Adriana Fernandes. resposta imunológica induzida pela infecção. camundongos. Universidade Federal de Minas Gerais. Instituto de Ciências Biológicas

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Texto

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Adriana Fernandes

Participação das citocinas IL

Participação das citocinas IL

Participação das citocinas IL

Participação das citocinas IL----4, IL

4, IL

4, IL

4, IL----13 e IL

13 e IL

13 e IL----33 na

13 e IL

33 na

33 na

33 na

resposta imunológica induzida pela infecção

resposta imunológica induzida pela infecção

resposta imunológica induzida pela infecção

resposta imunológica induzida pela infecção

experimental por

experimental por

experimental por

experimental por

Strongyloides

Strongyloides

Strongyloides

Strongyloides venezuelensis

venezuelensis

venezuelensis

venezuelensis

em

em

em

em

camundongos

camundongos

camundongos

camundongos

Universidade Federal de Minas Gerais Instituto de Ciências Biológicas

Programa de Pós-Graduação em Parasitologia Belo Horizonte, MG- Brasil

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2 Adriana Fernandes

Participação das citocinas IL-4, IL-13 e IL-33 na resposta

imunológica induzida pela infecção experimental por

Strongyloides venezuelensis em camundongos

Tese apresentada ao programa de Pós-Graduação em Parasitologia da Universidade Federal de Minas Gerais como requisito parcial para obtenção do grau de Doutora em Parasitologia.

Área de concentração: Imunoparasitologia Orientação: Dra. Deborah Negrão-Corrêa. Depto. de Parasitologia ICB/UFMG.

Belo Horizonte, MG - Brasil 2012

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3 LABORATÓRIOS ENVOLVIDOS LABORATÓRIOS ENVOLVIDOS LABORATÓRIOS ENVOLVIDOS LABORATÓRIOS ENVOLVIDOS

Imunologia de Helmintos - ICB/UFMG - Profa. Dra. Deborah Negrão-Corrêa;

Imunofarmacologia - ICB/UFMG - Prof. Dr. Mauro Martins Teixeira;

Mecanismos gerais de infecções fúngicas - ICB/UFMG - Prof. Dr. Ary Corrêa Júnior.

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4

Este trabalho é dedicado a minha mãe,

Rute Fernandes Silva, exemplo de

personalidade, caráter e vida.

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5 AGRADECIMENTOS

AGRADECIMENTOS AGRADECIMENTOS AGRADECIMENTOS

À Deus, por me guiar e estar ao meu lado sempre.

Aos meus pais Milton Pereira Silva e Rute Fernandes Silva, pelo exemplo, amor e suporte em todas as áreas da minha vida.

Ao William, pelo amor, carinho e apoio incondicional.

Ao Jú e a Bruna por todos os momentos felizes juntos e por estarem sempre presentes.

À Cláudia, pela amizade, carinho e apoio.

Ao meu namorado Celso Soares Santos, pelo incentivo, pelo apoio e por ter compreendido tão bem os momentos de ausência em função deste trabalho. À Profa. Dra. Deborah Negrão-Corrêa, pela orientação, ensinamentos e por ter tornado possível a realização deste trabalho.

Ao prof. Dr. Mauro Martins Teixeira pela colaboração.

À Sumara e à Sibele por todo apoio carinho e disponibilidade.

Às amigas Paula e Jaílza por estarem sempre presentes, pelos momentos alegres e por dividirem comigo as minhas histórias.

Aos colegas do laboratório, Michele, Emília, Cíntia e Vinícius pela convivência diária.

Ao José Carlos, por ter cuidado dos meus animais com imenso carinho e competência, este trabalho não teria sido o mesmo sem a sua colaboração.

À CAPES pela concessão da Bolsa.

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6

A satisfação está no esforço e não apenas na

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7 LISTA DE FIGURAS

LISTA DE FIGURAS LISTA DE FIGURAS LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Ciclo de vida de S. stercoralis ... 30 Figura 2 - Delineamento experimental da participação de IL-4 na carga parasitária e na resposta imune frente a infecção primária e secundária por S. venezuelensis em camundongos C57BL/6. ... 66 Figura 3 - Delineamento experimental da participação de IL-4 na carga parasitária, na indução de células TCD4+ e na produção de citocinas frente a infecção primária

e secundária por S. venezuelensis em camundongos BALB/c. ... 67 Figura 4 - Delineamento experimental da participação de IL-13 na carga parasitária e na resposta imunológica frente a infecção primária por S.

venezuelensis. ... 69

Figura 5 – Delineamento experimental da participação de IL-33 na carga parasitária e na resposta imunológica frente a infecção primária por S.

venezuelensis. ... 71

Figura 6- Número de larvas recuperadas do lobo esquerdo do pulmão de camundongos C57BL/6 não deficientes (WT) ou geneticamente deficientes na produção de IL-4 (IL-4-/-) após 2 dias da infecção por S. venezuelensis.. ... 84

Figura 7 - Avaliação cinética da carga parasitária no intestino de camundongos C57BL/6 não deficientes (WT) ou geneticamente deficientes na produção de IL-4 (IL-4-/-) infectados com 700 L3 de S. venezuelensis aos 7, 10, 14, 18 e 24 dias

após a infecção primária. ... 87 Figura 8 – Avaliação da eliminação de ovos no intestino de camundongos BALB/c não deficientes (WT) ou geneticamente deficientes na produção de IL-4 (IL-4-/-) infectados com 700 L3 de S. venezuelensis aos 7, 10, 14, 18 e 21 dias após a infecção primária.. ... 89 Figura 9 - Número de larvas recuperadas do lobo esquerdo do pulmão de camundongos C57BL/6 não deficientes (WT) ou geneticamente deficientes na produção de IL-4 (IL-4-/-) após 2 dias da re-infecção por S. venezuelensis. ... 91 Figura 10 – Avaliação da carga parasitária no intestino de camundongos C57BL/6 não deficientes (WT) ou geneticamente deficientes na produção de IL-4 (IL-4-/-) re-infectados com 700 L3 de S. venezuelensis aos 7 dias após a re-infecção.. ... 93 Figura 11 – Avaliação da carga parasitária no intestino de camundongos C57BL/6 não deficientes (WT) ou geneticamente deficientes da produção de IL-4 (IL-4-/-)

aos 14 dias após a infecção com 700 L3 de S. venezuelensis frente o tratamento com anti-IL-13. ... 95

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8 Figura 12 – Avaliação da carga parasitária no intestino de camundongos BALB/c não deficientes (WT) ou geneticamente deficientes na produção de IL-4 (IL-4-/-)

tratados ou não com IL-33 recombinante e infectados com 700 L3 de S.

venezuelensis aos 10 dias após a infecção.. ... 97

Figura 13 - Concentração de IgE total no soro de camundongos C57BL/6 deficientes ou não na produção de IL-4 aos 2, 7 e 14 dias após a infecção primária e secundária com 700 L3 de Strongyloides venezuelensis. ... 100 Figura 14 – Concentração de IgE sérica em camundongos C57BL/6 não deficientes (WT) ou geneticamente deficientes na produção de IL-4 (IL-4-/-)

submetidos ou não ao tratamento com anticorpo ainti IL-13 e infectados por 14 dias com 700 L3 de Strongyloides venezuelensis. ... 101 Figura 15 – Concentração de IgE sérica em camundongos BALB/c não deficientes (WT) ou geneticamente deficientes da produção de IL-4 (IL-4-/-) submetidos ou não

ao tratamento com IL-33 e infectados por 10 dias com 700 L3 de S.

venezuelensis.. ... 103

Figura 16 - Níveis de IgM no soro de camundongos C57BL/6 não deficientes (WT) e deficientes da produção de IL-4 (IL-4-/-) aos 2, 7 e 14 dias após a infecção primária e secundária com 700 L3 de Strongyloides venezuelensis. ... 105 Figura 17 - Níveis de IgM parasito-reativa no soro de camundongos C57BL/6 não deficientes (WT) e deficientes da produção de IL-4 (IL-4-/-) submetidos ou não ao tratamento com anticorpo anti-IL13 e infectados por 14 dias com 700 L3 de

