THEREZITA MARIA PEIXOTO PATURY GALVÃO CASTRO A FREQÜÊNCIA DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV) NA MUCOSA ORAL DE MULHERES PORTADORAS DE HPV GENITAL

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Texto

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THEREZITA MARIA PEIXOTO PATURY GALVÃO CASTRO

A FREQÜÊNCIA DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV) NA

MUCOSA ORAL DE MULHERES PORTADORAS DE HPV GENITAL

CONFIRMADO PELA PCR

Tese apresentada ao curso de Pós- Graduação da Faculdade de Ciência Médicas da Santa Casa de São Paulo para obtenção do título de Doutora em Medicina.

Área de concentração: Otorrinolaringologia Orientador: Prof. Dr. Ivo Bussoloti Filho

SÃO PAULO 2007

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Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

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Dedico este trabalho

Aos meus pais, ALOYSIO E MARIA AMÉLIA, Por me proporcionarem a formação intelectual, moral e ética; pelo incentivo constante para atingir este objetivo tão sonhado, que agora se concretiza. .

Ao meu esposo e filha, LUIZ GONZAGA E MARIA THEREZA, por estarem presentes em todos os momentos da minha luta na vida acadêmica-profissional, pela compreensão e paciência, para tornar possível a realização deste objetivo.

Aos meus irmãos, ALOYSIO JOSÉ, MARIA AMÉLIA E ALOYSIO FILIPE. Pela cooperação na realização desta pesquisa

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O homem erudito é um descobridor de fatos que já existem, mas o homem sábio é um criador de valores que não existem, e que ele faz existir. Albert Einstein

Nada pode impedi-lo quando você estabelece um objetivo. Ninguém pode impedi-lo, a não ser você mesmo. Eu acredito nisso. Sidney Sheldon

Valeu a pena? Tudo vale a pena, se a alma não é pequena. Fernando Pessoa

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AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Dr. Ivo Bussoloti Filho, meu orientador, Prof. Adjunto do Departamento de Otorrinolaringologia da Faculdade de Ciências Médicas da santa Casa de São Paulo, pelo incentivo e orientação na realização desta tese; minha admiração e respeito como profissional e como ser humano.

Ao meu pai, Aloysio Américo Galvão, Prof. Titular do Departamento de Letras Clássicas e Vernáculas da UFAL, Juiz de Direito e, atualmente, Vice –Presidente da Academia Alagoana de Letras, minha admiração e gratidão pelo incentivo e apoio na correção da tese.

Aos colegas do Laboratório de Biologia Molecular da Universidade Federal de Alagoas, o prof. Dr. Cícero Eduardo Ramalho Neto, coordenador deste laboratório e o pós-graduando Velber Nascimento Xavier, pela colaboração na realização dos resultados da PCR deste trabalho.

Às colegas do setor de Ginecologia do Posto Ambulatorial Médico Salgadinho (PAM- Salgadinho) – SUS – Maceió (AL), Dra. Zeneide W. de Melo Bertoldo e Dra. Vânia Morais da Silva, pelo incentivo e intensa ajuda na realização deste trabalho.

À Profa. Luiza Daura Fragoso de Barros, chefe do Departamento de Ginecologia da Universidade Federal de Alagoas, minha gratidão pela amizade e ajuda na elaboração deste trabalho.

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À Profa. Dra. Marta M. V. de Araujo do Departamento de Ginecologia da UFAL, pelo apoio a esta tese.

Ao Márcio José de Moraes Lopes, professor de computação, pelo auxílio recebido na elaboração dos gráficos e análise estatística empregada neste trabalho.

À colega Sandra Doria Xavier , Mestra em Otorrinolaringologia pela Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo, pela sua ajuda na realização deste trabalho

Aos colegas Profa. Dra. Ana Cristina K. Camargo, Prof. Dr. Arthur Guilherme L. de B. Sousa Augusto, Profa. Dra. Bianca Maria Liquidato e Profa. Dra. Heloisa Juliana Z. R. Costa, pela importante colaboração através das críticas em minha aula de qualificação.

À Sônia Alves, secretária da pós-graduação, que sempre me auxiliou com grande eficiência e simpatia.

A todos que, por meio de participação direta ou indireta, constante ou esporádica, contribuíram para a realização deste trabalho.

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ABREVIATURAS

CCE Carcinoma de células escamosas CH Captura híbrida

DB Dot blot

DST Doenças sexualmente transmissíveis DNA Ácido desoxirribonucléico

GP5+/GP6+ Primers consensus ou gerais HPV Papilomavírus humano

HIS Hibridização in situ

MY09/MY11 Primers consensus ou gerais PAM Posto de Assistência Médica PCR Reação de polimerase em cadeia

pRB Gene supressor do tumor ( gene do retinoblastoma ) p53 Gene supressor do tumor

RNA Ácido ribonucléico SB Hibridização Southen blot SUS Sistema Único de Saúde

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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO...1

1.1. Considerações gerais sobre o papilomavírus humano ...1

1.2. Patogênese da infecção pelo HPV...2

1.3. Métodos de diagnóstico do HPV...3

1.3.1. Exame clínico, colposcópico, citológico e biópsia...3

1.3.2. Métodos de biologia molecular...5

1.4. O HPV na região genital...7 1.5. O HPV na cavidade oral...8 1.6. Revisão da literatura...12 2. OBJETIVO...18 3. CASUÍSTICA E MÉTODO...19 3.1. Casuística...19 3.1.1. Critérios de inclusão...19 3.1.2. Critérios de exclusão... 19 3.2. Aspectos éticos...19 3.3. Método...20 3.3.1 Coleta de material...20 3.3.2. Estudo por PCR...22 3.3.3. Questionário...22 3.3.4. Levantamento bibliográfico...23 3.3.5. Estatística... 23 4. RESULTADOS...24 5. DISCUSSÃO... 38 6. CONCLUSÃO...44 7. ANEXOS... .45 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...51 FONTES CONSULTADAS...56 RESUMO...57 ABSTRACT...58 APÊNDICE...59

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INTRODUÇÃO

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1. INTRODUÇÃO

1.1. Considerações gerais sobre o papilmavírus humano

O papilomavírus humano pertence a um grupo de vírus heterogêneos ( De Villiers, 1989; Zur Hausen, De Villiers, 1994). O HPV é a abreviatura utilizada para identificar o papilomavírus humano, causador do condiloma acuminado ( do grego Kondilus = tumor redondo, e do latim acuminare = tornar pontudo) (Perez et al, 2000). Pertence a uma grande família de vírus, os papovaviridae. É pequeno, epiteliotrópico e tem cerca de 55nm de diâmetro. Apresenta um genoma composto de 7200 a 8000 pares de base com peso molecular de 5.2 x 106 daltons. É formado por um capsídeo que possui 72 capsômeros de estruturas icosaédricas, sem envelope lipoprotéico, em uma única molécula circular dupla de ácido desoxirribonucléico (DNA) ( Alvarenga et al, 2000; Tavares et al, 2000). O genoma viral possui vários seguimentos, L1 e L2, responsáveis pela formação do capsídeo; os E1 e E2 reguladores da transcrição viral, e E6 e E7 que se ligam aos genes supressores de crescimento tumoral, principalmente o p53 e o pRB respectivamente, inativando-os, e favorecendo o crescimento celular anárquico, resultando numa tumoração maligna. ( Zur Hausen, 2000; Camargos, Melo, 2001).

De acordo com a composição desses seguimentos, são identificados vários subtipos de HPV com diferentes características patogênicas. Alguns têm baixo risco para desenvolver neoplasias (6,11,41,43,44), enquanto outros têm alto risco ( 16,18,31,33,35,39,45,46,51,52). Os tipos 6 e 11 são os principais tipos envolvidos na maioria dos condilomas do trato genital, enquanto, os de alto risco, principalmente os tipos 16 e 18 estão presentes em cerca de 95% do câncer do colo do útero (Camargos, Melo, 2001; Galvão, 2004; Xavier et al, 2005).

