VERIFICAÇÃO DA PRODUÇÃO DE ANTICORPOS
ESPECÍFICOS EM ÉGUAS PRENHES, VACINADAS
CONTRA Rhodococcus equi, E AVALIAÇÃO DA
TRANSFERÊNCIA PASSIVA DESTES ANTICORPOS
PARA OS POTROS.
ALEXANDER BLOEM
BOTUCATU-SP
JULHO 2006
VERIFICAÇÃO DA PRODUÇÃO DE ANTICORPOS
ESPECÍFICOS EM ÉGUAS PRENHES, VACINADAS
CONTRA Rhodococcus equi, E AVALIAÇÃO DA
TRANSFERÊNCIA PASSIVA DESTES ANTICORPOS
PARA OS POTROS.
ALEXANDER BLOEM
Dissertação apresentada junto ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária para obtenção do título de Mestre
Orientador: Prof. Ass. Dr. Alexandre Secorun Borges
BOTUCATU-SP
JULHO 2006
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO DA INFORMAÇÃO
DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP
BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: Selma Maria de Jesus Bloem, Alexander.
Verificação da produção de anticorpos específicos em éguas prenhes vacinadas contra Rhodococcus equi e avaliação da transferência passiva destes anticorpos para os potros / Alexander Bloem. – 2006.
Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Botucatu, 2006.
Orientador: Alexandre Secorun Borges Assunto CAPES: 50501003
1. Eqüino - Doenças 2. Obstetrícia veterinária 3. Égua - Doenças CDD 636.10896
Prof. Ass. Dr. Alexandre Secorun Borges
Prof. Ass. Dr. Roberto Calderon Gonçalves
Prof. Dr. Júlio Augusto Naylor Lisboa
Prof. Ass. Dr. Márcio Garcia Ribeiro
Prof. Dr. Francisco Armando de Azevedo Souza
Dedico este trabalho;
Aos meus pais, José Bloem e Johanna Bloem
Às minhas irmãs Marlene e Liliane
E principalmente à minha esposa Érika ... Te amo muito...
AGRADADECIMENTOS
À Fazendas Interagro, pela oportunidade profissional e possibilidade da realização do experimento.
Aos amigos da Interagro pelo convívio diário e companheirismo.
Ao Jair Mariano de Souza, Renato de Oliveira e Luciano da Silva porque sem vocês este experimento não seria possível e também pela nossa grande amizade.
Ao meu orientador Prof. Ass. Dr. Alexandre Secorun Borges, pela paciência, compreensão, e amizade adquirida durante todo o curso.
Ao Prof. Ass. Dr. Márcio Garcia Ribeiro, pela amizade e pelo auxílio tanto na elaboração como na parte experimental do projeto.
Ao Prof. Ass. Dr. Rogério Martins Amorim, pela amizade e pelas sugestões na elaboração do trabalho.
Ao Prof. Ass. Dr. Roberto Calderon Gonçalves, pela amizade e pelos conhecimentos transmitidos.
À Profa. Ass. Dra. Ana Liz Garcia Alves, pela amizade e por me indicar ao meu orientador.
Ao Dr. Neimar Vanderlei Roncati, por nossa grande amizade e pela experiência profissional transmitida.
Ao Dr. Luis Pompêo Scomparin, pela nossa eterna amizade e pelo auxílio durante a fase laboratorial.
Ao Edinho e ao Fábio por serem muito mais do que amigos.
À toda a minha família, pelo amor e carinho recebido ao longo da vida.
À minha “filha” Alexia, pelo prazer de tê-la em minha vida.
À minha mãe, pelo amor, carinho e pela minha criação.
Ao meu pai por transmitir toda a sua experiência de vida.
Página RESUMO ... I ABSTRACT ... Iii 1. INTRODUÇÃO ... 01 2. REVISÃO DE LITERATURA ... 04 2.1. Introdução ... 05 2.2. Patogenia ... 07 2.3. Imunidade ... 08 2.4. Métodos diagnósticos... 10 2.5. Epidemiologia ... 13 2.6. Profilaxia ... 15
2.6.1. Imunidade vacinal de éguas e potros ... 15
2.6.2. Terapia com plasma ... 16
2.6.3. Fatores relacionados ao manejo ... 18
2.7. Tratamento ... 19 3. OBJETIVOS ... 21 3.1. Objetivo geral ... 22 3.2. Objetivos específicos ... 22 4. MATERIAL E MÉTODOS ... 23 4.1. Criatório ... 24 4.2. Animais e grupos ... 24
4.3. Analise dos resultados 31 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 32
6. CONCLUSÃO ... 40
7. BIBLIOGRAFIA ... 43
8. TRABALHO CIENTÍFICO ... 51
8.1.Normas de publicação da Revista Pesquisa Veterinária Brasileira (ISSN: 0100-736X Seropédica – Rio de Janeiro Brasil) 52 8.2.Trabalho a ser enviado para a Revista Pesquisa Veterinária Brasileira ... 56
RESUMO
Bloem, A. Verificação da produção de anticorpos específicos em éguas
prenhes vacinadas contra Rhodococcus equi e avaliação da transferência passiva destes anticorpos para os potros. [Evaluation of specific antibodies
production in mares vaccinated against Rhodococcus Equi, and the passive transference to the foal.] 2006. 91p. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho
A infecção por Rhodococcus equi apresenta distribuição mundial e causa pneumonia supurativa ocasionando grandes perdas econômicas decorrentes dos custos de medicação, diminuição do desenvolvimento e mortalidade. O objetivo principal deste trabalho é verificar a importância da produção de anticorpos após vacinação de éguas prenhes, e posterior transferência passiva colostral para o neonato, na profilaxia da enfermidade. Para isto foram utilizadas éguas, e seus respectivos neonatos, de uma propriedade onde já haviam sido registrados, em anos anteriores, vários casos de infecção por R.
equi. O experimento foi dividido em três fases. Na primeira fase, pretendeu-se
verificar a produção de anticorpos contra R. equi em éguas vacinadas e a transferência destes para os neonatos através do colostro, utilizando 78 éguas e seus neonatos. As éguas receberam uma dose de vacina contra R. equi, 45 e 15 dias antes do parto previsto e tiveram amostras de sangue colhidas para serem analisadas por imunodifusão para detecção de anticorpos contra R. equi nos seguintes momentos: antes da primeira dose de vacina; antes da segunda dose; e 10 dias após a segunda dose. Os potros nascidos destas éguas também tiveram uma amostra de sangue colhida aos 2 dias de vida com o mesmo propósito. A segunda fase objetivou o isolamento de R. equi em “swabs” transretais e em lavados traqueais, e verificar se a presença de anticorpos contra R. equi nos potros, adquiridos pelo colostro ou pela administração de plasma hiperimune, interfere na instalação de sinais clínicos da enfermidade. Para esta fase foram usadas 45 éguas e seus respectivos neonatos divididos em três grupos da seguinte maneira: Grupo I, formado por 24 éguas vacinadas contra R. equi, 45 e 15 dias antes do parto previsto e seus potros recém-nascidos. Nestes potros foram detectados anticorpos no teste de imunodifusão aos 2 dias de vida e não receberam plasma hiperimune na
primeira semana de vida. Grupo II, formado por 11 éguas vacinadas contra R.
equi, 45 e 15 dias antes do parto previsto, e seus potros recém-nascidos.
Nestes não foram detectados anticorpos no teste de imunodifusão aos 2 dias de vida e receberam 1 litro de plasma hiperimune na primeira semana de vida. Grupo III, formado por 10 éguas não vacinadas e seus potros recém-nascidos. Estes potros tiveram resultados variáveis no teste de imunodifusão e não receberam plasma hiperimune. Todos os 45 potros foram acompanhados durante o crescimento e tiveram colhidas, aos 45 e 90 dias, amostras de lavados traqueais e “swabs” transretais para possível recuperação do R. equi e também de outros microrganismos. Aos 150 dias foi colhida amostra de sangue para verificar a presença de anticorpos específicos. Na terceira fase a finalidade foi verificar se os anticorpos produzidos por 45 éguas após vacinação persistiram após um ano. A vacina comercial utilizada foi a Rodovac®. Os resultados mostram que houve uma boa produção de anticorpos contra R. equi após vacinação (89,65%) e que estes foram passados para os potros (92,30%) pelo colostro. Um ano após vacinação, 54,54% das éguas estudadas apresentaram anticorpos contra R. equi. Durante o experimento o R.
equi foi isolado em apenas 1 (entre 90) lavado traqueal, no qual o potro era
positivo no teste de imunodifusão e não havia recebido plasma hiperimune na primeira semana de vida. No ano do experimento não foi diagnosticado nenhum caso de rodococose na propriedade.