Strongyloides venezuelensis.. ... 107

Figura 18 - Níveis de IgG1 parasito-reativa no soro de camundongos C57BL/6 deficientes (IL-4-/-) ou não de IL-4 (WT) aos 2 e 14 dias após a infecção primária e

secundária com 700 L3 de Strongyloides venezuelensis. ... 109 Figura 19 – Atividade de peroxidase de eosinófilo (EPO) no homogenato intestinal de camundongos C57BL/6 selvagens (WT) e deficientes na produção da citocina IL-4 (IL-4-/-) durante a infecção e re-infecção com 700 L3 de S. venezuelensis. . 112 Figura 20 - Atividade de peroxidase de eosinófilo (EPO) no homogenato intestinal de camundongos C57Bl/6 selvagens (WT) ou deficientes na produção da citocina IL-4 (IL-4-/-) e tratados ou não com anticorpo neutralizante anti-IL-13 aos 14 dias

após a infecção por S. venezuelensis. anti-IL13. ... 114 Figura 21 – Atividade de mieloperoxidase (MPO) no homogenato intestinal de camundongos C57BL/6 selvagens (WT) e deficientes na produção da citocina IL-4 (IL-4-/-) durante a infecção e re-infecção com 700 L3 de S. venezuelensis.. ... 116

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9 Figura 22 - Atividade de mieloperoxidase (MPO) no homogenato intestinal de camundongos C57BL/6 selvagens (WT) ou deficientes na produção da citocina IL-4 (IL-IL-4-/-), tratados ou não com anticorpo neutralizante anti-IL-13 aos 14 dias após

a infecção por S. venezuelensis. . ... 118 Figura 23 - Proporção de células CD4+ na suspensão celular derivada de linfonodo mesentérico ou lâmina própria intestinal de camundongos BALB/c geneticamente deficientes (IL-4-/-) ou não (WT) da produção da citocina IL-4 durante a infecção primária ou re-infecção por S. venezuelensis... 121 Figura 24 - Proporção de células CD4/CD25+ na suspensão celular derivada de

linfonodo mesentérico ou lâmina própria intestinal de camundongos BALB/c geneticamente deficientes ou não na produção da citocina IL-4 durante a infecção primária ou re-infecção por S. venezuelensis... 123 Figura 25 – Avaliação da produção de IL-10 e IFN-γ por células derivadas de linfonodo mesentérico ou lâmina própria intestinal de camundongos BALB/c geneticamente deficientes (IL-4-/-) ou não (WT) da produção da citocina IL-4

durante a infecção primária ou re-infecção por S. venezuelensis. ... 127 Figura 26 - Proporção de células CD25/foxp3+ na suspensão celular derivada de linfonodo mesentérico ou lâmina própria intestinal de camundongos BALB/c geneticamente deficientes (IL-4-/-) ou não (WT) da produção da citocina IL-4

durante a infecção primária ou re-infecção por S. venezuelensis. . ... 130 Figura 27 - Níveis de IL-10 e IFN-γγγγ no homogenato intestinal de camundongos C57BL/6 geneticamente deficientes na produção da citocina IL-4 (IL-4-/-) ou não (WT) durante a infecção primária e re-infecção com S. venezuelensis. ... 133 Figura 28 - Níveis de IL-5 e IFN-γγγγ no homogenato intestinal de camundongos BALB/c geneticamente deficientes (IL-4-/-) ou não (WT) da produção da citocina IL-4 durante a infecção primária e a re-infecção com S. venezuelensis. ... 135

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10 LISTA DE ABREVIATURAS

LISTA DE ABREVIATURASLISTA DE ABREVIATURAS LISTA DE ABREVIATURAS AAMs Macrófagos Alternativamente Ativados

ADCC Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpo

Ag Antígeno

ANOVA Análise de variância

APC Célula Apresentadora de Antígeno

ARG-1 Arginase 1

BAL Lavado Broncoalveolar

BSA Albumina de soro bovino

CAM-1 Molécula de adesão intercelular

CCR Receptor de quimiocina do tipo CC

CD Cluster de diferenciação

CEBIO Centro de Bioterismo

CETEA Comitê de Ética em Experimentação Animal

ConA Concavalina A

CXCR Receptor de quimiocina do tipo CXC

DCs Células dendríticas

DPI Dias pós-infecção

ELISA Ensaio imuno-sorvente por enzima ligada (“enzime linked immunobsorbent assay”)

EPM Erro padrão da média

EPO Peroxidase de Eosinófilos

FIZZ Proteína expressa em macrófagos alternativamente ativados

HTAB Hexadeciltrimetilamônio

HTLV-1 Vírus Linfotrópico para Células T Humanas tipo 1

ICB Instituto de Ciências Biológicas

IFN-γ Interferon gama

Ig Imunoglobulina

IL Interleucina

IL-4 R Receptor de Interleucina do tipo 4

iNOS Óxido nítrico sintetase

KO Knock-out

L3 Larvas filarióides de terceiro estágio infectantes

LPS Lipofosfossacarídeo de bactéria Gram negativa

MHC II Complexo de histocompatibilidade do tipo II

MO Microscópio ótico

MPO Mieloperoxidase de neutrófilos

NK Células Natural Killer

NO Óxido nítrico

OPD O-fenilenodiamina Dihidroclorido

OVA Ovoalbumina

PBMC Células mononucleares do sangue periférico (“Peripheral Blood Mononuclear Cells”)

PBS Salina tamponada (“phosphate buffered saline”)

RPMI Meio de cultura cuja fórmula foi criada no Roswell Park Memorial Institute, NY

SNC Sistema Nervoso Central

STAT 6 Sinal transdutor e ativador de transcrição 6

TGF-β Fator de Crescimento Transformador-β

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11 Th1 Células T CD4+ auxiliadoras do tipo 1

Th17 Células T CD4+ auxiliadoras do tipo 17

Th2 Células T CD4+ auxiliadoras do tipo 2

TNF-α Fator de necrose tumoral

Treg Células T CD4+ designadas Regulatórias

UFMG Universidade Federal de Minas Gerais

WT “ Wild Tipe” Selvagens

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SUMÁRIO

SUMÁRIO

SUMÁRIO

SUMÁRIO

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13 1. INTRODUÇÃO ... 19 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 25 2.1 Aspectos gerais ... 26 2.2 Desenvolvimento do parasito ... 29 2.3 Manifestações clínicas ... 32

2.4 Infecções por nematódeos e desenvolvimento de resposta imune ... 36

2.5 Participação das citocinas IL-33, IL-4 e IL-13 na resposta imune induzida por nematódeos. ... 48

3. JUSTIFICATIVA ... 57 4. OBJETIVOS ... 59 4.1 Objetivo geral ... 60 4.2 Objetivos específicos ... 60 5. METODOLOGIA ... 61 5.1 Animais ... 62 5.2 Parasito e infecção ... 62

5.3 Obtenção de antígeno solúvel de larva ... 63

5.4 Delineamento Experimental: ... 64

5.4.1 Participação de IL-4 na resposta protetora contra S. venezuelensis. ... 64

5.4.2 Participação de IL-13 no mecanismo de proteção promovido pela infecção por S. venezuelensis. .... 68

5.4.3 Participação de IL-33 no mecanismo de proteção promovido pela infecção por S. venezuelensis. .... 70

5.5 Avaliação parasitológica da infecção ... 72

5.6 Obtenção do homogenato tecidual intestinal ... 73

5.7 Avaliação indireta da infiltração de Eosinófilos e Neutrófilos no tecido ... 73

5.8 Avaliação da produção de citocinas no homogenato intestinal... 75

5.9 Avaliação da resposta humoral. ... 76

5.10 Obtenção de células de linfonodos mesentéricos e lâmina própria intestinal ... 78

5.11 Avaliação da marcação celular na lâmina própria e no linfonodo mesentérico... 79

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14

6. RESULTADOS ... 82

6.1 Avaliação parasitológica ... 83

6.1.1 Participação da citocina IL-4 na carga parasitária de camundongos infectados por Strongyloides venezuelensis ... 83

6.1.2 Avaliação da participação da citocina IL-4 na infecção secundária por S. venezuelensis ... 90

6.1.3 Avaliação do tratamento com anticorpo neutralizante anti-IL-13 durante a infecção por S. venezuelensis em camundongos selvagens ou deficientes da produção de IL-4 ... 94

6.1.4 Avaliação do tratamento com IL-33 exógena durante a infecção por S. venezuelensis em camundongos selvagens ou deficientes na produção de IL-4. ... 96

6.2 Avaliação da resposta imune ... 98

6.2.1 Efeito de IL-4, IL-13 e IL-33 na ativação da resposta humoral durante a infecção experimental por S. venezuelensis em camundongos. ... 98

