SUMÁRIO
1. Composição do meio de cultura MS (Murashige & Skoog, 1962) ... 3
2. SOLUÇÃO STOCK ... 3
2.1 Preparação de uma solução stock de Quelato de Ferro (x10)... 4
2.2 Solução stock de vitaminas... 5
2.3 Solução stock do meio Knudson ... 5
3. Para calcular a quantidade de ml de solução stock: ... 6
4. Diluição de Hormônios Vegetais... 6
5. Diluição NaOH: 0,1N e HCl: 0,1N ... 6
6. PROCEDIMENTOS:... 7
6.1 Preparação do Meio de Cultura:... 7
6.2 Assepsia para sementes de orquídeas:... 7
6.3 Assepsia superficial para suculentas: ... 8
6.4 Inoculação de Dicksonia sellowiana ... 8
7. Procedimentos na estufa de aclimatação:... 9
8. Informações importantes ... 9
BOTANICA
1. Composição do meio de cultura MS (Murashige &
Skoog, 1962)
20 ml/L Macronutrientes 20 ml/L Micronutientes 30 g/L de Sacarose 1 g/L de carvão ativado
3,5 g/L de Agar (depende, fazer testes para ver a concentração adequada)
10 ml/L de Vitaminas
2. SOLUÇÃO STOCK
MACRONUTRIENTES (x50)
Composto MS (1962) Concentração final (mg l-1)
NH4NO3
(Nitrato de amonio) 1650mg/l 1650mg / 1000 X 50 = 82,5g ou (82,500mg)KNO3
(Nitrato de potássio) 1900mg/l 1900mg / 1000 X 50 = 95g ou (95,000mg)CaCl2.2H2O
(Cloreto de Cálcio) 440mg/l 440mg / 1000 X 50 = 22g ou (22,000mg)KH2PO4
(Dihidrogenofosfato de potássio) 170 mg/l 170mg / 1000 X 50 = 8,5g ou (8,500mg)MgSO4.7H2O
(Sulfato de magnésio) 370 mg/l 370mg / 1000 X 50 = 18,5g ou (18,500mg)OBS: Pipetar 20ml/L de Macro e Micronutrientes para obter a concentração desejada.
2.1 Preparação de uma solução stock de Quelato de Ferro (x10)
Para preparar uma solu
ção stock de quelato de Ferro 10
vezes
concentrada proceder da seguinte forma:
1. Dissolver 2.78 g de sulfato ferrosos heptahidratado em
350 ml
de
água destilada ou bidestilada
.
2. Dissolver num outro recipiente 3.73 g de Na2-EDTA
(
Ácidoetileno
-
diaminotetrac
ético, sal di
-s
ódica). Levar a
aquecimento
é r
ecomend
ável
.
MICRONUTRIENTES (x50)
Composto MS (1962) Concentração final (mg l-1)
Mn SO4.7H2O
(Sulfato de manganês) 22.3mg/l 22.3mg / 1000 X 50= 1.115g ou (1,115mg)H3BO3
(Ácido bórico) 6,2mg/l 6.2mg / 1000 X 50 = 0,31g ou (310mg)CuSO4.5H2O
(Sulfato de Cobre) 0,025mg/l 0.025mg / 1000 X 50= 0.00125g ou (1,25mg)CoCl2P.6H2O
(Cloreto de cobalto) 0,025mg/l 0.025mg / 1000 X 50= 0.00125g ou (1,25mg)NaMoO4.2H2O
(molibidato de sódio) 0,25mg/l 0.25mg / 1000 X 50 = 0.0125g ou (12,5mg)KI
(Iodeto de Potássio) 0,83mg/l 0.83mg / 1000 X 50= 0.0415g ou (41,5mg)
ZnSO4.7H2O
3. Quando os dois componentes se tenham dissolvido
completamente, combinar ambas as solu
ções e levar o
volume final a 1 litro usando
água destilada ou bi
-destilada.
A solu
ção obtida deverá ser levemente amarela e
transparente.
A concentra
ção
dos componentes usados na prepara
ção,
baseia-se na formula
ção de base do meio de Murashige e
Skoog, 1962.
