UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Instituto de Biologia
LUCIANA DE SOUSA PARADELA
Busca de novos inibidores da enzima glutaminase
“Search of new glutaminase inhibitors”
Campinas
2017
LUCIANA DE SOUSA PARADELA
Busca de novos inibidores da enzima glutaminase
“Search of new glutaminase inhibitors”
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de Mestra em Genética e Biologia Molecular, na área de Genética Animal e Evolução
Dissertation presented to the Institute of Biology of the University of Campinas in partial fulfillment of the requirements for the degree of Master in Genetics and Molecular Biology, in the area of Animal Genetics ad Evolution.
Orientadora: Dra. Sandra Martha Gomes Dias
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DE DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA LUCIANA DE SOUSA PARADELA E ORIENTADA PELA DRA. SANDRA MARTHA GOMES DIAS
CAMPINAS 2017
Campinas, 01 de agosto de 2017.
COMISSÃO EXAMINADORA
Profa. Dra. Sandra Martha Gomes Dias
Profa. Dra. Carolina Borsoi Moraes Holanda de Freitas
Prof. Dr. Rafael Victório Carvalho Guido
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
AGRADECIMENTOS
Ao longo dos anos de trabalho que resultaram nesta dissertação, pessoas e instituições me ajudaram, ensinando e apoiando. Agora que alcanço meus objetivos não poderia deixar de reconhecê-las.
Começo, como não poderia ser diferente, por agradecer meus pais, minha amada avó e tios. Obrigada pelos incentivos e apoio essenciais para minha formação pessoal e profissional, e por sempre acreditarem na minha vitória.
Ao meu querido Felipe pelo companheirismo de anos, sonhando, vivendo e trabalhando juntos pelos nossos objetivos e futuro.
Aos meus incansáveis amigos de laboratório, Carolline, Douglas, Krishina e Larissa, por toda amizade, ensinamentos, conselhos, suporte, força e melhores momentos dentro e fora do laboratório.
A minha orientadora, Sandra Dias, agradeço pela oportunidade de fazer parte de seu grupo de pesquisa, confiança e orientação durante esses anos.
A todos os amigos do laboratório pela amizade, momentos de descontração, ajuda e conselhos.
Agradeço à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela bolsa de estudos de mestrado, ao Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais (CNPEM) e ao Laboratório Nacional de Biociências por toda a infraestrutura e suporte técnico oferecidos.
Aos pesquisadores, técnicos e demais profissionais do LNBio por tornarem possível e factível a execução deste trabalho de dissertação.
RESUMO
A descoberta de fármacos é um processo longo e complexo. Em muitos casos, ele é composto pela identificação e validação inicial de alvo, seguida pelo desenvolvimento de ensaios bioquímicos ou celulares, rastreio de alto rendimento (High Throughput Screening, HTS) de uma biblioteca de compostos, identificação de compostos hits, otimização de moléculas leads e finalmente seleção de um candidato para seu desenvolvimento clínico. Glutaminase é uma enzima que desempenha um papel fundamental nas células tumorais e sua inibição ou atenuação da expressão demonstraram ser citotóxicas para vários tipos de tumor, em especial ao câncer de mama triplonegativo (TN) (sem expressão dos receptores de estrógeno ER, progesterona -PR e da proteína de membrana Her2). Mesmo sendo um importante alvo terapêutico, até a presente data, não há inibidores de glutaminase aprovados para o uso na clínica. Nosso grupo desenvolveu e realizou um ensaio bioquímico de HTS utilizando uma biblioteca de 30.000 compostos filtrados para seguirem as cinco regras de Lipinski. Neste trabalho, descrevemos no primeiro capítulo a avaliação de 11 dos compostos hits obtida em ensaios secundários celulares com o objetivo de verificar se os mesmos têm ação seletiva para tumores de mama TN em contraste a tumores não-T, células de tumor benigno (fibrose cística) e epitélio de mama imortalizado não tumorigênico. Dentre os compostos avaliados verificamos que os compostos C1 e C10 exibiram potência e seletividade tumoral medidos pela inibição do crescimento celular. Além disto, estes compostos inibiram em 50% o consumo de glutamina nas células tumorais TN MDA-MB-231 e diminuíram, nestas células, a porcentagem de núcleos marcados com Edu, indicando também ação citoestática. Entretanto, ambos compostos não apresentaram ação antitumoral dependente de GLS. Dando continuidade a busca por inibidores de glutaminase, no segundo capítulo desta dissertação, abordamos o estabelecimento de uma nova metodologia de triagem alvo-direcionada baseada em células, ensaio o qual foi empregado para o screening de duas coleções de bibliotecas de produtos naturais. Após validação e realização das triagens foi possível obter um total de 6 extratos/frações com potencial de serem inibidores seletivos de GLS.
ABSTRACT
The drug discovery process is a long and complex process composed of an initial target identification and validation, followed by the development of a biochemical or cellular assays, high throughput screening (HTS) of a compound library, hit identification, lead optimization and finally the selection of a candidate molecule for clinical development. Glutaminase is an enzyme that plays a key role on Myc-driven tumor cells and its expression inhibition or attenuation has been shown to be cytotoxic for various tumor types, especially triple-negative (TN) breast cancer (without expression of estrogen receptors-ER, Progesterone-PR and HER-2 membrane protein). Although it is an important therapeutic target, until nowadays, there are no glutamine inhibitors approved for use in the clinic. Our group developed and performed a biochemical HTS assay using a 30,000 compounds library filtered to follow the five Lipinsky rule. In this work, we describe in the first chapter the evaluation of 11 hits compounds obtained in secondary cell assays in order to verify if they have selective action against TN breast tumors in contrast to non-TN tumors, benign tumor cells (cystic fibrosis) and non-tumorigenic immortalized breast epithelium. Among the evaluated compounds, we verified that the compounds C1 and C10 exhibited potency and tumor selectivity measured by cell growth inhibition. In addition, these compounds inhibited the consumption of glutamine in TN tumor cells MDA-MB-231 by 50% and decreased the percentage of nuclei labeled with Edu, indicating also its cytostatic action. However, both compounds did not present GLS-dependent antitumor action. Continuing the search for glutaminase inhibitors in the second chapter of this work, we approached the establishment of a new target cell-based screening methodology, which was used to screen two collections of natural compounds libraries. After screening validation and execution, it was possible obtain a total of 6 extracts/fractions with potential to be selective GLS inhibitors.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: Diferenças metabólicas e ciclo da glutamina. ... 16
Figura 2: Principais destinos metabólicos e biossintéticos da glutamina. ... 18
Figura 3: Cronologia das principais descobertas no metabolismo da glutamina e do câncer. . 19
Figura 4. O metabolismo oxidativo da glutamina. . ... 20
Figura 5: Organização estrutural das isoformas das glutaminases de mamíferos. ... 22
Figura 6: Metabolismo da glutamina e alvos potentes para a terapia do câncer.. ... 25
Figura 7: Estruturas dos inibidores de glutaminase ... 26
Figura 8: “Do gene à droga”. ... 33
Figura 9: Resumo dos ensaios de triagem para detecção de fármacos. ... 43
Figura 10: Esquema da reação fluorimétrica de atividade de glutaminase por fluorescência de Resofurina.. ... 57
Figura 11: Triagem em larga escala e parâmetros estatísticos. ... 60
Figura 12: Proliferação tumoral sensível a retirada de glutamina.. ... 67
Figura 13: Ensaio dose-resposta de BPTES sobre proliferação de linhagens celulares .. ... 68
Figura 14: Ensaio de dose –resposta do composto C1 sobre a proliferação de linhagens celulares. ... 69
Figura 15: Ensaio de dose –resposta do composto C10 sobre a proliferação de linhagens celulares ... 70
Figura 16: Ação tumoral dos compostos C1 e C10. ... 71