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1.2. Patogênese da infecção pelo HPV

Após o contato com uma pessoa infectada, o vírus penetra através de microtraumatismos na pele ou mucosa. Progride até a camada basal do epitélio, atravessando a membrana citoplasmática da célula. O genoma viral é transportado para o núcleo onde é traduzido e transcrito. A multiplicação extensiva do DNA viral e transcrição de todos os genes virais, bem como a formação do capsídeo, ocorrem apenas nas camadas mais superficiais do epitélio. O vírus multiplica-se exclusivamente no núcleo de células infectadas ( Pfister, Wieland, 1999; Okada et al, 2000).

Classicamente a infecção pelo HPV pode ser dividida em três formas distintas: 1. Latente:

É quando encontramos a presença do vírus na região suspeita de infecção pelo HPV, por meio dos métodos de biologia molecular, com coleta através de raspado aleatório. O paciente não apresenta nenhum tipo de lesão clínica ou subclínica. A infecção latente pode se converter em infecção ativa por mecanismos ainda desconhecidos. Sabe-se, no entanto, que fatores como a permissividade celular, o tipo do vírus, o estado imunológico do hospedeiro e talvez a predisposição genética, podem levar a essa transformação, ou voltar ao estágio inicial com a recuperação da imunidade ( Okada et al,2000; Pereyra, Tacla, 2000; Carvalho, 2004). A transmissão nesta fase, ainda é uma interrogação e não tem tratamento (Carvalho, 2004 ).

2. Subclínica:

É a forma mais freqüente de infecção pelo HPV no colo do útero. Correspondendo a aproximadamente 80% dos casos de infecção. Não existe lesão visível. Somente fazemos o diagnóstico por meio de exames com lentes de aumento, sendo muito utilizado o colposcópio. Nos pacientes que desenvolvem infecção recidivante que não melhoram espontaneamente, e

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infectados pelos grupos de alto risco, pode a lesão progredir para neoplasia maligna, o que é incomum, compreendendo 5% a 10% dos infectados ( Pereyra, Tecla, 2000; Carvalho, 2004).

3. Clínica:

É facilmente detectada à vista desarmada, como uma verruga, pápula, ou mácula. Apenas 20% dos pacientes infectados apresentam lesões visíveis ( Carvalho, 2004).

O grau de infectividade é relativamente alto, pois varia de 25% a 65%. As lesões provocadas pelo HPV se disseminam rapidamente pelas regiões circunvizinhas por meio de um processo de auto-inoculação ( Carvalho,2004).

1.3. Métodos de diagnóstico do HPV

1.3.1. Diagnóstico clínico, colposcópico, citológico e por biópsia

Atualmente, o diagnóstico do HPV é obtido pela detecção de seus efeitos morfológicos sobre a citologia ou do seu ácido desoxirribonucléico (DNA).

Lawton et al ( 1992), afirmam que até o momento, não há método padronizado para a coleta do material da cavidade oral para pesquisa do HPV.

A técnica de coleta por raspado, utilizada na cavidade oral, permite colher um número suficiente de células epiteliais para análise molecular ( Kurose et al, 2004).

A coleta do material na região genital pode ser por biópsia, swab ou raspado, sendo esta última utilizada com freqüência para estudo citológico e detecção do DNA do HPV pelas técnicas de hibridização ( Zahm et al, 1999; Lancellotti et al, 2000).

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O exame clínico é o primeiro e mais importante passo para diagnosticar lesões associadas ao HPV, com o auxílio de um instrumento de amplificação, sendo a maioria das lesões identificada em diferentes sítios humanos. O colposcópio é muito importante para o diagnóstico da infecção subclínica pelo HPV nas regiões do colo do útero, vagina, genitália externa e ânus. Durante o exame de colposcopia é utilizada a aplicação do ácido acético a 5%, para a visualização de áreas com epitélio acetobranco sugestivo da presença do HPV como microverrugas, micropápulas, micropontilhados, entre outras alterações do epitélio que fazem parte dos critérios de colposcopia do trato genital (Zahm et al, 1999; Pereyra,Tecla, 2000). É o método mais importante para seleção de pacientes com infecção genital por HPV ( Carvalho, 2004).

No diagnóstico da infecção pelo HPV oral, a aplicação de ácido acético na mucosa oral não tem qualquer utilidade, pois, na cavidade oral, as lesões acetobrancas refletem alterações não específicas da infecção do HPV. Ao diagnosticar infecções orais por HPV, uma demonstração do DNA do HPV é mandatória, por causa da sua morfologia macroscópica, e, não raramente, a aparência histológica das lesões de HPV na cavidade oral não é distinta ( Syrjänen, 1999).

Kellokoski et al (1990a) estudaram HPV oral em mulheres com HPV genital, e o uso de ácido acético para detectar lesões sugestivas de HPV oral. Dentre 334 mulheres estudadas, 41% apresentaram impregnação por ácido acético na cavidade oral e foi encontrado o HPV em 50% dos casos. Nas pacientes que não tiveram impregnação por ácido acético, foi encontrado HPV em 50% dos casos. Concluíram que o uso do ácido acético não é específico para diagnosticar lesões orais por HPV, pois, não foi encontrada nenhuma ligação entre a infecção do HPV e o aspecto morfológico da superfície da mucosa oral, apesar de ser considerada a mucosa oral histologicamente semelhante à mucosa genital.

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O aspecto citológico da infecção do HPV caracteriza-se por: a) critérios maiores: coilócitos clássicos, halos citoplasmáticos perinucleares e displasia nuclear; b) critérios menores: disceratóticos, metaplasia imatura atípica, macrócitos e binucleação. Este método pode ser utilizado para investigação do HPV no colo do útero e vagina, porém menos útil para outros órgãos. Apresenta sensibilidade limitada e não tipa o HPV ( Zahm et al, 1999; Lacellotti et al, 2000). Para fins de diagnóstico do HPV, esse exame é pouco sensível e inespecífico em otorrinolaringologia, não havendo alterações patognomônicas associadas ao HPV. A coilocitose é o achado morfológico que mais se aproxima desta alteração, e mesmo assim, é inespecífico, sendo encontrado em outras patologias não ligadas ao HPV. Por outro lado, pode também ocorrer infecção pelo HPV na ausência de coilocitose ( Marone, Gusmão, 2000).

A biópsia vai permitir o estudo anatomopatológico de amostra representativa da lesão, para evidenciar alterações que sugerem a presença do vírus e graduar a lesão. A interpretação histológica é também dificultada quando existem alterações mínimas vírus-associadas. A histologia não permite a identificação da infecção latente e nem do HPV, o que se obtém apenas pelas técnicas de biologia molecular ( Zahm et al, 1999; Camargos, Melo, 2001 ).

1.3.2. Métodos de biologia molecular

O DNA do HPV pode ser detectado por diferentes técnicas de hibridização incluindo o southern blot (SB), dot blot (DB), hibridização in situ (HIS), captura híbrida (CH), e a reação em cadeia de polimerase (PCR), sendo esta última a mais sensível (Syrjänen, 1999 ). Atualmente, são os testes de hibridização os métodos de escolha para detecção do DNA do HPV em esfregaços citológicos e amostras de tecido ( Zahm, 1999).

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A hibridização de southern blot é utilizada para detecção do DNA do HPV no DNA de espécimes celulares e é considerada como “padrão ouro” para detecção do genoma do HPV. É um teste sensível e altamente específico, consistindo num valioso instrumento de pesquisa, mas não tem aplicação para testes de rotina clínica por ser demorado e trabalhoso ( Zahm et al, 1999).

O dot blot é um método rápido e pouco dispendioso para analisar amostras do DNA ou RNA do HPV. É utilizado principalmente para rastreamento de grandes números de amostras clínicas. Comparado ao southern blot apresenta uma baixa especificidade ( Zahm et al, 1999).

A hibridização in situ é a única técnica que permite a localização topográfica dos ácidos nucléicos virais em tecidos e células. Somente detectado nas infecções virais com mais de 10 a 20 cópias genômicas de HPV por célula. É um método substancialmente menos sensível que a hibridização de southern blot ou dot blot (Zahm et al, 1999).