Palavras-chave: eqüino, pneumonia, Rhodococcus equi, imunidade humoral, vacinação.
ABSTRACT
Bloem, A. Evaluation of specific antibodies production in mares
vaccinated against Rhodococcus Equi, and the passive transference to the foal. [Verificação da produção de anticorpos específicos em éguas prenhes
vacinadas contra Rhodococcus equi e avaliação da transferência passiva destes anticorpos para os potros.] 2006. 91p. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”.
The infection by R. equi is worldwide spread and causes suppurative pneumonia with great economic losses due to medication costs and development delay and mortality. The major aim of this study is to evaluate the importance of antibodies production after pregnant mare vaccination, and subsequently transference of these antibodies to the newborn foal through the colostrum, and on the control of the disease. Mares and their respective foals, from a specific farm that had had previous cases of R. equi infection in early years, were used for this trial. The study was divided into three steps. On the first step the goal was to evaluate the production of antibodies against R. equi in vaccinated mares and the transference of these to the new-born foal through the colostrum. These mares received one dose of vaccine against R. equi, 45 and 15 days before delivery and had blood samples collected to be analyzed by AGID test for detection of specific antibodies against R. equi on the following sampling times; a) before the first vaccine dose, b) before the second dose, c) 10 days after the second dose. The new-born from these mares also had a blood sample collected when they were 2-day-old with the same purpose. The goal of the second step was to evaluate the recovery of R. equi in transretal swabs and in tracheobronchial aspirate and also if the presence of antibodies against R. equi in the foals, acquired either through the colostrum or through the hyperimune plasma (H.I.), interferes with the development of clinical signs of the disease. For this step 45 mares and their respective foals were divided in three groups as follow; a) Group I, 24 vaccinated mares against R. equi, 45 and 15 days before delivery, and their respective foals as well. These foals had a positive determination of antibodies against R. equi, on the AGID test when they were 2-day-old, and didn’t receive H.I. plasma on the first week of life. b) Group II, 11 vaccinated mares against R. equi, 45 and 15 days before delivery, and
their respective foals as well. These foals had a negative determination of antibodies against R. equi, on the AGID test when they were 2-day-old, and received 1 liter of H.I. plasma on the first week of life. c) Group III, 10 non-vaccinated mares and their respective new-born foals. These foals had variable results on the immunodiffusion test and didn’t receive H. I. plasma. All the 45 foals were followed during their development, and had tracheobronchial aspirate and transretal swabs samples collected when they were 45 and 90-day-old, for the possible recovery of the R. equi and other microorganisms. When they were 150-day-old another blood sample was collected to check the presence of specific antibodies. The aim of third step was to evaluate if the antibodies produced by the mares after vaccination persist from one year to the other, therefore 45 mares were used, and had their blood collected to check the persistence of specific antibodies against R. equi one year after vaccination. The trade mark Rodovac® was the vaccine used in vaccinated groups. The results show that there is a good production of antibodies against R. equi after vaccination (89,65%), and they were transferred to the foals (92,30%) through colostrum. One year after the the last vaccination against R. equi 54,54% of the studied mares presented antibodies against R. equi. During the experiment the
R. equi was isolated in just one(out of 90) tracheobronchial aspirate in which the
foal was positive on the immunodiffusion test and hadn’t received H.I. plasma on the first week of life. During the experiment year no case of R. equi infection was detected in the property.
Keywords. equine, pneumonia, Rhodococcus equi, humoral immunity, vaccination..
1. INTRODUÇÃO
Durante a década de 80 ocorreu grande incremento na criação do cavalo, e surgiram centenas de novos criadores dispostos a grandes investimentos, sem a preocupação de atingir um resultado condizente. A criação de cavalos no Brasil está passando nos últimos anos por um processo de profissionalização da produção e assim podemos dizer que hoje deixou de ser apenas um entretenimento de finais de semana e passou a ser encarada como uma indústria de cavalos.
Devido a um processo natural de seleção de mercado, hoje o Brasil possui menor número de criatórios, porém com muito mais qualidade tanto no fenótipo individual como também geneticamente. A indústria brasileira do cavalo é considerada por muitos especialistas no assunto como de “primeiro mundo”, e dependendo da raça somos os melhores do mundo.
Como em todas as modalidades onde o profissionalismo está envolvido, a criação de cavalo não é diferente, e com isto necessita de uma administração bem planejada e coerente, desde a escolha dos animais (genético), passando pela manutenção das instalações, conservação das pastagens e pelo manejo alimentar e sanitário.
De forma semelhante a outros setores da economia brasileira, a criação de cavalos também tem seus problemas, e para que tudo corra bem estes necessitam de soluções. Entre os inúmeros problemas está a rodococose, que se manifesta principalmente como uma infecção pulmonar (pneumonia) e é causada pelo Rodococcus equi, acometendo potros nos primeiros meses de vida.
A rodococose causa anualmente grandes prejuízos decorrentes de gastos com medicamentos, mão de obra especializada e procedimentos ligados ao manejo do haras. Além disto, o prognóstico nem sempre é favorável, pois sempre corremos o risco de, ou perder a vida do animal, ou perdê-lo como atleta.
A principal forma de evitar uma endemia de rodococose numa propriedade é a instalação de um manejo profilático adequado. Sendo assim este trabalho tem como objetivo verificar a eficácia de opções para a prevenção
da rodococose, tais como vacinação dos animais e a administração de plasma hiperimune.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Introdução
Rhodococcus equi é uma bactéria Gram-positiva, pleomórfica,
capsulada, imóvel, sem flagelo (Ellenberger et al., 1986), filamentosa, que não forma esporos, não fermenta carboidratos e é ácido resistente (Jones et al., 1997). É um patógeno intracelular facultativo e acomete potros entre 1 e 4 meses de idade (Patton et al., 2004), sendo muito resistente às condições ambientais adversas e aos desinfetantes químicos, podendo estar viável por longos períodos no meio ambiente (Martins, 2003). Trata-se de um agente oportunista (Johnson et al., 1983; Ellenberger et al., 1986). A natureza oportunista do microorganismo é evidente em seres humanos com imunossupressão (Ellenberger et al., 1986).
Virtualmente, todos os cavalos estão expostos ao R. equi desde o nascimento, e a maioria desenvolve respostas imunes primárias que subseqüentemente os protegem durante a vida (Hines et al., 1996). O microorganismo está presente no solo e nas fezes de herbívoros, e provavelmente é mantido no cavalo, como microbiota normal do trato intestinal (Peiró et al., 2002). Takai et al. (1986b) relataram que o R. equi pode ser encontrado nas fezes de potros durante a primeira semana de vida, sendo que sua concentração permanece alta durante as primeiras oito semanas. A presença dessa bactéria no trato gastrintestinal foi considerada a principal fonte de estimulação antigênica em potros (Prescott et al., 1980).
Sua distribuição é altamente variável, sendo endêmica em alguns haras e esporádica em outros. Isso parece ser devido a diferenças na densidade populacional de potros, no manejo da fazenda, em fatores ambientais (temperatura, poeira, pH do solo) e na virulência das cepas (Meijer e Prescott, 2004). A maioria dos casos de pneumonia por R. equi ocorre durante o verão, período que coincide com a alta susceptibilidade do potro e as condições ótimas para a multiplicação bacteriana no ambiente (Hondalus et al., 1997).
Apesar da prevalência em ambientes de criação de cavalos, casos de pneumonia por R. equi são esporádicos em potros e extremamente raros entre
cavalos adultos (Ellenberger et al., 1986), a menos que estejam imunossuprimidos. A taxa de morbidade mundial tem sido estimada em 5 a 17%, enquanto que na América do Norte, aproximadamente 3% das mortes de potros têm sido atribuídas a esse microorganismo (Ainsworth, 1999). A alta mortalidade está associada, entre outros, ao início tardio da terapia e à dificuldade de se diagnosticar a doença no seu estágio inicial (Anzai et al., 1997).
