Karen Roberta Tancredo
Dinâmica de especificidade de parasitos Monogenea dactylogirídeos em seus hospedeiros e eficácia da formalina contra Dactylogyrus
minutus
Tese submetida ao Programa de Pós-Graduação em Aquicultura da Universidade Federal de Santa Catarina para a obtenção do Grau de Doutora em Aquicultura.
Orientador: Prof. Maurício Laterça Martins
Florianópolis 2019
AGRADECIMENTOS
Agradeço a todas as pessoas que contribuíram, direta ou indiretamente, para a realização deste trabalho tão importante para mim:
À minha família que sempre esteve por perto, obrigada pelo amor incondicional e espero que vocês fiquem felizes com o caminho que escolhi viver!
Ao meu orientador Maurício Laterça Martins, que há 10 anos me aceitou como estagiária da graduação e desde então, vem compartilhando conhecimento, projetos e tarefas, sem medir esforços para o meu crescimento. Te admiro muito como pessoa e profissional, tua generosidade não tem tamanho!
As minhas duas inspirações profissionais Gabriela Tomas Jerônimo e Natália Marchiori, que jamais me deixaram desanimar a cada desafio que surgia, sempre solícitas e prestativas a contribuir para o meu desenvolvimento, auxiliando com os artigos e me incentivando a chegar mais longe. É gratificante saber que as tenho como amigas para vida também!
A todos os colaboradores do laboratório AQUOS, foram muitos que passaram durante a minha jornada, em especial os amigos Lucas Cardoso, William Furtado, Gabriela Hashimoto e Ágata Paseto, tenho vocês no coração!
Por fim, creio que toda contemplação e realização vem do poder da oração e da fé que você deposita em si mesmo, e eu acreditei desde o início que eu era capaz de concluir mais esta etapa na minha vida, obrigada Deus!
RESUMO GERAL
Este estudo objetivou investigar a dinâmica de especificidade de Monogenea, parasito de Cyprinus carpio, em diferentes hospedeiros e condições experimentais. Primeiramente, foi determinada a toxicidade da formalina nas concentrações de 100, 150 e 200 mg L-1 para C. carpio e a atividade antiparasitária in vitro de formalina contra Dactylogyrus minutus. Ao final deste ensaio, recomenda-se um banho curto (1 h) em carpas koi com concentração mínima de 75 mg L-1 de formalina, não excedendo 100 mg L-1 para tratamento contra D. minutus. Posteriormente, foi determinada a concentração letal mediana (CL50 24 h) de formalina em Xiphophorus maculatus (platy), Xiphophorus heleri (espada), Oreochromis niloticus (tilápia), Danio rerio (zebrafish) e Carassius auratus (goldfish). Neste ensaio, a tilápia foi a espécie com o maior CL50 24 h (191,34 mg L-1), no entanto o zebrafish foi a espécie mais resistente. Recomenda -se usar 100 mg L-1 de formalina para banhos profiláticos durante 1 h para espada, zerafish, tilápias e goldfish. Para o ensaio de infestação experimental, amostras de três diferentes espécies de peixes ( C. carpio, Danio rerio e Oreochromis niloticus) foram submetidos a 2 diferentes ensaios. No ensaio 1, uma situação de condição mista de hospedeiros foi simulada com o número das três espécies de peixes igual (n=10 por espécie) e em contato com 10 carpas koi parasitadas com D. minutus. No ensaio 2, o delineamento foi o mesmo do ensaio 1, porém o número de carpas foi restringido para 1, colocada separada em um tanque-rede dentro da caixa contendo os outros peixes. Após quarenta dias no ensaio 1, somente a carpa apresentou infestação por D. minutus nas brânquias (prevalência (P) 53,84%, intensidade média (IM) 1,4±0,89 e abundância média (AM) 0,53±0,92). No ensaio 2, das duas carpas avaliadas, 1 estava parasitada com D. minutus nas brânquias. Em conclusão, D. minutus se comportou como uma espécie especialista, não infestando o zebrafish nem a tilápia. Por fim, foram identificadas três espécies de monogenea Dactylogyrus nas brânquias de C. auratus: Dactylogyrus anchoratus, Dactylogyrus baueri e Dactylogyrus formosus. A espécie mais prevalente foi D. baueri (P=70%, IM=2,14±1,21, AM=1,5±1,43), seguida de D. anchoratus (P=60%, IM=1,67±0,81, AM=1,00±1,05) e D. formosus (P=30%, IM=1,66±1,15, AM=0,5±1,64). Este estudo recomenda concentrações para o uso da formalina como profilaxia em seis espécies de peixes de alta relevância na aquicultura, bem como fornece importantes informações sobre espécies de Dactylogyrus spp.
de ocorrência em peixes Cyprinidae, e confirma a especificidade de D. minutus em C. carpio. Como a dispersão deste hospedeiro e consequentemente dos seus parasitos é ampla, devido a sua distribuição geográfica, o monitoramento da transmissão de Dactylogyrus spp. nos peixes da família Cyprinidae no Brasil é sugerido.
Palavras-chave: Aquicultura, infestação experimental; especificidade de hospedeiro; formalina; taxonomia.
ABSTRACT
This study aimed to investigate the specificity dynamics of Monogenea, parasite of Cyprinus carpio, in different hosts and experimental conditions. Firstly, formalin toxicity was determined at 100, 150 and 200 mg L-1 concentrations for C. carpio and the in vitro antiparasitic activity of formalin against Dactylotyrus minutus. It can be recommended a short bath (1 h) in koi carp with a minimum concentration of 75 mg L-1 of formalin, not exceeding 100 mg L-1 for treatment against D. minutus. Subsequently, the median lethal concentration of formalin LC50 in Xiphophorus maculatus (platy), Xiphophorus heleri (swordtail), Oreochromis niloticus (tilapia), Danio rerio (zebrafish) and Carassius auratus (goldfish) was determined. Tilapia had the highest LC50 24 h reaching (191.34 mg L-1) and the zebrafish was the most resistant. It is recommended to use 100 mg L-1 of formalin for prophylactic baths for 1 hour (swordtail, zebrafish, tilapia and goldfish). For the experimental infestation test, samples of three different fish species (C. carpio, Danio rerio and Oreochromis niloticus) were collected and submitted to 2 different tests. In the assay 1 a host mixed condition was simulated with three species of fish equal (n = 10 per species) and in contact with 10 koi carp parasitized with D. minutus. In assay 2, the experimental design was the same as in assay 1 but the number of carp was restricted to one placed in a separate tank-net inside the box containing the other fish. After 40 days, only the carp showed infestation by D. minutus in the gills (prevalence (P) 53.84%, mean intensity (MI) 1.4 ± 0.89 and average abundance (MA) 0.53 ± 0.92). In the assay 2 one out of two carps evaluated was parasitized with 1 D. minutus in the gills. During a simulated mixed and restricted experimental condition, D. minutus behaved as a specialist species, colonizing neither zebrafish nor tilapia. Finally, three species of Dactylogyrus monogenea were identified in the gills: Dactylogyrus anchoratus, Dactylogyrus baueri and Dactylogyrus formosus in C. auratus. The most prevalent species was D. baueri (P = 70%, IMI = 2.14 ± 1.21, AM = 1.5 ± 1.43), followed by D. anchoratus (P = 60%, IMI = 1.67 ± 0.81, AM = 1.00 ± 1.05) and D. formosus (P = 30%, IMI = 1.66 ± 1.15, AM = 0.5 ± 1.64). This study recommends concentrations for the use of formalin as prophylaxis in six fish species of high relevance in aquaculture, as well as providing important information on species of Dactylogyrus spp. of occurrence in Cyprinidae fish, and confirms the specificity of D. minutus in C. carpio. As the dispersion of this host and consequently of its parasites is broad, due to
its geographic distribution, the monitoring of the transmission of Dactylogyrus spp. in Cyprinidae family in Brazil is suggested.