- Produção de IgE ... 98

- Indução de IgM, IgG1 e IgG2a reativas à antígeno solúvel de L3 ... 104

6.2.2 Efeito de IL-4 e IL-13 na infiltração/ativação de eosinófilos e neutrófilos no intestino de camundongos infectados por S. venezuelensis ... 110

6.2.3 Efeito de IL-4 na ativação de células T CD4+ efetoras e reguladoras durante a infecção e re-infecção experimental por S. venezuelensis em camundongos. ... 119

6.2.4 Avaliação da produção de citocinas IL-10 e IFN-γ por células CD4+ frente a infecção experimental por S. venezuelensis ... 124

6.2.5 Avaliação da participação de células T regulatórias frente a infecção experimental por S. venezuelensis ... 128

6.2.6 Avaliação da produção de citocinas ... 131

7. DISCUSSÃO ... 136

8. CONCLUSÕES ... 149

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RESUMO

RESUMO

RESUMO

RESUMO

Embora seja conhecido o papel fundamental da resposta Th2 na proteção contra nematódeos, sabe-se que os mecanismos responsáveis pelo controle do parasito são diferentes para cada espécie. Em camundongos infectados por

Strongyloides venezuelensis foi demonstrado a importância da sinalização via

IL-4R/Stat 6 na indução de resposta protetora, entretanto a participação das citocinas IL-4, IL-13 e IL-33 neste mecanismo ainda não foi estabelecida, sendo foco principal deste trabalho. Para esta finalidade, foram utilizados camundongos deficientes da produção de IL-4 (IL-4-/-) infectados primariamente ou re-infectados

por S. venezuelensis. Após a infecção, camundongos IL-4-/- e selvagens foram tratados com anticorpo neutralizante de IL-13 ou com IL-33 exógena. Em comparação com os camundongos não deficientes, camundongos IL-4 -/-apresentaram aumento significativo de carga parasitária e atraso na eliminação do parasito sem alterações nos mecanismos de fecundidade. Em infecções primárias, a deficiência da produção de IL-4 acarretou em uma menor proporção de células CD4+ no linfonodo mesentérico e em diminuição de produção de IL-10, IL-5 e

IFN-γ na mucosa intestinal. Além disso, a ausência de IL-4 impediu a produção de IgE, e diminuiu os níveis de produção de EPO e MPO. Em animais re-infectados a deficiência da produção de IL-4 acarretou em aumento da proporção de células CD4+ no linfonodo mesentérico e também em maior detecção de IL-10 em células CD4+ e na mucosa intestinal. Junto a isso, a deficiência de produção de IL-4

acarretou na ausência de produção de IgE em menor produção de IgG1 e menor desgranulação de neutrófilos no intestino. A neutralização de IL-13 durante a

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16 infecção por S. venezuelensis não interferiu na carga parasitária mas diminuiu a fecundidade dos parasitos e acarretou em uma menor produção de IgM por camundongos IL-4-/-. e em um aumento de peroxidase de eosinófilos frente a infecção. A administração de IL-33 não interferiu na carga parasitária e na fecundidade de S. venezuelensis, entretanto aumentou a produção de IgE por camundongos IL-4-/- frente a infecção. Os resultados indicam que o controle da

infecção por S. venezuelensis é mediado por mecanismos dependente de IL-4 e não dependentes de IL-13 ou IL-33, sendo que IL-13 participa de mecanismos anti-fecundidade.

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ABSTRACT

ABSTRACT

ABSTRACT

ABSTRACT

Even though the importance of Th2 response in protection against nematodes is well established, the effector mechanism controlling the parasite can be different in each species. It was demonstrated in mice infected with

Strongyloides venezuelensis the importance of IL-4R/Stat 6 activation in the

induction of a protective response, however the involvement of 4, 13 and IL-33 in this mechanism has not yet been established, being the main focus of this work. For this purpose, we used mice deficient in the production of IL-4 (IL-4-/ -) primarily infected or re-infected with S. venezuelensis. After infection, IL-4-/ - and

wild type mice were treated with neutralizing antibody against IL-13 or exogenous IL-33. Comparing to wildtype mice, IL-4 deficient mice showed a significant increase in parasite burden and a delay in parasite elimination without changes in the fecundity. During primary infection, the IL-4 deficiency resulted in a smaller proportion of CD4+ cells in the mesenteric lymph nodes and decreased the production of IL-10, IL-5 and IFN-γ at the site of the lamina propria. Furthermore, the absence of IL-4 prevented IgE production, and reduced EPO and MPO levels in the host intestine. In re-infected animals, the deficiency of IL-4 resulted in an increase in the proportion of CD4+ cells in mesenteric lymph nodes and also in the intracellular detection of IL-10 in CD4+ cells in the intestinal mucosa. Along with this, the IL-4 deficiency resulted in ablation of IgE production, in a lower production of IgG1 and in a reduced degranulation of neutrophils in the intestine. The neutralization of IL-13 did not affect S. venezuelensis parasite burden but decreased the fecundity of the parasites and resulted in a lower production of

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18 parasite-specific IgM in IL-4-/- mice and an increase in eosinophil peroxidase during the infection. IL-33 administration did not affect the worm burden and fecundity but increased the IgE production by IL-4-/- mice. The results indicate that the control of

S. venezuelensis infection is dependent on mechanisms mediated by IL-4 and not

by IL-13 or IL-33. Moreover, the data suggests that IL-13 participates in anti-fecundity mechanisms during S. venezuelensis infection.

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1. INTRODUÇÃO

1. INTRODUÇÃO

1. INTRODUÇÃO

1. INTRODUÇÃO

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20 Infecções por nematódeos intestinais são altamente prevalentes na população humana e em animais, especialmente em criações intensivas. Na população humana, estudos estimam que aproximadamente um quarto da população mundial possa estar infectado por nematódeos parasitos intestinais, sendo que a maioria das pessoas infectadas vive em países em desenvolvimento localizados em regiões tropicais e subtropicais (Hotez et al. 2008, Stepek et al. 2006, Chan, 1997, Khan & Collins, 2004). A infecção crônica por estes nematódeos, especialmente em crianças expostas a altas cargas parasitárias, pode acarretar em diversos problemas de saúde, por diferentes mecanismos, que em muitos casos resultam em deficiência no desenvolvimento físico e cognitivo do indivíduo (Stephenson et al. 2000).

A infecção pelo nematódeo Strongyloides stercoralis afeta 30 a 100 milhões de pessoas em todo mundo, sendo mais prevalente em áreas onde as condições sanitárias são precárias e onde o clima é quente e úmido (Siddiqui & Berk 2003, Berthony et al. 2006). O hospedeiro se infecta através da penetração percutânea de larvas filarióides do parasito, entretanto, uma vez estabelecida a infecção por

S. stercoralis, parte das larvas pode evoluir até a forma infectante ocorrendo

auto-infecção do hospedeiro. Desta maneira, a auto-infecção por S. stercoralis pode resultar em infecções persistentes com uma larga variação de manifestações clínicas. O aumento da carga parasitária e a potencial ameaça de disseminação das larvas para todos os órgãos internos são frequentemente relatadas em indivíduos com função comprometida do sistema imune.

A resposta imune protetora contra infecção por nematódeos intestinais, tanto em infecções experimentais como em humanos, é dependente de células T,

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21 e predominantemente, caracterizada por resposta tipo 2, resultando em aumento e ativação de eosinófilos e mastócitos, aumento nos níveis de IgE e IgG4 (ou IgG1 em camundongos), aumento da produção de muco pelas células caliciformes localizadas no epitélio superficial da mucosa (revisto por Finkelman et al.1997, Patel et al. 2009). Mais recentemente também ficou estabelecido a importância da resposta imune do tipo 2 na indução de macrófagos alternativamente ativados, no aumento da renovação das células do epitélio intestinal e aumento da contratilidade muscular do órgão (Jenkins & Allen 2009). Estas alterações podem mediar a resistência de nematódeos intestinais.

Interleucina 33 (IL-33) é uma citocina produzida por células T CD4+, T CD8+, NK-T, basófilos, eosinófilos e mastócitos (Barner et al.1998, Emson et al.1998, Gessner at al. 2005, Anthony et al. 2007) e foi recentemente classificada como uma citocina quimioatratora e indutora de células Th2 (Komai-Koma et al. 2007) devido particularmente a propriedade de aumentar a produção de IL-4, IL-13 e IL-5. IL-33 tem sido relatada como um ligante importante entre a imunidade inata e adaptativa frente a infecção por diferentes nematódeos intestinais (Humphreys et al, 2008).