A captura híbrida é um método que não distingue entre os tipos específicos de HPV, e a sua aplicabilidade como, método de pesquisa, é limitada, mas pode representar um bom teste para uso clínico de rotina. É capaz de detectar 18 tipos de HPV, sendo a sua sensibilidade menor que a da PCR, e muito utilizada em amostras de colo do útero. Apresenta um grupo A com sondas para os HPVs de baixo risco ( 6, 11, 42, 43 e 44), e um grupo B com sondas para os HPVs de médio e alto risco (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 e 68 ) ( Zahm et al, 1999; Lancellotti et al, 2000).

A reação em cadeia de polimerase (PCR) é uma técnica que revolucionou a virologia, devido à sua sensibilidade extremamente alta, podendo detectar até 1 genoma em 100.000 células. Sob ótimas condições experimentais, com o uso de procedimentos laboratoriais estritamente controlados, evita o aparecimento de contaminação, sendo considerado o método de detecção mais sensível do HPV ( Tavares et al, 2000 ).

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Caracteriza-se pela amplificação de quantidades diminutas de seqüência de DNA-alvo em diversos milhões de vezes. São necessários sistemas iniciadores (primers) que consistem em seqüência de pares de bases de DNA, que vão se acoplar em regiões específicas do DNA-alvo, seja na região tardia (L) ou curta (E) do HPV. Os iniciadores (primers) podem ser: os iniciadores específicos do tipo, que detectam um tipo simples de HPV, ou os iniciadores consensus (também chamados gerais ou genérico ) que detectam um painel de diferentes tipos de HPV em uma única reação. Os mais utilizados são os iniciadores consensus designados como MY09/MY11 e GP5+/GP6 +( Gravitt et al, 2000; Ribeiro, 2002 ).

Trata-se de um processo térmico cíclico que inclui três etapas: desnaturação, onde a fita dupla de DNA é separada em fitas simples; anelamento, onde os iniciadores anelam especificamente com as suas seqüências complementares de DNA-alvo fita simples, e, finalmente, a extensão do iniciador, onde um DNA polimerase termoestável gera fitas filhas de DNA que atravessam a região entre dois iniciadores. A partir de então, as duplas fitas recém-geradas servem como modelos para um ciclo de PCR subseqüente ( Ribeiro, 2002). Atualmente, a PCR permite uma avaliação aprofundada dos dados epidemiológicos, incluindo a prevalência de infecções subclínicas ou latentes ( Galvão, 2004) .

1.4. O HPV na região genital

Atualmente, a infecção genital pelo HPV é a doença sexualmente transmissível (DST) viral mais freqüente na população sexualmente ativa, porém, a sua freqüência de transmissão do trato genital para a cavidade oral não está esclarecida ( Kellokoski et al, 1992a; Okada et al, 2000 ).

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A infecção genital por HPV ocorre por contato direto com o epitélio infectado do colo uterino, vagina e vulva. O colo do útero é o sito genital mais comum da infecção. O HPV tem alta prevalência na região anogenital em pacientes com idade entre 15 a 40 anos com vida sexual ativa ( Zur hausen et al, 1994; Pfister,Wieland, 1999 ). Estima-se que ela acometa 30 a 50% dos adultos sexualmente ativos e que 2% apresentem verrugas genitais. É mais freqüente durante a menacme, em especial na gestação e mais rara na infância e pós-menopausa. ( Tavares et al, 2000 ).

Vários estudos epidemiológicos relataram os fatores de risco para a infecção do HPV e para a progressão maligna das lesões induzidas pelo HPV, são eles: início precoce da atividade sexual, múltiplos parceiros sexuais, o uso do fumo, a presença de outras DST e a imunodeficiência ( Alvarenga et al, 2000; Burd, 2003; Carvalho, 2004).

A grande preocupação em relação ao HPV é o câncer de colo do útero, pois, compreende a causa mais freqüente neste caso ( Carvalho, 2004).

1.5. O HPV na cavidade oral

O DNA do HPV foi demonstrado em mucosa de aspecto normal principalmente na região anogenital, mas, também na mucosa oral de ambos os sexos, sendo sugerida a possibilidade da cavidade oral atuar como reservatório de HPV ( Kellokoski et al, 1992a ). Não se conhece claramente ainda o processo de transmissão deste vírus para a mucosa oral. Admite-se que possa ocorrer durante o parto vaginal ( Fredericks et al, 1993), ou por meio da auto-inoculação e prática de sexo oral ( Giraldo et al, 1996; Zur Hausen, 1996 ) .

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Há possibilidade de a saliva ter um papel protetor contra a infecção pelo HPV devido à presença de agentes antimicrobianos como as lisozimas, lactoferrina, IgA e citocinas ( Kellokoski et al, 1992a; Miletic et al, 1996 ).

O HPV foi encontrado nos mais variados locais do corpo humano, já tendo sido descrito na pele ( em qualquer local do corpo), nas mucosas da genitália, na uretra, nos seios paranasais, nas cavidades nasais, laríngea e bucal. Particularmente, sobre a cavidade oral, pouco se conhece a respeito da infecção do HPV nesta localização (Giraldo et al, 1996 ).

Os locais mais frequentemente acometidos na cavidade oral são: lábios, palato, língua, gengiva, úvula, tonsilas e assoalho da boca. O assoalho da boca é um local com muita saliva, onde agentes cancerígenos, como o fumo e o álcool aí dissolvidos, permitem maior oportunidade para a ação deletéria viral, favorecendo a infecção viral ( Terai et al, 1999a; Marone, Gusmão, 2000).

Foram identificados até o presente mais de 100 tipos de HPV ( Bouda et al, 2000; Terai, Takaji, 2001). Desses, 25 tipos (HPV-1, 2, 3, 4, 6, 7, 10, 11, 13, 16, 18, 31, 32, 33, 35, 40, 45, 52, 55, 57,58, 59, 69, 72 e 73), foram associados com as lesões orais benignas ( papilomas de células escamosas, condiloma acuminado, verruga vulgar e hiperplasia hepitelial focal, e as lesões orais malignas, principalmente o carcinoma de células escamosas ( Syrjänen, 2003). Em relação à mucosa oral normal, a presença do HPV é muito variável na literatura. De acordo com 15 trabalhos sobre o assunto, do período de 1992 a 2006, a freqüência de HPV variou de 0 a 81% , como pode ser visto na tabela 1.

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TABELA 1: HPV na mucosa oral normal

___________________________________________________________________________ Investigador Tipo de coleta Técnica N°. P / N°. C % Tipos de HPV mais freqüentes Jalal ( 1992) R PCR e HIS 19 / 78 40% !6 Holladay ( 1993) B PCR e SB 1 / 6 16.5% 16 Ostwald ( 1994) R PCR e SB 1 / 97 1% Eike ( 1995) R PCR 0 / 61 0% Mao (1995) R PCR e SB 4 / 26 15.4% 16 Mao (1996) B PCR 0 / 6 0% Cruz ( 1996) B PCR 0 / 12 0% Bustos (1999) B HIS 0 / 33 0% Pillai ( 1999) B HIS 0 / 10 0% Terai ( 1999b) R PCR 30 / 37 81% 18 Bouda ( 2000) R PCR,DB, HIS 0 / 16 0% Sugiyama ( 2003) B PCR 16 / 44 36% 16 Zhang ( 2004) B PCR 22 / 40 55% 16 e 18 Kurose ( 2004) R PCR 4 / 662 0.6% 16, 53, 71, 12 Sacramento (2006) R PCR 7 / 50 14 % 61, 16,18 e 52

N°= número; P= positivos; C= casos; HIS= hibridização in situ; SB= Southern blot; PCR= reação em cadeia de polimerase; R= raspado; B= biópsia.

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O envolvimento do HPV na carcinogênese oral é um assunto controverso (Syrjänen, 2003).

Miller e Johnstone (2001), em uma meta-análise, relataram que o HPV é duas a três vezes mais comum em lesões pré-malignas orais e 4,7 vezes mais comum em carcinomas epiteliais orais em comparação com a mucosa oral normal. Os resultados indicaram o HPV como um fator de risco independente para o carcinoma oral de célula escamosa.

Uobe K et al (2000) pesquisaram o DNA do HPV em 20 amostras de biópsias de carcinoma de células escamosas (CCE) orais, pela técnica PCR, e encontraram 100% de positividade. Concluíram, sugerindo que a infecção de HPV pode ser um dos vários fatores de risco para o câncer oral.