Keywords: Aquaculture, experimental infestation; host specificity; formalin; ecological fitting; taxonomy.
LISTA DE FIGURAS Indrodução Geral
Figura 1 - Regionalização da aquicultura brasileira... 17 Figura 2 - Distribuição da produção de carpas produzidas em 2015 nas regiões administrativas da EPAGRI no estado de Santa Catarina... 18 Figura 3 - Fotomicrografia em microscópio eletrônico de varredura de brânquia de Cyprinus carpio parasitado por Dactylogyrus minutus Kulwièc, 1927 (Dactylogyridae). Em destaque no círculo branco, opisthaptor fixo ao tegumento... 21 Capítulo I
Figure 1. Light photomicrograph of Dactylogyrus minutus Kulwièc, 1927, of Cyprinus carpio var. koi collected in Biguaçu, Santa Catarina, Brazil. A-haptor; B - male copulatory complex; C
- adult parasite……… 35
Figure 2. Effective median concentration (EC50) of formalin for Dactylogyrus minutus (Monogenea: Dactylogyridae) infesting Cyprinus carpio var. koi (Bars represent 95% of the confidence
limit)………... 37
Figure 3. Cumulative mortality of Cyprinus carpio var. koi relative to the time during formalin immersion baths at different
concentrations………. 38
Capítulo II
Figure 1. Experimental design………... 57 Figure 2. Graphic of fish mortality in percentage in relation to the time during the baths with formalin in the different concentrations... 60 Capítulo III
Figura 1. A) Delineamento experimental do ensaio 1. B) Delineamento experimental do ensaio 2... 74 Figura 2: Dactylogyrus minutus Kulwièc, 1927 parasito de Cyrpinus carpio, Santa Catarina. A. Complexo copulatório masculino (cirrus e peça acessória). B. haptor (barra e âncoras). C. Ovo... 76 Capítulo IV
Figura. 1: Fotomicrografias de Dactylogyrus spp. de Carassius auratus cultivados no sul do Brasil. A - Dactylogyrus
anchoratus (Dujardin, 1845) Wagener, 1857; B - Dactylogyrus baueri Gussev 1985; C – Dactylogyrus formosus Kulwièc, 1927 92
LISTA DE TABELAS Capítulo I
Table 1: Concentration of formalin in mg L-1 capable of killing 100% of Dactylogyrus minutus (Monogenea: Dactylogyridae) considering the time, in the in vitro test. Different letters indicate a significant difference among the times (p <0.05)………. 36 Table 2. Median lethal concentration (LC50) of formalin (mg L-1) for Cyprinus carpio var. koi during the immersion baths for 6 and
24 h………. 39
Capítulo II
Table 1. Fish species submitted to the formalin assay (LC50 24h) 54 Table 2. Water quality parameters during acclimation period before the formalin assay (CL50 24h)... 55 Table 3. Median lethal concentration (LC50 24h) of formalin (mg L-1)... 61 Capítulo III
Tabela 1. Espécies de peixe submetidos aos ensaios de infestação experimental com Dactylogyrus minutus (Monogenea: Dactylogyridae)... 72 Tabela 2. Parâmetros de qualidade de água dos peixes durante os ensaios com infestação experimental com Dactylogyrus minutus (Monogenea: Dactylogyridae)... 72 Tabela 3: Comparação morfométrica dos caracteres (em micrômetros, expresso em amplitude de variação e media entre parênteses) de Dactylogyrus minutus Kulwièc, 1927 do presente estudo e descrições prévias... 77 Capítulo IV
Tabela 1: Comparação morfométrica dos caracteres (em micrômetros, expresso amplitude de variação e média entre parênteses) de Dactylogyrus anchoratus (Dujardin, 1845) Wagener, 1857, Dactylogyrus baueri Gussev 1985 e Dactylogyrus formosus Kulwiec, 1927 do presente estudo e descrições prévias... 90
SUMÁRIO INTRODUÇÃO GERAL... 17 JUSTIFICATIVA... 26 OBJETIVOS... 27 OBJETIVO GERAL... 27 OBJETIVOS ESPECÍFICOS... 27
CAPÍTULO I: Toxicity of formalin for fingerlings of Cyprinus carpio var. koi and in vitro efficacy against Dactylogyrus minutus Kulwièc, 1927 (Monogenea: Dactylogyridae)…….……… 29
Abstract... 30
Introduction... 31
Material and Methods... 32
Results... 35
Discussion... 39
Acknowledgement... 41
References... 42
CAPÍTULO II: Ecotoxicological assays to determinate the median lethal concentration (LC50) of formalin for fish... 49
Abstract... 50
Introduction... 51
Material and Methodos... 53
Results... 58
Discussion... 62
Acknowledgement... 64
References... 64
CAPÍTULO III: Infestação experimental e descrição morfológica de Dactylogyrus minutus Kulwièc, 1927 (Monogenea: Dactylogyridae), parasito de Cyprinus carpio var. koi... 69 Resumo... 70 Introdução... 71 Material e Métodos... 71 Resultados... 74 Discussão... 77 Agradecimentos... 81 Referências... 81
CAPÍTULO IV: Três espécies de Dactylogyrus Diesing, 1850 (Monogenea: Dactylogyridae) coletados em Carassius auratus
cultivados no sul do Brasil... 85
Resumo... 86 Introdução... 87 Material e Métodos... 88 Resultados... 89 Discussão... 92 Agradecimentos... 95 Referências... 95 CONSIDERAÇÕES FINAIS... 99
INTRODUÇÃO
Contextualização da Aquicultura
A aquicultura é considerada uma atividade multidisciplinar no que se refere ao cultivo de diversos organismos aquáticos, como plantas aquáticas, moluscos, crustáceos e peixes (Figura 1), sendo que a intervenção ou manejo do processo de criação é imprescindível para o aumento da produção (OLIVEIRA, 2009).
Figura 1. Regionalização da aquicultura brasileira (Fonte: BARBALHO, 2015)
A produção de pescado mundial continua a crescer mais rápido do que os outros setores de produção de alimento. Em 2016, foi registrado uma produção total de 110,2 milhões de toneladas, dos quais 80 milhões de toneladas foram destinados ao consumo humano (FAO, 2018). Dentro deste percentual, os peixes são os organismos aquáticos mais cultivados, com destaque para a produção das espécies de água doce, com 51,4
milhões de toneladas. No ranking mundial, o Brasil produziu 507,10 mil toneladas em piscicultura continental (FAO, 2018). Tal importância brasileira na produção aquícola foi possível devido ao melhoramento na distribuição dos sistemas e o aumento da produção (FAO, 2018).