Interleucina - 4 (IL-4) é produzida por células T do tipo 2, basófilos, mastócitos e eosinófilos (Grünig et al. 1998, Wills-Karp et al. 1998) sendo o principal estímulo para o desenvolvimento de células Th2 a partir de células T CD4+ virgens. Os efeitos biológicos da produção de IL-4 são exercidos através de sua ligação aos seus receptores (IL-4R), expressos na superfície de várias células. Trabalhos realizados pelo nosso grupo de pesquisa, utilizando infecções experimentais por S. venezuelensis, demonstraram que a eliminação dos vermes

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22 adultos do intestino de camundongos é precedida por aumento de produção de citocinas do tipo 2 e que o processo de eliminação dos vermes é muito retardado em animais geneticamente deficientes em elementos da via de ativação IL-4R/Stat6 (Negrão-Corrêa et al. 2004, Negrão-Corrêa et al., 2006).

O receptor de IL-4 do tipo I é um heterodimero composto pela cadeia alfa do receptor de IL-4 (IL-4Rα), que é responsável pela ligação de IL-4, associada com uma segunda cadeia polipeptídica, a cadeia gama que é comum ao receptor de IL-2 (IL-2Rγ). O IL-4R tipo I é ativado apenas pela ligação por IL-4, sendo expresso principalmente em células hematopoiéticas e é componente essencial para a indução do fenótipo Th2. Entretanto, IL-4Rα pode se associar a cadeia α1 do receptor de IL-13 (IL-13Rα1), formando IL-4R tipo II, que é expresso primariamente em células não hematopoiéticas, sendo capaz de ligar-se tanto a IL-4 como IL-13 (Finkelman et al., 2004; Ramalingam et al., 2008; Anthony et al., 2008). As regiões carbóxi-terminais de IL-4Rα e de IL-13Rα1 iniciam a cascata de sinalização, no estado dimerizado ou isoladamente, via quinases de tirosina da família Janus (JAK), as quais promovem interações com o fator de transcrição STAT6, que, por sua vez, se liga às seqüências consenso nas regiões promotoras dos genes regulados pela IL-4 e/ou IL-13 (Nelms et al. 1999, Kelly-Welch et al. 2003, Thirumalai et al. 2008). Um segundo receptor para IL-13 foi identificado, sendo composto por IL-13Rα2, uma proteína que se liga com alta afinidade e exclusivamente a 13 (Mentink-Kane et al. 2004). Este segundo receptor de IL-13 existe na forma solúvel, identificável no soro e na urina, e também expresso em células como fibroblastos (Shirakawa et al. 2000). IL-13Rα2 é considerado um regulador negativo da atividade de 13 in vivo, pois a região citoplasmática de

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IL-23 13Rα2 não apresenta seqüência de sinalização intracelular, e a sua expressão é aumentada pela presença da própria IL-13 e também é dependente de IL-10 e STAT6 (Chiamaronte et al. 2003, Mentink-Kane et al. 2004).

Assim, considerando que IL-4 e IL-13 compartilham muitas propriedades biológicas, a existência de receptores específicos de cada citocina expressos em diferentes tipos celulares pode resultar na indução de propriedades especificas que podem estar diferentemente associadas à imunidade protetora e/ou imunopatologia promovida por diferentes espécies de nematódeos intestinais. Para exemplificar podemos citar que infecções experimentais utilizando-se camundongos geneticamente deficientes demonstraram que IL-4, mas não IL-13 foi requerido para eliminação de Heligmosomoides polygyrus (Lawrence et al. 1998), uma espécie de nematódeo que habita a mucosa do intestino delgado durante o seu desenvolvimento. Ao contrário, IL-13 e não IL-4 foi crucial para eliminação de Nippostrongylus brasiliensis (Urban et al. 1998), nematódeo com ciclo pulmonar que posteriormente se estabelece na luz do intestino delgado. Por outro lado, tanto IL-13 como IL-4 são necessários para eliminação de Trichuris

muris, que vivem na camada epitelial do ceco (Bancroft et al. 1998) e Trichinella spiralis, que habita o epitélio do intestino delgado (Finkelman et al. 2004).

Desta forma, é necessário entendermos os possíveis mecanismos imunológicos induzidos pela atividade de IL-4, IL-13 e IL-33 que possam ser responsáveis pela proteção do hospedeiro contra infecções por Strongyloides, levando-se em consideração que alguns mecanismos podem atuar de maneira protetora para algumas espécies e não para outras. Por isso, neste estudo, utilizamos camundongos geneticamente deficientes na produção da citocina IL-4,

(24)

24 bem como a neutralização de IL-13 e a administração de IL-33 exógena para investigar o papel destas citocinas no processo de eliminação deste parasito e de alterações patológicas induzidas pela infecção primária ou pela re-infecção por

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2. REVISÃO BIB

2. REVISÃO BIB

2. REVISÃO BIB

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

LIOGRÁFICA

LIOGRÁFICA

LIOGRÁFICA

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2.1 Aspectos gerais

Atualmente no mundo, mais de três bilhões de pessoas encontram-se infectadas com helmintos parasitos (Hotez et al. 2008). Apesar de infecções por estes parasitos geralmente não serem fatais, elas estão associadas a altas taxas de morbidade e a infecções crônicas, geralmente levando a anemia e desnutrição (WHO 1999). Países desenvolvidos têm conseguido controlar estas infecções através da implantação de programas eficientes de saúde pública e de um sistema efetivo de engenharia sanitária. Entretanto, doenças causadas por helmintos continuam sendo um grave problema de saúde pública em países em desenvolvimento principalmente em países tropicais e subtropicais (Ziegelbauer et al. 2012).

Os parasitos do gênero Strongyloides são nematódeos que pertencem ao Filo Nematoda, Classe Secernentea, Ordem Rhabditida e Família Strongyloididae (Adamsom 1987). Recentemente foi proposta uma reclassificação do filo Nematoda baseada no seqüenciamento de bases de DNA ribossomal onde Blaxter e colaboradores concluíram que a ordem Rhabidita, a qual Strongyloides está inserido, é parafilética e seus membros foram rearranjados em três subordens (Blaxter et al. 2008). Neste contexto, o gênero Strongyloides foi reclassificado como membro da na Classe Chromadorea, Ordem Rhabditida (= Secernenta), Sub-Ordem Tylenchina e Família Strongyloididae (Schmidt & Roberts 2009). A diferenciação morfológica das espécies de Strongyloides baseia-se, principalmente em caracteres da fêmea parasita, como tamanho do corpo, morfologia do ovário, formato da cauda e da abertura bucal. Yamagutti (1961)

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27 catalogou 43 espécies no gênero Strongyloides, sendo 34 descritas como parasitos do intestino delgado de mamíferos, 5 de aves, 4 de anfíbios e 2 de répteis. Atualmente, estão descritas 52 espécies deste gênero (Speare 1989), entretanto, devido a grande semelhança morfológica existente entre estas diferentes espécies, muitas vezes a descrição foi baseada na espécie do hospedeiro em que foram encontradas.

Dentre as espécies do gênero Strongyloides, S. stercoralis parasita o intestino delgado do homem, sendo o agente causador da estrongiloidose humana. A prevalência da estrongiloidose está associada a condições climáticas da região e ao nível sócio-econômico em que vive a população, estimando-se que 30 a 100 milhões de pessoas apresentam-se infectadas em 70 diferentes países do mundo, sendo que no Sudeste Asiático, África e América Latina estão localizadas as regiões com maiores índices de prevalência desta parasitose (Genta 1989, Siddiqui & Berk 2003).

No Brasil, a importância deste parasito como agente etiológico da estrongiloidose foi salientada primeiramente por Ribeiro da Luz em 1880, como uma doença de grande importância para saúde pública, com taxa de infecção atingindo 41,5% sendo encontrada em todos os estados brasileiros (Morais 1948). Levantamentos bibliográficos indicam que a prevalência da infecção por S.

stercoralis ainda encontra-se elevada na população brasileira, sendo verificado

que dos 1.133 indivíduos examinados na Amazônia, 221 estavam infectados (Egido et al. 2001). Em Porto Alegre, no hospital das clínicas, 8,3% dos pacientes internados estavam infectados com S. stercoralis (Teixeira 1997) e no Hospital de Uberlândia, Minas Gerais, entre 300 crianças de 1- 4 anos, a prevalência da

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28 infecção por S. stercoralis foi de 13% (Machado & Costa Cruz 1998). A estrongiloidose tornou-se um importante problema médico e social devido à facilidade de transmissão, a presença da auto-infecção, ao potencial de cronicidade e a possibilidade de re-agudização em indivíduos imunodeprimidos, podendo originar as formas graves de hiper-infecção e disseminação, onde a infecção evolui muitas vezes para óbito. (Siddiqui & Berk 2001).