No Brasil, as infecções por R. equi representam a doença mais importante em potros (Ribeiro et al., 2002). No entanto, poucas investigações foram conduzidas sobre a avaliação da virulência dos isolados de R. equi de potros, e por isso, pouco se sabe sobre a prevalência de plasmídeos virulentos no Brasil (Ribeiro et al., 2002; Martins, 2003).
A infecção por R. equi causa broncopneumonia subaguda ou crônica supurativa com extensa abscedação (Prescott e Hoffman, 1993), e, secundariamente enterocolite ulcerativa, linfadenite mesentérica, osteomielite, artrite séptica e linfangite ulcerativa (Meijer e Prescott, 2004). Pode ocorrer também a deposição de imunocomplexos, que contribui para o desenvolvimento de uveíte, hipópio, anemia e trombocitopenia (Ainsworth, 1999) e polissinovite auto-imune (Ribeiro et al., 2002).
A infecção por R. equi é uma causa importante de mortalidade de potros de um a seis meses de idade. As perdas econômicas incluem o retardo no crescimento, diminuição da capacidade de trabalho, alto custo da terapia, diminuição do valor dos animais afetados e mortalidade de animais (Peiró et al., 2002).
2.2. Patogenia
Classicamente, a doença causada pelo o R. equi é insidiosa em potros. As lesões pulmonares iniciais são caracterizadas pelo influxo celular de macrófagos, células gigantes multinucleadas e neutrófilos nos alvéolos. Com a evolução da doença observa-se necrose e destruição do parênquima pulmonar coincidente com a presença de macrófagos degenerados contendo a bactéria no citoplasma (Hondalus et al., 1997).
A habilidade do R. equi em se multiplicar e destruir macrófagos alveolares é a base de sua patogenicidade (Takai et al., 1985; Prescott e Hoffman, 1993). Os fatores que determinam se o animal exposto ao R. equi elimina a bactéria ou desenvolve a doença são: a dose infectante, a virulência da cepa infectante, e o desenvolvimento de uma resposta imune apropriada (Hines et al., 1997).
A virulência do R. equi para potros está associada a uma proteína (VapA) de 15 a 17 kDa (Prescott e Hoffman, 1993). O gene que codifica o VapA está localizado em um plasmídeo virulento de 85 a 90 kb. As cepas que não contêm esse plasmídeo são incapazes de sobreviver e se replicarem nos macrófagos, sendo não virulentas para potros e camundongos (Meijer e Prescott, 2004). Assim, infecções naturais em potros são causadas basicamente pelos R. equi produtores de VapA (Takai, 1997).
Não está completamente esclarecida a resposta celular e de produção de citocinas à VapA, nem como os eqüinos respondem, exceto que a infecção sintomática tende a produzir quantidades significantes de anticorpos específicos contra VapA, detectados por “imunoblots” (Hines et al., 1997).
Além disso, a virulência parece também estar associada ao ácido micólico contido nos glicolipídeos do R. equi, pois as cepas com longas cadeias de ácido micólico foram mais letais em camundongos em infecções experimentais, em relação às cepas de cadeias mais curtas. Outros possíveis fatores de virulência incluem a cápsula polissacarídica, a colesterol-oxidase, e as exoenzimas colina fosfohidrolase (fatores equi) (Prescott e Hoffman, 1993).
2.3. Imunidade
Há evidências que tanto os anticorpos, como os linfócitos T têm papel na imunidade e que a secreção de citocinas é essencial contra a infecção causada pelo R. equi (Hines et al., 1997). A ativação de macrófagos pela via do sistema imune mediado por células e de leucócitos polimorfonucleares pela via do sistema imune humoral são necessárias para eliminar efetivamente o R. equi e superar a infecção (Martens et al., 1990).
A produção de anticorpos contra o R. equi está difundida na população de eqüinos. A idade para o desenvolvimento da pneumonia coincide com o declínio de anticorpos maternais do potro, entre 5 a 10 semanas de vida (Prescott e Hoffman, 1993). Os anticorpos atuam principalmente opsonizando o
R. equi. Após a fagocitose, a bactéria não fica mais acessível à ação dos
anticorpos e a imunidade à infecção, se restringe aos eventos mediados por células (Hines et al., 1997). A opsonização do R. equi com anticorpos específicos aumenta a fusão fagossomo-lisossomo e a morte intracelular subseqüente, sugerindo que o mecanismo de entrada celular deve influenciar o destino final da bactéria (Ainsworth, 1999).
A maioria dos estudos de imunidade celular ao R. equi advém de modelos experimentais com camundongos (Hines et al., 1997). Os dois principais mecanismos pelos quais os linfócitos T mediam o “clearence” da bactéria intracelular são a destruição direta da célula infectada e a secreção de citocinas. Embora tanto os linfócitos T CD4+ (“helper”) quanto os CD8+ (citotóxicos) contribuam para a defesa do hospedeiro contra o R. equi em camundongos, os linfócitos T CD4+ apresentam maior importância e são absolutamente mais requisitados para o “clearence” pulmonar completo (Giguère, 2000).
Os linfócitos T CD4+ podem ser divididos nas classes Th-1 (resposta tipo I) e Th-2 (resposta tipo II), baseados nos distintos padrões de produção de citocinas. As células Th-1 são definidas pela habilidade em produzir interferon gama (IFN-γ) e interleucina 2 (IL-2), enquanto que as Th-2 produzem IL-4, IL-5 e IL-10. O balanço relativo das respostas tipo I “versus” tipo II determina o resultado, incluindo a habilidade dos hospedeiros infectados em controlar o número de patógenos intracelulares. Esse efeito é mediado pelas respectivas
linfocinas produzidas (Hines et al., 1997). O IFN-γ é a citocina que mais ativa o macrófago que regula os mecanismos celulares para a morte do microorganismo, sendo potencializado pela IL-2. Em contraste, a IL-10 regula negativamente a atividade do macrófago, e os potros afetados parecem manter a infecção pelo R. equi devido à resposta das células 2, mesmo se a de Th-1 for induzida (Ainsworth, Th-1999).
2.4. Métodos diagnósticos
É difícil diagnosticar a infecção por R. equi no estágio inicial e distinguir a pneumonia causada por esse agente, de outras doenças respiratórias (Prescott e Hoffman, 1993; Anzai et al., 1997).
A infecção por R. equi é diagnosticada pela associação da anamnese, exame físico e exames complementares.
No histórico, é importante salientar a cronicidade da doença, presença de outros potros acometidos, condições do ambiente que promovem a disseminação aerógena do agente (Ainsworth, 1999), além da adequada ingestão de colostro pelo potro ao nascimento e se a doença é endêmica na fazenda.
No exame físico, são evidentes sinais de doença respiratória, associados ou não a sinais de enterite, artrite e linfadenopatia.
A hematologia geralmente revela leucocitose com neutrofilia, hiperfibrinogenemia, anemia e, ocasionalmente, trombocitopenia (Ainsworth, 1999) ou trombocitose (Leadon et al., 1988). O monitoramento da contagem de leucócitos é útil para detecção precoce de potros infectados, em planteis com alta prevalência de pneumonia por R. equi (Giguère et al., 2003).
A radiografia torácica pode apresentar padrão alveolar proeminente com consolidação pulmonar, lesões nodulares e linfadenopatia hilar (Peiró et al., 2002). No entanto, esse método apresenta pouco valor para se estimar o prognóstico, já que é difícil o diagnostico no estágio inicial da doença (Anzai et al., 1997).
A ultra-sonografia pulmonar é útil quando o envolvimento do parênquima é periférico (Peiró et al., 2002), podendo-se observar áreas de consolidação pulmonar e densidades nodulares discretas (Ainsworth, 1999).
Segundo Takai et al. (1986a), potros com pneumonia por R. equi eliminam grande número de bactérias (106 a 108/ grama de fezes) e o cultivo quantitativo pode ser um método diagnóstico complementar da infecção.