A produção brasileira de peixes cresceu 4,5%, em relação ao ano de 2017 e atingiu um total de 722.560 toneladas (PEIXEBR, 2019). O estado de Santa Catarina é o 5º maior produtor de peixes do Brasil, e em 2018 foram produzidas 45.700 mil toneladas (PEIXEBR, 2019), com destaque para a tilápias (Oreochromis niloticus) detentora de 33.800 mil toneladas. As carpas, em Santa Catarina, compõem o 2ª grupo de peixes mais produzido, e representam um valor de 22,57% do total que é produzido, sendo cultivadas principalmente nas regiões do Alto Vale e Oeste Catarinense (Figura 2) (SILVA et al., 2017).
Figura 2. Distribuição da produção de carpas produzidas em 2015 nas regiões administrativas da EPAGRI no estado de Santa Catarina (Fonte: SILVA et al., 2017)
Além disso, o estado conta com inúmeros pesque-pagues, sendo 115 registrados pela Empresa de Pesquisa Agropecuária e Extensão Rural de Santa Catarina - EPAGRI (SILVA et al., 2017), que associam a produção à empreendimentos turísticos, e oferecem uma estrutura de lazer aliada à eficiente forma de comercialização (INSTITUTO CEPA, 1996). Contudo, a maior parte dos cultivos continua sendo desenvolvida por pequenos produtores rurais que, na sua maioria, têm na piscicultura uma atividade complementar de renda (SOUZA-FILHO et al., 2002). As
condições climáticas do estado limitam a produção de diversas espécies de peixes, como a tilápia, onde sua produção fica limitada ou mesmo inviabilizada em baixas temperaturas.
Aspectos Sanitários da Piscicultura
Como fatores predisponentes para ocasionar um diagnóstico positivo para as doenças, diversas condições de estresse as quais podem ser submetidas as populações de peixes, como o excesso de matéria orgânica na água, oxigênio dissolvido abaixo das concentrações adequadas e alta densidade animal, tem sido a grande preocupação nas pisciculturas (FIGUEIREDO; LEAL, 2008). Esta situação pode culminar em significativos prejuízos econômicos (MORAES; MARTINS, 2004).
De acordo com Portz et al. (2013), os principais parasitos de peixes de cultivo com potencial para causar doenças são os protozoários Piscinoodinium pillulare, Ichthyophthirius multifiliis, Trichodina spp. e platelmintos Monogenea Dactylogyrus spp. e Gyrodactylus spp. Os parasitos Monogenea são agentes causadores de enfermidades, com diversos registros de grandes mortalidades em escala mundial (TURGUT, 2012). A exemplo, Gyrodactylus salaris Malmberg, 1957, que é um patógeno de notificação obrigatório segundo a OIE (Office International des Epizooties), teve impacto catastrófico sobre as populações de salmonídeos na Noruega afetando ainda outros países como: Dinamarca, Escócia e Finlândia (BAKKE, 2007). Em Israel, alevinos de carpa comum (Cyprinus carpio Linnaeus, 1758) com 25-35 dias pós eclosão foram devastados por uma severa infestação de Dactylogyrus vastator Nyebelin, 1924, durante a primavera e início do verão (PAPERNA, 1963). No Golfo do Aqaba, Allobivagina sp. (Microcotylea) causou alta mortalidade no cultivo e em peixes selvagens de dusky spinefoot (Siganus luridus Rüppell, 1829). Altas infestações causadas por Zeuxapta seriolae (Heteraxinidae) também foram associadas as mortalidades de amberjack (Seriola dumerili Risso, 1810) nas gaiolas de cultivo no Balearic Islands (GRAU et al., 2003).
Os surtos destes parasitos são facilitados pelo grande adensamento e manejo sanitário deficiente nas pisciculturas (PORTZ et al., 2013), além de possuírem alta capacidade de dispersão, impacto epizoótico e dificuldade de controle em cativeiro (PEREIRA JR. et al., 2006). Na maioria dos casos, podem causar um duplo tipo de lesão em seus hospedeiros: nos tecidos no local de adesão deixando hemorragias; e ao mesmo tempo, alimentam-se do tecido rompido e do sangue proveniente
da injúria (BYCHOWSKY, 1957). O que favorece infecções secundárias causadas por bactérias (CRESPO; CRESPO, 2003).
As análises parasitológicas de longo prazo são importantes para avaliar a relação entre o parasitismo e os fatores ambientais, fornecendo conhecimento para adotar medidas sanitárias adequadas a cada situação. Em um estudo com peixes cultivados no Sudeste do Brasil durante um período de cinco anos, Martins et al. (2000) observaram Monogenea como a principal classe de parasitos responsável por alterações de comportamento e mortalidade. Dias et al. (2015) realizaram monitoramentos parasitológicos em cultivos de tambatinga (Colossoma macropomum x Piaractus brachypomus) na região Norte, e relataram os altos níveis de prevalência de monogenea nas dez pisciculturas investigadas. As ações preventivas para evitar surtos de enfermidades parasitárias incluem a manutenção da qualidade da água, nutrição adequada, desinfecção de pessoas e unidades de cultivo, esterilização dos instrumentos e manuseio adequado dos animais, para evitar o estresse (PAVANELLI et al., 2008).
Classe Monogenea
A classe Monogenea compreende um diverso grupo de ectoparasitos. Apresentam ciclo de vida monoxeno, parasitando brânquias, pele e cavidade oral, embora poucas espécies ocorram na cavidade nasal, intestino e bexiga urinária (GRATZEK, 1988). Eles danificam o epitélio do hospedeiro devido à adesão pelo opisthaptor (órgão de fixação) e assim, se alimentam ativamente (HARMS, 1996) (Figura 3). Em anfíbios e répteis aquáticos eles podem ser encontrados na boca, cloaca ou bexiga urinária (BOEGER; VIANNA, 2006), no entanto a maioria está descrita nos peixes (TAKEMOTO et al., 2013).
Figura 3. Fotomicrografia em microscópio eletrônico de varredura de brânquia de Cyprinus carpio parasitado por Dactylogyrus minutus Kulwièc, 1927 (Dactylogyridae). Em destaque no círculo branco, opisthaptor fixo ao tegumento. Fonte: Karen R. Tancredo.
Vários tipos de órgãos sensoriais são encontrados no tegumento e nos seus órgãos de fixação. Entre as estruturas sensitivas estão receptores individuais e compostos, sensilas e pequenas papilas, que provavelmente exercem papel fundamental para o sucesso do seu encontro com o hospedeiro (BUCHMANN; LINDENSTROM, 2002; TAKEMOTO et al., 2013).
Com uma riqueza de espécies e ubiquidade, são um dos parasitos mais estudados em hospedeiros peixes. A família Dactylogyridae, que são ovíparos e quase sempre encontrados nas brânquias, e Gyrodactylidae, que podem ser ovíparos ou vivíparos, e parasitam geralmente a superfície corpórea, são as duas principais famílias de Monogenea descritas nos peixes (TAKEMOTO et al., 2013). Enquanto espécies vivíparas utilizam mecanismos de transmissão mais restritos como, o contato direto entre os hospedeiros, as espécies ovíparas produzem constantemente ovos os quais são liberados ao meio ambiente (EIRAS, 1994). Estes ovos possuem um opérculo por onde se dá a eclosão, são geralmente volumosos e, em muitas espécies, apresentam excrescências filiformes (em uma ou ambas as extremidades) que podem desempenhar algumas funções como fixação ao hospedeiro, adesão ao sedimento e/ou retardamento da velocidade de sedimentação quando em suspensão (EIRAS, 1994).