Figura 17: Redução do consumo de glutamina pelos compostos C1, C10 e BPTES. ... 72
Figura 18: Ação citoestática dos compostos C1 e C10. ... 73
Figura 19: Padronização de formação de esferóides multicelulares de MDA-MB-231 em placas de baixa aderência Ultra Low Attachment (ULA).. ... 74
Figura 20: Efeito de BPTES e C1 sob o crescimento dos esferoides celulares ... 74
Figura 21: Dose-resposta e IC50 dos compostos BPTES e C1 sobre a intensidade média de fluorescência de células MDA-MB-231 mKO crescidas em 3D.. ... 75
Figura 22: Esquema de pLKO-Tet-On e seu mecanismo de ação.. ... 82
Figura 23: Racional da campanha baseada em células. ... 84
Figura 24: Efeitos da atenuação da expressão de GLS induzido por doxiciclina. ... 86
Figura 25: Triagem primária com a biblioteca PN LNBio. ... 87
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Compostos direcionados ao metabolismo de glutamina em câncer. ... 24
Tabela 2: Exemplos de moléculas terapêuticas que foram aprovadas no período de 2001 a 2006 pela FDA-US ... 30
Tabela 3: Estratégias de triagens. ... 43
Tabela 4: Descrição de parâmetros-chave na avaliação de HTS. ... 57
Tabela 5: Índice de Tanimoto dos 11 compostos contra 968, BPTES e CB-839 e FragFp de similaridade. ... 65
Tabela 6: Resumo dos resultados obtidos com as 11 moléculas adquiridas da ChemBridge.. 66
Tabela 7: IC50 dos 11 compostos sobre a proliferação celular de MDA-MB-231, iHMEC, MCF10A e SKBR3. ... 70
Tabela 8: Avaliação de características de segurança, ADME e perfil físico-químico dos 11 compostos em estudo. ... 79
Tabela 9: Propriedades químicas calculadas pelo programa OpenaBabel dos 11 compostos.. 80
Tabela 10: Resultados da triagem primária da biblioteca de PN LNBio... 87
Tabela 11: Resultados da triagem secundária da biblioteca de PN LNBio. ... 88
Tabela 12: Seleção dos hits da triagem secundária da biblioteca de PN LNBio. ... 88
Tabela 13: Resultados da triagem primária da biblioteca PN Phytobios.. ... 90
Tabela 14: Resultados da triagem secundária da biblioteca PN Phytobios ... 90
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
3PG 3-fosfogliceratoADME Absorção, Distribuição, Metabolismo e Excreção
Ala alanina
ANK ankirina
ATCC American Type Culture Collection ATP adenosina trifosfato
BPTES bis-2-(5-pheny- lacetamido-1,2,4-thiadiazol-2-yl)ethyl sulfid CYP450 citocromo P450
DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole DHAP fosfato de diidroxiacetona DMSO sulfóxido de dimetil Dox doxiciclina
EGF fator de crescimento epitelial ER receptor de estrógeno
F6P frutose-6-fosfato FBS Fetal Bovin Serum
FDA Food and Drug Administration
FDG-PET F18-deoxiglucose Positron Emission Tomography G6P glicose-6-fosfato
GAB Glutaminase B GAC Glutaminase C
GADP gliceraldeído3-fosfato GDH glutamato desidrogenase
GEMMs camundongos geneticamente modificados GFP green fluorescente protein
GLS glutaminase GLU glutamato
GLUD glutamato desidrogenase GLUL glutamina sintetase GSH glutationa
HCA High Content Analysis HCS High Content Screening
HER receptor de fator de crescimento epidérmico HIF fator induzível por hipóxia
HMEC Human Mammary Epithelial Cells HTS High Throughput Screening
KGA Kidney-type glutaminase
L-DON acivicin, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina LGA Liver-Type Glutaminase
MDR1 Multi Drug Resistance Protein 1
MEGM Mammary Epithelial Cell Growth Medium MOI Multiplicity of infection
NH4+ amônia OAA oxaloacetate PD farmacodinâmica P-gp P-glycoprotein PK farmacocinética PN produtos naturais PR receptor de progesterona R5P ribose 5-fosfato
RMN ressonância magnética nuclear RNAi RNA de interferência
ROS espécies reativas de oxigênio S/B signal-to-background
S/N signal-to-noise
SAR relação de estrutura-atividade SD standard derivation
sh short hairpin
SW signal window
TCA ciclo do ácido tricarboxílico TERT Telomerase reverse transcriptase Tet tetraciclina
TNBC câncer de mama triplo negativo
UDP-GlcNAc difosfato de uridina de N-acetilglucosamina
ULA Ultra Low Attachment αKG alfa cetoglutarato
A adaptação metabólica tumoral ... 15
O ciclo do TCA e a glutaminólise ... 16
Glutamina: um nutriente versátil ... 18
Glutaminases ... 21
Metabolismo de glutamina: oportunidades terapêuticas ... 22
Glutaminase em tumor de mama triplo-negativo ... 27
A Terapia Tumoral: desafios, frustações, avanços e oportunidades... 28
Processo de descoberta e desenvolvimento de fármacos: do gene ao fármaco .. 34
Seleção e Validação do Alvo ... 34
Avaliação do risco biológico na validação de alvos ... 35
Avaliação dos riscos técnicos ... 39
O processo de descoberta da molécula candidata (hit) ... 41
Desenvolvimento de Ensaios ... 44
Definindo uma série de hits ... 46
Fase Hit-to-Lead ... 48
Fase de otimização da molécula Lead ... 49
Screening baseado em células versus em alvos isolados ... 51
Vantagens e desafios de triagens baseada em células versus HTS de alvos selecionados ... 52
Triagens baseadas em células ... 52
HCS na descoberta e validação de alvos ... 53
Triagens de ensaios bioquímicos ... 54
Combinação de triagens de células e alvo selecionado ... 54
2 OBJETIVO ... 55
Geral ... 55
Específicos ... 55
3 CAPÍTULO 1: IDENTIFICAÇAO DE NOVOS INIBIDORES DE GLUTAMINASE BASEADOS NA TRIAGEM BIOQUÍMICA ALVO DIRECIONADA ... 56
Implementação de ensaio fluorimétrico de atividade de glutaminase automatizado
para HTS ... 56
MATERIAL E MÉTODOS ... 60
Ensaios Enzimáticos ... 60
Cultura de Células ... 61
Ensaios de crescimento celular, citotoxicidade e de inibição in vitro ... 62
Western-Blot ... 62
Análise de Ciclo Celular ... 63
Cultura de células 3D ... 64
RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 65
Estudos Bioquímicos ... 65
Análise de similaridade in silico ... 65
Ensaios enzimáticos de dose-resposta ... 66
Estudos Celulares ... 67
Ensaios de Proliferação Celular e Dependência de Glutamina ... 67
Ensaios de Citotoxicidade in vitro ... 68
Padronização de metodologia de formação de esferoides 3D ... 73
Análise de bioinformática de propriedades de toxicidade e ADME dos 11 compostos. ... 75
CONCLUSÕES ... 77
PERSPECTIVAS ... 78
4 CAPITULO 2: TRIAGEM ALVO ESPECÍFICA BASEADA EM CÉLULAS ... 81
MATERIAL E MÉTODOS ... 83
Cultura de Células ... 83
Western blot ... 83
Ensaio celular de proliferação – seleção de compostos inibidores do crescimento celular 83 Hipótese de Validação de Hits... 84
BIBLIOTECAS ... 85
RESULTADOS ... 86
Prova de conceito do ensaio celular ... 86
Triagem com Biblioteca Phytobios ... 88 CONCLUSÃO ... 91 PERSPECTIVAS: ... 91 5 ARTIGO PUBLICADO ... 92 6 REFERÊNCIAS ... 104 7 APÊNDICES ... 112
APÊNDICE I: Gráficos Dose Resposta Enzimáticos ... 112
APÊNDICE II: Gráficos Dose-Resposta Celulares ... 114
8 ANEXO ... 118
ANEXO I: Autorização da Comissão Interna de Biossegurança (CIBIO) do CNPEM ... 118
1 INTRODUÇÃO
A adaptação metabólica tumoral
As células tumorais exibem atividades metabólicas aumentadas e incomuns em comparação com as células diferenciadas normais, uma vez que reprogramam sua maquinaria metabólica para satisfazer suas exigências bioenergéticas e biossintéticas 1. Uma dessas
anormalidades metabólicas é que as células tumorais absorvem glicose a taxas mais altas em relação ao tecido normal, mas usam menos glicose para a fosforilação oxidativa (OXPHOS) e favorecem a oxidação incompleta da glicose através da via glicolítica mesmo na presença de oxigênio, contribuindo para a produção de lactato e a biossíntese de lipídeos e outras macromoléculas (Figura 1A) (Warburg 1956; Kim & Dang 2006; Jin et al. 2016; DeBerardinis et al. 2008; DeBerardinis 2008b). A este fenômeno, publicado na década de 1920 por Otto Warburg, se deu o nome de efeito Warburg ou glicólise aeróbica, o qual é atualmente explorado em análises clínicas através do uso de F18-deoxiglucose Positron Emission Tomography (FDG-PET) para a visualização de tumores com captação de glicose aumentada. A captação aumentada de glicose detectada pela técnica FDG-PET se correlaciona com um prognóstico ruim e alto potencial metabólico em vários tipos de tumor 7. Recentemente, a glicólise aeróbica foi reconhecida como um novo hallmark do câncer segundo Hanahan e Weinberg 8.
