade oral e em um grupo controle sem
histórico de câncer de cavidade oral.
• Avaliar a sobrevida de pacientes com o câncer de cavidade oral em 60
meses.
• Avaliar as possíveis associações entre as frequências do polimorfismo
ADH1B R48H e o prognóstico dos pacientes com carcinomas de
cavidade oral.
• Avaliar as possíveis associações entre as frequências do polimorfismo
4. METODOLOGIA
4.1. DELINEAMENTO METODOLÓGICO
Estudo epidemiológico retrospectivo e analítico, tipo caso-controle, que
comparou a frequência dos polimorfismos no gene ADH1B R48H em amostras
tumorais de pacientes com câncer de cavidade oral e amostras de sangue
periférico de indivíduos saudáveis sem histórico de câncer de cavidade oral.
Para o grupo casos, foi realizada análise de sobrevida e usado blocos de
parafina de pacientes diagnosticados em 2005 e 2006 para o seguimento total
de 60 meses. E para o grupo controle foi usado sangue periférico de usuários
do Laboratório de Análises Clínicas da PUC-Goiás que já fariam exame de
sangue. Não conferindo nenhum risco adicional tanto para o grupo caso,
quanto para o grupo controle.
4.2. POPULAÇÃO DE ESTUDO
O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres
Humanos do Hospital Araújo Jorge (HAJ), sob o nº CAAE
45582615.5.0000.0031. As variáveis clínicopatológicas e sociodemográficas
potencialmente associadas à sobrevida dos pacientes, em cinco anos, foram
analisadas, incluindo idade ao diagnóstico, estadiamento TNM (tamanho
tumoral, presença e número de metástases linfonodais e aparecimento de
metástases à distância) e o grau nuclear do tumor. As curvas de sobrevida
foram geradas usando o método de Kaplan-Meier e comparadas pelo teste de
Log-rank. Todos os cálculos estatísticos foram realizados por meio do software
GraphPad Prism 4.02 para Windows (GraphPad Software, San Diego, CA,
diagnóstico e foi concluído na data do óbito ou quando completados 60 meses
após o diagnóstico.
4.3. SELEÇÃO DOS CASOS PARA DETERMINAÇÃO GENOTÍPICA DE
ADH1B POR PCR/RFLP
A frequência do polimorfismo em ADH1B R48H foi investigada em 61
espécimes de CCE de cavidade oral diagnosticados no HAJ, Goiânia-GO, no
período de 2005 a 2006. Inicialmente, foram levantados 189 casos de CCE de
cavidade oral, diagnosticados no período de 2005 a 2006. Em seguida, foram
eliminados aqueles que não tinham dados clinicopatológicos nos prontuários ou
confirmação histopatológica e aqueles que eram casos de câncer em sítios
anatômicos diferentes da cavidade oral, o que totalizou 104 casos. Os 104
casos foram pesquisados junto ao Departamento de Patologia do HAJ para
levantamento dos blocos disponíveis. Em função da quantidade de material
tumoral presente em cada bloco e a fim de preservar o tecido disponível, e
após a extração e quantificação do DNA, 61 casos foram selecionados para a
detecção do polimorfismo.
O tamanho amostral foi calculado de acordo com a equação (n= )
onde n é o tamanho amostral, n0 é um sobre o erro, que será de 10%, e N é o
tamanho populacional, que será o número de casos de câncer de cavidade oral
previstos para o período apurado, em Goiânia. Assim, foram analisados 61
casos e 66 controles. A seleção dos casos foi feita a partir de uma busca ativa
nos registros informatizados do Setor de Anatomia Patológica do Hospital
Araújo Jorge. Os tumores com diagnóstico histopatológico confirmado foram
selecionados para o levantamento de blocos histopatológicos e para a análise
prontuários, incluindo idade, gênero, estadiamento clínico, tamanho da lesão,
comprometimento de linfonodos regionais, metástases à distância, subtipo
histológico, localização e seguimento do paciente. Os sujeitos do grupo
controle foram convidados a participar do estudo durante a realização dos
exames de rotina em um centro público de atendimento a saúde, quando foram
informados sobre os objetivos do estudo e assinaram o Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) (Anexo II). Posteriormente, o
paciente foi submetido à coleta de sangue periférico por um técnico
responsável. As alíquotas do sangue coletadas foram mantidas refrigeradas em
recipiente adequado e transferidas ao final do dia para o Laboratório de
Oncogenética do Hospital Araújo Jorge, onde foram realizados os
experimentos de genotipagem.