Em algumas espécies ovíparas, a eclosão do ovo não exige nenhum estímulo, em outras, a eclosão só ocorre na presença de substâncias da secreção dos hospedeiros, o que assegura mais chances da larva sobreviver (BUCHMANN; BRESCIANI, 2006). A eclosão também pode ser estimulada pela turbulência da água, fotoperíodo e principalmente a temperatura, portanto estes são considerados interventores no sucesso do ciclo de vida destes parasitos (EIRAS, 1994; TAKEMOTO et al., 2013). No estudo conduzido por Marchiori et al. (2015), para verificar a influência da temperatura e da salinidade em ovos de Aphanoblastella mastigatus (Suriano, 1986), os autores constataram que a taxa de eclosão dos ovos de A. mastigatus foi significativamente maior a 28 °C do que em 24 ºC, além disso durante um período de 24 h, dois picos na oviposição ocorreram nos momentos de maior variação da luminosidade (06 h 15 e 18 h 15). A oviposição de Dactylogyrus vastator foi máxima a 30 ºC e sete dias após a infecção nos hospedeiros carpa, os parasitos alcançaram a maturidade sexual mantidos a 20º C (ZHANG et al., 2015).
A patogenicidade da monogenea está ligada principalmente ao seu órgão de fixação, fisiologia e estratégia de alimentação. Algumas espécies alimentam-se diretamente do sangue dos seus hospedeiros, gerando um diagnóstico de anemia, baixos níveis de eritrócito, hematócrito e hemoglobina. Letargia, anorexia, palidez das brânquias, dos músculos, rins e fígado também podem ocorrer nos casos de infestações severas (BUCHMANN; BRESCIANI, 2006).
O controle destes parasitos dentro dos cultivos tem sido feito por meio de intervenção química, com o uso do sulfato de cobre, formaldeído, cloreto de sódio, peróxido de hidrogênio (BUCHMANN; BRESCIANI, 2006). O formaldeído 37% (CH2O) é um produto químico comercial (NASC, 2002) que tem registro para uso legal desde 1986, nos Estados Unidos e no Canadá (JENKINS, 2014). Segundo o Francis-Floyd (1996), a concentração para um banho prolongado é de 15 a 25 mg/L e para um banho de curta duração 250 mg/L. Sudova et al. (2007) sugerem banhos curtos com 60 – 250 mg/L durante 20- 60 minutos. A tolerância dos peixes à produtos químicos pode variar dependendo de uma série de fatores, entre eles da espécie, idade e das condições do cultivo (Martins, 2004; Dolezelova et al., 2009). No entanto, com várias espécies comerciais na aquicultura, estudos de concentração adequada de produtos químicos para banhos terapêuticos e profiláticos são necessários para evitar o risco do uso indiscriminado desses produtos, o que pode gerar impactos ambientais, intoxicação de espécies silvestres, estresse e mortalidade no cultivo (ANDRADE et al., 2005; SANCHES et al., 2007; PAIXÃO et al., 2013).
Relação Monogenea x Hospedeiro Especificidade
Para Buchmann (1998), há uma relação muito íntima do parasito com o muco do hospedeiro, seja pela presença de algum nutriente, estimulante químico ou outros componentes específicos que sustentem a capacidade reprodutiva da monogenea, uma vez que a partir da eclosão, o tempo que o oncomiracídio (larva) precisa encontrar seu hospedeiro-tipo é curto.
Uma das principais características da classe Monogenea é a alta especificidade parasitária, uma vez que muitas das espécies conhecidas são citadas ocorrendo em uma única espécie hospedeira. Llewellyn (1956), por exemplo, ao estudar 18 espécies de Monogenea parasitos de 17 espécies de peixes, concluiu que todas, com exceção de duas espécies, eram estritamente específicas aos seus hospedeiros. No entanto, estudos mais recentes apontadom, que esta especificidade está relacionada com o fato de que os parasitos vivem pelo menos uma parte de suas vidas utilizando recursos oferecidos pelos hospedeiros, além de apresentarem um habitat previsível que os protege das adversidades ambientais externas (MACHADO et al., 2013).
Para Buchmann e Lindenstrøm (2002), a especificidade envolve algumas etapas. Primeiro, o parasito precisa reconhecer moléculas produzidas pelo hospedeiro a curtas distâncias, e quando em contato serem compatíveis. As células epiteliais da superfície de fixação devem ser reconhecidas e utilizadas pelo parasito para sua “alimentação”, além de evitar os mecanismos do sistema imune. Após a fixação do Monogenea, este deve ser capaz de se reproduzir em seu hospedeiro, pela percepção adequada de sinais para iniciar a resposta fisiológica. A natureza dos habitats dos parasitos, bem como as interações entre seus hospedeiros, são de interesse por causa da diversidade de associações entre parasito-hospedeiro (WHITTINGTON et al., 2000).
O conceito de especificidade de hospedeiro pode ser reconhecido como uma relação duradoura estabelecida entre a reprodução de monogenea no seu hospedeiro-tipo (BUCHMANN; LINDENSTROM, 2002). Para outros autores, um parasito é considerado específico quando está associado a uma única espécie de hospedeiro ou a um grupo de espécies hospedeiras que estão filogeneticamente próximas (EL ESBÉRARD et al., 2005). Pode ser uma ferramenta extremamente útil para a compreensão de como ocorrem as interações entre os dois organismos, para o conhecimento dos fatores que podem alterar esta interação como: tipo de parasito, idade, sexo do hospedeiro e muco que
afetam a virulência e a distribuição do parasito (ROHDE, 1994; LAFFERTY et al., 2006; ORLOFSKE et al. 2012). No entanto, as vantagens de uma especificidade, podem não ser somente positiva, especialmente se a população de hospedeiros é instável (COMBS, 1997). Outro fator relevante é se a hibridização entre espécies de peixe pode afetar a especificidade, como Šimková et al. (2013) relataram em um
estudo com Cyprinus carpio Linnaeus, 1758, Carassius gibelio Bloch, 1782 e híbrido a relação parasito-hospedeiro identificando 15 espécies de Monogenea, classificadas em: estritamente especialista (parasitam somente um hospedeiro), generalista intermediário (parasitam espécies hospedeiras não con-genéricas, especialista intermediário (parasitam espécies hospedeiras con-genéricas e generalistas (parasitam espécies hospedeiras filogeneticamente distantes). A abundância total foi menor no híbrido, o que representa menor suscetibilidade quando comparado com os outros hospedeiros.
Em surubim híbrido Pseudoplatystoma reticulatum x P. corruscans foi observado pela primeira vez parasitos Monogenea: Dactylogyridae, previamente descritos em bagres pertencentes ao gênero Pseudoplatystoma. No entanto outras espécies de Monogenea Vancleaveus ciccinus e V. janacauensis descritas em pirarara (Phractocephalus hemioliopterus Bloch & Schneider, 1801) e jaú (Zungaro zungaro Humboldt, 1821), respectivamente, foram encontrados no surubim híbrido, e a ocorrência pode estar relacionada ao processo de hibridação interespecífica, que os torna alvo de preocupação ecológica por possuírem a habilidade de abrigar parasitos não usuais aos progenitores do gênero Pseudoplatystoma (JERÔNIMO et al., 2016).