A explicação atual para o efeito Warburg é de que a alta taxa glicolítica proporciona diversas vantagens para as células. Se o fluxo glicolítico é alto o suficiente, como acontece no processo canceroso, o consumo da glicose para a produção de adenosina trifosfato (ATP), mesmo possuindo um baixo rendimento por molécula de glicose, resulta em uma porcentagem final de ATP que pode exceder à produzida pela fosforilação oxidativa (DeBerardinis et al. 2008). Além do mais, as células em estado de proliferação, e especialmente as células tumorais, dependem fortemente da disponibilidade de precursores metabólicos para a síntese dos blocos constituintes celulares (lipídeos, proteínas e ácidos nucléicos). A via glicolítica fornece diretamente intermediários para a síntese de lipídeos e do açúcar ribose dos nucleotídeos (Figura 1B). Desta maneira, o efeito Warburg beneficiaria tanto a necessidade bioenergética quanto biossintética das células. Por fim, em contraste com a respiração mitocondrial, a geração de energia pela via glicolítica ocorre independente da oferta de oxigênio e permite às células sobreviverem e migrarem para áreas hipóxicas (com baixo nível de oxigênio), um fator crucial para o crescimento do tumor. Entretanto, a observação de que células derivadas de tumores hipóxicos cultivadas em condições de normóxia ainda mantém o fenótipo glicolítico, indica que
a força dirigente do aumento da glicólise não é uma simples adaptação às condições de falta de oxigênio e que, ao contrário, mecanismos genéticos estabilizados podem estar promovendo a ativação glicolítica dentro dos tumores 9.
Figura 1: Diferenças metabólicas e ciclo da glutamina. A) Diferenças entre o metabolismo de células
quiescentes diferenciadas (em cima) e de células proliferativas (em baixo) no tocante ao destino do piruvato. B) Células tumorais obtém os precursores biossintéticos a partir do metabolismo da glicose e glutamina. A glicose e a glutamina, os quais são os dois nutrientes mais abundantes no meio extracelular, fornecem carbono para a síntese de ácidos nucléicos, lipídeos e proteínas. A biossíntese de purina e pirimidina utiliza ribose 5-fosfato (R5P) produzida pelos braços oxidativos (a partir de G6P) e não-oxidativos (a partir de F6P) da via ribose fosfato, e aminoácidos derivados da glicose e glutamina. A síntese de ácidos graxos, necessária para a produção de lipídeos requer acetil-CoA (Ac-CoA) gerado a partir do citrato exportado da mitocôndria. A síntese de proteínas requer aminoácidos, tRNA e ribossomos, sendo que ambas, glicose e glutamina, são usados para gerar estas moléculas. Glutamina também doa nitrogênio para nucleotídeos e para a síntese de aminoácidos. G6P, glicose-6-fosfato; F6P, frutose-6-fosfato; GADP, gliceraldeído3-fosfato; 3PG, 3-fosfoglicerato; DHAP, fosfato de diidroxiacetona; OAA,
oxaloacetato; αKG, alfa cetoglutarato. Adaptado de 5,10.
O ciclo do TCA e a glutaminólise
Para sintetizar lipídeos, proteínas e ácidos nucléicos, as células também usam precursores do ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) (Figura 1B). Desta maneira, o papel chave do ciclo TCA nas células em proliferação é o de agir como uma fonte de metabólitos para a biossíntese. Isto representa uma diferença importante em relação ao metabolismo não proliferativo de tecidos oxidativos, como o cardíaco por exemplo, onde a visão tradicional do ciclo TCA é o de servir para extração máxima de ATP a partir de substratos oxidáveis. Durante a proliferação celular, muito do carbono que entra o ciclo TCA é usado em vias biossintéticas
que consomem, ao contrário de produzir ATP. O resultado é o contínuo efluxo de intermediários metabólicos (cataplerose) 5,11.
A glicose metabolizada que entra no ciclo TCA dentro da mitocôndria na forma de piruvato é convertida a acetil-CoA, e então em citrato. O citrato é transferido para fora da mitocôndria e, no citosol, é convertido à oxaloacetato (OAA) e o precursor lipogênico, acetil-CoA (Figura 1B). A exportação de citrato para a síntese lipídica tem impacto sobre a função geral do ciclo resultando o que é chamado de ciclo “truncado”, devido a diminuição da quantidade relativa da fração de citrato mitocondrial que é oxidada. Além disso, a própria diminuição do aporte de piruvato, fruto do aumento da sua conversão em lactato na via glicolítica, é um fator importante de trucagem do TCA. Outros intermediários do ciclo do TCA também são usados para a biossíntese de diferentes macromoléculas. OAA e α-cetoglutarato suplementam o pool de aminoácidos não-essenciais que serão usados para a síntese de proteínas e nucleotídeos, contribuindo para o fenômeno de cataplerose 12.
De maneira a sustentar o funcionamento do ciclo TCA em face a cataplerose, as células cancerosas precisam lançar mão de um influxo de metabólitos intermediários, fenômeno conhecido como anaplerose. Para isso, utilizam frequentemente o metabolismo de aminoácidos, particularmente a glutamina, aminoácido de maior abundância no sangue já que, juntamente com a alanina, é responsável por transportar nitrogênio (e grupamento amina) pelo organismo. As células tumorais podem oxidar a glutamina parcialmente de uma maneira análoga à oxidação parcial da glicose através da glicólise aeróbica, via denominada glutaminólise. Este aminoácido, não só fornece um substrato importante para a respiração, mas também para a síntese de outras macromoléculas, como nucleotídeos, proteínas e hexosaminas 13. Além da sua função crítica no fornecimento de carbono e nitrogênio para a biossíntese de macromoléculas, a glutaminólise também tem um papel importante na regulação do equilíbrio redox, sinalização mTOR, apoptose e autofagia, tornando a glutamina uma fonte energética e biossintética para as células proliferativas 5.
A glutamina, após ser transportada para as células através de transportadores tais como SLC1A5 e SLC7A5 (Figura 2), é convertida na mitocôndria em glutamato e ainda em alfa-cetoglutarato (α-KG) pela glutaminase (GLS), GDH e outras enzimas para permitir a produção de ATP através do ciclo TCA e para fornecer esqueletos de nitrogênio, enxofre e carbono para a produção de precursores biossintéticos necessários para o crescimento e proliferação de células cancerosas.
Figura 2: Principais destinos metabólicos e biossintéticos da glutamina. A glutamina entra nas células de
mamíferos através de transportadores tais como SLC1A5 (também conhecido como ASCT2) 14. A própria
glutamina pode contribuir para a biossíntese de nucleotídeos e a síntese de difosfato de uridina de
N-acetilglucosamina (UDP-GlcNAc) para o suporte de dobramento e tráfico da proteínas 15, ou é convertida em
glutamato pelas glutaminases (GLS ou GLS2) 16. O glutamato pode contribuir para a síntese da glutationa e tem
muitos outros destinos metabólicos na célula que têm um impacto em vários erros congênitos do metabolismo,
que foram recentemente revistos 17. O glutamato é convertido em α-cetoglutarato (α-KG) através de um dos dois
conjuntos de enzimas, a glutamato desidrogenase (GLUD1 ou GLUD2, também referida coletivamente como
GLUD) ou aminotransferases. Considerando que o subproduto da GLUD é NH4+, o subproduto das reações
aminotransferases são outros aminoácidos. Note-se que as aminotransferases podem estar presentes no citoplasma ou nas mitocôndrias. α-KG entra no ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) e pode fornecer energia para a célula. O
malato que sai do ciclo de TCA pode produzir piruvato e NADPH para reduzir equivalentes 18, e o oxaloacetato
(OAA) pode ser convertido em aspartato para suportar a síntese de nucleótidos 19. Alternativamente, α-KG pode
prosseguir através do ciclo TCA, em um processo chamado carboxilação redutora (RC) para produzir citrato, que
suporta a síntese de acetil-CoA e lipídios 20,21.