Surgiyama et al ( 2003) investigaram a presença do HPV em 86 amostras de biópsia de CCE oral pela técnica PCR, e encontraram o HPV 16 em 35% destas amostras. Os resultados sugeriram que o HPV 16 possa estar envolvido precocemente no desenvolvimento de algum carcinoma oral.

Kansky et al (2003) detectaram a presença de DNA de HPV em 8.4% das 59 amostras de biópsia de CCE oral, pela técnica PCR, com prevalência para o HPV 16. Os autores sugerem uma participação restrita do HPV na etiopatogenia da maioria do CCE oral.

Sacramento et al (2006) afirmam uma possível ligação do HPV no câncer da cavidade oral, já que a orofaringe é revestida por um epitélio de características semelhantes àquelas da região genital, onde o HPV é o grande responsável pelo câncer do colo do útero

Levando em consideração o envolvimento do HPV com o câncer genital, sua possível ligação com alguns cânceres orais, e pelo pouco conhecimento sobre a relação entre o HPV oral e o genital, além da preocupação de pessoas que têm infecção genital por HPV e possa adquiri-la em outros locais do corpo, como na cavidade oral, torna-se de grande importância pesquisar o HPV na cavidade oral de pacientes com HPV genital.

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1.6. Revisão da literatura

Esforços têm sido feitos no sentido de se conhecer a freqüência do HPV na mucosa oral de pacientes com HPV genital, para melhor compreensão desta doença na mucosa oral.

Kellokoski et al (1990b) pesquisaram alterações na mucosa oral sugestiva da presença de HPV em 334 mulheres com infecção genital por HPV. A cavidade oral foi examinada à vista desarmada e foram colhidas amostras por raspagem citológica da mucosa do vestíbulo da boca bilateralmente, em 317 pacientes e, em 255 delas foram também realizadas biópsias para estudo citológico e histológico. Os resultados mostraram a presença de coilocitose em três ( 0.9%) das 317 amostras citológicas orais, e em 24 ( 9.4%) das 255 biópsias orais. Foram encontradas lesões orais em 127(38%) das 334 pacientes, sendo que, apenas três (0.9%) pacientes apresentaram lesão verrucosa oral. Observaram também que a mucosa oral era clinicamente normal nas 207 das 334 (62%) pacientes examinadas. Não há relato da taxa de prática de sexo oral.

Kellokoski et al (1992a) pesquisaram a presença de HPV oral pela técnica de hibridização dot blot, em 262 mulheres com infecção genital por HPV. A cavidade oral foi examinada à vista desarmada com coleta do material por raspagem citológica da mucosa oral. Somente 10 (3.8%) das 262 amostras orais foram positivas para HPV, sendo o HPV 6 o tipo mais prevalente. Constataram-se duas pacientes com lesões condilomatosas orais e oito pacientes com mucosas orais normais. Houve concordância dos tipos de HPV genital e oral em sete (30%) das 10 pacientes e o tipo de HPV mais frequentemente encontrado na cavidade oral e genital foi o tipo 6. Não há relato da taxa de prática de sexo oral.

Kellokoski et al, no mesmo ano ( 1992b), realizaram biópsia oral à vista desarmada em 272 mulheres com HPV genital e pesquisaram o HPV oral em todas elas pela técnica southern blot e em 85 delas pela técnica PCR. Os resultados mostraram a presença de DNA do HPV

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em 42 (15.4%) das 272 biopsias orais, usando a técnica de hibridização Southern blot, sendo nove amostras de lesões clínicas e 33 de mucosa oral clinicamente normal. Pela técnica PCR, foram 25 positivas das 85 amostras de biopsia oral (29.4%), em que a maior prevalência foi para o HPV 6 e 11, seguido do HPV 16 e 18 na mucosa oral. Houve concordância dos tipos de HPV genital e oral em apenas 8% dos casos, para o HPV 11 e 16, e o tipo 16 foi o mais encontrado na região genital. Não há relato da taxa de prática de sexo oral.

Van Doornum et al (1992) pesquisaram a prevalência do HPV oral e genital em homens e mulheres com múltiplos parceiros sexuais, num total de 65 homens e 111 mulheres. O exame da cavidade oral foi à vista desarmada. A coleta foi realizada por raspado da mucosa oral e genital. A técnica empregada foi a PCR. Os resultados mostraram na região genital a presença do HPV em vários locais numa proporção de 21 (32%) dos 65 homens e 25 (23%) das 111 mulheres, em nenhum dos pacientes, porém, foi encontrado HPV oral. Não há relato da freqüência de aparecimento de lesões orais e nem a taxa de prática de sexo oral.

Panici et al (1992) avaliaram a presença do HPV oral em pacientes com infecção genital por HPV confirmado histologicamente. Participaram 101 pacientes ( 35 masculinos e 66 femininos). 99 (98%) dos 101 pacientes praticavam sexo oral. O exame da cavidade oral foi realizado com auxílio do colposcópio e foi utilizado ácido acético como marcador de possíveis lesões orais por HPV, seguido de biópsia das mesmas para estudo histológico. O resultado mostrou diagnóstico histológico de condiloma oral em 49 (48%) dos 101 pacientes. Somente oito pacientes tinham lesão oral à vista desarmada. Destes 49 pacientes, foram selecionadas 20 amostras de esfregaços orais ( swabs de algodão) para hibridização in situ. O resultado foi positivo para HPV oral em nove (45%) deles. Prevaleceu em cinco pacientes o HPV 6 e 11 e, em quatro pacientes, os tipos de HPV16 e 18.

Giraldo et al (1996) pesquisaram o HPV por estudo citológico na mucosa oral de 51 mulheres com infecção genital clínica ou subclínica pelo HPV. A prática de sexo oral foi

(23)

relatada em 23 (45%) das 51 pacientes. A coleta oral foi por raspado da cavidade oral à vista desarmada. Os resultados mostraram achados citológicos compatíveis com HPV, a coilocitose esteve presente em 6% das amostras orais das 51 pacientes. Contudo, não foram observadas lesões clínicas na cavidade oral de todas as pacientes em estudo.

Sarruf e Dias (1997) avaliaram a presença do HPV citopatológicamente na cavidade bucal de 54 pacientes ( 13 femininos e 41 masculinos) portadores de infecção genital por HPV. A prática de sexo oral foi relatada em apenas 11(20%) das 54 pacientes. Todos os pacientes foram submetidos ao exame da cavidade oral à vista desarmada seguido de enxágüe bucal com ácido acético à 2% na tentativa de identificar a presença de áreas acetobrancas. A coleta de material para estudo citológico e histológico foi realizada por meio de raspado da mucosa oral com espátula de madeira nas áreas acetobrancas ou, na ausência dessas, na região da mucosa do vestíbulo da boca bilateralmente. Somente na presença de lesão oral, foi realizada exérese e o material submetido á técnica de hibridização in situ para identifcção do DNA do HPV. A cavidade oral foi normal em 45 pacientes, e áreas acetobrancas foram encontradas em nove pacientes. Ocorreu a presença de lesão clínica oral em apenas dois ( 3.7%) pacientes, cujo estudo por hibridização in situ, identificou DNA do HPV em apenas 1 caso. A avaliação citológica e histológica identificou coilocitose em 7(13%) amostras orais. Badaracco et al (1998) pesquisaram pela técnica PCR e encontraram HPV oral em cinco de 10 mulheres com HPV genital confirmada pela PCR. Todos os pacientes foram submetidos a exame clínico da cavidade oral à vista desarmada e com colposcópio, O material foi coletado por raspado da face dorsal e ventral da língua ou de lesão previamente identificada. Apenas três pacientes tinham lesão oral. Observaram concordância entre os tipos de HPV em três das 10 pacientes e, tanto na região genital como oral houve um predomínio do HPV 16 . Não há relato da prática de sexo oral.