A aspiração traqueal ou brônquica tem sido realizada tanto pela técnica de inserção percutânea, usando agulha e sonda de polietileno, quanto pela técnica de inserção transnasal de um endoscópio. O primeiro método tem a vantagem de colher os aspirados evitando-se a contaminação do trato anterior,
porém causa injúria ao potro. Já o segundo não é traumático ao potro, mas requer equipamento caro e pesado (Anzai et al., 1997). Anzai et al. (1997) relataram que a técnica de colheita intranasal do aspirado traqueal por meio de um cateter de silicone é um método fácil e confiável sem ser prejudicial ao animal, podendo ser útil para colheitas a campo. No entanto, deve-se evitar sua realização em animais com intensa dispnéia (Giguère e Prescott, 1997).
Em virtude da falta de estudos a campo comparando a sensibilidade e a especificidade dos testes sorológicos, o cultivo bacteriano associado ao exame citológico do lavado traqueobrônquico permanecem como os métodos de escolha no diagnóstico de pneumonia por R. equi (Giguère e Prescott, 1997). Anzai et al. (1997) concluíram que a combinação da aspiração traqueal com o isolamento bacteriano foi o método de maior valor para o diagnóstico de pneumonia por R. equi em potros. No entanto, potros sem doença clínica, expostos a ambientes contaminados, podem apresentar R. equi presente na traquéia como resultado da inalação de poeira contaminada (Giguère e Prescott, 1997).
O diagnóstico definitivo é assim, baseado no isolamento do R. equi e na citologia de aspirados transtraqueais (Ainsworth, 1999). Entretanto, cultivos positivos devem ser interpretados no contexto dos sinais clínicos, uma vez que os potros podem inalar o microorganismo e eliminá-lo efetivamente sem desenvolver o quadro de pneumonia (Peiró et al., 2002). Além disso, o cultivo bacteriano requer dois dias ou mais para o desenvolvimento da colônia típica de R. equi no meio Àgar-sangue (Anzai et al., 1997).
Os testes sorológicos empregados no diagnóstico de R. equi são divididos em três maiores tipos: a imunodifusão em ágar gel, inibição sinérgica da hemólise e o teste ELISA (Giguère e Prescott, 1997). Os três testes detectam o anticorpo contra R. equi e parecem ser úteis no diagnóstico dos estágios mais avançados da doença (Prescott e Hoffman, 1993). No entanto, esses testes apresentam limitações, quando houver grande exposição dos potros a esse microorganismo numa idade precoce, levando à produção de anticorpos sem que haja necessariamente a manifestação de sinais clínicos. Além disso, os anticorpos maternos causam reações positivas em alguns métodos sorológicos, podendo confundir sua interpretação (Giguère e Prescott, 1997).
A técnica de reação em cadeia pela polimerase (PCR) tem sido aplicada a amostras de sangue ou aspirados transtraqueais, a fim de melhorar a sensibilidade do diagnóstico e reduzir o período de espera necessário para o isolamento do microorganismo. No entanto, esse método deve ser utilizado como auxiliar ao cultivo bacteriano, por ser muito sensível e poder apresentar resultados falso-positivos (Peiró et al., 2002). Takai et al. (1995), referem que, se trata de um método sensível e específico para a identificação de plasmídeos de R. equi baseado na seqüência de DNA, sendo inclusive mais rápido que os procedimentos de rotina, como o cultivo bacteriano (Takai et al., 1998).
Segundo Anzai et al. (1997), os métodos de PCR e de imunofluorescência direta podem não somente detectar o R. equi, como também confirmar sua virulência. No entanto, são menos específicos que o cultivo bacteriano. Assim, os autores sugerem que as duas técnica são úteis na rápida detecção do R. equi virulento nos aspirados traqueais, mas têm menor valor para o diagnóstico nos estágios inicias da doença, quando comparados ao cultivo microbiano. Mas se há eliminação da bactéria nas vias aéreas e elas não podem ser isoladas pelas técnicas de cultivo padrão, pois estão dentro dos fagócitos, esses métodos parecem ter maior sensibilidade na detecção da bactéria nos aspirados traqueais colhidos de potros com pneumonia crônica, em casos a campo (Anzai et al., 1997).
No exame de necropsia, é observada broncopneumonia abscedante bilateral, com evidência de obstrução de vias aéreas, congestão e consolidação do parênquima pulmonar. A abscedação pode se estender para os linfonodos brônquicos e mediastínicos, que podem conter material que varia de purulento a caseoso. Histologicamente, as lesões são granulomatosas, contendo material caseoso com numerosos macrófagos e neutrófilos. Lesões gastrintestinais são caracterizadas histopatologicamente pela presença de necrose de mucosa, membranas diftéricas e atrofia de vilosidades (Ainsworth, 1999). O exame “post-morten” tem grande importância nos casos de evolução rápida onde os potros não foram avaliados clinicamente.
2.5. Epidemiologia
Potros nascem naturalmente agamaglobulinêmicos visto que a placenta, epiteliocorial, não permite a transferência de imunoglobulinas maternas para o feto. A ingestão de colostro e absorção dos anticorpos maternos deve ocorrer para que o potro obtenha anticorpos passivamente, para a proteção contra organismos oportunistas e patogênicos a que são expostos, logo após o nascimento (De Luca et al., 2001). No entanto, segundo Takai et al. (1989), a hipogamaglobulinemia não deve ser o único fator predisponente para a infecção por R. equi nos potros, sugerindo que outros fatores concorrem para a ocorrência da doença.
A susceptibilidade de potros ao R. equi é atribuída, em parte, à imaturidade das repostas imunes, humoral e mediada por células (Peiró et al., 2002). A exposição de grande número de bactérias virulentas, no período em que os níveis de imunoglobulinas maternas estão diminuindo (quatro a seis semanas de vida), é sugerida como o maior fator do desenvolvimento de infecções por R. equi (Ainsworth, 1999).
As fezes são as fontes iniciais de exposição para potros jovens, que realizam coprofagia (Peiró et al., 2002), que é um comportamento natural dos potros. Eles podem inalar grande número de microorganismos quando se alimentam ou mesmo quando cheiram fezes secas. Quanto maior a densidade populacional, maior o risco de infecção. Há também o risco de gastroenterite fatal causada pela ingestão do R. equi (Clarke, 1989).
Takai (1997) considera que: a) o R. equi avirulento está difundido nas fezes de cavalos e em seu ambiente, em todas as propriedades; b) há alta contaminação por R. equi virulento nas fezes e no ambiente em propriedades nas quais a doença é endêmicas, mas não em fazendas onde não há problemas, sugerindo que os potros criados nestas são expostos mais freqüentemente ao R. equi virulento em relação aos potros de fazendas em que não há problemas; c) apenas o R. equi virulento é isolado de lesões de potros naturalmente infectados, mostrando que infecções naturais são causadas principalmente pelo R. equi virulento; e d) potros infectados, que constantemente eliminam grande quantidade de R. equi virulento nas fezes, são a maior fonte de infecção para outros potros e de contaminação do
ambiente por cepas virulentas, e esse deve ser o mecanismo de desenvolvimento progressivo da infecção em fazendas com doença endêmica.
A maioria dos casos ocorre durante clima seco e quente, pois são condições ótimas para multiplicação bacteriana e os potros inalam partículas contaminadas na poeira (Meijer e Prescott, 2004). Estábulos pouco ventilados, com poeira e lotados aumentam o risco de infecção por R. equi em virtude de favorecerem a aerossolização (Clarke, 1989). Takai et al. (1987) comprovaram tal fato, pois isolaram R. equi do ar nos estábulos, e o número de bactérias dispersas no ar aumenta particularmente em dias secos e quentes.
Potros que adquiriram anticorpos maternos pelo colostro em níveis adequados desenvolvem “maturidade” imunológica e melhores respostas imunes primárias e protetoras (Hines et al., 1997), diminuindo o risco de apresentarem doença clínica, apesar de estarem expostos à infecção.
2.6. Profilaxia
2.6.1. Imunidade vacinal de éguas e potros
Somente a ingestão de colostro de éguas hiperimunizadas não é suficiente para promover proteção total aos potros (Martens et al., 1991). Sugere-se que os isotipos de imunoglobulinas que mediam os efeitos críticos do plasma, não devem ser eficientemente transferidos no colostro; os imunógenos e/ou os protocolos de imunização não devem induzir anticorpos suficientemente; que não haja especificidade apropriada ao antígeno ou que parte dos efeitos protetores do plasma imune incluam fatores não humorais (Hines et al., 1997).