Glutamina: um nutriente versátil
Durante décadas, pesquisadores tem demonstrado a importância do metabolismo de glutamina para o crescimento celular e o seu papel crítico para a sobrevivência das células tumorais (Figura 3) 6,21,22.
Figura 3: Cronologia das principais descobertas no metabolismo da glutamina e do câncer. A-KG,
a-cetoglutarato; GLUD, glutamato desidrogenase. Retirado de 21
A glutamina é um aminoácido tradicionalmente visto como não essencial, cuja função primária é a de armazenamento de nitrogênio nos músculos e principal transportador de nitrogênio entre os órgãos. Embora constitua aproximadamente 4% de toda a massa proteica muscular, quando na forma livre, a glutamina pode contribuir com até 20% da fração de
aminoácidos em plasma sanguíneo e com mais de 40% em músculos 23. Mamíferos podem sintetizar glutamina em diversos tecidos, porém, durante períodos de rápido crescimento
ou de doenças, onde a demanda por esse aminoácido excede a sua disponibilidade, torna-se, nesse contexto, um aminoácido essencial. Esse conjunto de observações faz hoje com que a glutamina seja considerada como ‘condicionalmente’ essencial 24.
Células proliferativas são ávidas consumidoras de glutamina por ser um dos nutrientes mais versáteis dentro do contexto do metabolismo intermediário e da mediação de vias de sinalização em mamíferos, como o transporte de aminoácidos essenciais e a estimulação da mTOR (mammalian target of rapamycin). Desta maneira, a glutamina exerce papel importante na regulação do crescimento, mobilidade e sobrevivência celular, além do processo de transcrição e síntese de proteínas 25.
O destino metabólico da glutamina, por sua vez, pode ser ramificado em duas vias, dependendo do grupo químico a ser aproveitado (Figura 4). Na primeira via, seu γ-nitrogênio vai para a biossíntese de nucleotídeos sendo precursora direta da síntese tanto de anéis purínicos como pirimidínicos. Os γ-nitrogênios de duas moléculas de glutamina são utilizados para produzir um anel purínico e um terceiro é utilizado na conversão de xantina monofosfato a guanosina monofosfato. Na formação de anéis pirimidínicos é utilizado um nitrogênio do grupo amino da glutamina e um do aspartato, e outro nitrogênio proveniente de um grupo amino é
adicionado à uridina trifosfato para formar citidina trifosfato 24. O γ-nitrogênio também é empregado na via de síntese de hexosaminas que culmina com a adição de O-GlcNAc a resíduos de serina e treonina. Desta maneira, a disponibilidade de glutamina pode controlar a atividade de diversas proteínas.
Figura 4. O metabolismo oxidativo da glutamina. O γ-nitrogênio da glutamina vai para a biossíntese de
nucleotídeos, de hexosaminas e asparagina. Este γ-nitrogênio pode também ser removido pela ação de glutaminases, gerando glutamato (Glu) e amônia (NH4+). O α-nitrogênio e/ou do esqueleto carbônico na forma de glutamato contribuem para a síntese de aminoácidos não-essenciais, como aspartato (Asp) e alanina (Ala), e agentes antioxidantes, como a glutationa (GSH). O glutamato é também utilizado na síntese de prolina e é de total importância para a anaplerose do Ciclo do Ácido Cítrico (TCA). A formação de α-cetoglutarato durante a reação de glutaminólise contribui para a reposição dos intermediários do TCA e formação de NADPH, que serão utilizados na construção de blocos biossintéticos como lipídeos e aminoácidos. Adicionalmente, neste ciclo será produzido poder redutor (NADH e FADH2) para a produção de energia na forma de ATP. α-KG: α-cetoglutarato;
Glc: glicose. Retirado de 26.
A segunda via faz uso do α-nitrogênio e/ou do esqueleto carbônico. Esses grupos químicos contribuem para a síntese de aminoácidos não-essenciais, como aspartato e alanina, e agentes antioxidantes, como a glutationa (GSH). Adicionalmente, o metabolismo da glutamina contribui para a geração de combustível respiratório através da sua oxidação no ciclo do ácido tricarboxílico (TCA), conforme comentado acima. A oxidação do esqueleto carbônico desse aminoácido dentro da mitocôndria é uma das principais fontes de energia em linfócitos, enterócitos, fibroblastos e diversas linhagens tumorais 27. Um importante ponto em comum entre todas as reações inseridas na segunda categoria é que estas utilizam de fato o aminoácido glutamato derivado da glutamina como substrato. Apesar de, como mencionado acima, a
glutamina ser um nutriente abundante, o glutamato não o é. A reação catalisada pelas glutaminases dependentes de fosfato gera glutamato e mais um íon amônio pela quebra hidrolítica da cadeia lateral da glutamina. Glutamato é então convertido em α-cetoglutarato, o qual entra no ciclo do TCA. Também conforme já comentado acima, a anaplerose do ciclo do TCA pelo α-cetoglutarato é de suma importância para a manutenção do equilíbrio metabólico nas situações de cataplerose ou baixa entrada de piruvato glicolítico, típicas de células proliferativas, o que as torna altamente dependentes de glutamina para a sobrevivência. 28
Glutaminases
O processo de conversão da glutamina na glutaminólise é iniciado por glutaminases fosfasto-dependentes na mitocôndria, que catalisam a desaminação da cadeia lateral da glutamina gerando glutamato e amônia 5. Existem quatro isoformas da glutaminase identificadas até então em mamíferos: Glutaminase B (GAB), Glutaminase C (GAC), Kidney-type glutaminase (KGA), Liver-Type Glutaminase (LGA). Essas isoformas são codificadas por dois genes distintos mas estruturalmente relacionados, GLS e GLS2, que apresentam evidências de formação por duplicação seguida de evolução divergente 29,30. O gene GLS, constituído de 19 éxons e presente no cromossomo 2, codifica as duas isoformas GAC e KGA produzidas por splicing alternativo. A isoforma KGA possui expressão constitutiva na maioria dos tecidos, enquanto a isoforma GAC é comumente encontrada em coração, pâncreas, rim e pulmão 31. O gene GLS2, presente no cromossomo 12, consiste em 18 éxons e codifica para a enzima LGA e GAB. Originalmente identificada no fígado, LGA/GAB também são encontrados em tecidos cerebrais e no pâncreas32.
Tanto KGA como GAC compartilham completa identidade sequencial desde o N-terminal até o fim do domínio glutaminase, e, devido à ocorrência de splicing alternativo após a sequência codificante para estas regiões, o C-terminal das duas isoenzimas é apenas 4% idêntico (Figura 5) 32. Cassago et al. demostraram em 2012 que, enquanto GAC é
exclusivamente mitocondrial (além de ser a mais responsiva ao ativador fosfato), KGA pode assumir outras localizações distintas na célula, o que levantou a hipótese de que KGA tenha funções diversas (CASSAGO et al., 2012).
Figura 5: Organização estrutural das isoformas das glutaminases de mamíferos. KGA e GAC são produtos
de splicing alternativo do gene GLS, enquanto que a LGA e GAB são produtos do uso alternativo de início da transcrição de um gene distinto, GLS2. GAC, KGA e GAB, mas não LGA, possuem o sinal de localização para a mitocôndria, designado MS. Em comum, todas apresentam domínio catalítico Glutaminase (identidade sequencial acima de 80%), além de motivos NR box, de possível interação com receptores nucleares. KGA, LGA e GAB ainda possuem prováveis domínios ankirina (ANK) de interação com outras proteínas. Na região C-terminal, KGA possui ainda uma sequência KEN box, enquanto que LGA e GAB tem uma sequência de interação com domínio
PDZ. Não existe predição de motivos conhecidos para a região C-terminal de GAC. Retirado de 33.