(24)

Cañadas et al (2004) pesquisaram o HPV pela técnica PCR, na cavidade oral e genital de 188 mulheres portadoras de HPV genital. O exame da cavidade oral foi à vista desarmada. A coleta foi por raspado da mucosa oral e genital. Os resultados mostraram positividade na mucosa oral em 15( 7.9%) das 188 mulheres, sendo o HPV 6 o tipo mais freqüente. Na região genital foi identificado o HPV, em vários locais, sendo a maior prevalência para o HPV 16, seguido do HPV 18. Foi encontrada concomitância da infecção genital e oral pelo HPV em 5% dos casos, para o HPV 16. Não há relato da freqüência de aparecimento de lesões orais e nem da taxa de prática de sexo oral.

Smith et al (2004) investigaram a presença do HPV oral, pela técnica PCR em 165 mulheres grávidas com diagnóstico de HPV genital. A cavidade oral foi examinada à vista desarmada e o material foi coletado por bochecho com solução salina por 30 segundos. O resultado mostrou positividade na mucosa oral em 14 (8,5%) das 165 mulheres, sendo o HPV 16 o tipo mais freqüente tanto na cavidade oral e na região genital. Em nenhuma paciente o tipo de HPV foi concordante nos dois sítios estudados e não há relato da freqüência de aparecimento de lesões na cavidade oral e nem da taxa de prática de sexo oral.

Giraldo et al ( 2006) encontraram positividade para HPV oral pela técnica PCR em 29 (20.7%) das 140 mulheres com ou sem lesão genital. A coleta foi por raspado da mucosa oral à vista desarmada. Detectaram também a positividade para HPV genital, pela técnica PCR, em 26 (89%) das 29 mulheres com HPV oral. Não há relato da freqüência do aparecimento de lesões orais. A prática de sexo oral ocorreu em 16(55.2%) das 29 mulheres com positividade para HPV oral, e em 59 (23.2%) das 111 mulheres negativas para HPV oral.

O resumo destes trabalhos relatados acima, referente à pesquisa do HPV na mucosa oral de pacientes com lesões genitais por HPV pode ser visualizado na tabela 2.

(25)

TABELA 2: Resumo referente à pesquisa do HPV na mucosa oral de pacientes com lesões genitais por HPV Tipos de HPV

Autor / ano Sexo Método Técnica N° de N° positivo Lesão mais freqüente Concordância entre os tipos de coleta utilizada casos oral e % oral genital e oral de HPV genital/oral

Kellokoski ( 1990) F R/ B CITO 317 3 ( 0.9%) 127 (38%) - - - HISTO 255 24 (9.4%) Kellokoski (1992a) F R DB 262 10 (3.8%) 2 (0.8%) 6 6 30% Kellokoski ( 1992b) F B SB 272 42 ( 15.4%) 9 (3. 3%) PCR 85 25 (29.4%) 16 6 e 11 8% (PCR) Van Doornum (1992) M/F R PCR 21/25 0 (0%) - - - - Panici (1992) M/F B HISTO 101 49 (48%) 8 (7.9%) - 6 e 11 - HIS 20 9 (45%) Giraldo (1996) F R CITO 51 3 (6%) - - - - Sarruf, Dias (1997) M/F R/B CITO / HISTO 54 7 (13%) 2 (3.7%) - - - HIS 2 1 (50%)

Badaracco ( 1998) F R PCR 10 5 (50%) 3 ( 30% ) 16 16 30% Cañadas (2004) F R PCR 188 15 ( 7.9%) - 16 6 5% Smith ( 2004 ) F Bo PCR 165 14 (8.5%) - 16 16 0% Giraldo (2006) F R PCR 140 29 ( 20.7%) - - - - Bo= bochecho; B= biópsia; CITO: citologia; DB= Dot blot; F= feminino; HIS= hibridização in situ; HISTO= histologia; M= masculino; N°= número; PCR= reação em cadeia de polimerase; R= raspado; SB= Southern blot .

(26)

OBJETIVO

(27)

2. OBJETIVO

O objetivo do trabalho é determinar a freqüência de HPV na mucosa oral de mulheres com HPV genital confirmado pela técnica de PCR.

(28)

CASUÍSTICA E MÉTODO

________________________________________________________

(29)

3. CASUÍSTICA E MÉTODO

3.1. Casuística

Para o desenvolvimento deste trabalho, critérios de inclusão e de exclusão foram predeterminados e descritos a seguir:

3.1.1 Critérios de inclusão a) Sexo feminino

b) Idade de 14 a 51 anos

c) Com diagnóstico de lesão genital por HPV ( clínica e/ou subclínica) confirmado pela técnica PCR.

3.1.2 Critérios de exclusão

a) Pacientes com doenças degenerativas, imunodeprimidas, ou que estivessem usando imunossupressores

b) Pacientes com sorologia positiva para HIV

c) Paciente que, apesar do exame colposcópico sugestivo para HPV ( lesão clínica ou subclínica), o resultado pela PCR da amostra por raspagem citológica da lesão genital foi negativo para HPV

3.2. Aspectos éticos

Este estudo foi submetido à apreciação e aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UFAL sob o protocolo nº 005564/02-50. As pacientes envolvidas na pesquisa foram informadas do procedimento de coleta das amostras orais e genitais, do sigilo das informações prestadas e assinaram o termo de consentimento por escrito ( anexo 1).

(30)

3.3. Método

3. 3.1. Coleta de material

Durante o período de maio de 2005 a novembro de 2006 foi realizado um estudo seccional, no qual foram recrutadas 52 pacientes dos Ambulatórios de Ginecologia da Universidade Federal de Alagoas e do Posto de Assistência Médica (PAM) Salgadinho – SUS, Setor de Doenças Sexualmente Transmissíveis, em Maceió – AL.

Todas as pacientes foram submetidas ao exame clínico ginecológico para identificação de verruga, considerada a lesão clínica pelo HPV. Em seguida, realizado o exame colposcópico, com aplicação de ácido acético à 5%, para identificar lesões acetobrancas, no colo do útero, vagina e genital externo, correspondendo às lesões subclínicas pelo HPV.

Durante o exame ginecológico foram coletadas amostras por raspagem citológica, utilizando-se escovas esterilizadas (Kit para coleta de copocitologia oncótica da Libbs) na região genital com lesão clínica ou subclínica por HPV (no genital externo, vagina e colo do útero). Em seguida, foram introduzidas em tubos com tampas, individualizadas com o nome genital, contendo uma solução tampão ( tris-HCL 10mM, pH 8, EDTA 1mM) e encaminhadas para o Laboratório de Biologia Molecular de Genômica e Proteômica (GEMPRO) da Universidade Federal de Alagoas (UFAL) e mantidas sob temperatura de

__

20ºC, para execução da técnica PCR (Reação de Polimerase em cadeia).

Deste recrutamento foram selecionadas 30 pacientes com HPV genital positivo pela técnica PCR, para realização do exame da cavidade oral e da orofaringe à vista desarmada, com o auxílio de luz artificial proveniente de fotóforo para identificação de lesões clínicas de HPV. Não foi utilizado colposcópio ou aplicação de ácido acético durante o exame da mucosa

(31)

oral. Foram colhidas amostras por raspagem citológica, utilizando escovas esterilizadas (Kit para coleta de copocitologia oncótica da Libbs) nas regiões prováveis de implantação do vírus, no palato, úvula, tonsilas, dorso da língua, região sub-lingual e mucosa jugal.

Estas escovas foram introduzidas em tubos com tampas, individualizados com o nome oral, contendo a mesma solução tampão e encaminhadas para o mesmo Laboratório de Biologia Molecular da UFAL para execução da técnica de Reação de Polimerase em cadeia (PCR).

O fluxograma da coleta do material e seu encaminhamento pode ser visto na fig 1.

FIGURA 1: Fluxograma da coleta do material e seu encaminhamento Lesão subclínica Raspado citológico genital técnica PCR ou clínica da

REGIÃO GENITAL

Pacientes com HPV genital positiva pela PCR

Exame da cavidade ORAL

Normal ou com lesão

Raspado citológico oral

PCR

(32)

3.3.2. Estudo por PCR

Uma vez encaminhadas as amostras de raspados citológicos genital e oral para o Laboratóro de Biologia Molecular da UFAL, a extração do DNA genômico foi realizada conforme a metodologia do kit GFX (Asmersham Bioscience), enquanto que a concentração do DNA de cada amostra foi estimada por um espectrofotômetro (Genova), e na amplificação do DNA do HPV, foi utilizado os primers consensus MY09/MY11, com posterior identificação dos tipos virais pela visualização dos padrões obtidos de eletroflorese. Conforme demonstrado no protocolo utilizado no Laboratório de Biologia Molecular da UFAL , visualizado no anexo2.