O que promove a especificidade nem sempre é proveniente de uma co-especialização entre parasito e hospedeiro ao longo do tempo, mas pode ser resultado de um processo de adaptação alternando seus hospedeiros (BOEGER; KRITSKY, 1997). Explorar o hospedeiro, no entanto, pode significar em diminuição da sua sobrevivência, sua fecundidade e sua mobilidade (COMBS, 1997).
Ecological fitting
O conceito da relação parasito-hospedeiro está sustentado pelo que os autores chamam de ecological fitting, conceituado por Janzen (1985) como o processo pelo qual os organismos passam a colonizar e persistir em novos ambientes, usar novos recursos e formar associações com outras espécies, o que representa um mecanismo adicional para a co-especialização, co-evolução ou co-adaptação (AGOSTA, 2006). Em outro estudo, Agosta e Klemens (2008) abordam que o ecological fitting
é o mecanismo fundamental para o sucesso da associação das espécies introduzidas e/ou invasoras. O incremento na capacidade de troca de hospedeiro (host-switching) não está baseado na evolução do parasito, mas sim no poder de criar afinidade e aproveitamento do ambiente, uma vez que alguns parasitos sobreviveram a extinção de hospedeiros-tipo (BROOKS et al., 2006).
Durante um estudo de infecção experimental, King e Cable (2007) monitoraram o estabelecimento e reprodução de Gyrodactylus turnbulli Harris, 1986 em diversas espécies de peixes ornamentais poecilídeos, assim como de hospedeiros filogeneticamente mais distantes. Os autores concluíram que G. turnbulli pode infectar uma grande variedade de hospedeiros, incluindo hospedeiros de outras famílias. Ainda segundo o mesmo autor, há evidências a partir de estudos moleculares prévios, indicando que a troca de hospedeiros é um mecanismo chave para especialização dentro dos Gyrodactylidae.
Já Larsen e Buchmann (2006), estudaram a relação parasito-hospedeiro in vitro com G. salaris em salmão-do-Atlântico (Salmo salar Linnaeus, 1758), truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss Walbaum, 1792) e carpa comum (C. carpio) e encontraram mais parasitos fixados em S. salar, seu hospedeiro-tipo, do que nas outras duas espécies de peixes com o passar do tempo. O mesmo aconteceu com G. derjavini Mikailov, 1975 definindo sua preferência por seu hospedeiro-tipo O. mykiss.
Diante das possíveis adversidades ambientais e da restrição de recursos, estes parasitos podem obter sucesso na conquista de um novo hospedeiro partindo de outros meios. Estudos tem apontado a co-especialização como uma alternativa e distribuição na relação parasito-hospedeiro, diferentemente da co-evolução na transição de ambientes e conquistas de novos hospedeiros, este estabelecimento passa por processos como: oportunidade, compatibilidade e resolução dos conflitos emergentes (ARAÚJO et al., 2015).
Na Noruega, enormes perdas da população de salmão em ambiente natural foram registradas causadas por infestação de G. salaris juntamente com o salmão do Atlântico em seu ambiente natural da Suécia (JOHNSEN; JENSEN, 1991). O resultado foram perdas econômicas de aproximadamente US$ 500 milhões (KING; CABLE, 2007). Da mesma forma, D. vastator introduzido na Europa com a carpa capim Ctenopharyngodon idellus Valenciennes, 1844 (Cyprinidae) da Ásia, causou perdas nos cultivos de carpa (C. carpio) (SCHAEPERKLAUS, 1990).
Alguns pesquisadores também observaram estratégias reprodutivas e de sobrevivência de parasitos para as futuras gerações em
situação de restrição de hospedeiros como, por exemplo, a troca de espermatóforos entre os parasitos ou a auto-fertilização de uma única espécie de Neobenedenia (Monogenea), produzindo mais de 300 ovos em duas semanas (OGAWA et al., 2014; DINH HOAI; HUTSON, 2014) e que muitas vezes causam prejuízos irreversíveis em cultivo (MOREIRA et al., 2013).
Portanto, diante do potencial de dispersão dos parasitos Monogenea em diferentes hospedeiros, incluindo os mecanismos de adaptação a novos recursos, pode-se considerar que este fato representa uma ameaça para os cultivos e para as espécies naturais. As alterações nas condições ambientais e a restrição do hospedeiro-tipo pode esclarecer se os parasitos monogenea encontrados na carpa koi (C. carpio) apresentam especificidade. Na carpa comum, espécies do gênero Dactylogyrus sp. tem sido reportadas ao redor do mundo (MOLNÁR, 1994; JALALI E BARZEGAR, 2005; MHAISEN et al., 2013; VILIZZI et al., 2015).
JUSTIFICATIVA
Os parasitos Monogenea são conhecidos por sua alta especificidade de hospedeiro, uma vez que muitas espécies podem ocorrer em um único peixe. No entanto, estudos mais recentes têm apontado evidências de que esta relação parece não ser tão específica quanto se pensava, mas pode depender do recurso que ele fornece. Alguns destes estudos sugerem que os parasitos são capazes de se adaptar em uma situação de restrição, detectando as substâncias presentes no hospedeiro que podem ser compatíveis para garantir o sucesso de infestação. A transmissão direta é facilitada pela proximidade dos hospedeiros da mesma espécie e os parasitos se desenvolvem rapidamente nas melhores condições ambientais. O tratamento para monogenea pode ser difícil de aplicar dependendo da quantidade de peixes pois, a forma mais comum é através de banhos de imersão com formalina. Neste sentido, a Aquicultura, com alguns modelos de sistema de cultivo e a prática de transferência de espécies entre habitats, pode propiciar um cenário favorável aos parasitos Monogenea se adaptarem a novos hospedeiros. Assim, a finalidade deste estudo foi compreender, por meio de dois diferentes experimentos de infestação por transmissão direta, se os parasitos Monogenea se tornariam restritos ao seu hospedeiro tipo ou se esses helmintos são capazes de estabelecer afinidades com outras espécies de peixes, mesmo que ambos não tenham evoluído conjuntamente e não sejam da mesma família.