Prescott et al. (1996) demonstraram que éguas prenhes imunizadas com antígeno VapA desenvolvem boa produção de anticorpos que foram transferidos para os potros pelo colostro. No entanto, a capacidade protetora desses anticorpos colostrais anti-VapA em potros ainda não está totalmente comprovada. Assim, precisa-se ainda determinar como o VapA poderá ser utilizado como imunógeno na infecção por R. equi (Hines et al., 1997).
Becú et al. (1997) reportaram que a vacinação de éguas, usando vacina contendo VapA (entre outros fatores), diminuiu significativamente a prevalência de pneumonia em potros em fazendas onde a doença é endêmica de 3% para 1,2%. Além disso, em outra fazenda, a vacinação de éguas e a administração de plasma hiperimune aos potros reduziram de 6% para 0% a ocorrência da enfermidade. Esses autores também concluíram que a vacinação ativa parenteral de potros não foi eficaz.
Prescott et al. (1997) relataram que a vacinação de éguas e potros com antígeno contendo VapA não protegeu os potros e, em contrapartida, deve ter aumentado a ocorrência de pneumonia por R. equi nos potros. No entanto, Varga et al. (1997) sugerem que potros com baixa titulação de anticorpos durante a primeira semana de vida adquiriram proteção pela vacinação repetida na terceira, quinta e sétima semanas de vida, e não devido à vacinação das mães.
Cauchard et al. (2004) relataram que, comparada com a administração de plasma hiperimune, que é de custo elevado e de obtenção trabalhosa, a
imunização de éguas prenhes com VapA, associada a um adjuvante de nanopartícula baseado em água forneceu uma proteção passiva aos potros mediada por anticorpos anti-R. equi a um custo menor.
A imunização ativa de éguas com antígeno protetor parece ser consideravelmente mais conveniente, no controle de pneumonia por R. equi em fazendas afetadas enzooticamente, do que a administração de grande volume de plasma intravenoso. Para isso, necessitam-se de mais estudos para examinar a imunização ativa, baseados na melhor compreensão de antígenos de importância e no método de associação de adjuvante para produzir resposta imune Th-1 efetiva, para proteção contra pneumonia por R. equi (Giguère e Prescott, 1997; Prescott et al., 1997).
2.6.2. Terapia com plasma
Embora a imunidade mediada por células seja considerada responsável pela eliminação da infecção por R. equi, a proteção com soro ou plasma hiperimune tem sido demonstrada tanto em infecções experimentais como naturais (Martens et al., 1989). Porém, avaliando-se os estudos que utilizaram o plasma hiperimune para prevenção de rodococose, pode-se observar que apenas 2 de 5 estudos comprovaram a eficácia deste procedimento no manejo profilático desta enfermidade (Giguère e Jacks, 2005).
Pela ingestão do colostro, a imunoglobulina G (IgG), é primariamente absorvida através de células especializadas, presentes no intestino delgado, por 18 a 24 horas após o nascimento. Os potros que não absorvem quantidade adequada de imunoglobulinas colostrais são considerados como portadores de falhas na transferência passiva (FTP). Há muitas circunstâncias que podem resultar na FTP, como lactação prematura, potros órfãos, potros rejeitados, potros muito fracos para mamar, concentração baixa de anticorpos no colostro ou baixa absorção de anticorpos pelo potro (De Luca et al., 2001).
A transferência passiva de imunidade humoral protege os potros de muitas doenças de neonatos. Isso é comumente alcançado pela transferência passiva de anticorpos pelo colostro da mãe, podendo também ser realizado pela administração parenteral de plasma hiperimune, soro ou gamaglobulina de
doadores sensibilizados. O plasma e o soro contêm anticorpos opsonizantes e neutralizantes específicos, além de fatores não específicos como a fibronectina, interferons, linfocinas, monocinas, entre outros (Martens et al., 1990), de elevada importância na imunidade neonatal.
A terapia para FTP em potros com mais de 18 a 24 horas de vida inclui administração de fonte exógena de imunoglobulinas. Nessas situações, o plasma eqüino por via intravenosa é a terapia de escolha. No entanto, encontrar um doador adequado e obter plasma fresco pode ser inconveniente e consumir muito tempo. Plasma congelado pode ser adquirido comercialmente, mas é caro e deve ser descongelado cuidadosamente antes da administração (De Luca et al., 2001).
Até o momento, a transfusão de plasma hiperimune é considerada o método de eleição para se evitar a pneumonia por R. equi, tanto experimentalmente, quanto em condições a campo (Peiró et al., 2002). De Luca et al. (2001) obtiveram bons resultados com o tratamento com plasma hiperimune, aumentando as concentrações séricas de IgG nos potros infectados, ao contrário dos animais tratados com soro.
A administração de plasma hiperimune para potros no primeiro mês de vida, em fazendas com infecção endêmica, diminui a ocorrência de pneumonia por R. equi (Prescott e Hoffman, 1993). No entanto, o plasma deve ser administrado antes do desafio pelo agente. A administração de plasma hiperimune aos potros, sete dias após o desafio com R. equi, não alterou o curso da doença. O mecanismo pelo qual a transferência de plasma hiperimune promove proteção e sua relação com os anticorpos maternos ainda não são completamente conhecidos (Hines et al., 1997).
O período ideal para a administração do plasma hiperimune para potros em fazendas onde a doença é endêmica, não está claro. Cohen et al. (2001) sugerem que, como a infecção pelo R. equi ocorre geralmente durante a primeira semana de vida, as medidas preventivas, como a administração de plasma hiperimune, devem ser mais efetivas se realizadas durante esse período. Novos estudos são necessários para avaliar o melhor período para a administração do plasma. Entretanto, a infusão dentro da primeira semana de vida, seguida por uma segunda administração entre 25 a 30 dias idade, parece ser a melhor indicação até o momento (Giguère e Prescott, 1997).
Apesar da imunização passiva de potros ser altamente benéfica e de custo acessível, na prevenção de infecção por R. equi, em muitas fazendas, diferentes falhas também foram relatadas (Giguère e Prescott, 1997). Hurley e Begg (1995), em um estudo com a administração de plasma hiperimune ,com altos níveis de anticorpos dentro das 48 horas após o nascimento, verificaram falha na proteção contra pneumonia causada pelo R. equi: nove de 34 potros (26%) que foram transfundidos e 12 de 57 (21%) não tratados desenvolveram pneumonia. As razões para essa falha são desconhecidas, mas parecem estar relacionadas à exposição ao R. equi, após o declínio dos anticorpos passivamente transferidos.
Martens et al. (1989) assinalaram a importância da imunidade humoral e a eficiência da imunoterapia ativa humoral, contra a pneumonia por R. equi em potros. A administração parenteral de plasma hiperimune protegeu efetivamente contra a infecção
2.6.3. Fatores relacionados ao manejo
Outros meios de controlar a doença incluem exame clínico dos potros duas vezes por semana em fazendas onde a ocorrência é endêmica; descanso dos “paddocks” para que haja crescimento de pasto; aumento da área para que os potros fiquem dispersos e menos concentrados; diminuição da densidade populacional de animais nos piquetes, para que haja menor consumo do pasto; reduzir as condições de poeira e areia; remoção e compostagem do esterco; quarentena para potros recém-adquiridos ou vindos de fazendas endemicamente afetadas; concentrar partos nos períodos mais frios do ano; assegurar adequada ingestão de colostro pelo potro; e realizar exames regulares e cuidadosos de potros inapetentes, com febre ou tosse, ou com qualquer evidência de doença do trato respiratório posterior (Prescott e Hoffman, 1993).
2.7. Tratamento
O reconhecimento precoce da doença, o isolamento e o tratamento de potros reduzem a perda dos animais e previne a propagação de microorganismos virulentos (Prescott e Hoffman, 1993).
No passado, a mortalidade associada à pneumonia por R. equi era considerada muito alta (50% a 80%) fundamentada no uso de penicilina, aminoglicosídeos ou associações com trimetoprim-sulfonamida (Barton e Hughes, 1980). O R. equi mostra sensibilidade a diversas drogas antibacterianas “in vitro”. No entanto, “in vivo”, a efetividade da terapia antimicrobiana é variável, inclusive com o aparecimento de recidivas (Peiró et al., 2002).