4.4. EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO
As extrações de DNA das amostras de sangue (controles) foram
realizadas pela técnica de salting-out (GREEN & SAMBROOK, 2012). Para a
extração de DNA das amostras de tecido tumoral fixado em parafina, foi
utilizado o Kit comercial Wizard Genomic Purification Kit (Promega, Madison,
WI, EUA). Em ambos os casos, seguiu-se as instruções fornecidas pelos
fabricantes dos kits.
Após as extrações, o DNA extraído e purificado foi submetido à
quantificação por espectrofotometria, sendo posteriormente armazenadas em
freezer à temperatura de -80 °C, onde permaneceram até serem submetidas às
4.5. DETECÇÃO E GENOTIPAGEM DOS POLIMORFISMOS
Os polimorfismos genéticos de ADH1B foram examinados utilizando
Reações em cadeia da polimerase (PCR), seguidas de polimorfismo de
comprimento dos fragmentos de restrição(RFLP), como descrito por Wei et al.
(2010). Para a realização das amplificações por PCR, utilizou-se
aproximadamente 20 µg de DNA genômico, 0,1 mM de dNTPs, 1,5 mM de
MgCl2, 0,5 U de Taq DNA-polimerase, 2 pmol de cada primer, além de tampão
de PCR contendo 50 nM de KCl, 10 mM de Tris-HCL e 0,1% de Triton X-100.O
DNA genômico das amostras foram amplificados utilizando-se os primers de
acordo com a Tabela 4, onde o polimorfismo é mostrado em itálico e
sublinhado.
Tabela 4 - Sequência dos primers utilizados nas Reações em Cadeia da Polimerase.
Primer Sequência Tamanho do
Amplicon
ADH1B R48H
Forward 5’-AGAAACACAATTTCAGGAATTTGGGT-3’
Reverse 5’- ACTAACCACGTGGTCATCTGCG-3’ 132 pb
Os produtos de PCR foram então submetidos à digestão pela enzima de
restrição HhaI para ADH1B R48H, utilizando-se o protocolo fornecido pelo
fabricante (NewEnglandBiolabs, Beverly, MA, EUA), mostrados na Tabela 5,
quando foram então separados em géis de poliacrilamida.
Tabela 5- Enzimas de Restrição utilizadas para a genotipagem de SNIPs de ADH.
SNPs Enzimas de restrição Sítio de restição Condição de digestão
ADH1B R48H HhaI 5' GCGC5' ---GCG C--- 3'
3' CGCG 3' ---C GCG--- 5'
37°C 1-16 h
4.6. METODOLOGIA DE ANÁLISE DE DADOS
A análise estatística dos dados será realizada por meio do software
GenePop® Webversion 4.1.0. A utilização deste programa permite avaliar as frequências alélicas e genotípicas da população estudada, bem como o
equilíbrio de Hardy-Weinberg. A comparação das frequências alélicas e
genotípicas nos subgrupos será feita por meio do teste t Student, que é mais
adaptado para comparação entre as médias de grupos populacionais, quando
o desvio padrão destas populações é desconhecido.
4.7. CRITÉRIOS DE INCLUSÃO
Casos: participantes com diagnóstico de carcinoma de cavidade oral
comprovados histopatologicamente, que apresentaram dados clinicos -
patológicos nos respectivos prontuários, blocos de parafina disponíveis no
Serviço de Anatomia Patológica do Hospital Araújo Jorge e seguimento clínico
por um período mínimo de cinco anos.
Controles: participantes sem diagnóstico de carcinoma de cavidade oral, com
idade e sexo correspondente aos casos, que concordaram em participar do
estudo, assinaram o TCLE e maiores de 18 anos.
4.8. CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO
Casos: participantes que não tiveram o diagnóstico histopatológico confirmado
para o câncer de cavidade oral, ou cujos blocos de tumores não estiveram
disponíveis no serviço, ou ainda com dados clínicos incompletos em seus
Controles: Participantes com diagnóstico ou histórico familiar de câncer de
cavidade oral ou que não concordaram em participar do estudo, não assinaram
o TCLE, menores de 18 anos.
4.9. FLUXOGRAMA DE EXCLUSÃO
Casos Inicialmente selecionados no SAP/HAJ (149)
Exclusão por serem casos de câncer em outros sítios anatômicos diferentes de
cavidade oral (12) Exclusão por falta de dados nos prontuários
(49)
Exclusão por falta de confirmação histopatológica
(2)
Exclusão por falta de blocos disponíveis antes de tratamento radioterápico
(25)
Total de casos incluídos no estudo (61)