3.3.3 Questionário

Todas as pacientes responderam um questionário padronizado, onde foram abordados fatores epidemiológicos envolvidos na transmissão do HPV, como, idade de inicio da atividade sexual, número de parceiros, sexo oral e anal, etilismo e tabagismo, como se vê no anexo 3.

(33)

3.3.4 Levantamento bibliográfico

Os levantamentos bibliográficos a respeito da prevalência do HPV na mucosa oral normal e em pacientes com HPV genital foram obtidos por meio de pesquisa na internet, junto ao “Index Medicus” (Medline) e LILACS (Literatura Latino-Americana e do Caribe de Informação em Ciências da Saúde), para acesso à literatura mundial, além de livros e revistas científicas. Os descritores usados para acesso aos artigos foram:

Papilomavirus humano Infecção pelo HPV Na mucosa oral e genital Na mucosa oral normal No câncer oral e genital

3.3.5. Estatística

Foram aplicadas técnicas de estatística descritiva, calculadas médias e desvios padrões, incluindo tabelas e gráficos ilustrativos. O teste qui-quadrado seria para observar as diferenças entre a presença e ausência de HPV na cavidade oral de mulheres com o diagnóstico de HPV genital, entretanto, como será visto a seguir, nenhum resultado foi positivo, por este motivo o teste não foi aplicado. Os valores de “ρ” foram considerados como significativos quando menores que 0,05. O aplicativo utilizado foi o Statistical Package for Social Science (SPSS) versão 15.0.

(34)

RESULTADOS

_________________________________________________________

(35)

4. RESULTADOS

Os resultados de todas as pacientes entrevistadas podem ser vistos nas tabelas 1A, 1B, 1C e 1D.

(36)

____________________________________________________________________________________________________________________

N° do Idade Inicio da N° de Sexo Sexo Tabagismo Etilismo Tipo Local Tipo de Paciente atividade parceiros oral anal lesão genital lesão genital HPV genital sexual

1 32 17 3 não não não não subclínica colo 16 2 30 17 4 sim sim sim não subclínica colo 16

3 36 17 2 sim sim não não clínica e subclínica vulva e colo 6b 4 19 13 1 sim não sim não subclínica colo não

5 24 22 1 não não não não subclínica colo indeterminado 6 29 19 4 sim sim não não subclínica colo e vagina não 7 39 17 5 sim não não não subclínica colo não 8 21 20 1 não não não não clínica colo, vulva, vagina 6b 9 15 14 1 sim não não não clínica e subclínica colo e vulva não 10 21 18 5 sim sim não não subclínica colo não 11 51 22 3 sim sim não não subclínica colo 66 12 42 15 2 sim sim sim não subclínica colo não 13 21 16 2 sim sim sim não clínica e subclínica colo, vagina, vulva 6b 14 19 15 2 sim sim sim não subclínica vulva e vagina não 15 17 12 2 sim não não não clínica e subclínica colo e vulva 6b

_______________________________________________________________________________________________________________________________ HPV= papilomavírus humano

(37)

Tabela 1B: Resultado individualizado dos pacientes 16 a 30 ( continuação )

____________________________________________________________________________________________________________________

N° do Idade Inicio da N° de Sexo Sexo Tabagismo Etilismo Tipo Local Tipo de Paciente atividade parceiros oral anal lesão genital lesão genital HPV genital sexual

16 36 18 2 sim não sim não subclínica colo não 17 25 13 3 sim não não não subclínica colo 16 e MM8 18 32 15 6 sim sim não não subclínica vagina não 19 45 19 4 sim sim sim não clínica vulva e ânus 6b

20 32 17 1 não não sim não subclínica colo indeterminado 21 19 15 3 sim sim não não subclínica colo, vagina não

22 14 14 1 sim sim não não clínica e subclínica colo, vagina, vulva 16 23 32 16 2 sim sim não não subclínica colo 31 24 21 15 2 sim sim não não clínica e subclínica colo e vulva 6b 25 24 15 1 sim sim não não subclínica colo 6b 26 16 13 4 sim sim sim não clínica e subclínica colo, vagina, vulva não 27 32 15 1 não não não não subclínica colo 52 28 36 28 2 não não não não clínica e subclínica colo,vagina , vulva não 29 37 18 3 sim sim não não subclínica colo não

30 30 18 2 sim não não não subclínica colo indeterminado HPV= Papilomavírus humano

(38)

____________________________________________________________________________________________________________________

N° do Idade Inicio da N° de Sexo Sexo Tabagismo Etilismo Tipo Local Tipo de Paciente atividade parceiros oral anal lesão genital lesão genital HPV genital sexual

31 17 14 4 sim não sim não subclínica colo não 32 32 22 2 não não não não subclínica colo não 33 23 15 8 sim sim não não subclínica colo 6b 34 35 14 1 sim não sim não subclínica colo não 35 20 17 1 sim não não não subclínica colo indeterminado 36 17 14 2 sim sim não não subclínica colo LVX 100 37 30 12 2 não não sim não subclínica colo não 38 20 13 2 sim não não não subclínica colo, vagina 6b 39 26 12 10 sim sim não não subclínica colo 6b 40 16 13 3 sim não não não subclínica colo, vagina 6b 41 14 10 20 sim sim não não subclínica colo, vagina indeterminado 42 28 13 10 sim sim não não subclínica colo indeterminado 43 21 12 10 sim não não não clínica vulva indeterminado 44 27 19 1 não não não não subclínica colo indeterminado 45 46 16 3 sim sim sim não subclínica colo 62

HPV= Papilomavírus humano

(39)

Tabela 1D: Resultado individualizado dos pacientes 46 a 56 ( continuação )

____________________________________________________________________________________________________________________

N° do Idade Inicio da N° de Sexo Sexo Tabagismo Etilismo Tipo Local Tipo de Paciente atividade parceiros oral anal lesão genital lesão genital HPV genital sexual

46 47 16 3 sim sim não não subclínica colo não 47 43 12 20 sim sim não não subclínica colo indeterminado 48 28 18 4 sim não não não subclínica colo não 49 25 14 5 sim não não não subclínica colo não 50 30 16 8 sim sim sim não subclínica colo não 51 25 15 2 sim sim não não subclínica colo 58

HPV= Papilomavírus humano

(40)

Das 51 pacientes, 76% (40/51) apresentaram lesões subclínicas no exame de colposcopia, enquanto 17% (8/51) apresentaram lesões subclínicas e clínica, e apenas 7 % (3/51) apresentaram lesões clínicas no exame físico ginecológico. Quanto à localização da lesão, foi a região do colo do útero a mais acometida, com 92% (47/51), como podemos ver na tabela 2.

TABELA 2: Lesões genitais das 51 pacientes

Localização

Lesão genital No _______________________________ de mulheres colo vagina vulva ânus Clínica 3 1 1 3 1 Subclínica 40 38 7 1 Clínica e subclínica 8 8 4 8 ___________________________________________________________________________ Total 51 47 12 12 1

Fonte: Departamento de Ginecologia da UFAL e Ambulatório de Ginecologia do Posto de Assistência Médica (PAM) Salgadinho – SUS

(41)

4.1 Caracterização da amostra

A amostra a seguir descrita compreende as 30 pacientes com HPV genital confirmadas pela técnica PCR, já tendo sido excluídas as 21 pacientes com diagnóstico negativo para HPV pelo exame de PCR.

A média de idade dos casos foi de 27,1 anos, variando de 14 a 51 anos, com desvio padrão de 9,58. A distribuição etária das 30 pacientes pode ser vista na figura 2.