A combinação de eritromicina e rifampicina é considerada a terapia de escolha no tratamento de pneumonia por R. equi em potros (Prescott e Hoffman, 1993), em virtude de apresentarem-se como fármacos lipossolúveis com boa penetração em membranas celulares, alcançando altas concentrações terapêuticas nos pulmões, nas secreções bronquiais e no interior de fagócitos, permanecendo ativas dentro dos piogranulomas (Zertuche e Hillidge, 1987). Hillidge (1987) relata que 50 de 57 potros (88%) se recuperaram da doença, utilizando essa combinação, nas doses de 25 mg/kg de eritromicina, três vezes ao dia, e 5 mg/kg de rifampicina, duas vezes ao dia, com duração de quatro a nove semanas de tratamento.
Apesar de incomum, alguns potros podem desenvolver diarréia severa no início da terapia, sendo recomendada a suspensão das drogas e uma terapia intensiva para restabelecer o equilíbrio hídrico, eletrolítico e ácido-básico. Outros efeitos colaterais dessa associação de antibióticos são inapetência, desconforto abdominal, diarréia, assim como sinais de úlcera gástrica (Hoffman, 1993). Mães de potros que estão sendo medicados com eritromicina podem desenvolver colite grave causada por clostrídios, talvez devido à ingestão de metabólitos ativos da droga excretados pelos potros (Gustafsson et al., 1997).
Jacks et al. (2001) citam que a eritromicina causa vários efeitos colaterais. Possui absorção inconstante quando oferecida por via oral e seu uso está associado a cepas multi-resistentes. A claritromicina e a azitromicina
são mais estáveis, melhor absorvidas e atingem melhor concentração tanto nos tecidos como dentro dos fagossomos (Giguère et al., 2004), além de causarem menor efeito gástrico (Davis et al., 2002). A azitromicina é um antimicrobiano comumente usado na medicina humana e, devido às suas vantagens em relação à eritromicina, entre elas, a administração a cada 24 horas, está se tornando uma alternativa atraente para o tratamento de infecções por R. equi (Jacks, et al., 2001). A dose indicada é de 10mg/kg, 1 vez ao dia, por três dias consecutivos, seguida de mais três aplicações em dias alternados.
Uma terapia adicional deve incluir a infusão de fluido intravenoso em potros desidratados. A nebulização com solução salina pode melhorar o “clearence” mucociliar e a expectoração. Os potros que estiverem sofrendo de angústia respiratória requerem oxigenioterapia, que pode ser feita por insuflação nasal com moderada hipóxia ou por oxigenação transtraqueal percutânea em animais severamente hipoxêmicos (Prescott e Hoffman, 1993).
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo geral:
Verificar a produção de anticorpos específicos em éguas prenhes vacinadas contra Rhodococcus equi e avaliar a transferência passiva destes anticorpos para os potros.
3.2. Objetivos específicos
Determinar se éguas vacinadas com uma vacina contra R. equi há um ano apresentam anticorpos contra R. equi, utilizando a prova de imunodifusão.
Verificar se éguas com anticorpos específicos contra R. equi presentes antes do parto são capazes de transferir esta imunidade para os potros após a ingestão de colostro.
Verificar a ocorrência de rodococose durante os primeiros 150 dias de vida
Verificar se há presença ou não de anticorpos séricos contra R. equi aos 150 dias de vida.
Verificar a capacidade de recuperação deste agente no lavado traqueal e nas fezes de potros manejados em uma propriedade que regularmente apresentou problemas de rodococose em anos anteriores.
Verificar a microbiota bacteriana isolada de lavado traqueal e nas fezes em potros.
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Criatório
O estudo foi conduzido numa propriedade localizada em Itapira-SP. A propriedade possui 520 animais de Puro Sangue Lusitano, todos registrados, dos quais 157 são fêmeas em idade reprodutiva, 21 são garanhões em atividade, 5 garanhões aposentados, 250 potros e potrancas entre 1 e 36 meses de idade, além de outros 87 animais (inteiros, castrados e fêmeas) que estão sendo trabalhados diariamente atrelados ou montados no campo, no picadeiro e na pista de adestramento.
Minhas atividades clínicas foram iniciadas nesta propriedade em 25 de maio de 1997 e nesta época, a rodococose era endêmica no haras. Foram introduzidas alterações no manejo e procedimentos de controle e de terapia incluindo a vacinação contra R. equi nas éguas prenhes e a administração de plasma hiperimune nos potros recém-nascidos.
4.2. Animais e grupos
O estudo foi realizado entre os meses de setembro e março, em duas temporadas de monta, 2002-2003 e 2003-2004.
Ao longo do estudo foram realizados todos os procedimentos padrões de profilaxia, já instituídos no plantel, incluindo vacinação, vermifugação e controle de ectoparasitas.
As vacinas utilizadas são as anti-rinopneumonite e influenza1, anti-tetânica e encefalomielite2, realizadas anualmente no mês de fevereiro, além da anti-rábica3, realizada duas vezes ao ano, nos meses de maio e novembro. A vacinação anti-Rhodococcus equi4 é realizada nas éguas prenhes 45 e 15
1
Fluvac® EHV 4/1, Fort Dodge
2
Equiloide®, Fort Dodge
3
RaiVet®, Biovet
4
dias antes do parto previsto. Também é realizada vacinação anti-rinopneumonite5, no quinto, sétimo e nono mês de gestação.
Quanto às vermifugações, são realizadas de 5 a 6 vezes ao ano, intercalando-se os princípios ativos. Os mais utilizados nesta propriedade são: moxidectina6 e associação de praziquantel com ivermectina7.
Para o controle de carrapatos são realizados banhos com bomba costal, com produto à base de piretróide8 na diluição 2:1000 ml, a cada 21 dias. Esporadicamente, dependendo da ocorrência, também é utilizada medicação “pour on” à base de fipronil9.
No manejo dos neonatos incluem-se a anti-sepsia do umbigo com iodo 2% e pulverização do local com repelentes de moscas e larvas de insetos. Estes procedimentos são realizados uma vez ao dia até o quinto dia de vida. A administração de plasma hiperimune na primeira semana de vida, também faz parte da rotina, sendo rotineiramente indicado para animais negativos no teste de imunodifusão para Rhodococcus equi, potros de alto valor zootécnico, e também os neonatos com predisposição a alguma doença, tais como nascidos com síndrome do mal-ajustamento neonatal.
A maioria dos potros nasce em dois piquetes especialmente destinados para a parição das éguas. Estes piquetes são denominados de “maternidade”, nos quais os potros permanecem durante os 5 dias em que seus umbigos estão sendo curados e, posteriormente, são conduzidos para outro piquete onde seguirão o manejo rotacional do restante da propriedade. Até os seis meses de idade são vermifugados a cada trinta dias intercalando-se os princípios já citados. A partir dos seis meses eles passam a seguir o manejo do restante dos animais. Aos cinco meses recebem a primeira dose de vacina contra influenza e rinopneumonite1 além de tétano e encefalomielite2. Um mês após a primeira dose recebem a dose de reforço das mesmas.
A produção de plasma é realizada na propriedade. Para a colheita são escolhidos animais adultos, saudáveis e vacinados contra diversas enfermidades tais como: Tétano, Influenza, Rinopneumonite, Encefalomielite,
5
Pneumabort®, Fort Dodge
6
Equest®, Fort Dodge
7
Ivermectina Gel Composto®, Ouro Fino
8
Barrage®, Fort Dodge
9
Rhodococcus equi, Salmonela spp, Rotavirus, Sreptococcus spp, Escherichia coli e Klebsiella spp. Após a colheita (10 litros de sangue) de cada animal a
bolsa é armazenada em temperatura de 5ºC durante 24 horas para que após a sedimentação da fração vermelha do sangue possa ser feita a passagem do plasma para as bolsas satélites, que comportam 1 litro de plasma. Em média, cada doador produz 5 litros de plasma a cada 45 dias.
Os animais que participaram do estudo também não sofreram alterações alimentares, isto é, seguiram o manejo alimentar indicado para a categoria, já instalado na propriedade. Assim, estes foram mantidos em piquetes formados com gramínea de Tifton 85, recebendo sal mineral e água potável “ad libidum”, além de suplementação com ração comercial10.