OBJETIVOS
OBJETIVO GERAL
Investigar a dinâmica de especificidade de Monogenea (Dactylogyridae), parasito de Cyprinus carpio, submetida a diferentes hospedeiros em condições experimentais e os efeitos da formalina para banhos profiláticos e como antiparasitário.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Identificar as espécies de parasito Monogenea de Cyprinus carpio, Carassius auratus, Oreochromis niloticus, Danio rerio, Xiphophorus maculatus e Xiphophorus helleri;
- Determinar a concentração letal mediana (CL50, 24h) de formalina para todas as espécies Cyprinus carpio, Carassius auratus, Oreochromis niloticus, Danio rerio, Xiphophorus maculatus e Xiphophorus helleri, utilizadas neste estudo; - Determinar a concentração mínima inibitória (CMI) de formalina
para Monogenea (Dactylogyridae) de Cyprinus carpio;
- Investigar, sob diferentes condições experimentais, se espécies de Monogenea (Dactylogyridae) parasitos de Cyprinus carpio são capazes de infestar outras espécies de peixes da mesma família e de diferentes famílias do seu hospedeiro-tipo;
Capítulo I
Toxicity of formalin for fingerlings of Cyprinus carpio var. koi and in vitro efficacy against Dactylogyrus minutus Kulwièc, 1927 (Monogenea: Dactylogyridae)
Artigo publicado no periódico Journal of Parasitic Diseases (ISSN: 0971-7196 (Print) 0975-0703 (Online))
Publicado on-line em 14 de dezembro de 2018. DOI: https://doi.org/10.1007/s12639-018-1056-1
Abstract
The toxicity of formalin on Cyprinus carpio var. koi and its anti-parasite effects against Dactylogyrus minutus (Monogenea) in in vitro tests is analyzed. Specimens of D. minutus were submitted to eight concentrations of formalin: 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250 mg L-1, in triplicate. Concentrations of formalin 100, 150 and 200 mg L-1 were then tested to determine the median lethal concentration of 50% of the fish per immersion bath. Fish behavior was also observed during the first six hours of exposure. The 200 mg L-1 concentration was the most rapid efficacy for D. minutus, killing all parasites in 16 min. All parasites were killed in 47 min at concentration 100 mg L-1. Concentration 200 mg L-1 was the most lethal for fish in less than 24 h exposure, with 24 h LC50 at 135.44 (119.78 - 153.14) mg L-1. The therapeutic index was 2.05 to 30 min and 1.15 to 16 min. A short bath (1 h) is recommended in koi carp with a minimum concentration of 75 mg L-1 of formalin, not exceeding 100 mg L-1 for treatment against D. minutus.
Key-words: Cyprinus carpio, treatment, formalin, therapeutic index, Monogenea, Dactylogyrus sp
Introduction
The koi carp Cyprinus carpio (Linnaeus, 1758) is an ornamental fish with high market demand due to its ease in breeding and to its great variation in color patterns (Hussain et al. 2014, 2015). It is a fast-growing species (Hashem et al. 1997) and very tolerant to variations in water quality parameters and stocking density (Carneiro et al. 2015). However, its cultivation has been affected by ectoparasite Monogenea Dactylogyrus Diesing 1850, featuring 900 species (Gibson et al. 1996; Santos et al. 2016).
Carps are usually infected by more than one species of Dactylogyrus, some of them highly pathogenic, especially for fingerlings (Kritsky and Heckmann 2002; Jalali and Barzegar 2005), causing massive mortality rates and high liabilities to producers (Buchmann et al. 1993; Bretzinger et al. 1999; Kritsky and Heckmann 2002). Several studies investigated the biology and mechanisms of infestation of these parasites (Ergens and Dulmaae 1969; Dzika et al. 2009; Mhaisen et al. 2013), pinpointing the species D. achmerowi Gussev 1955, D. anchoratus Dujardin, 1845, D. arcuatus Yamguti, 1942, D. difformis Wegener, 1857, D. extensus Mueller & Van Cleave, 1932, D. formosus Kulwiec, 1927, D. intermedius Wegener, 1910, D. vastator Nybelin, 1924 and D. minutus Kulwiec, 1927 as the most prevalent (Gibson et al. 1996; Jarkovský et al. 2004; Kohn et al. 2006; Stojanovski et al. 2008; Molnár 2012).
Outbreaks of Monogenea parasites occur due to their life cycle in a specific host, temperature and culture densities (Turgut and Akin 2003). Monogenea are included among parasites with higher dispersion, epizootic impact and control difficulties in tanks (Pereira Jr. et al. 2006). Koi carp fingerlings were devastated in Israel by a severe infestation of Dactylogyrus vastator Nybelin, 1924, during the spring and early summer (Paperna 1963).
For the control of Monogenea outbreaks, several chemical agents, such as praziquantel, toltrazuril, chloramine, hydrogen peroxide, malachite green, formalin and others, have been used to verify their efficacy in in vivo treatments,. However, few studies were undertaken to investigate in vitro effects, or rather, the products´ performance when added directly to adult parasites or at some stage of their life cycle
(Schmahl and Mehlhorn 1985; Buchmann et al. 1993; Buchmann and Kristensson 2003; Stephens et al. 2003; Sharp et al. 2004; Katharios et al. 2006; Sitjà-Bobadilla et al. 2006).
Formalin (aqueous formaldehyde gas 37%), which replaced malachite green in the treatment of parasitic diseases, has been
highlighted for its effectiveness (Martins 2004; Buchmann and Kristensson 2003). It also provides other advantages, such as easy metabolization by aquatic organisms and low potential for bioaccumulation (Picón-Camacho et al. 2012). Formalin´s main drawback is its high toxicity to fish. However, recovery time is relatively short when properly applied, even in small fish (Schmahl 1991). The use of formalin has recently been banned in the European Union because the handling of the product causes risks to humans (UEMS 2016).
Formalin is used as a fungicide for fish eggs and as a treatment against ectoparasite infestations. It has been legally registered since 1986 in the United States and Canada (Rach et al. 1997; FDA 2014). Formalin is particularly applied against protozoa (Ichthyobodo sp., Trichodina sp. and Chilodonella sp.) and Monogenea (Dactylogyridae and Gyrodactylidae) parasites of the body surface and of fish gills (Scott 1993).
The use of formalin is indicated in some protocols in the form of short baths (up to 1 h) at concentrations ranging between 150 and 250 mL m-3 or in long-term baths (24 h) at concentrations ranging between 10 and
15 mL m-3 (Thoney and Hargis 1991; Martins 2004). However, there is
scant information on the direct effect of this product on the parasite and on the concentrations that are really effective and safe for fish. Fish resistance to chemicals may vary and depends on a number of factors, including species, age and culture conditions (Dolezelova et al. 2009).
Thus, treatment with formalin has been investigated for use in commercial fish farms, analyzing its efficacy, toxicity and which doses are safe for the fish species. In other words, better prophylaxis and treatment protocols and procedures are investigated (Burka et al. 1997). Current study evaluates the Median lethal LC50 concentration of formalin in Cyprinus carpio var. koi and its in vitro anti-parasitic activity against Dactylogyrus minutus Kulwièc, 1927.
Material and Methods Specimen collection
One hundred and fifty koi carp fingerlings (weight 1.73 ± 0.25 g; total length 4.7 ± 0.46 cm mean ± standard deviation) were obtained in September 2016 from a fish farm located in Biguaçu, state of Santa Catarina, Brazil (27º27'20"S; 48º41'32"W), and were transported alive to the Aquatic Organisms Health Laboratory of the Federal University of Santa Catarina (UFSC). The fish were distributed in 70L-aquariums and
acclimatized under experimental conditions (dissolved oxygen 6.95 ± 0.63 mg L-1; water temperature 27.82 ± 0.14°C; conductivity 213 ± 46.66 μS cm-1, total suspended solids 106 ± 23.33 ppm and total ammonia 0.60 ± 0.63 mg L-1). All parameters, except total ammonia, were measured with a multiparameter Hanna® HI9829 (Hanna Instruments Brazil, Barueri, Brazil). Total ammonia was measured with a colorimetric kit (Alfakit, Florianópolis, Brazil).
After the acclimation period, thirty fish were anesthetized with eugenol (75 mg L-1) and euthanized by cerebral disruption to investigate Monogenea infestation in the gills, with a stereomicroscope (ZEISS Stemi DV4). All procedures were performed following protocols by the Ethics Committee of the Federal University of Santa Catarina
(CEUA/UFSC/PP00928).