FIGURA 2: Distribuição etária das 30 pacientes estudadas

7 14 5 3 1 0 5 10 15 20 25 30 Número de pacientes

1

2

3

4

5

idade 10 - 20 21 - 30 31 - 40 41 - 50 51 - 60

(42)

Em relação ao início da atividade sexual, predominaram as pacientes com idade abaixo de 18 anos, em 80% ( 24/30) dos casos , (figura 3).

FIGURA 3: Início da atividade sexual das pacientes estudadas ( n=30)

24

6

0 5 10 15 20 25 30 Núm ero de pacientes

1

2

idade < 18 ≥ 18

(43)

Quanto ao número de parceiros sexuais, predominaram 2 a 3 parceiros, em 46% (14/30) dos casos, (figura 4).

FIGURA 4: Número de parceiros sexuais das pacientes estudadas ( n=30) 8 14 3 3 2 0 5 10 15 20 25 30 Número de pacientes

1

2

3

4

5

NÚMERO DE PARCEIROS SEXUAIS

01 02 - 03 04 - 08 09 - 10 20

(44)

Em relação a prática de sexo oral, 80% (24/30) praticavam sexo oral e 20% (6/30) não. Já a prática de sexo anal, 43% ( 17/30) relataram que praticavam sexo anal, e 57% ( 13/30) não (figura 5).

FIGURA 5: Prática de sexo oral e anal pelas pacientes estudadas (n=30 ) 24 (80,0%) 6 (20,0%) NÃO-SEXO ORAL SEXO ORAL 17 (56,7%) 13 (43,3%) NÃO-SEXO ANAL SEXO ANAL

Quanto a vícios, 17% (5/30) eram tabagistas e 83% (25/30) não. Nenhuma das pacientes eram etilista (figura 6).

FIGURA 6: Tabagismo e etilismo nas pacientes estudadas ( n=30)

30 (100%) 0 (0%) ETILISTA NÃO-ETILISTA 25 (83%) 5 (17%) TABAGISTA NÃO-TABAGISTA

(45)

4.1.1. Lesões genitais das 30 pacientes com HPV genital positivo pela técnica PCR

Predominaram as lesões subclínicas, com 73% (22/30 ) dos casos, seguido pela associação de lesões subclínicas e clínicas com 17% ( 5/30 ) dos casos, e 10% ( 3/30 ) dos casos com apenas lesões clínicas. A região do colo do útero foi a mais acometida, em 90% (27/ 30) dos casos, observados na tabela 3.

TABELA 3: Lesões genitais das pacientes estudadas ( n=30)

Lesões Número Localização

genitais de pacientes colo vagina vulva ânus

Clínica 3 1 1 3 1 Clínica e subclínica 5 4 2 5 - Subclínica 22 22 3 - - Total 30 27 6 8 1 Fonte: Departamento de Ginecologia da UFAL e Ambulatório de Ginecologia do Posto de Assistência Médica (PAM) Salgadinho – SUS

4.1.2 PCR genital

O HPV 6b foi o tipo mais frequentemente encontrado na região genital, aparecendo em 36.6% dos casos ( 11/30). Sendo que 30% (9/30) foram indeterminados. Outros tipos de HPV também foram encontrados, tais como: HPV 16 em 13% ( 4/30), HPV LVX100, HPV 66, HPV52, HPV 62, HPV 58, HPV 31 em 3.4% (1/30) , como pode ser visto na tabela 4.

(46)

Em apenas uma paciente foi encontrado mais de um tipo de HPV na amostra genital, que foi o HPV 16 e HPV MM8.

TABELA 4: HPV genital das pacientes estudadas pela técnica PCR ( n=30)

__________________________________________________________________________ TIPOS DE NÚMERO DE HPV PACIENTES PERCENTÁGEM HPV6b 11 36.6% INDETERMINADO 9 30.0% ( 3 ) HPV 16 ( 1) HPV 16 + HPV MM8 4 13.0% HPVLVX100 1 3.4% HPV 66 1 3.4% HPV 52 1 3.4% HPV 62 1 3.4% HPV 58 1 3.4% HPV 31 1 3.4% Total 30 100%

(47)

4.1.3. Lesões orais

Em relação a cavidade oral e a orofaringe das 30 pacientes, não apresentaram lesões clínicas sugestivas de HPV ao exame macroscópico.

4.1.4. PCR oral

Todas as amostras obtidas por raspado citológico da mucosa oral das 30 pacientes foram negativas para HPV pela técnica PCR. Observada na tabela 4 e figura 7.

Tabela 5: PCR oral das 30 pacientes estudadas

PCR NÚMERO DE PERCENTAGEM AMOSTRAS PCR - 30 100% PCR + 0 0% TOTAL 30 100%

Fonte: Laboratório de Biologia Molecular da Universidade Federal de Alagoas

(48)

FIGURA 7: ilustra o resultado da PCR de amostras orais

Amostras de HPV orais negativas para os primers MY09 e MY11 (linhas 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35); Bandas inespecíficas para os primers MY09 e MY11 (Linhas 9, 11, 13); DNA da globina humana para os primers GH20 e PC04 (268 pb e bandas inespecíficas) linhas 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36 em gel de agarose (1,2%). Controle positivo HPV e Globina nas linhas 37 e 38, respectivamente. M= marcador de 100 pb

Fonte: Laboratório de Biologia Molecular da UFAL

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2072 pb 100 pb 100 pb 2072 pb M 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38

(49)

DISCUSSÃO

________________________________________________________

(50)

5. DISCUSSÃO

Neste estudo, a amostra é formada de 30 mulheres com infecção genital confirmada pela PCR, após a exclusão das 21 pacientes que foram negativas para HPV genital pela técnica PCR. Todas as 51 pacientes foram submetidas ao exame clínico ginecológico com a utilização do colposcópio. Instrumento utilizado na seleção de pacientes com infecção genital por HPV ( Carvalho, 2004), para o diagnóstico da infecção subclínica pelo HPV nas regiões do colo do útero, vagina e genitália externa, após o uso de ácido acético à 5% ( Zahm et al, 1999; Pereyra, Tecla, 2000).

Não foi realizado, neste estudo, o exame citológico, por ser um método de sensibilidade limitada, que não tipa o HPV e inespecífico em otorrinolaringologia ( Zahm et al, 1999; Lacelloti et al, 2000; Marone, Gusmão, 2000), nem o estudo histopatológico, por não ser capaz de identificar o tipo de HPV associado ao efeito citopático, o que se obtém apenas pelas técnicas de biologia molecular ( Zahm et al, 1999; Camargos, Melo, 2001). A PCR foi a técnica escolhida por ser de sensibilidade extremamente alta (Syrjänen, 1999) e por ser também considerada o melhor método de escolha para a pesquisa do DNA do HPV em esfregaços e amostras de tecido ( Zahm et al, 1999).

A PCR, quando realizada em ótimas condições experimentais e com procedimentos laboratoriais estritamente controlados ( Tavares et al, 2000), evita o aparecimento de contaminação, o que foi feito no presente estudo.

No exame da PCR, foi escolhido o sistema de primers MY09/MY11 por ser um dos mais utilizados em pesquisa de DNA do HPV e por detectar um painel de diferentes tipos de HPV em uma única reação ( Gravitt et al, 2000; Ribeiro, 2002). Tudo isso permite também uma avaliação aprofundada dos dados epidemiológicos sobre a infecção do HPV, incluindo a prevalência de infecções subclínicas ou latentes ( Galvão, 2004).

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A amostra apresenta pacientes com vida sexual ativa, uma média de idade de 27 anos, variando de 14 a 51 anos, condizente com a literatura ( Zur Hausen et al, 1994; Pfister, Wieland, 1999), com início de atividade sexual precoce, maior incidência abaixo de 18 anos, e um predomínio de dois a três parceiros sexuais, o que contribui para aumentar as chances de infecção pelo HPV na região genital ( Alvarega et al, 2000; Burd, 2003; Carvalho, 2004). Não só a transmissão do HPV genital para a cavidade oral, como a sua freqüência é pouco conhecida ( Kellokoski et al, 1992a; Okada et al, 2000 ). Nota-se que, assim como no estudo de Panici et al,1992, este trabalho também apresenta elevada prática de sexo oral, 98% e 80% respectivamente, enquanto, os estudos de Giraldo et al, 1996; Sarruf, Dias, 1997 e Giraldo et al, 2006, apresentaram taxas menores de 45%, 20% e 48% respectivamente, com resultados variados de presença ou ausência de HPV na cavidade oral. O que faz acreditar que não há uma indicação clara, nem comprovada, de que as pessoas que pratiquem sexo oral tenham maior predisposição à infecção oral pelo HPV do que aquelas que nunca praticaram. Com relação aos hábitos de fumar e etilismo, a taxa de fumantes foi de apenas cinco (16%) das 30 pacientes e nenhuma era etilista, o que não influiu nos resultados, apesar de serem fatores que favoreçam a infecção do vírus HPV na mucosa oral (Terai et al, 1999; Marone et al, 2000).