Além da infecção humana, outras espécies do gênero Strongyloides são importantes parasitos de animais domésticos, sendo responsável por prejuízos na atividade pecuária; entre eles S. ransoni, parasito do intestino de suínos, S. westeri que parasita equídeos, S. avium parasito de aves e S. papillosus, parasito de ovinos e bovinos. Strongyloides fuelleborni é parasito habitual de macacos, entretanto, tem sido responsável pela infecção em humanos, em algumas regiões da África, como no Zimbaboe e nas Filipinas (Beaver et al. 1984, Speare 1989, Ashford & Barnish 1987).

Segundo Levine (1980), o departamento de agricultura dos Estados Unidos estimou que a estrongiloidose em suíno foi responsável por perda anual de 2.7 milhões de dólares no país. No Brasil, não existe um estudo do prejuízo provocado pela infecção promovida por espécie do gênero Strongyloides em rebanhos, entretanto, a infecção por S. papillosus, é responsável pelo curso branco (diarréia catarral) que pode resultar na morte de bezerros em fase de lactação (de 6-8 meses) por desidratação. Esta infecção atinge, principalmente, animais jovens de rebanhos estabulados, sendo que o animal adulto desenvolve imunidade protetora (Freitas, 1977). Strongyloides venezuelensis e S. ratti, são parasitos de roedores, utilizados como modelos experimentais em estudo de interação parasito–

(29)

29 hospedeiro (Negrão-Corrêa et al. 2003), ensaios terapêuticos (Satou et al. 2001) e como fonte de antígeno heterólogo para padronização de novas técnicas no imunodiagnóstico da estrongiloidose humana (Costa-Cruz et al. 1999).

2.2 Desenvolvimento do parasito

O ciclo de vida das espécies do gênero Strongyloides é caracterizado por uma alternância de gerações de vida livre e vida parasitária. Segundo Genta (1986), esta característica confere ao parasito uma relação bem sucedida com dois ecossistemas - o hospedeiro e o meio ambiente. As larvas de 3º estádio (L3) de S. stercoralis, denominadas larvas filarióides, penetram ativamente pela pele ou pela mucosa oral, esofágica ou gástrica do hospedeiro. Estas larvas secretam proteases, que auxiliam na penetração e na migração através dos tecidos podendo atingir a circulação sangüínea (McKerrow et al. 1990). Ao chegar aos capilares pulmonares, atingem o pico de concentração de larvas por volta do segundo dia após a infecção, posteriormente, as larvas do parasito atravessam o endotélio do capilar e a membrana alveolar, migram pela árvore brônquica e chegam à faringe, onde podem ser expelidas pela expectoração, ou deglutidas, atingindo o intestino delgado do hospedeiro. Após penetrarem na mucosa do intestino delgado do hospedeiro, as larvas de Strongyloides sofrem duas mudas para completar o seu desenvolvimento, e diferenciam-se em fêmeas (Werthein & Lengy 1965, Schad 1989). Estas fêmeas amadurecem sexualmente e produzem seus ovos por partenogênese mitótica (Triantaphyllou & Moncol 1977). O pico da infecção no intestino ocorre por volta dos sete dias após a infecção. Os ovos

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larvados são eliminados na luz intestinal e as larvas rabdito

eclodem, sendo a maioria destas larvas eliminadas nas fezes do hospedeiro infectado. O período pré

15 a 25 dias (Vadlamudi et al.

Figura 1 - Ciclo de vida de S. stercoralis

http://www.cdc.gov/parasites/strongyloides/biology.html

No caso da estrongiloidose humana, algumas larvas rabditóides de

stercoralis, ainda na luz intestinal de indivíduos infecta

larvas filarióides e penetram na mucosa intestinal (íleo ou cólon), re hospedeiro, processo conhecido por auto

consequências patológicas. No mecanismo de auto filarióides presentes na região perianal podem também re

larvados são eliminados na luz intestinal e as larvas rabditoides de 1º estádio (L1) eclodem, sendo a maioria destas larvas eliminadas nas fezes do hospedeiro infectado. O período pré - patente da infecção no homem é de aproximadamente

Vadlamudi et al. 2006).

S. stercoralis (Disponível em:

http://www.cdc.gov/parasites/strongyloides/biology.html) modificado por

No caso da estrongiloidose humana, algumas larvas rabditóides de , ainda na luz intestinal de indivíduos infectados, transformam larvas filarióides e penetram na mucosa intestinal (íleo ou cólon), re

hospedeiro, processo conhecido por auto-infecção interna, com graves ências patológicas. No mecanismo de auto-infecção externa, as larvas rióides presentes na região perianal podem também re-infectar o hospedeiro

30 ides de 1º estádio (L1) eclodem, sendo a maioria destas larvas eliminadas nas fezes do hospedeiro patente da infecção no homem é de aproximadamente

) modificado por Fernandes, A.

No caso da estrongiloidose humana, algumas larvas rabditóides de S. dos, transformam-se em larvas filarióides e penetram na mucosa intestinal (íleo ou cólon), re-infectando o cção interna, com graves infecção externa, as larvas infectar o hospedeiro

(31)

31 contribuindo para um agravamento do quadro clínico do paciente (Grove 1996, Vadlamudi et al. 2006).

A maioria das larvas rabditóides L1 eliminadas no meio externo, caso encontrem condições adequadas de temperatura e umidade, evoluem para larvas filarióides capazes de infectar o hospedeiro vertebrado. Este tipo de desenvolvimento é denominado ciclo direto ou homogônico. Entretanto, parte das larvas rabditóides eliminadas pelas fezes do hospedeiro podem evoluir, através de 4 mudas, para machos e fêmeas de vida livre, que se reproduzem originando uma ou mais gerações de vida livre (Schad 1989).

Os fatores que determinam este tipo de desenvolvimento, denominado de ciclo indireto ou heterogônico, não estão completamente esclarecidos. Alguns autores acreditam que a diferenciação é geneticamente determinada na formação do ovo. Inicialmente, Chang & Graham (1957) descreveram diferenças no número de cromossomos das formas de vida parasitária e de vida livre, sugerindo que as fêmeas parasitas seriam triplóides (3n) podendo produzir simultaneamente três tipos de ovos, triplóides (3n), diplóides (2n) e haplóides (n). As larvas rabditóides triplóides (3n) originariam em larvas filarióides triplóides infectantes completando o ciclo direto, enquanto que as diplóides se transformariam em fêmeas de vida livre e as haplóides em machos. Entretanto, alguns estudos não confirmam a diferença de ploidia e indicam que todas as formas evolutivas do ciclo de Strongyloides são diplóides (Harvey & Viney 2001). Estes autores confirmam que a determinação sexual é genética; sendo que as fêmeas, tanto de vida livre como parasitas, contém 6 cromossomos sendo 2 cromossomos sexuais (2n=6, XX) e machos somente 5 cromossomos, pois recebem apenas um cromossomo sexual X (2n=5,

(32)

32 XO). A diferenciação entre fêmeas parasitas e de vida livre aconteceria posteriormente devido à diferenciação na expressão gênica, que poderia ser influenciada pela resposta imune do hospedeiro, disponibilidade de nutrientes e temperatura ambiental entre outros fatores (Viney 1999, Harvey et al. 2000).

Para facilitar o esclarecimento de vários aspectos da interação parasito-hospedeiro as espécies que parasitam roedores, como S. venezuelensis, têm sido utilizadas devido à facilidade de manutenção e manipulação no laboratório. Entretanto, é importante ressaltar algumas diferenças entre o desenvolvimento desta espécie e o descrito para S. stercoralis: as larvas infectantes de S.

venezuelensis migram preferencialmente pela musculatura e tecidos subcutâneos

até atingir o pulmão (Takamure 1995, Negrão-Corrêa 1990), apenas ovos larvados do parasito são eliminados nas fezes, não sendo observado o fenômeno de auto infecção, e finalmente ratos e camundongos infectados com S. venezuelensis apresentam auto-cura por volta do 12º ao 14º dia após a infecção (Galliard 1938, Taira et al. 1995, Nakai & Amarante 2001; Marra et al. 2010) e ficam protegidos contra re-infecções por um curto período de tempo (Murrell,1980, Fernandes et al., 2008).