Apesar de serem originadas de genes diferentes, as principais diferenças entre as sequências de nucleotídeos que codificam para as isoenzimas KGA e LGA encontram-se somente no éxon inicial e nos que procedem ao sítio catalítico (éxons 16 ao 19 em KGA e 16 ao 18 em LGA). O éxon 1 compartilha 62.5% de similaridade entre os dois genes e codifica para 129 resíduos em KGA, enquanto que somente 61 na LGA. A sequência codificada contém os sinais envolvidos para o direcionamento das proteínas para a mitocôndria. O éxon 18 da LGA possui o menor índice de similaridade entre as duas isoenzimas (29.4%)34.
Metabolismo de glutamina: oportunidades terapêuticas
A dependência de células cancerosas sobre o metabolismo da glutamina a tornou um alvo terapêutico anticancerígeno atraente 21 e, por conseguinte, novos esforços têm sido feitos
para caracterizar compostos que inibem etapas específicas de glutaminólise, especialmente aqueles com dependência de glutaminase associada a oncogene (Tabela 1) 35–37. Como
de tumores, sendo indispensável para a proliferação de células cancerosas. Por conseguinte, a inibição específica do transportador para bloquear a absorção de glutamina poderia ser uma abordagem terapêutica promissora para o tratamento do câncer. De fato, verificou-se que a benzilserine e a L-y-glutamil-p-nitroanilida inibem eficazmente SLC1A5 e suprimem o crescimento tumoral em câncer de pulmão e melanoma 38,39. Além disso, foi demonstrado que
2-aminobiciclo(2,2,1)-heptano-2-carboxylic (BCH), um inibidor de SLC7A5, inibe a sinalização de mTOR 25.
Este interesse em encontrar pequenas moléculas direcionadas ao metabolismo da glutamina originou-se nos anos 50, quando vários análogos da glutamina, incluindo acivicin, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina (L-DON) e azaserine foram testados quanto à sua atividade anti-tumoral, tanto em estudos pré-clínicos quanto clínicos 40. Todos os três análogos mostraram certo grau de efeitos anti-proliferativos in vitro, bem como em modelos xenográficos de animais. Eles se dirigem, não especificamente, a várias enzimas glutaminolíticas tais como GLS e, portanto, inibem a biossíntese de nucleotídeos dependente de glutamina. Embora os análogos de glutamina introduzam a possibilidade de exploração terapêutica do vício da glutamina para o tratamento do câncer, toxicidades limitantes da dose incluindo neurotoxicidade, toxicidade gastrointestinal e mielossupressão impedem o desenvolvimento posterior desses análogos de glutamina na clínica 4.
GLS é um dos mais amplamente estudados alvos de fármacos na via da glutaminólise devido ao seu papel crítico no metabolismo da glutamina (Figura 6). Por isso, a caracterização de novos inibidores específicos para GLS tornou-se recentemente um campo de intensa pesquisa e uma variedade de pequenas moléculas inibidoras têm sido relatadas 41,42. DON (Figura 7A), o mais antigo conhecido inibidor da glutaminase, é um inibidor de sítio ativo dirigido 43, que tem sido utilizado como um composto ferramenta para ajudar a elucidar o potencial envolvimento de glutaminase na demência associada ao HIV (HAD), patogenia e esclerose múltipla. No entanto, DON é um reagente tóxico não seletivo que inibe várias enzimas que utilizam glutamina. DON tem também potência inibidora fraca em milimolar em modelos in vitro de doenças, e não é bem tolerada in vivo 43,44.
Composto
Alvo
BPTES GLS1 968 GAC CB-839 GLS1 Ebselen GLS1, GLS2 Chelerythrine GLS1, GLS2 Apomorphine GLS1, GLS2DON Antagonista de glutamina
Acivicin γ-Glutamil transpeptidase glutamina
amidotransferase; Antagonista da glutamina
BCH Transportador de glutamina (SLC7A5)
α-Methyl-DL-tryptophan Transportador de glutamina (SLC6A14)
Tamoxifen Transportador de glutamina (ASCT2)
Raloxifene Transportador de glutamina (ASCT2)
GPNA Transportador de glutamina (ASCT2)
EGCG GDH
L-Asparaginase Glutamina
Phenylacetate Glutamina
Tabela 1: Compostos direcionados ao metabolismo de glutamina em câncer.
O inibidor GLS mais bem caracterizado é o bis-2-(5-pheny- lacetamido-1,2,4-thiadiazol-2-yl)ethyl sulfid (BPTES) (Figura 7C). O BPTES inibe alostericamente a transição dímero-tetrâmero de GLS 41,45, que é crítico para a ativação da enzima, apresentando boa potência na faixa de micromolar (Ki = 0,2 µM) e um modo incompetitivo de inibição (Thomas et al. 2013). Apesar de ser mais potente do que o DON, BPTES não é um composto com boas características farmacológicas, pois tem alto peso molecular (534 Da), além de baixa solubilidade e biodisponibilidade (Robinson et al. 2007). A análise da estrutura cristalina de GLS-BPTES mostrou que BPTES se liga à interface dimérica de GLS e consequentemente estabiliza a forma tetramérica inativa da enzima 45. BPTES efetivamente inibe o crescimento
de vários tipos de tumores, incluindo carcinoma hepatocelular Myc-dependente 46, carcinoma de células renais e linfoma 47. Consistente com o papel crítico da glutaminólise na homeostase
energética celular e redox, a inibição de GLS por BPTES diminui os níveis de ATP e aumenta profundamente os níveis de ROS 47. Além disso, demonstrou-se que a combinação de BPTES com inibidores de proteína de choque térmico 90 induz seletivamente a morte celular em células tumorais dirigidas por mTORC1 48. Curiosamente, a expressão de piruvato carboxilase se correlaciona negativamente com a sensibilidade ao BPTES em linhagens celulares de câncer de pulmão, indicando que a sensibilidade à inibição de GLS pode ser afetada pelo modo de entrada de carbono no TCA 49. Além disso, foram desenvolvidas várias moléculas derivadas de BPTES
Figura 6: Metabolismo da glutamina e alvos potentes para a terapia do câncer. Após o transporte para o
citosol por LAT1 (transportadores de aminoácidos de tipo L 1), ASCT2 (transportadores de aminoácidos ASC do sistema 2) e outros transportadores, a glutamina é catalisada pela glutaminase e converte em glutamato e amônia. Em seguida, fornece material macromolecular para a síntese de aminoácidos e lipídios. A glutamina também é usada para trocar aminoácidos essenciais, o que poderia ativar mTOR e promover o crescimento celular. O glutamato é também utilizado para trocar cisteína extracelular pela produção de GSH. GLS é uma enzima chave para o metabolismo da glutamina, que pode ser inibida por vários inibidores, incluindo 968, BPTES e CB-839, que acompanham outros inibidores do metabolismo da glutamina são mostrados em círculo vermelho. Retirado de
52.
Sendo o mais recente inibidor desenvolvido, o CB-839 (Figura 7D) foi descrito por Gross e colaboradores em 2014. CB-839 foi descrito como um inibidor potente e seletivo de GLS1 52 (IC50 de 50 nM sobre GAC recombinante; 20-30 nM sobre glutaminase endógena de lisado de tecido; 50 nM sobre proliferação celular de tumores de mama triplo negativo, TN), disponível via oral e específico para KGA e GAC (sem ação sobre GLS2) 51. Mais, CB-839 foi específico sobre TNBC que são altamente resistentes a quimioterapia, não apresentando efeito sobre a viabilidade da linhagem não-TN T47D (IC50 > 1000 nM). CB-839 também inibiu o crescimento de linfoma, mieloma, mesotelioma, leucemia aguda e câncer de pulmão 53 e apresentou atividade antitumoral em dois modelos xenográficos, como um agente único em tumor TN derivado de paciente e tanto como agente único ou em combinação com paclitaxel
Figura 7: Estruturas dos inibidores de glutaminase DON (A), 968 (B), BPTES (C) e CB-839 (D).