Morphological identification of Dactylogyrus minutus
Prior to the in vitro assays, dactylogyrids were collected from the gills of 30 fish; they were fixed in 70% alcohol, washed in distilled water in a Petri dish and mounted in Hoyer’s medium, following procedures by Kritsky et al. (1995) for the study of sclerotized structures. Some dactylogyrids were stained with Gomori trichrome stain (Humason, 1979) to study their internal morphology. Criteria followed the morphological characteristics by Ogawa and Egusa (1977) and Lambert (1977). Ecological terms "prevalence" (P%), "mean intensity of infection" (IMI) and "average abundance" (AM) followed Bush et al. (1997).
In vitro formalin test against Dactylogyrus minutus
Eight formalin concentrations were tested to detect the most efficient minimal concentration causing 100% parasite mortality according to time intervals. Stock solutions of formalin diluted in distilled water were previously prepared and tested separately in triplicate: 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250 mg L-1 (37% Formaldehyde, SIGMA-ALDRICH®). In addition, two controls were prepared, or rather, the system water in which the fish were (C1) and the other was made up of distilled water (C2).
Filaments from the parasitized gill arches and containing specimens of D. minutus (5-6 parasites per well) were collected and separated into a flat bottom plate from six-well cell culture (KASVI®). In the standardized volume of 3 mL per well, each parasitized filament received a formalin concentration (adapted from Hashimoto et al. 2016).
Whereas initial time (0 min) was the moment of immersion of the gill filaments in each concentration tested, finish time occurred when total mortality occurred. Mortality was observed every 5 min at the highest concentrations and every 10 min at the lowest concentrations, by stereomicroscope (ZEISS Stemi DV4, Oberkochen, Germany). Parasites were considered dead when the absence of movements was detected when stimulated with a fine histological needle, and by the observation of typical characteristics of Monogenea mortality, such as body wrinkling (Reimschuessel et al. 2011). After analyzed the results, the parasites were mounted in Hoyer’s medium for confirmation of the species D. minutus. Number of dead Monogenea parasites was also employed to determine the median effective concentration (EC50). EC refers to the drug concentration which produces 50% of its maximum response (Rose and Golan 2015).
Toxicity of formalin for koi carp
Seventy-two specimens were randomly distributed in polyethylene tanks with a fixed volume of 25 L, totaling eight fish per tank to evaluate the effect of formalin on koi carp. Each tank contained a thermostat at an average temperature of 26°C and air-to-air compressor adjusted to the maximum of its capacity. Formalin baths were subsequently submitted to three different concentrations of 100, 150 and 200 mg L-1 (37% Formaldehyde, SIGMA-ALDRICH®) in triplicate. Formaldehyde was added to each tank at the specific amount to obtain formalin concentrations described above and mixed with a glass stick for 60 sec. Feeding of the fish was suspended 24 h before the start of the tests and during the experimental period. Dead fish were removed and quantified up to 24 h or when mortality reached 50%. Median lethal LC50 concentration was calculated for 6 and 24 h. Survival fish at the end of the 24h period remained under observation within the same system until a total of 168 h. The therapeutic index (TI) was calculated using the ratio fish LC50 / EC50 of the parasite: TI=LC50
EC50 (Foster 1939). So that a drug
may be considered good for therapeutic purposes, it should have TI equal to or higher than 2 (Yacubian 2007). The observation of fish behavior in the first 6 h was also recorded. The fish were observed by swimming rhythm and agitation on the surface or near the aeration site.
Statistical analysis
Data from the in vitro test of the concentrations with respect to time were submitted to Shapiro-Wilk and Bartlett to verify the normality and homoscedasticity, respectively. Data that not presented variance homogeneity were transformed in Log. After the premise was ensured, the data were submitted to a variance analysis unifactorial ANOVA and the means were separated by a Tukey test. All of the tests were realized at a significance value of 5% with the of Statistica 10.0 software. Parasite EC50 and koi carp LC50 were determined by the Trimmed Spearman Karber method for recording mean mortality rates (Hamilton et al. 1977). Results
Morphological identification of Dactylogyrus minutus
Dactylogyrus minutus (Figure 1) presented the same characteristics of the species described by Ogawa and Egusa (1977) with a prevalence of 80%; mean infection intensity of 4.26±2.55; average abundance 5.33±1.52.
Figure 1. Light photomicrograph of Dactylogyrus minutus Kulwièc, 1927, of Cyprinus carpio var. koi collected in Biguaçu, Santa Catarina, Brazil. A-haptor; B - male copulatory complex; C - adult parasite.
In vitro formalin test against Dactylogyrus minutus
Among all concentrations, the 200 mg L-1 concentration was the most rapid efficacy, killing all parasites in 16 min. However, there was no statistical difference for 250, 175, 125 and 75 mg L-1 when compared to the most lethal concentration (Table 1). At concentration 100 mg L-1, parasites died in 47 min, below what is usually recommended in prophylactic baths (1 h for short-term baths). The two controls took more than five hours to kill the parasites. The lowest concentration tested (50 mg L-1) required 104 min to kill all D. minutus specimens. Formalin EC50 for D. minutus at 16 min was 114.04 (95.68-135.92) mg L-1 and decreased to 66.02 (52.81-82.52) mg L-1 at 30 min (Figure 2).
Table 1: Concentration of formalin in mg L-1 capable of killing 100% of Dactylogyrus minutus (Monogenea: Dactylogyridae) considering the time, in the in vitro test. Different letters indicate a significant difference among the times (p <0.05).
Formalin (mg L-1) Time (minutes)
C1 318±12.19e C2 269±15.10d 50 104±6.18c 75 37±9.29ab 100 47±3.46b 125 38±2.00ab 150 20±1.00a 175 29±4.50ab 200 16±3.60a 250 20±450ab
Figure 2. Effective median concentration (EC50) of formalin for Dactylogyrus minutus (Monogenea: Dactylogyridae) infesting Cyprinus carpio var. koi (Bars represent 95% of the confidence limit). Toxicity of formalin for koi carp
The concentration of 200 mg L-1 was the most lethal for all fish in less than 24 h. Koi carp showed no mortality during exposure to 100 mg L-1 formalin concentration (Figure 3). However, almost all fish (70%) were dead at 150 mg L-1, in 24 h. LC50 for 6 h was 191.34 (174.75 - 209.51) mg L-1 and LC50 24 h was 135.44 (119.78 - 153.14) mg L-1 (Table 2).
Figure 3. Cumulative mortality of Cyprinus carpio var. koi relative to the time during formalin immersion baths at different concentrations.
Taking into account the value of LC50 24 h of koi carp and EC50 for D. minutus, the result of the therapeutic index was between 1.15 for 16 min and 2.05 for 30 min.
Fish behavior during baths was gradually observed in the first 6 h, at all concentrations. During the first two hours, the behavior of the fish at the 200 mg L-1 concentration comprised agglomeration close to the aeration entrance in the boxes and agitated swimming with hyperventilation. Increase in mucus production was observed after more than 4 h of exposure, causing a change in the color of the water (slightly cloudy); decrease in opercular beating and slow swimming until the onset of the first deaths. In addition, the discoloration of fish, especially the most colored ones, was well evidenced. At 150 and 100 mg L-1, the first signs of agitation and agglomeration near the inflow in the boxes started between 4 and 6 h after the start of the baths. No mortality was recorded in these two concentrations until the initial 6 h of behavioral observation.