2.3 Manifestações clínicas

A interação entre S. stercoralis e o homem pode resultar na erradicação do parasito ou na evolução para uma infecção crônica e assintomática, que pode se prolongar por mais de 65 anos devido ao processo de auto-infecção (Grove 1996; Schad et al. 1989). Ocasionalmente, também pode ocorrer aumento de carga e disseminação do parasito, quadro geralmente associada a um estado de

(33)

33 imunossupressão do hospedeiro, podendo levá-lo a morte (Bradley et al. 1978; Genta 1986, Siddiqui & Berk 2003).

Nas populações em que a estrongiloidose é endêmica, observam-se pessoas não infectadas com altos níveis de anticorpos específicos contra S.

stercoralis, sugerindo que algumas pessoas que foram infectadas desenvolveram

uma resposta protetora capaz de controlar o parasito (Genta et al. 1986). Entre as pessoas com infecção ativa, a maioria apresenta-se assintomática ou com sintomatologia pouco específica, como dores abdominais, problemas digestivos, diarréias e má absorção alimentar. A sintomatologia pode ser intermitente ou intercalada com longos períodos assintomáticos.

Existem casos onde o paciente pode evoluir para a hiper-infecção ou para a forma disseminada da doença, onde o parasito pode ser documentado em vários órgãos como no fígado, pulmão, coração e sistema nervoso central (SNC). Complicações, como infecções bacterianas secundárias (principalmente por germes gram negativos), podem levar a um quadro de septicemia e meningite bacteriana, sendo relacionadas com altas taxas de mortalidade. Nestes casos, há disseminação sanguínea de bactérias intestinais que acompanham as larvas durante o processo de auto-infecção. Concomitantemente, lesões da mucosa e do cólon podem facilitar a penetração das bactérias (Carvalho 1988, Vadlamudi 2006).

As formas graves da estrongiloidose têm sido associadas com imunossupressão do hospedeiro, especialmente quando há comprometimento da imunidade mediada por células, como ocorre em linfomas, leucemias, carcinoma, síndromes nefróticas, glomerulonefrites crônicas e subnutrição. As formas graves

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34 de estrongiloidose também têm sido associadas ao uso continuado de drogas imunossupressoras (Grove, 1989). Os corticosteróides e seus metabólitos também exercem um efeito estimulante direto sob as larvas do parasito, acelerando sua evolução de rabditóide para filarióide favorecendo a auto-infecção, ou ainda esta droga pode ter efeito sobre a fêmea parasita, levando ao aumento da ovipostura (Nagalotimanth et al. 1974). Assim, associado ao efeito imunossupressor produzido pelo corticóide, um grande número de larvas re-infectam o hospedeiro e disseminam pelo organismo originando casos graves da parasitose, podendo causar hemorragias intestinais e pulmonares, septicemias e meningites (Genta et al. 1986). Blatt & Cantos (2003) demonstraram em seu estudo a elevada prevalência do parasitismo por S. stercoralis em pacientes HIV positivo. No entanto, poucos casos de estrongiloidose disseminada têm sido relatados em pacientes portadores da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida, apesar de mais raro do que inicialmente se esperava, a hiper-infecção com mau prognóstico tem sido relatada nestes pacientes (Blatt & Cantos, 2003; Silva 2005, Gasparini et al. 2004). Recentemente, têm sido demonstrada a associação da estrongiloidose com o vírus linfotrópico para células T humanas tipo 1 (HTLV-1), com apresentação de formas graves e recorrência após o tratamento. A associação entre HTLV-1 e estrongiloidose tem sido demonstrada em regiões onde ambas as infecções são endêmicas. Porto & colaboradores (2002) verificaram que a infecção humana pelo vírus HTLV-1 está relacionado com uma alta produção de IFN-γ e desvio da resposta imune para Th1. Nos pacientes co-infectados pelo vírus e por S. stercoralis, o aumento da resposta imune Th1, promovido pelo vírus HTLV-1,

(35)

35 resulta em uma redução significativa na produção de Interleucina-4 (4), 5, IL-13 e IgE, componentes participantes dos mecanismos de defesa contra S.

stercoralis, explicando assim, a maior ocorrência de formas graves da

estrongiloidose em pacientes infectados pelo HTLV-1. Trabalho recente sugere a participação de células T regulatórias na indução de maior suscetibilidade ao parasito em pacientes hiper-infectados por Strongyloides e co-infectados com HTLV-1, neste trabalho, os autores relataram um aumento de células T regulatórias associado a uma diminuição de eosinofilia e diminuição de produção de IL-5 (Montes et al. 2009).

Desta forma, é evidente que a evolução dos diferentes quadros clínicos observados na estrongiloidose está relacionada com a resposta do hospedeiro ao parasito, sendo essencial o conhecimento detalhado da interação do Strongyloides sp. - hospedeiro para se propor alternativas de diagnóstico e terapia mais eficiente para o controle desta parasitose.

(36)

36

2.4 Infecções por nematódeos e desenvolvimento de resposta

imune

Infecções por nematódeos e a consequente resposta imune estabelecida pelo hospedeiro são produtos de uma prolongada e dinâmica co-evolução, sendo selecionadas estratégias que levam a uma resposta imune modulada que permite a sobrevivência do parasito e uma menor lesão do hospedeiro. Independente da extensa complexidade antigênica dos nematódeos, na maioria dos casos, a resposta imune induzida por estes parasitos são predominantemente de perfil Th2, caracterizada pela produção de IL-4, IL-5, IL-9, IL-10, IL-13 (Urban et al. 1992, Finkelman et al. 1997). Outros estudos indicam que citocinas produzidas por células da resposta imune inata, como IL-21, IL-33 e IL-25, também contribuem para o estabelecimento da resposta do tipo 2 (revisto por Anthony et al. 2007). A produção das citocinas do perfil Th2 estimulam a diferenciação de células B em plasmócitos produtores de IgE e IgG4 e a diferenciação e ativação de eosinófilos, mastócitos e basófilos (Gause et al. 2003, Anthony et al, 2007, Finkelman et al. 1999, Finkelman et al. 2004, Urban et al. 1991, Urban et al. 1998, Zhao et al. 2003, Patel et al. 2009, Iriemenam et al. 2010). Outros estudos têm demonstrado também a participação de macrófagos alternativamente ativados em infecções helmínticas, sendo que ativação deste tipo celular é promovida por citocinas Th2, especialmente IL-4 e IL-13 (Gordon 2003). Finalmente, existem relatos da atuação direta de IL-4 e/ou IL-13 na mucosa intestinal, alterando a contração muscular (Zhao et al. 2003), a proliferação das células epiteliais intestinais (Cliffe et al. 2005) e a diferenciação de células caliciformes produtoras de RELM-β (Artis et al.

(37)

37 2004). Diferentes autores têm demonstrado uma associação entre a resposta de células Th2 e a proteção contra diversos nematódeos parasitos, em modelo experimental murino (revisto por Anthohy et al. 2007, Finkelman et al. 2004, Patel et al. 2009). No caso específico da infecção por espécies do gênero Strongyloides, a associação da resposta Th2 com proteção tem sido verificada tanto na infecção humana como em modelos experimentais. Na estrongiloidose humana, pacientes co-infectados por HTLV-1, vírus que promove uma alta produção de IFN-γ e desvio da resposta imune para o tipo Th1, apresentam aumento da carga parasitária e disseminação do nematódeo que coincide com a redução na produção de IL-4, IL-5, IL-13 e IgE, componentes participantes do mecanismo de defesa contra S. stercoralis (Porto et al. 2002, Porto et al. 2001). A participação da resposta imune do tipo 2 no mecanismo de controle da infecção por nematódeos do gênero Strongyloides foi confirmada por estudos de infecção experimental utilizando S. venezuelensis em camundongos geneticamente deficientes no receptor de IL-4 e no fator de transcrição induzido por esta via (IL-4Rα-/- ou STAT6-/-), sendo que, nestes camundongos, observou-se um retardo no período

de eliminação dos vermes quando comparado ao período de eliminação da infecção em camundongos selvagens (Negrão-Corrêa et al. 2006, Sasaki et al. 2005).