Um outro composto, 968 (benzophenanthridinone 968) (Figura 7B), representa outra classe de inibidor GLS que recentemente chamou muita atenção. Ao contrário do BPTES, o 968 é menos eficaz na inibição da atividade da enzima GLS quando adicionado a GLS ativa por pré-tratamento com fosfato inorgânico, um ativador alostérico 54. De fato, um estudo posterior mostrou que, ao contrário do BPTES, 968 não estabiliza um estado tetramérico inativo de GLS, mas preferencialmente liga-se a um inativo estado monomérico de GLS e inibe as alterações conformacionais ativas da enzima 54. O tratamento com 968 suprimiu a transformação oncogênica induzida por Rho GTPases em fibroblastos e câncer da mama, e mostrou atividade antitumoral sinérgica em combinação com a inibição de mTOR no glioblastoma 55,56. Uma vez que o BPTES e o 968 regulam a atividade de GLS através de
mecanismos alostéricos distintos, estes compostos podem ser ainda examinados para combinação de tratamento para aumento da inibição de GLS e supressão tumoral 4.
A possibilidade de direcionar a etapa que converte glutamato em α-KG também foi explorada e foram descritos vários inibidores. Foi demonstrado que o epigallocatechin gallate, um flavonoide do chá verde, inibe alostericamente o GDH e suprime eficazmente o crescimento tumoral em muitos tipos de câncer que dependem da glutamina 57. No entanto, o fato de o epigallocatechin gallate apresenta numerosas atividades farmacológicas e potencialmente possui múltiplos alvos na célula, não deixa claro o quanto a inibição de GDH por ele explica a sua atividade antitumoral in vivo. Jin e colaboradores 58 identificaram recentemente a purpurina e seu derivado permeável a células R162 como novos inibidores de GDH. A purpurina liga-se diretamente e inibe especificamente a atividade de GDH1 in vitro. Mais importante, a purpurina não apresenta qualquer efeito na atividade de outras enzimas dependentes de NADPH tais como a 6-fosfogluconato desidrogenase e a fumarato hidratase, enquanto que o epigallocatechin gallate afeta dramaticamente a atividade de ambas as enzimas. A inibição de GDH por R162
em células cancerosas induz um nível elevado de ROS e inibe o crescimento tumoral in vivo, suportando ainda um papel crítico da glutaminólise na manutenção do equilíbrio redox em células cancerosas e indicando GDH1 como um alvo antitumoral promissor 4,58.
Adicionalmente a GDH, transaminases glutamato dependentes também foram consideradas como alvos de fármacos para modular a glutaminólise. Aminooxiacetato, que inibe não especificamente as transaminases, demonstrou ser eficaz na inibição da proliferação celular e do crescimento tumoral em vários estudos pré-clínicos 59,60.
Glutaminase em tumor de mama triplo-negativo
Cerca de 15% dos casos diagnosticados de câncer de mama correspondem a um tipo de tumor caracterizado pela falta de expressão dos genes dos receptores de estrógeno (ER) e progesterona (PR), ESR1 e PGR, respectivamente, e do gene ERBB2 (que codifica o receptor de fator de crescimento epidérmico 2, HER2), principais marcadores moleculares e alvos terapêuticos para a doença 61–64. Por essa característica, esse grupo é chamado de câncer de mama triplo-negativo e apresenta um perfil molecular único, comportamento agressivo e pior prognóstico 65,66, estando associado a um aumento no tamanho do tumor 67, padrões distintos de metástase 65, associação com BRCA1 68, expressão aberrante de moléculas de reparo de DNA 62 e desenvolvimento na idade jovem, principalmente em mulheres de origem africana e americana 69.
Por seu perfil triplo-negativo, esse tipo de câncer de mama não responde aos tratamentos convencionais da doença baseados no uso de anticorpos monoclonais inibidores de HER2 70 e de antagonistas de hormônios 63. Além disso, o caráter molecular heterogêneo, sem alvos bem definidos, dificulta o entendimento da doença e o desenvolvimento de tratamentos específicos e eficazes 71. As terapias disponíveis para os casos diagnosticados são focadas principalmente em (i) inibidores de EGFR 72,73, amplificado em apenas 5% dos casos de câncer de mama
triplo-negativo 74 e (ii) inibidores de PARP 75,76, eficazes nos casos em que há ocorrência de mutação
em BRCA1/2, correspondendo a cerca de 15% dos casos 66,74.
Estudos recentes têm encontrado uma relação entre o perfil triplo-negativo do tumor e um metabolismo alterado 77–80, sugerindo que a reprogramação metabólica pode ser chave na progressão da doença. Em pesquisa realizada por Tchou e colaboradores 7, verificou-se que o grau de captação de 2-deoxi-2-(18F) fluoroD-glicose, uma técnica empregada para a visualização de tumores sólidos em pacientes (FDG-PET – Positron Emission Tumography), correlaciona-se com o índice proliferativo de tumores de mama triplo-negativo, sugerindo um
aumento da glicólise ou efeito Warburg, um reconhecido marco da adaptação metabólica sofrida pelos tumores 5. O consumo aumentado de glicose vem sendo amplamente estudado para este tipo de câncer, diversos estudos encontraram uma relação entre o metabolismo deste nutriente e a agressividade do tumor 81–85. Pelicano e colaboradores mostraram que linhagens
de câncer de mama triplo-negativas exibiam uma diminuição no consumo de oxigênio e aumento no consumo de glicose e produção de lactato quando comparadas com células positivas para receptores hormonais. Além disso, demonstraram que mTOR é importante para regular fosforilação oxidativa e que manipular a expressão de genes metabólicos chaves, como p70S6K poderia alterar respiração e metabolismo de glicose, tornando as células menos resistentes a terapias e mais propensas à morte celular 81.
A análise de uma painel de linhagens de câncer de mama mostrou que a expressão de GAC e sua atividade glutaminolítica encontra-se elevada na maioria dos TNBC em relação à células que expressam algum dos receptores, sendo um biomarcador potencial para a sensibilidade ao inibidor de GLS 51,86. Conforme comentado acima, o tratamento de linhagem triplo-negativa de câncer de mama com CB-839, um inibidor de GLS, reduziu o consumo de glutamina e a produção de glutamato, diminuiu o consumo de oxigênio e de diversos intermediários do ciclo do TCA, indicando potencial terapêutico para compostos que inibam a glutaminólise 51.
A Terapia Tumoral: desafios, frustações, avanços e oportunidades
O câncer é uma doença progressiva de várias etapas complexas resultado da acumulação de anormalidades genéticas e epigenéticas que conduzem à transformação de células normais em derivados malignos. Este processo coordena cada tumor de uma maneira tão dinâmica e única que é extremamente difícil delinear com precisão todas as alterações que causam, mantêm e propagam a doença. Apesar do enorme progresso na compreensão da biologia do câncer, incluindo a decodificação de várias redes regulamentares que regem crescimento e morte celular, a terapia-alvo do câncer ainda é a exceção. De fato, até a presente data existem muitos poucos exemplos de terapias que conduzem à cura; a toxicidade proveniente do tratamento é uma questão importante e o câncer continua a ser uma das maiores causas de morte em todo o mundo 87.
Historicamente, os tumores sólidos foram tratados por cirurgia durante os últimos 4000 anos 88. Foi apenas após a descoberta dos raios X, no final do século XIX, que a radioterapia emergiu como uma nova abordagem terapêutica. Apesar de que tumores localizados possam
ser tratados por terapia local, tumores extensos ou metastáticos e malignidades hematológicas exigiram o desenvolvimento de terapias anticâncer sistêmicas. Os esforços iniciais na descoberta de drogas anticâncer começaram em meados do século XX, com base na observação de que agentes citotóxicos podem ser usados para matar as células que exibem altas taxas de proliferação. Até a presente data, na maioria das doenças proliferativas, a cirurgia, radioterapia e quimioterapia sistêmica ainda compreendem o padrão de tratamento. Na verdade, estão continuamente sendo desenvolvidos novos compostos quimioterapêuticos (genotóxicos), apesar da indução de efeitos secundários graves que surgem dos danos causados ao tecido normal 87.