2.2 Solução stock de vitaminas
VITAMINAS (x100)
Composto MS (1962) Concentração final (mg l-1)
Ácido
Nicot
ínico
0,5mg/l 0,5mg / 1000 X 100 = 0,05g ou(50mg)Piridoxina.HCl
0,5 mg/l 0,5mg / 1000 X 100 = 0,05g ou (50mg)Tiamina.HCl
0,1mg/l 0,1mg / 1000 X 100 = 0,01g ou (10mg)Glicina
2,0mg/l 2,0mg / 1000 X 100 = 0,2g ou (200mg)Mio-inositol
100mg/l 100mg / 1000 X 100 = 10g ou (10.000mg)OBS: Pipetar 10ml de cada solução para 1 L de meio
2.3 Solução stock do meio Knudson
STOCK (x10) KNUDSON C
Composto
Knudson C
(1946) Concentração final (mg l-1)
Ca(NO 3 ) 2 * 4 H 2 O
1000 mg/l 1000mg / 1000 X 10 = 10g ou (10,000 mg)KH 2 PO 4
250 mg/l 250mg / 1000 X 10 = 2,5g ou (2,500mg)(NH 4 ) 2 SO 4
500 mg/l 500mg / 1000 X 10 = 5g ou (5,000mg)FeSO 4 * 7 H 2 O
25 mg/l 25mg / 1000 X 10 = 0,25g ou (250mg)MnSO 4 * 4 H 2 O
7,5 mg/l 7,5mg / 1000 X 10 = 0,075g ou (75mg)
OBS: Pipetar 100ml/l acrescentar 20g/l de sacarose, 4,5g/l de ágar. (no meio Knudson não vai carvão).
3. Para calcular a quantidade de ml de solução stock:
C1.V1=C2.V2Onde: C1: concentração final do stock em mg V1: o volume que deseja saber em ml C2: concentração necessária (protocolo) V2: volume do está sendo preparado EXEMPLO: (ac.nicotinico) C1.V1=C2.V2 50mg.V1=0,5mg.1000ml V1=500/50 V1= 10ml (Glicina) C1.V1=C2.V2 200mg.V1=2,0mg.1000ml V1=10ml
4. Diluição de Hormônios Vegetais
HORMÔNIOS VEGETAIS
Substância PM Para converter
mg/L em µM, multiplique por Para converter µM em mg/L, multiplique por Solvente
NAA ou ANA 186,2 5,37 0,186 Água+ gotas de
KOH 1M
BAP 225,3 4,44 0,225 Água+ gotas de
HCl 1M
5. Diluição NaOH: 0,1N e HCl: 0,1N
(para uso no pHmetro)HCl 0,1N: 8,3ml de HCl e completar até 1 litro de água destilada. Obs: NaOH aumenta o pH e HCl diminui.
6. PROCEDIMENTOS:
6.1 Preparação do Meio de Cultura:
*Os meios normalmente seguem o padrão de pH 5,8.
* Na LAPI adotamos ½ MS, ou seja apenas 10ml de macro e micronutrientes + vitaminas e 30g/l de sacarose, o pH é ajustado para 5,8 (mede-se o pH antes de colocar a sacarose, pois esta pode prejudicar o bom funcionamento do eletrodo).
Enquanto mede-se o ph (que deve chegar aos 5,8), o meio deve estar no agitador magnético para homogeneização, para aumentar o pH coloca-se gota a gota o NaOH e para diminuir o HCl.
Após retirar o eletrodo do meio, ainda no agitador, coloca-se a sacarose, e espere dissolver totalmente. Leve este meio para a chapa aquecedora e quando estiver quente, acrescentar 4,5g/L de Agar e 1g/L de carvão ativado, mexer para misturar bem. Ao ferver, retirar e colocar 50ml em cada frasco, com o uso de uma proveta. (CUIDADO: atenção para não esquecer e ferver demais derramando o líquido sobre a chapa, use sempre luvas térmicas para não se queimar). Tampar os frascos de uma forma que fiquem meio fechados, levar para a autoclave, os meios devem ser autoclavados durante 20 minutos a uma temperatura de 120ºC e 1 atm. (seguir as instruções da autoclave).
Obs: Nunca abrir frascos fungados dentro do laboratório, tirar o elástico e autoclavar ainda com os plásticos.
6.2 Assepsia para sementes de orquídeas:
Se a cápsula estiver fechada pode-se flambar levemente, abri-la em duas ou mais partes dependendo do seu tamanho, colocar as sementes em hipoclorito 10% (quando o risco de contaminação for alto o hipoclorito pode ser a 20%, se a cápsula estiver fungada por fora deixar primeiro no hipoclorito 20% por 10 min, lava-se uma vez com água autoclavada, depois coloca no hipoclorito 10% e deixa mais 20 min) deixar as sementes durante 20 minutos, mexendo de 2 em 2 minutos para misturar bem. Após esse tempo lavar as sementes 3 vezes com água autoclavada, na última lavagem deixar um pouco da água. Para inocular as sementes agitar a “peneirinha” e pegar com a pisseta, colocar nos vidros.