Table 2. Median lethal concentration (LC50) of formalin (mg L-1) for Cyprinus carpio var. koi during the immersion baths for 6 and 24 h.
6 h 24 h LC50 mg L-1 191.34 135.44
95% Upper limit 174.75 119.78 95% Lower limit 209.51 153.14 Discussion
The results elucidate the potential of formalin in in vitro treatment against D. minutus, parasite of C. carpio var. koi. Several previous studies available in the literature were developed to establish therapeutic concentrations of the chemical agent that were safe for the host. They were tested directly in the form of immersion baths (Martins 2004). However, when tested as above, concentrations could only be partially effective (efficacy ranging between 49 and 78%). Moreover, direct effective concentration on the parasite is unknown (Liang and Leong 1992; Sharp et al. 2004; Fajer-Ávila et al. 2007).
The most lethal concentration in current study in relation to time intervals was 200 mg L-1 for parasites and fish. Complete elimination of D. minutus occurred in 16 minutes. The above concentration may be satisfactory in the case of C. carpio larvae. In fact, results by Theron et al. (1991) showed that larvae of the common carp at 4, 12 and 20 days after hatching, proved to be very resistant in formalin baths at 200 mg L -1, for 30 min. Tamaru et al. (2001) suggest formalin treatment for swordtail (Xiphophorus helleri Heckel, 1848) at concentration 250 mg L -1, for 1 h. Further, 250 mg L-1 formalin in the gills of the rainbow trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum, 1792) presented aggressive effects on fish after 1 h bath, such as detachment of secondary lamella epithelium, hyperplasia and cell hypertrophy (Smith and Piper 1972). Therefore, regardless of the concentration, preliminary tests on a small batch of fish are important due to possible variations in product toxicity on a particular species, which may increase by water quality, size or age of the specimens.
In this study, the most lethal concentrations killed the parasites in less than 30 min, but these doses may damage the integrity of fish tissue during the prophylactic bath.Fajer-Ávila et al. (2003) observed that, in lethal dose trials with bullseye puffer (Sphoeroides annulatus Jenyns, 1842), fish showed hyperemia in the mouth and tail erosion at
concentrations above 142 mg L-1 after 20 min of bath. According to Reardon and Harrel (1990), formalin toxicity causes dysfunction in the osmoregulatory and respiratory balance, leading the fish to death. Further,
Chinabut et al. (1988) observed fish swimming on the surface with erratic movements and reported first mortalities, after 12-18 h of formalin treatment.
Rowland et al. (2006) reported that several fish submitted to 30 or 40 mg L-1 formalin presented partial re-infestation after 30 days of
treatment. In two months, the prevalence of Monogenea returned to 100%. Diggles et al. (1993) performed tests on the life cycle phase of Monogenea and reported a decrease in the viability of laying eggs, the survival of oncomiracidia and a 70% reduction in Polylabroides
multispinosus adults and juveniles from the yellowfin bream gills
(Acanthopagrus australis Günther, 1859), submitted to 300 mg L-1
formalin during 30 min. Nevertheless, the authors still recommend a larger dose (400 mg L-1) to ensure complete removal of adult parasites.
Although formalin is effective against Monogenea eggs, its greatest efficacy appears to be in newly placed eggs than in embryonated eggs about to hatch (Svendsen and Haug 1991).
Monogenea parasites of freshwater or saltwater fish may react at different concentrations of formalin. Pahor-Filho et al. (2012) observed that, in the case of mullet juveniles (Mugil liza Valenciennes, 1836), 400 mg L-1 formalin were lethal to Ligophorus spp. after a one-hour bath. In
the case of the silver perch (Bidyanus bidyanus Mitchell, 1838), a 30 mg L-1 concentration of formalin was the most effective against Lepidotrema bidyana (Rowland et al. 2006). Sharp et al. (2004) evaluated 250 and 400
mg L-1 of formalin against Benedenia seriolae and Zeuxapta seriolae
from the gills of the yellowtail amberjack (Seriola lalandi Valenciennes, 1833) and detected better results (90%) at the highest concentration, with a 1-h bath.
In the control test with fish tank water and distilled water, D.
minutus remained alive for more than 5 h outside the host. Similar results
obtained by Andrade-Porto et al. (2017) revealed approximately the same lifetime for Dawestrema cycloancistrium Price and Nowling, 1967, or rather, mortalities began after 4 h from the start of the tests. Several studies report that temperature is one of the factors that most influence Monogenea survival and reproduction success.
According to studies by the Food and Drug Administration (FDA) (1995), the maximum recommended formalin concentration for a prophylactic bath in fish of any species is 250 mg L-1 for 1 h exposure, at
current results indicate that 200 mg L-1 was lethal in less than 24 h for koi
carp fingerling, the recovery time of the fish after treatment, besides the damage caused in the gill epithelium, may be irreparable, even considering a 1 h bath. At concentration 200 mg L-1, the fish showed signs
of agglomeration, accelerated opercular beating, lethargy and increased mucus production in less than 6 h exposure. This explains why, after tests at the lower concentrations, some specimens survived and were able to recover when allocated to another system.
One may conclude that, in formalin treatments, fish susceptibility depends on concentration, time, species and age. Rates for the control of the same parasite group may vary between wide concentration ranges (Sharp et al. 2004).
FDA (1995) report shows that the formalin time interval in water is approximately 36 h. After that period, it falls drastically due to the effects of hydrolysis and oxidation. Time interval may reach 48 h under anaerobic conditions (Alberta Environment 2006). After the employment of formalin, the water of any concentration treatment should be diluted to 1 mg L-1 before being discharged into the environment or into another water body (FDA 1995).
The therapeutic index (TI) (Foster, 1939) is an approximate safe measure for a chemical to be used for treatment purposes, calculated by the LC50 ratio of the fish and EC50 of the parasite. In the case of koi carp, 135.44 mg L-1 of formalin is a safe dose and, at the same time, effective against the parasite as from 30 min of exposure, according to the recorded TI of 2.05. An anti-parasite drug must have a high therapeutic index to be effective at all stages of the life cycle, not to promote resistance of the parasite and to be of low environmental impact (Shao 2001). The higher the index, the safer the dose, since it prolongs exposure time to the chemical by employing a fixed concentration without affecting the health of the fish (Horwath et al. 1978).
Overall results show that a minimum concentration of formalin against D. minutus is 75 mg L-1 and the koi carp was well resistant at 100 mg L-1 formalin concentration in a short bath (1 h). Other points, such as the monitoring of water quality during bathing, are required, since formalin decreases the dissolved oxygen level in water (Reed et al. 2009).
Conflict of Interest:
Acknowledgment
The authors thank National Council of Scientific and Technological Development (CNPq) for financial support (CNPq
446072/2014-1) and Research grant to M.L. Martins (CNPq
305869/2014-0), Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel (CAPES/EMBRAPA Ed. 15/236) for PhD scholarship to K.R. Tancredo, and Vale dos Betas fish farm for fish donation. This study as financed in part by the Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel – Brazil (CAPES) – Finance Code 001.
References
Andrade-Porto SM, Affonso EG, Kochhann D, Malta JCO, Roque R, Ono EA, Tavares-Dias M (2017) Antiparasitic efficacy and blood effects of formalin on Arapaima gigas (Pisces: Arapaimidae). Aquaculture 479:38-44.
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