A propriedade possui um programa de conservação e reforma de pastagens. Para isto os piquetes são manejados de acordo com a época do ano e carga de animais. As éguas costumam formar grupos de aproximadamente 20 cabeças, independentemente de estarem acompanhadas ou não de seus potros. Para cada grupo de éguas tem-se à disposição quatro piquetes, realizando-se um rodízio de acordo com a oferta de alimento. Em média, cada piquete é utilizado durante três semanas, e geralmente, ficam em repouso por nove semanas. A cada ano são reformadas em torno de 10% das pastagens.
Todos os animais utilizados passaram por um exame clínico antes da realização de qualquer procedimento. As horas seguintes ao parto também foram acompanhadas, procurando observar estado geral da égua e do potro, além de avaliar a presença de colostro, sua qualidade e garantia de ingestão deste pelo neonato.
Assim sendo o estudo foi dividido em três fases:
Na primeira fase foi selecionado um grupo de 78 éguas vacinadas contra
R. equi, 45 e 15 dias antes do parto previsto, e seus respectivos potros, com a
finalidade de verificar tanto a resposta imune das éguas após a vacinação contra R. equi, quanto a transferência de imunidade passiva destas para os potros através do colostro.
10
A segunda fase foi realizada com 45 éguas e seus respectivos potros divididos em três grupos com a finalidade de verificar se ocorreria a enfermidade nestes animais e se seria possível a recuperação do agente no lavado trans-traqueal ou nas fezes:
O grupo I foi constituído por 24 éguas vacinadas contra R. equi, 45 e 15 dias antes do parto previsto, e seus potros não vacinados (n=24). Estes potros, ao nascimento, mamaram colostro de suas próprias mães, tiveram o sangue colhido 48 horas após o nascimento, e obtiveram resultado positivo no teste de imunodifusão11. Estes potros não receberam plasma hiperimune contra R. equi. O grupo II foi constituído por 11 éguas vacinadas contra R. equi, 45 e 15 dias antes do parto previsto, e também por seus potros não vacinados (n=11). Estes potros, ao nascimento, mamaram colostro de suas próprias mães, tiveram seu sangue colhido 48 horas após o nascimento, e obtiveram resultado negativo no teste de imunodifusão. Estes potros receberam 1 litro de plasma hiperimune anti-R. equi na primeira semana de vida
O grupo III, foi constituído por 10 éguas não vacinadas e também por seus filhos (10). Estes potros, ao nascimento, mamaram colostro de suas próprias mães, tiveram seu sangue colhido 48 horas após o nascimento, e obtiveram resultado de titulação variável no teste de imuno difusão comercial. Estes potros não receberam plasma hiperimune contra R. equi.
As 10 éguas prenhes do grupo III, não foram vacinadas e tiveram amostra de sangue colhidas para imunodifusão 7 dias antes do parto previsto. As 78 éguas integrantes da primeira fase (total de animais onde já estão inclusas as 35 éguas integrantes dos grupos I e II da segunda fase) tiveram amostras de sangue colhidas para imunodifusão em três momentos distintos: Antes da aplicação da primeira dose de vacina contra R. equi, antes da segunda aplicação e 10 dias após a segunda aplicação.
As amostras de sangue das 88 éguas foram colhidas com agulhas de colheita a vácuo 21G12, e armazenadas em tubos de colheita de sangue a vácuo sem anticoagulante13. Após a colheita, a amostra permanecia em repouso por um período de aproximadamente duas horas para que houvesse a
11
Rododiagnos®, Clinica Eqüina SRL, Capitán Sarmiento, Argentina
12
Vacutainer®, Becton Dickinson
13
sedimentação da parte vermelha e retração do coágulo. O soro foi retirado com seringa descartável14 de 3ml, acoplada a uma agulha 40X0,8015, e armazenado em frascos plásticos cônicos de 1,5ml. Após armazenagem do soro, este era congelado em “freezer” a uma temperatura de -20ºC. Estas amostras eram semanalmente enviadas para serem analisadas no Laboratório Clínico de Eqüinos – Mogi Mirim – SP. As amostras de soro sangüíneo dos animais foram testadas pela técnica de imunodifusão em gel de ágar (Mancini et al., 1965; Fahey et al., 1965), utilizando o ¨kit¨diagnóstico ¨Rhododiagnos¨, de acordo com as recomendações do fabricante. Embora as interpretações de animais positivos no ¨kit¨ apresentem variações quanto à intensidade (fraco e forte positivo), foi considerado positivo, no presente estudo, toda e qualquer reação de precipitação no teste.
Os potros que compuseram a primeira fase tiveram uma amostra de sangue colhida com 48 horas de vida, simplesmente para a verificação de transferência de imunidade passiva através do colostro, enquanto que os potros dos grupos I, II e III(segunda fase), tiveram amostras de sangue colhidas às 48 horas e aos 150 dias de vida. A colheita e armazenagem destas amostras seguiram o mesmo padrão utilizado nas éguas.
Amostras de lavado trans-traqueal e “swabs” transretais foram colhidas dos potros (grupos I, II e III), aos 45 e 90 dias de vida. Ambos os procedimentos foram realizados com leve sedação com 1ml de acepromazina por via intravenosa. Para a colheita de lavado transtraquel também foi necessário o uso de 1 ml de Cloridrato de lidocaina 2% sem vasoconstritor16 para anestesia local. A contenção dos potros foi feita por dois auxiliares de enfermagem.
Para a colheita de material trans-traqueal foi utilizado cateter intracardíaco com agulha acoplada 14G17. O procedimento consistiu na passagem da agulha, entre os anéis traqueais, no terço final do pescoço para infusão intratraqueal de 20 a 40 ml de solução de cloreto de sódio 0,9% e posterior recuperação do líquido infundido. Após a colheita o material foi armazenado em tubos de colheita de sangue a vácuo e mantido em condições
14
Unijet®, Plascalp
15
Precision Glide®, Becton Dickinson
16
Coridrato de Lidocaína 2%, Genérico Hipolabor
17
de refrigeração, sendo encaminhado para o Laboratórios de Enfermidades Infecciosas dos Animais da FMVZ-UNESP/Botucatu-SP, no mesmo dia da colheita. O material foi submetido a exames microbiológicos, semeado-o nos meios de ágar sangue ovino (5%) desfibrinado e ágar MacConkey, mantidos por 96 horas, em condições de aerobiose, a 37oC. O R. equi foi identificado segundo características morfo-tintorias, bioquímicas e de cultivo, incluindo teste de CAMP (KRIEG; HOLT, 1994; QUINN et al., 1994).
Após o uso, os cateteres intracardíacos com agulha acoplada 14G, foram enviados para esterilização com óxido de etileno e foram utilizados por 3 vezes.
Para a colheita transretal foram utilizados “swabs”18. A colheita foi realizada esfregando-se o “swab” na parede da ampola retal do potro. Após a colheita, o material foi armazenado no próprio recipiente e mantido em condições de refrigeração sendo encaminhado para o Laboratório de Enfermidades Infecciosas dos Animais da FMVZ-UNESP/Botucatu-SP, no mesmo dia da colheita. No laboratório as amostras fecais foram semeadas nos meios de ágar sangue ovino, MacConkey e no caldo tetrationato, e mantidas em condições de aerobiose a 37oC. Após 12 horas, o material fecal, disposto no meio de tetrationato foi semeado no ágar de Salmonella-Shigella (SS), mantido em condições de aerobiose, a 37ºC, por 24 h. Após 24 horas os microrganismos isolados nos meios de SS, sugestivos do gênero Salmonella (colônias com centro enegrecido) e no ágar MacConkey ou ágar sangue foram identificados segundo suas características morfo-tintoriais, bioquímicas e de cultivo (Edwards & Ewing, 1972; Krieg & Holt, 1984; Quinn et al., 1994). O material foi também submetido a exames microbiológicos, semeado nos meios de ágar sangue ovino (5%) desfibrinado e ágar MacConkey, mantidos por 96 horas, em condições de aerobiose, a 37oC, para o diagnóstico de outras enterobactérias e do R. equi.
Os potros da primeira fase foram acompanhados durante o crescimento, mas não tiveram colhidas amostras de swab transretal e lavado traqueal. Deste grupo, foram analisadas apenas as amostras de sangue colhidas das éguas, nos três momentos citados anteriormente e também as amostras colhidas dos
18
potros com 48 horas de vida. O principal motivo de existência deste grupo foi à necessidade de maior número de éguas e potros para melhor avaliação da resposta imunológica da vacina e também da transferência de imunidade passiva pelo colostro.