* Meios de cultura para suculentas (violeta, kalanchoe..) deve-se usar 20 ml de hormônio BAP e NAA, e não colocar carvão ativado.
6.3 Assepsia superficial para suculentas:
Cortar a folha da planta, ou o botão floral ainda fechado, colocar em uma vasilha com água e detergente (4 gotas de detergente para 1L de água) deixar por 20 minutos, lavar 2 vezes com água da torneira, a terceira vez lavar com água destilada, deixar um pouco de água para não desidratar enquanto prepara-se a câmara e o hipoclorito 20%. Colocar tudo na câmara de fluxo, as placas de Petri tem que ser autoclavadas e secadas em estufa a 150ºC, colocar o hipoclorito a 20 % na câmara também, ligar o germicida por 10 minutos. Após esse tempo colocar as folhas e botões no hipoclorito e deixar 20 min, escorrer o hipoclorito num béquer para descarte, lavar 3 vezes com água autoclavada, na ultima vez deixar um pouco de água para não desidratar.
Segura a folha com a pinça já esterilizada no fogo corta-se as extremidades com o bisturi também já flambado, coloca no frasco no sentido da seiva, para inocular o pecíolo também corte-se uma parte central, pode colocar mais de um no frasco,os botões pode colocar mais de um também, com as folhas coloca-se apenas uma. Obs: não encostar as folhas e os pecíolos no fundo do frasco.
Tanto para orquídeas quanto para violetas após 30 dias fazer repique,
no caso da violeta fazer o meio sem hormônio, mas se a planta estiver fraca colocam-se novamente os hormônios.
6.4 Inoculação de Dicksonia sellowiana
O meio utilizado é o com o MS com a metade das concentrações de macro e micronutrientes, sem sacarose, sem ágar e carvão, é acrescido de 0,01% de Benlate (fungicida) Materiais utilizados: 1 – Erlenmeyer de 2L 2 – Beckers de 600ml 1 – Becker de 150ml 1 – Placa de petri 1 – Funil 1 – Tampa de caneta 1 – Colher Papel filtro
Preparar a câmara com todos os materiais autoclavados, e os frascos contendo o meio MS, deixar 20 minutos na luz germicida, antes de
manusear na câmara não esquecer de desligar a germicida. Colocar o papel filtro no funil e este no erlenmeyer e adicionar uma solução de hipoclorito 10% com os esporos no funil, após filtrar adicionar os 1000ml de água destilada autoclavada, aos poucos, no funil para lavar os esporos. Quando acabar a água, com auxilio da tampa de caneta, colocar uma determinada quantidade de esporos nos frascos de meio MS.
7. Procedimentos na estufa de aclimatação:
Quando as plantas atingirem um tamanho considerável, retirá-las do frasco com auxilio de uma pinça e lavar bem as raízes para não ficar sujas de meio, pois este pode apodrecer as raízes da planta. Envolver as raízes com um pouco de Sphagnum molhado e colocá-las em bandejas próprias. Identificá-las com placas contendo o nome da planta.
As regas não podem ser em excesso, deve ser o suficiente para deixar o substrato úmido e não encharcado, não deve-se molhar as plantas todos os dias. Mantê-las em sombra, o sol pode queimar mudas pequenas.
Uma vez por semana deve-se pulverizar sobre as mudas o adubo foliar, (diluição: 1 colher de café em 1 litro de água).
Quando achar que a planta (orquídea) deve ser replantada em um vaso maior, colocar pedras no fundo do vaso e completar com o substrato (casca de pinus, fibra de coco, fibra de xaxim...) colocar a planta de uma forma que ela fique fixa no vaso. Nunca colocar terra (a não ser que a planta seja terrestre), e também não colocar pó-de-xaxim. Pode-se misturar ao substrato, pedaços de carvão e isopor.
Pesquisar sobre cada espécie, pois algumas necessitam de mais água que outras.
No inverno fechar as cortinas de plástico para o vento e o frio não queimar as plantas.
8. Informações importantes
Os MACRONUTRIENTES são aqueles absorvidos em grandes quantidades pelas plantas. E os MICRONUTRIENTES são aqueles absorvidos em pequenas quantidades.
- Nitrogênio: É constituinte de aminoácidos, nucleotídeos e coenzimas, tendo importância na síntese protéica. A toxidez do amônio às células diminui ou desaparece quando ele é usado como única fonte de nitrogênio na forma de sal de um ácido orgânico, de preferência um ácido tricarboxílico (Torres, 1998). Meios enriquecidos de nitrogênio são
fundamentais para a embriogênese somática, bem como diferenciação da parte aérea (Amirato, et al. 1983).