Embora, inicialmente, o desenvolvimento de terapias antitumorais tenha baseado-se em observações empíricas, o desafio atual é desenvolver paradigmas terapêuticos explorando o conhecimento proveniente de biologia molecular, celular e estudos de biologia de sistemas da formação e progressão tumoral. Apesar da natureza pleiotrópica de tumores, várias características são compartilhadas por quase todas as doenças malignas, sendo elas: a autossuficiência em sinais de crescimento, evasão de apoptose / imunovigilância, insensibilidade aos sinais inibidores de crescimento, potencial replicativo ilimitado, angiogênese sustentada e invasão de tecidos / metástases, bem como stress metabólico, mitótico, oxidativo e os danos no DNA 8,89. Consequentemente, tem sido desenvolvida e explorada uma multiplicidade de abordagens terapêuticas direcionadas para as vias/fatores chave que suportem ou sejam essenciais para o desenvolvimento de tumores. 87.
Esforços para elucidar a base molecular do câncer não são novos. Eles datam da caracterização de vírus oncogênicos em animais nos anos 1960 e 1970, a identificação dos primeiros oncogenes causadores de câncer e genes supressores de tumor nos anos 1970 e 1980, e a descoberta das formas em que os genes cancerosos subvertem as vias de transdução de sinal na década de 1990 90. O que tem sido radicalmente diferente nos últimos dez a quinze anos é
uma profunda mudança cultural, em que a descoberta de drogas tumorais abraçou a oncologia molecular como uma fonte de alvos causadores de doenças para a descoberta de fármacos direcionada a hipóteses, baseada em mecanismos 88,91,92.
A primeira geração de medicamentos eficazes contra o câncer foram os citotóxicos que ainda regem a base da maioria dos tratamentos 92. Muitos foram descobertos por rastreio de compostos que matam células tumorais. O conceito subjacente ao desenvolvimento destes agentes foi que as células tumorais replicam o seu DNA e dividem-se mais frequentemente do que as células saudáveis. Essa noção sustentou o desenvolvimento de antimetabólitos que inibem a síntese de DNA e inibidores de micro túbulos, como o Taxol (paclitaxel), que
bloqueiam a mecânica da divisão celular. Embora esta primeira era de desenvolvimento de drogas antitumorais não tenha explorado deliberadamente a base genética do câncer, muitos dos agentes foram, no entanto, "molecularmente direcionados". O termo "terapia molecular direcionada" e sinônimos, são agora utilizados para descrever agentes de moléculas pequenas que não são apenas concebidos racionalmente, mas também atuam sobre alvos oncogênicos causadores de doenças. O número crescente de agentes aprovados, juntamente com os anticorpos terapêuticos que agem em alvos semelhantes (Tabela 2), demonstra que estamos em uma segunda era dourada do desenvolvimento de medicamentos contra o câncer 88,92.
Esta transição da quimioterapia citotóxica para a descoberta e desenvolvimento de fármacos molecularmente direcionados para o câncer, resultou num número crescente de terapias bem-sucedidas que afetaram a vida de um grande número de pacientes com câncer. A exemplo, a bem estabelecida administração de anti-estrogênicos e anti-androgênicos para tratamento de câncer de mama e próstata, que são direcionados por seus respectivos hormônios (Huang et al., 1988). Estes sucessos foram seguidos por uma série de outros fármacos de pequenas moléculas que inibem alvos críticos do câncer, por exemplo, os inibidores de quinase do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) 93. Esses exemplos fornecem ampla evidência do sucesso do direcionamento aos alvos patogênicos nos quais as células cancerígenas são "viciadas" 94,95.
Tabela 2: Exemplos de moléculas terapêuticas que foram aprovadas no período de 2001 a 2006 pela FDA-US (Food and Drug Administration – United States). Adaptado de Collins & Workman, 2006.
Certamente não há escassez de potenciais alvos de drogas. Mais de 350 genes tumorais foram catalogados (www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/Census/) e novos continuam sendo encontrados, particularmente por métodos sistemáticos de alto rendimento, como pela ferramenta tecnológica de RNA de interferência de alto rendimento (RNAi) 96,97 A validação e
priorização dos melhores alvos é agora uma atividade crítica, podendo ser realizada através da utilização de uma combinação de conhecimento em genética humana e genômica, validação funcional, especialmente por superexpressão ou knockdown por RNAi, e por experimentação in vivo com modelos transgênicos ou modelo 98. Um conceito importante para a seleção de alvos é sua drogabilidade. Um alvo drogável é aquele acessível e que se liga com alta afinidade às moléculas de fármaco putativos, seja uma molécula pequena ou produtos biológicos maiores que, após ligação, induzam uma resposta biológica que pode ser medida tanto in vitro como in vivo. Assim, enquanto enzimas como quinases e pequenos domínios de interações proteína-proteína, a exemplo CD80/CD28 e HIF-1α/p300, são drogáveis, outros alvos em potencial não são, como a oncoproteína mutante RAS e o mutante tumor supressor p53 88.
Uma grande expectativa para a terapia tumoral molecularmente direcionada é seu destaque em relação a boa eficácia e baixa toxicidade, o que é comprovado pelo fármaco Gleevec 99 cujo alvo é a proteína tirosina quinase BCR-ABL. Uma teoria importante subjacente a esta seletividade é a da "dependência oncogênica" ou "vício" 95. Embora exija maiores validações experimentais, este conceito propõe que as células tumorais passem por seleção para se tornarem direcionadas, e também dependentes, de vias oncogênicas fundamentais. Esta identificação de características distintas das células cancerosas é um fator chave na seleção de alvos tumorais, e podem surgir por mutações ou rearranjos de genes, alterações epigenéticas herdadas ou legados de linhagens celulares. E, apesar de contribuírem para o desenvolvimento do câncer, essas características genéticas, epigenéticas ou metabólicas podem criar "dependências", ou seja, fraquezas que podem ser exploradas. Este conceito de dependência tumoral fornece uma ferramenta valiosa para explorar alvos de drogas oncológicas, selecionando um alvo individual para trabalhar ou construindo um portfólio de alvos para combater a doença de diferentes maneiras. 88.
Este reconhecimento do valor de direcionar os vícios específicos do oncogene e a necessidade de biomarcadores complementares para a seleção de pacientes está agora tendo um grande impacto na descoberta e no desenvolvimento de medicamentos contra o câncer. No entanto, apesar do considerável progresso feito com as novas terapias molecularmente direcionadas, para muitos pacientes as opções terapêuticas ainda são limitadas. Desta maneira, o processo de trazer um novo fármaco para os pacientes ainda é frustrantemente lento com altas
taxas de falha, um problema frequentemente chamado de "Vale da Morte" entre a pesquisa básica e a aprovação de novos medicamentos 94,100,101.
Esta evolução não é tão rápida como gostaríamos que fosse pois, apesar do bom progresso realizado na identificação e, em seguida, definição de drogabilidade de alvos genéticos patogênicos, o sequenciamento de um número cada vez maior de genomas tumorais revelou uma extraordinária complexidade, incluindo a presença de milhares de alterações genéticas e considerável heterogeneidade genética, não apenas entre tumores diferentes, mas também dentro de um câncer individual 102–104. Isso torna desafiador a identificação das principais mutações responsáveis e das terapias farmacológicas combinadas, um problema ainda mais exacerbado pela evolução clonal de tumores 105. As populações heterogêneas em tumores são propensas a presença de células-tronco resistentes a fármacos 106 e também uma gama de células hospedeiras envolvidas na progressão tumoral 104. Esta heterogeneidade contribui, incontestavelmente, para a resistência aos fármacos e a necessidade de combinações entre eles 94.
Além disso, uma vez identificado um potencial novo alvo terapêutico, podem haver obstáculos científicos e técnicos significativos à descoberta de um fármaco novo e eficaz. É importante notar que, cada vez mais se reconhece que a seleção e validação dos melhores alvos pode ser muito desafiador 98. Não só a ligação causal do alvo proposto à doença clínica deve estar firmemente estabelecida e uma clara hipótese clínica desenvolvida, mas as consequências quantitativas da modulação deste alvo devem ser mostradas como sendo suficientes para produzir um efeito biológico terapeuticamente significativo em modelos experimentais relevantes 94.