Apesar da associação da resposta do tipo-2 com o controle da infecção por nematódeos, os possíveis mecanismos de ação ainda não estão completamente esclarecidos. O aumento de citocinas do tipo2 frente à infecção por nematódeos estimula a produção de algumas classes e subclasses de anticorpos, como IgG1 e IgE. A imunoglobulina E (IgE) tem um papel central em respostas alérgicas e

(38)

38 também participa da resposta imune contra nematódeos devido a sua capacidade de se ligar especificamente a receptores IgE de alta afinidade em mastócitos ou basófilos pela cadeia alfa do receptor FC épsilon tipo I (Fcε R-I) (Turner & Kinet 1999). A partir da ligação do antígeno ao IgE ligado a estas células, segue-se a desgranulação e conseqüente liberação de mediadores solúveis como histamina, heparina, citocinas e proteases. Por outro lado, IgE também pode se ligar ao receptor FcεR-I presente em eosinófilos de alguns mamíferos, como o caso do homem, levando a uma reação de citotoxicidade celular dependente de anticorpos, envolvida também na eliminação de helmintos (Gounni et al. 1994). Além de sua capacidade de ativar mastócitos, basófilos e eosinófilos, IgE pode se ligar ao receptor IgE de baixa afinidade (CD23, ou Fc-ɛ RII) nas células B para ampliar as respostas imunes celulares e humorais (Delespesse et al. 1992). Embora seja conhecido que IgE tem sido fortemente associada a infecções por helmintos e doenças alérgicas, o papel da IgE na imunidade protetora contra infecção por helmintos tem sido difícil de estabelecer. Durante uma infecção helmíntica os níveis séricos de IgE podem aumentar até 100 vezes (Jarrett & Bazin 1974), o que é proporcionalmente maior do que a resposta de qualquer outro isotipo de imunoglobulinas. No entanto, a concentração absoluta de IgE no soro é ainda muito baixa quando comparada com subclasses de IgG. Embora os níveis de IgE se mostrem elevadas durante a infecção, apenas uma pequena porção de IgE presente no soro é parasito específica (Turner et al. 1979). Para hipersensibilidade tipo I e ADCC, dois mecanismos que têm sido relacionados à proteção contra helmintos, um excesso de IgE não-específica poderia bloquear o desenvolvimento do mecanismo de proteção pelo hospedeiro, saturando os

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39 receptores de IgE em células efetoras com imunoglobulina não específica e impedindo a ativação dos mecanismos efetores (Pritchard 1993). Entretanto, evidências experimentais não confirmam a possibilidade de bloqueio de mecanismos efetores e vários estudos demonstram a participação de anticorpo, principalmente do isotipo IgE na eliminação de diferentes nematódeos como T.

spiralis e S. venezuelensis (revisado por Bell 1996 e Negrão-Correa 2001) .

Alguns estudos revelam que a produção de IgE específica contra antígenos do parasito ocorre principalmente no local da infecção, como mucosa intestinal e pulmonar ou órgãos linfáticos associados, podendo afetar o controle de nematódeos parasitos como T. spiralis, Heligmosomoides polygyrus e S.

venezuelensis (Negrão-Corrêa et al. 1996, Negrão-Corrêa et al. 1999, Silveira et

al. 2002). É interessante salientar que em camundongos deficientes da produção de eosinófilos (∆dblGATA) e infectados por S. venezuelensis foi verificado a uma maior concentração de IgE total, sugerindo a importância deste tipo celular no seqüestro desta imunoglobulina (Eschenazi 2008).

Além da participação de IgE, outros isotipos de imunoglobulinas estimuladas na presença da resposta imune do tipo 2 também podem participar da resposta protetora contra a infecção por nematódeos. Dixon et al. (2010) demonstraram altos níveis de IgG1 no soro e também de IgG1 ligada a células do cólon de camundongos protegidos pela vacinação com antígeno secretado-excretado de T. muris associado a adjuvante incompleto de Freund. Os autores sugeriram nesse caso, que os anticorpos poderiam estar envolvidos na expulsão dos vermes induzida pela vacinação. No caso do S. venezuelensis, Fernandes et al. (2008) também demonstraram altos níveis de IgG1 produzidos frente a

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40 imunização prévia com larvas L3 do parasito. A produção de imunoglobulina M (IgM) parasito-específica também tem sido associada com o controle precoce de larvas de S. stercoralis principalmente através da ativação do complemento (Brigandi et al. 1996). Corroborando com esta hipótese Ligas et al. (2003) transferiram soro completo e IgM purificados de camundongos previamente imunizados contra S. stercoralis para camundongos virgens antes da infecção experimental. Os autores relataram que a transferência passiva destes anticorpos levou a uma redução de 80% do número de larvas vivas recuperadas nesses camundongos. A infecção experimental com S. stercoralis em camundongos deficientes na produção de células B sugere que linfócitos B têm papel no controle da re-infecção, mas não durante a infecção primária (Herbert et al. 2002).

Além da resposta humoral, existem evidências experimentais associando mastocitose intestinal e aumento de células caliciformes com a eliminação de algumas espécies de nematódeos, tais como H. polygyrus (Hashimoto et al. 2009) e T. spiralis (Knight et al. 2008). Na infecção Strongyloides Sp., a participação de mastócitos no processo de eliminação dos vermes foi inicialmente demonstrada em camundongos W/WV, uma linhagem de camundongos que apresenta uma mutação no gene c-kit responsável pela deficiência na diferenciação de mastócitos. A infecção experimental por S. ratti (Nawa et al. 1985; Abe & Nawa 1987) ou S. venezuelensis (Khan et al. 1993) em camundongos W/WV resultou em

retardo na eliminação dos vermes comparado ao observado em camundongos não deficientes. Além disto, em camundongos atímicos a resposta protetora contra

S. ratti foi restaurada após tratamento prolongado com IL-3, tratamento este capaz

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41 importância da mastocitose intestinal no processo de eliminação de S.

venezuelensis foi novamente confirmada em infecções experimentais com o

nematódeo em camundongos geneticamente deficientes em IL-3 (Lantz et al. 1998) e em camundongos deficientes na produção da subunidade p85alfa do complexo phosphatidylinositol-3 quinase (PI3K), que resulta em ausência de mastócitos no intestino e no peritôneo, tornando os animais altamente susceptíveis a infecção por S. venezuelensis (Fukao 2002).

A desgranulação de mastócitos, através da ligação do antígeno à IgE ligadas ao receptor de alta afinidade expresso na membrana celular, promove a liberação de enzimas proteolícas, citocinas e mediadores inflamatórios, que além de atuar diretamente sobre o verme, induz modificações fisiológicas, tais como aumento de permeabilidade e de motilidade da mucosa intestinal, e infiltração de células que podem atuar na eliminação deste parasito. Outra hipótese pela qual a mastocitose intestinal atuaria na eliminação dos vermes do intestino, experimentalmente verificada em infecções experimentais com S. venezuelensis, sugere que proteoglicanas fortemente sulfatadas presentes em grânulos de mastócitos e secretadas no intestino dificultariam a fixação dos vermes no epitélio da mucosa intestinal e, consequentemente facilitariam a eliminação dos mesmos (Maruyama et al. 2000). Mecanismo semelhante também pode ocorrer com a secreção de mucinas sulfatadas produzidas por células caliciformes durante a infecção (Ishikawa et al. 1995, Maruyama et al. 2002).

A resposta imune do tipo-2 também acarreta na diferenciação e ativação de eosinófilos. A elevação destas células está frequentemente associada com aumento da produção de quimiocinas, como eotaxina (CCL11) e citocinas, como

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42 IL-5. Uma vez ativadas estas células produzem e estocam proteínas citotóxicas em grânulos citoplasmáticos, como proteína básica principal (MBP), proteína catiônica eosinofílica (ECP), peroxidase eosinofílica (EPO), neurotoxina derivada do eosinófilo (EDN), além de mediadores lipídicos, como PAF e LTB4, e esteróides, como estrógenos e glicocorticóides (Cara et al. 2000). A desgranulação do eosinófilo é induzida por complemento e/ou, em uma fase mais tardia da infecção ou na re-infecção, mediada por anticorpos específicos, processo denominado de citotoxidase mediada por anticorpos (ADCC). Eosinófilos ativados também podem realizar desgranulação gradativa mediada pelo reconhecimento do complexo antígeno-anticorpo e por várias citocinas incluindo IL-3, IL-5, fator estimulador da colônia de macrófagos (GM-CSF) (Carlson et al. 1993). A ativação por citocinas, imunoglobulinas e complemento leva estas células a secretarem uma variedade de citocinas como IL-2, IL-4, IL-6 e IL-10. Tais moléculas regulam a permeabilidade vascular, modulam o tráfego celular, a secreção de muco e a contração do músculo liso (Anthony et al. 2007, Rothenberg & Hogan 2006). Em infecções por S. stercoralis, os eosinófilos podem ainda iniciar a resposta imunológica específica agindo como células apresentadoras de antígenos (Padigel et al. 2006).