- Fósforo: é adicionado ao meio, principalmente, como fosfato de potássio monobásico (H2PO4-), pois é a forma que é absorvido (George, 1996). Atua no metabolismo energético, na regulação de processos enzimáticos e na ativação de enzimas (Santiago, 2001). Necessário para a síntese do ATP e na organogênese está envolvido na diferenciação da parte aérea, pois reverte o efeito das auxinas.
- Potássio: Ativador de várias enzimas do metabolismo de carboidratos e proteínas. Umas das importantes é a quinase do piruvato, enzima envolvida nos processos de glicólise e respiração (Santiago, 2001). É necessário para a embriogênese somática (Amirato, 1983). A deficiência de potássio pode conduzir a hiperhidricidade e decréscimo na taxa de absorção de fosfato. - Cálcio: Usado na forma de nitrato ou cloreto. Está envolvido na divisão celular, uma vez que um dos componentes da lamela média é o pectato de cálcio. Mantem a integridade da membrana celular e é importante para a germinação de grãos de pólen (George, 1993).
- Magnésio: Usado na forma de sulfato de magnésio. É um dos componentes da clorofila, co-fator importante para várias reações enzimáticas que atuam sobre substratos fosforilados.
- Ferro: Está numa faixa intermediária entre os macros e micronutrientes. É adicionado ao meio na forma de quelato Fe-EDTA. Envolvido nas reações de oxi-redução nos organismos vivos. Essencial para a síntese da clorofila. - Molibdênio: é adicionado na forma de molibidato de sódio. Cofator da redutase do nitrato.
- Cobre: É usado como sulfato de cobre. É um cátion que em dose acima do normal é fitotóxico às culturas. Constituinte da enzima plastocianina que é importante componente do transporte de elétrons.
- Cloro: É essencial para a fotossíntese, sendo requerido durante a reação de Hill.
- Zinco: Sulfato de zinco. Importante nas reações de oxi-redução das plantas. Co-fator de enzimas anidrase carbônica.
- Manganês: Sulfato de manganês. Essencial no metabolismo para a reação de Hill na fotossíntese, quando a molécula de água é quebrada produzindo elétrons e oxigênio.
- Cobalto: é usado como cloreto de cobalto e está envolvido na expansão foliar.
- Carbono: é uma fonte importante de energia, é a forma do esqueleto de todos os compostos orgânicos. A suplementação geralmente é pela adição de açúcar na forma de sacarose, glicose, frutose e outras.
VITAMINAS:
- Tiamima: Tem efeito estimulador. Na forma de tiamina-pirofosfato é um co-fator essencial para reações críticas da respiração aeróbica, a fotossíntese e a biossíntese de alguns aminoácidos e terpenóides em plantas (Goodwin & Mercer, 1983).
- Piridoxina: Está envolvida na biossíntese de aminoácidos durante a fotorrespiração, na transaminação de aminoácidos aromáticos que formam auxina AIA endógena, e na biossíntese de alcalóides (Goodwin & Mercer, 1983).
- Ácido Nicotínico: Também contribui como substratos, à biossintese de alcalóides.
- Mio-Inositol: Tem efeito estimulador, aumentando o número de gemas. - Glicina: é dispensável.
Ágar: É um polissacarídeo extraído de algas marinhas, é dissolvido
em água fervente e gelificado na presença de cátions quando esfriado. Se for autoclavado num pH abaixo de 4,5 ocorre uma hidrólise do Agar que o impede de polimerizar-se ao esfriar. A consistência do meio depende da concentração de ágar utilizada, do pH, da concentração de sais (meios com menor concentração de sais ficam menos sólidos do que meios com concentrações mais altas de sais minerais) e da presença de certas substâncias como carvão ativado, que interferem na gelificação. Altas concentrações de ágar, ou meios muito consistentes, podem limitar a difusão de nutrientes até o explante (Romberger & Tabor, 1971).
9. Referências
AMIRATO, P.V.; YAMADA, Y., Ed. Handbook of plant cell culture: techniques for propagation and breeding. New York: Macmillan, 1983. GEORGE, E. F. Embryogenesis: Plant propagation by tissue culture. Exegetics, Edington 1996.
GOMES, G. A. C.; Aclimatização: cultura de tecidos. Paiva e Paiva, UFLA, Lavras, M.G. 2001.
GOODWIN, T.W. & MERCER, E.I. Intoduction to Plant Biochemistry. 2nd ed. Pergamon Press, New York. 1983.
SANTIAGO, E. J. A.; PAIVA, R.; PAIVA, P. D. O; SANTANA, J. R. F.; TORRES, A. C. Cultura de tecidos e transformação genética de plantas. Embrapa 1998.