Todas as 30 pacientes apresentam HPV genital, confirmado pela PCR, com predomínio para o HPV 6 (36%), encontrado em 11 pacientes com lesões clínicas e subclínicas, principalmente no colo do útero. O que é condizente com a literatura, ao relatar ser freqüente o HPV 6 no condiloma do trato genital ( Camargo, Melo, 2001; Galvão, 2004; Xavier et al, 2005). Outros tipos de HPV, como o HPV 16, 31 e 52, considerados de alto risco foram encontrados em pacientes deste estudo, sendo de grande importância por serem identificados nas displasias e em cerca de 95% dos cânceres do colo do útero (Camargos, Melo, 2001; Galvão, 2004; Xavier et al, 2005). Quanto às lesões genitais, prevaleceu a forma subclínica

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em 73% dos 30 casos, cuja localização mais freqüente foi no colo do útero, conforme também observado na literatura (Pereyra, Tecla, 2000; Carvalho, 2004).

Em relação à presença concomitante do mesmo tipo de HPV genital e oral num mesmo indivíduo, observou-se uma variação nos resultados de 0 % no estudo de Smith et al. 2004 e de 5 a 30% nos estudos de Kellokoski et al, 1992a,b; Badaracco et al, 1998 e Cañadas et al, 2004. A esta concordância, poderíamos sugerir uma possível transmissão orogenital nas pacientes envolvidas.

Ao exame minucioso da cavidade oral à vista desarmada, das 30 pacientes estudadas, não foram encontradas lesões clínicas sugestivas de HPV, o que sugere ser uma mucosa oral normal, que pode incluir infecções subclínicas e/ou latentes ( Pereyra, Tecla, 2000; Carvalho, 2004), e, assim, a possibilidade da cavidade oral atuar como reservatório de HPV ( Kellokoski et al, 1992a).

Em comparação com os estudos da literatura ( kellokoski et al, 1990; kellokoski et al, 1992a,b; Panici et al, 1992; Giraldo et al, 1996; Sarruf, Dias, 1997; Badaracco et al, 1998) a oroscopia não difere expressivamente, observando-se a presença de lesão clínica oral numa variação de 3.7% a 38% dos casos, ocorrendo um predomínio de mucosa oral normal. Consequentemente, leva a crer que a presença de lesões clínicas por HPV na mucosa oral seja rara em mulheres com HPV genital.

A freqüência do HPV na mucosa oral normal é muito variável na literatura ( Jalal et al, 1992; Holladay et al, 1993; Ostwald et al, 1994; Eike et al, 1995; Mao et al, 1995; Mao et al, 1996; Cruz et al, 1996; Bustos et al, 1999; Pillai et al, 1999; Terai et al, 1999; Bouda et al, 2000; Sugiyama et al, 2003; Zhang et al, 2004; Kurose et al, 2004; Sacramento et al, 2006) com resultados discrepantes e uma maior prevalência para o HPV 16, o qual, também é prevalente em estudos de câncer oral ( Uobe K et al, 2000; Sugiyama et al, 2003; Kansky et al, 2003), sendo ainda um assunto controverso (Syrjänen, 2003). Atualmente, o HPV pode ser

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considerado como um fator de risco para o câncer oral (Miller, Johnstone, 2001; Uobe K et al, 2000). Acreditamos, que seja importante continuar a se pesquisar o HPV na mucosa oral para podermos explicar a sua atuação na carcinogênese oral, já que a mucosa oral é revestida por um epitélio com características semelhantes àquelas da região genital (Sacramento et al, 2006).

Por outro lado, acreditamos que não traga benefícios para o paciente, o achado de infecção latente, por várias razões: a) o paciente apresenta-se na forma assintomática, fase em que o vírus está alojado na camada basal do epitélio ( Pfister, Wieland, 1999; Okada et al, 2000); b) a não transmissão do vírus nesta fase; c) por não termos como prever se esta infecção se transformará, ou não, numa infecção ativa (subclínica ou clínica), este processo de transformação para a forma ativa se dá por mecanismo ainda desconhecido, Sabendo-se, no entanto, que fatores como a permissividade celular, o tipo do vírus e o estado imunológico do hospedeiro podem levar a essa transformação, ou voltar ao estágio inicial com a recuperação da imunidade ( Okada et al, 2000; Pereyra, tecla, 2000; Carvalho, 2004); d) por não haver indicação de tratamento nesta fase; e) por não existir confirmação da ligação da infecção latente com o câncer oral.

Neste estudo, durante o exame da cavidade oral não foi utilizado o ácido acético, por não ter qualquer utilidade, já que na cavidade oral as lesões acetobrancas refletem alterações não específicas da infecção pelo HPV ( Syrjänen, 1999).

O colposcópio não foi utilizado durante o exame da cavidade oral das 30 pacientes, devido à falta de embasamento na literatura a seu respeito, apenas encontrado em dois estudos ( Panici et al, 1992 e Badaracco et al, 1998), e pela ineficiência do ácido acético na cavidade oral ( Kellokoski et al, 1990a). Acreditamos que seja necessária uma adequação dos critérios colposcópicos do trato genital, para que sejam utilizados na identificação de lesões sugestivas de HPV na mucosa oral.

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A coleta por raspado é muito utilizada na região genital tanto para estudo citológico como para detecção do DNA do HPV pelas técnicas de hibridização (Zahm et al, 1999; Lancellotti et al, 2000), enquanto, na mucosa oral, não há uma padronização no método de coleta para a pesquisa do HPV (Lawton etal, 1992). Foi utilizado, neste estudo, o método de raspagem tanto na região genital como na cavidade oral, também realizado em outros estudos com resultados positivos nas duas regiões ( Kellokoski et al, 1992a; Badaracco et al, 1998; Cañadas et al, 2004; Giraldo et al, 2006). É um método não invasivo, utilizado na pesquisa do HPV na mucosa oral, com possibilidade de colher um número suficiente de células epiteliais para análise molecular (Kurose et al, 2004) em várias regiões como palato, língua, gengiva, úvula, tonsilas e assoalho da boca ( Terai etal, 1999; Marone et al, 2000).

Há várias possibilidades de justificar a baixa freqüência do aparecimento do HPV nas amostras da cavidade oral, pelo que podemos destacar: a) a defesa imunológica local com a presença de enzimas proteolíticas ( Kellokoski et al, 1992a; Milectic et al, 1996); b) a baixa transmissibilidade pela auto-inoculação e sexo oral; c) a ausência de hábitos de fumar e ser etilista; d) os diferentes métodos utilizados na pesquisa do HPV oral; e) e a presença da infecção latente .

As amostras orais foram negativas para HPV nas 30 pacientes deste estudo, pela PCR. Em comparação com os resultados de outros estudos da literatura que utilizaram a técnica PCR ( Kellokoski et al, 1992b; Van Doornum et al, 1992; Badaracco et al, 1998; Cañadas et al, 2004; Smith et al, 2004; Giraldo et al, 2006), observa-se uma baixa freqüência de aparecimento de HPV na mucosa oral. Deste modo, podemos sugerir que a presença da infecção genital por HPV não parece ser fator predisponente para a infecção oral por HPV. Esta constatação é importante para aqueles pacientes que tem HPV genital e ficam preocupados com a transmissão do mesmo para seu(s) parceiro(s) bem como para outros locais de seu corpo como a cavidade oral. Acreditamos não ser necessário o exame da

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