A eosinofilia sanguínea e aumento no número de eosinófilos na mucosa gastrointestinal (Rothwell 1989) são alterações características de infecções por nematódeos, entretanto, seu envolvimento na imunidade protetora permanece controverso. Estudos realizados in vitro indicam que os eosinófilos e anticorpos específicos podem destruir larvas de uma variedade de helmintos parasitos (Butterworth et al. 1975, Kazura & Grove 1978, Butterworth 1984, Gransmuller et

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43 al. 1987). Em estudos in vivo, onde a eosinofilia induzida pela infecção por helmintos foi reduzida ou eliminada através do tratamento com anticorpos neutralizantes anti-IL-5 ou anti-IL-5R, ou ainda através da manipulação genética de IL-5 ou IL-5Rα, o papel dos eosinófilos como células efetoras da imunidade protetora foi bastante conflitante. Desta forma, a redução significativa da eosinofilia não alterou a carga parasitária e/ou cinética da infecção promovida por

T. spiralis (Herndon & kayes 1992, Hokibara et al. 1997) e Nippostrongylus brasiliensis (Coffman et al. 1989). Por outro lado, eosinófilos produzindo IL-4 foram

ativamente recrutados para o local de migração da larva no pulmão (Voehringer et al. 2004) durante a infecção por N. brasiliensis.

A infecção experimental por S. stercoralis em camundongos tem demonstrado que a destruição de larvas do parasito é dependente da produção de IL-5 e consequentemente de eosinofilia (Rotman et al. 1996). Outros trabalhos confirmam a participação do eosinófilo como a principal célula efetora responsável pela morte de larvas de S. stercoralis do pulmão de camundongos (Herbert et al. 2000). A possível participação de eosinófilos no mecanismo de controle de

Strongyloides também foi sugerida em ratos ou em camundongos previamente

expostos ao S. ratti e ao S. venezuelensis que apresentaram eosinofilia precoce e redução da carga parasitária de vermes adultos, redução de ovos eliminados nas fezes e diminuição do tempo necessário para a eliminação do parasito (Dawkins et al. 1980; Sato & Toma 1990; Fernandes et al. 2008).

Apesar da ampla utilização de camundongos geneticamente deficientes na produção de IL-5 ou protocolos de neutralização desta citocina em modelos experimentais, a associação ou não de eosinófilos com proteção ou patologia

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44 nestes modelos é definitiva, pois a manipulação desta citocina pode interferir em outros elementos da resposta imunológica além da diferenciação de eosinófilos propriamente dita. Por exemplo, camundongos geneticamente deficientes na produção de IL-5 apresentam menos linfócitos B1 (CD5+) na cavidade peritoneal e na mucosa intestinal (Kopf et al. 1996). Outra consideração importante é que na ausência de IL-5, apesar da significativa redução na diferenciação de eosinófilos, outras citocinas e quimiocinas, como GM-CSF, IL-3 e eotaxina, podem atuar na diferenciação e migração destas células. Além disso, ha uma pequena população de eosinófilos que se desenvolvem e funcionam na ausência de receptores funcionais para IL-5, GM-CSF e IL-3 (Nishinakamura et al.1996). Devido a estes questionamentos, Yu et al. (2002) desenvolveram a linhagem de camundongos BALB/c com deficiência completa e seletiva na diferenciação de eosinófilos, denominados ∆dblGATA. O fator de transcrição GATA-1 expresso em quatro linhagens hematopoiéticas (eritrócitos, megacariócitos, mastócitos e eosinófilos) reprograma células mielóides para 3 diferentes linhagens: eritrócitos, megacariócitos e eosinófilos. A atividade especifica de GATA-1 para eosinófilos parece ser mediada por um sitio duplo de alta afinidade, sendo que a deleção deste sítio de ligação no promotor GATA-1 leva a perda seletiva de eosinófilos in

vivo (Du et al. 2002). Trabalhos preliminares do nosso grupo de pesquisa

utilizando esses camundongos ∆dblGATA demonstram que os camundongos seletivamente deficientes na maturação de eosinófilos apresentam carga parasitária elevada e atraso na expulsão de S. venezuelensis quando comparados com os controles selvagens, o que sugere que o eosinófilo é uma importante

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45 célula na resposta inata ao S. venezuelensis (Pereira 2008). Ainda no nosso grupo de pesquisa, utilizando-se camundongos ∆dblGATA, foi demonstrado que no caso de re-infecções por S. venezuelensis, os eosinófilos não possuem papel essencial no estabelecimento de uma resposta imunológica protetora do tipo Th-2 (Eschenazi 2008).

Atualmente ficou estabelecida a importância da resposta imune do tipo 2 na indução de macrófagos alternativamente ativados - AAMs (Jenkins et al. 2010; Herbert et al. 2009; Smith et al. 2007; Siracusa et al. 2008). Até recentemente, macrófagos estavam associados quase que exclusivamente a resposta imune do tipo-1 promovida principalmente por parasitos intra-celulares, tendo papel secundário em comparação ao papel de eosinófilos, basófilos e mastócitos durante a infecção por nematódeos. No entanto, estudos têm demonstrado que na presença de IL-4 e IL-13 os macrófagos são ativados de maneira alternativa em comparação à ativação de macrófagos mediada por IFN-γ em um ambiente de citocinas Th1. Originalmente descritos como macrófagos alternativamente ativados por IL-4/IL-13 como oposição a clássica combinação de IFN-γ e LPS, os AAMs são também referidos como células M2 (Martinez, et al. 2008). Podem ser distinguidos pela alta expressão de ARG1, Ym-1, RELM-α ou (Fizz1), IL-4 receptor α (IL-4R α), receptor de manose (CD206) e pela ausência da expressão de óxido nítrico sintase indutível (iNOS) (Anthony et al. 2007). Os macrófagos M1 e M2 também apresentam diferenças funcionais e efetoras, sendo que nos macrófagos M1 a presença de IFN-γ induz a expressão da enzima iNOS que metaboliza arginina resultando na produção de NO e citrulina. Entretanto, a estimulação de

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46 macrófagos na presença de IL-4 leva a expressão de arginase 1, que metaboliza arginina formando prolina que é utilizada para produção de colágeno (Bogdan 1991; Mosser 2003; Bronte et al. 2003).

Como a ativação de AAMs é dependente da estimulação da via IL-4Rα-STAT6 e como a produção de IL-4 e IL-13 são induzidas durante a infecção por nematódeos intestinais, trabalhos vêm sendo realizados para se investigar o papel de AAMs na proteção ou na patologia promovida pela infecção por diferentes nematódeos. Zhao et al. (2008), investigaram o papel de macrófagos no mecanismo de controle da infecção por N. brasiliensis em camundongos. Os autores verificaram que a infecção pelo nematódeo acarreta em aumento de AAMs, e a depleção destas células, através do tratamento de camundongos com lipossomas contendo clodronato, resulta em bloqueio da hiper-contratilidade do músculo liso intestinal com consequente prejuízo da eliminação do parasito. Outros autores, como Anthony et al. (2006), também demonstraram que a indução da produção de IL-4 pela infecção experimental por H. polygyrus resultou em diferenciação localizada de AAMs, que prejudicaram a sobrevivência das larvas do parasito através de uma via dependente de arginase. Macrófagos alternativamente ativados também produzem uma família de proteínas rica em cisteína denominada de RELM (resistin-like molecules) ou FIZZ (Found in Inflammatory Zone). Entre elas RELM-α/Fizz-1 e RELM-β/FIZZ2 tem sido melhor estudada, sendo evidenciado que estas proteínas potencializam a resposta Th-2 e podem participar de mecanismos protetores induzidos durante a infecção por T. spiralis, N.

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Referências

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