A terceira e última fase do experimento, realizada durante a temporada 2003-2004, foi composta por um grupo de 45 éguas, com a finalidade de verificar se a imunidade adquirida, com a vacinação contra o R. equi, persistiu de uma temporada a outra. Estas éguas também fizeram parte da primeira fase do experimento. Portanto, foram vacinadas na temporada 2002-2003. Antes que fosse dada a primeira dose de vacina anti-R. equi da temporada 2003-2004, isto é, 45 dias antes do parto previsto, foi colhida amostra de sangue para imunodifusão. O processo de coleta, armazenagem e envio seguiu o mesmo padrão da temporada anterior.
Tabela 1 – Fases do experimento.
Fases Animais e Grupos Finalidades
Primeira 78 éguas vacinadas e seus respectivos potros Verificar soroconversão e transferência de anticorpos
Sda
G1: 24 éguas vacinadas e seus respectivos potros positivos e sem plasma hiperimune. G2: 11 éguas vacinadas e seus respectivos potros negativos e com plasma hiperimune.
G3: 10 éguas não vacinadas e seus respectivos potros com resultados variados e sem plasma hiperimune.
Verificar presença de anticorpos contra R. equi aos 150 dias de vida. Capacidade de recuperação do R. equi Verificar a microbiota traqueal e retal. Verificar a ocorrência de rodococose.
Terceira 45 éguas vacinadas na temporada anterior Presença de anticorpos contra
R. equi, um ano após última
4.3. Analise dos resultados
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Durante a realização deste estudo, não foi alterado o manejo diário da propriedade. As medidas profiláticas associadas ao controle da rodococose foram mantidas e entre elas está o manejo de pastagem. Na propriedade as pastagens são manejadas de acordo com o volume e a qualidade da massa verde disponível e também de acordo com o número de animais por piquete, variando assim o tempo de permanência em cada piquete. De maneira geral os lotes são formados de acordo com o número de éguas, independente delas estarem com ou sem potro ao pé. Na propriedade existe uma densidade média de 1,33 animais por hectare e a maioria dos lotes é formado por 20 animais (éguas) que por sua vez rodam em 4 piquetes de 4 a 5 hectares cada. Com a instalação de um manejo correto, tanto de rotação como do uso de defensivos e adubos, as pastagens tendem a ter mais qualidade nutricional, maior poder de rebrota e maior durabilidade. As reformas das pastagens, de uma maneira mais intensiva e ordenada, foram iniciadas em 1999. Normalmente são reformados 10% da área de pastagens da propriedade e hoje faltam 20% dela para completar o ciclo.
A instalação de reformas e de um manejo adequado das pastagens provavelmente, auxiliou na profilaxia da rodococose. Este procedimento, associado a outros já implantados em temporadas anteriores como, diagnóstico precoce da enfermidade, isolamento do potro doente, vacinação das éguas contra R. equi, testes de imunodifusão de anticorpos contra R. equi em potros com dois dias de vida e administração de plasma hiperimune nos potros negativos em temporadas anteriores, certamente contribuíram para a ausência de rodococose na temporada (2002-2003). A propriedade continuou sendo acompanhada nas temporadas seguinte, nas quais também não foram diagnosticados casos de infecção por R. equi.
Quanto aos procedimentos realizados durante o experimento temos que: a) A contenção dos potros, conforme descrita anteriormente, para a colheita de “swab” transretal e lavado traqueal foi extremamente satisfatória. O auxílio de enfermeiros, associado ao uso de acepromazina como miorrelaxante e de lidocaína 2% como anestésico local mostraram-se eficazes para a realização
do procedimento. b) A técnica usada para a colheita de lavado traqueal mostrou-se eficaz, mas apesar de simples deve ser feita sempre por um profissional experiente. A infusão de 20 ml de solução salina foi adequada para a recuperação de pelo menos 10 ml de solução contendo material turvado pelas secreções traqueais. Durante este procedimento nenhum potro se machucou e posteriormente também não houve aparecimento de edema, linfangite, celulite ou abscesso no local. c) A administração do plasma hiperimune ocorreu com o potro em estação e sem sedação sendo ele apenas contido por dois auxiliares (um segurando a cabeça e pescoço e outro a base da cauda). Neste procedimento também não ocorreram acidentes, já que o plasma já era utilizado anteriormente na propriedade e os auxiliares tinham bastante experiência neste tipo de contenção. d) A colheita de sangue tanto nas éguas como nos potros foi feita puncionando-se a jugular no terço médio do pescoço e também não foram observadas complicações durante e/ou após o procedimento.
Primeira fase: Foram colhidas amostras de 78 éguas no terço final de
gestação, que tinham recebido duas doses de vacina contra R. equi há um ano e seus respectivos potros nos momentos já citados. Os resultados foram os seguintes;
No primeiro momento (antes de receber a primeira dose de vacina
anti-R. equi) verificou-se que 29 destas 78 éguas obtiveram resultado negativo na
prova de imunodifusão para pesquisa de anticorpos específicos contra R. equi e 49 éguas obtiveram resultado positivo. Não se sabe ao certo o motivo destas 49 éguas serem positivas, mas provavelmente este resultado seja devido à persistência da imunidade adquirida com a vacina de uma temporada a outra, já que esta vacinação fazia parte do manejo profilático do haras antes do experimento ser iniciado. Entretanto não podemos excluir a possibilidade de uma parte destes anticorpos ser resultante de uma exposição ao agente no meio ambiente. Virtualmente, todos os cavalos são expostos ao R. equi desde o nascimento, e a maioria deles desenvolve respostas imunes primárias que irão protegê-los ao longo da vida Hines et al. (1996),. Adicionalmente, Peiró et al. (2002) relatam que o R. equi é encontrado nos solos, nas fezes e que também fazem parte microbiota do trato intestinal dos herbívoros. Estas 49 (62,82%) éguas positivas não tiveram alterações dos resultados nos demais
momentos, isto é, permaneceram com presença de anticorpos após a aplicação da primeira e da segunda dose de vacina. Martins (2003) observou resultados similares após colher amostras de sangue para verificação da presença de anticorpos contra R. equi antes dos animais serem vacinados.
A virulência de R. equi decorre da presença de plasmídeo, sendo os mais virulentos o 85kb tipo I-IV, 87kb I e II, e o 90kb tipo I e IV (Ribeiro et al., 2004). A vacina utilizada para estimular a produção de anticorpos contém antígenos associados ao plasmídeo 85-90 kb de virulência (VapA), além de exoenzimas “fatores equi” (colesterol oxidase e fosfolipases), antígenos capsulares, somáticos e acido micólico. Estes componentes são inativos em formol e precipitados com gel de hidróxido de alumínio.
Das 29 éguas negativas no primeiro momento foi observado, após a primeira dose de vacina, que 22 (75,86%) eram positivas e 7 permaneciam negativas. Após a segunda dose foram verificadas 26 (89,65%) positivas e 3 negativas, mostrando que a vacina promove alta soroconversão após a segunda dose, resultados similares aos estudos de Prescott et al. (1996) e de Martins (2003), que também observaram forte soroconversão em éguas prenhes imunizadas com antígeno VapA .
Quanto à análise dos potros destas éguas tivemos 69 potros (88,46%) positivos e 9 negativos. Destes, três são potros de éguas com resultado também negativo após a segunda dose. Assim, de maneira similar ao constatado por Prescott et al. (1996) e por Martins (2003), a transferência de imunidade passiva da égua para o potro através do colostro é extremamente satisfatória.
De Luca et al. (2001), assinalaram que vários motivos concorrem para uma inadequada transferência de imunidade passiva, tais como: lactação prematura, ausência ou baixa qualidade do colostro, morte da mãe, ou ainda problemas que debilitam o recém-nascido. Como não realizamos a avaliação da transferência de imunidade passiva nos primeiros dias de vida, não podemos confirmar se os animais com inadequada transferência de imunidade específica ao R. equi ingeriram adequadamente o colostro de alta qualidade. Porém, como foram acompanhados durante todo seu desenvolvimento até um ano de idade e nunca apresentaram sinais de enfermidades, possivelmente relacionadas com uma baixa transferência de imunidade passiva, é provável