Ainda, uma outra preocupação para a descoberta da droga é a falha da drogabilidade do alvo. Muitos alvos com ligação promissora à doença, tais como proteínas RAS mutadas ou fatores de transcrição como o c-MYC ou o fator induzível por hipóxia (HIF), são atualmente considerados como tecnicamente não drogáveis - ou pelo menos extremamente desafiadores para serem alvo de químicos medicinais que utilizam pequenas moléculas 107. Mesmo no caso das proteínas mais drogáveis, levam-se vários anos para identificar um candidato a fármaco que satisfaça a exigência rigorosa para o desenvolvimento clínico 94,108.
Primordialmente, temos aprendido que as hipóteses de doença nem sempre se traduzem dos modelos celulares e in vivo para a clínica, como particularmente ilustrado pela multiplicidade de agentes, como inibidores de histona desacetilases e fármacos antimitóticos e antiangiogênicos que entraram em ensaios clínicos, mas até agora tem mostrado apenas eficácia limitada e/ou altas taxas de falha, muitas vezes em grandes ensaios clínicos randomizados de
Fase III 94,109. Outro problema frustrante é que, para fármacos que foram introduzidos com sucesso em ensaios clínicos e demonstraram eficácia terapêutica, surge frequentemente resistência, como protagonizado recentemente por crizotinib 110 e vemurafenib 111.
No entanto, há muitas razões para ser otimista em relação a descoberta e desenvolvimento de medicamentos contra o câncer, principalmente devido aos avanços científicos e tecnológicos recentes que nos ajudam a enfrentar os desafios que enfrentamos. Novos conceitos como o "vício não-oncogênico" 89 e a "letalidade sintética" 112 ampliaram o
escopo para além da exploração de vícios oncogênicos e ajudaram a guiar a identificação de novos alvos, seja através de pesquisas conduzidas por hipóteses ou de campanhas de triagem em larga escala 94.
Químicos medicinais, trabalhando em estreita parceria com seus colaboradores biólogos, tornaram-se muito eficientes na descoberta de candidatos clínicos eficazes e seguros que agem em novos alvos e estão empurrando o limite do que é considerado tecnicamente drogável (Figura 8). É cada vez mais comum ver o uso de modelos de camundongos geneticamente modificados (GEMMs) para testar um fármaco em condições que possam imitar de perto a situação clínica real 94,113.
Figura 8: “Do gene à droga”. O processo de desenvolvimento de novas terapias molecularmente direcionadas.
Química biológica e biologia estrutural utilizando pequenas moléculas geradas durante a descoberta de drogas não só aceleram a progressão ao longo do caminho para a clínica, mas também servem para unir as várias fases. Assim, as sondas de pequenas moléculas podem ser usadas para "olhar adiante" e antecipar os melhores modelos para orientar o desenvolvimento de fármacos, ao mesmo tempo permitindo que as hipóteses biológicas subjacentes da
Finalmente, não há dúvida de que estamos na era da medicina personalizada ou estratificada, a qual garante que o medicamento correto seja dado ao paciente certo no momento exato, garantindo assim uma rápida progressão através de ensaios clínicos e benefícios terapêuticos máximos para os pacientes 93,114. Todos estes avanços são ilustrados pela recente
aprovação do inibidor de BRAF vemurafenib, apenas 9 anos após as mutações de BRAF terem sido publicadas pela primeira vez 115. Assim, a posição atual é aquela em que nós temos visto
alguns sucessos extraordinários na nossa exploração do genoma do câncer e da biologia tumoral, ao mesmo tempo encontrando uma série de desafios frustrantes que, no entanto, representam oportunidades para descobrir e desenvolver novos fármacos 94.
Processo de descoberta e desenvolvimento de fármacos: do gene ao fármaco
Seleção e Validação do Alvo
Os fármacos falham na clínica por duas razões principais: a primeira é que eles não funcionam e o segunda é porque eles não são seguros. Como tal, um dos passos mais importantes no desenvolvimento de um novo fármaco é a identificação e a validação dos alvos. Um alvo é um termo amplo que pode ser aplicado a uma gama de entidades biológicas que podem incluir, por exemplo, proteínas, genes e RNA. Um bom alvo precisa ser eficaz, seguro, atender a necessidades clínicas e comerciais e, acima de tudo, ser drogável. Um alvo drogável é acessível às moléculas de fármaco putativos, seja uma molécula pequena ou produtos biológicos maiores que, após ligação, induzam uma resposta biológica que pode ser medida tanto in vitro como in vivo. Uma boa identificação e validação de alvos permite uma maior confiança na relação entre alvo e doença, e nos permite explorar se a modulação do alvo conduzirá a efeitos adversos baseados em mecanismos 116.
Selecionar um alvo para trabalhar é a decisão mais importante que um grupo de descoberta de medicamentos enfrenta 117. Isso ocorre porque, se o alvo errado for selecionado,
então os consideráveis recursos que são aplicados no processo de seleção do alvo - incluindo, potencialmente, os enormes custos de ensaios clínicos que não mostram atividade terapêutica - serão inteiramente desperdiçados. Além disso, há o custo de oportunidade associado quando não se trabalha com um alvo melhor 94.
A seleção de um novo alvo para a descoberta de medicamentos para câncer baseia-se cada vez mais na força da evidência de que ele representa uma dependência ou vulnerabilidade para um dado conjunto estratificado de pacientes com câncer, comumente definidos pelo seu status genético molecular 98. Tal evidência é importante não só para proporcionar confiança de
que um efeito antitumoral será alcançado se o alvo for modulado farmacologicamente, mas também para ajudar a garantir, tanto quanto possível, que a seletividade para células tumorais versus células saudáveis normais será alcançada pelo eventual fármaco que emerge dos projetos de descoberta de drogas 94.
Selecionar o alvo certo é quase inevitavelmente uma questão de equilibrar oportunidades com riscos. Oportunidade é geralmente refletida pela necessidade médica não satisfeita que um novo medicamento será direcionado. O risco pode ser amplamente avaliado em duas categorias: i) Risco biológico, isto é, um inibidor do alvo, se descoberto, mostra o efeito biológico e terapêutico desejado nos pacientes?; ii) Risco de viabilidade, ou seja, é possível que um inibidor que atua sobre o alvo e exibe propriedades semelhantes a fármacos possa realmente ser descoberto? Estes riscos individuais devem ser considerados coletivamente para avaliar o risco global associado a um novo objetivo e deve salientar-se que qualquer risco particular por si só raramente deve ser considerado um obstáculo 94.
Avaliação do risco biológico na validação de alvos
Os candidatos alvos vêm de uma variedade de fontes que são baseadas em esforços de rastreio biológico de alto rendimento e em pesquisas conduzidas por hipóteses. Embora estas abordagens nos forneçam uma gama de proteínas que mostram uma ligação com a biologia do tumor, estes alvos potenciais têm de ser considerados como candidatos que sempre terão de submeter-se a extensos experimentos secundários de validação que são projetados para fornecer confiança suficiente de que a modulação de um alvo particular levará ao efeito terapêutico desejado 94.
A avaliação da validade de um determinado alvo tumoral pode ser concentrada em duas questões-chave: i) Existe evidência suficiente de que o alvo é superativado ou parte de uma via superativada que impulsiona um conjunto definido de tumores e contribui para o crescimento do câncer? - ou que suporta o processo oncogênico ou representa uma vulnerabilidade que pode ser explorada através da letalidade sintética?; ii) Existe evidência de que a inibição do alvo leva ao efeito desejado em pacientes, por exemplo, regressão tumoral e aumento da sobrevida em doses bem toleradas? 94
Ao longo da última década, os alvos terapêuticos moleculares para o tratamento do câncer foram identificados como produtos gênicos individuais, seguindo uma avaliação rigorosa e centralizada na sua contribuição para a tumorigênese e o seu potencial para a descoberta de fármacos. Cada vez mais, estão sendo empregadas abordagens mais sistêmicas que envolvem o sequenciamento amplo e imparcial do genoma tumoral, objetivando
