PRODUÇÃO DE FICOCIANINA E PERFIL DE ÁCIDOS GRAXOS EM CULTIVO DE SPIRULINA UTILIZANDO LEDS

PRODUÇÃO DE FICOCIANINA E PERFIL DE ÁCIDOS

GRAXOS EM CULTIVO DE SPIRULINA UTILIZANDO LEDS

D.F.Prates

, M.T.Barcia

, C.Ballus

, E.M.Radmann

,J.A.V. Costa

1- Escola de Química e Alimentos - Universidade Federal do Rio Grande, Laboratório de Engenharia Bioquímica – CEP: 96200-211 - Rio Grande - RS - Brasil, Telefone 55 (53) 32336969 - e-mail: (denisefprates@gmail.com)

2- Departamento de Tecnologia e Ciência dos Alimentos - Universidade Federal de Santa Maria, Centro de Ciências Rurais - CEP: 97105-900- Santa Maria-RS-Brasil, telefone: (55) 32208364 sub-ramal 210 – e-mail: (milene.barcia@ufsm.br)

3- Departamento de Tecnologia e Ciência dos Alimentos - Universidade Federal de Santa Maria, Centro de Ciências Rurais - CEP: 97105-900- Santa Maria-RS-Brasil, telefone: (55) 3220-8254 sub-ramal 210 – (cristiano_ballus@yahoo.com.br)

4 - Escola de Química e Alimentos - Universidade Federal do Rio Grande, Laboratório de Engenharia Bioquímica – CEP: 96200-211 - Rio Grande - RS - Brasil, Telefone: 55 (53) 32336969 –e-mail: (emradmann@yahoo.com.br)

5 - Escola de Química e Alimentos - Universidade Federal do Rio Grande, Laboratório de Engenharia Bioquímica – CEP: 96200-211 - Rio Grande - RS - Brasil, Telefone: 55 (53) 32336969 – Fax: 55 (53) 32336869 – e-mail: (jorge@pq.cnpq.br)

RESUMO – Nesse trabalho buscou-se avaliar a influencia que os diodos emissores de luz (LEDs) de cor branca, em diferentes fotoperíodos, exercem nas características nutricionais da biomassa de

Spirulina sp. LEB 18, no seu teor de ficocianina e perfil de ácidos graxos. O uso de LEDs brancos no

fotoperíodo parcial (12 h fluorescente: 06 h LED branco : 06 h escuro) e no fotoperíodo integral (12 h fluorescente: 12 h LED branco : 00 h escuro) de iluminação, promoveram a concentração da biomassa microalgal. Também estimularam a produção de lipídios totais, e alteram o perfil de ácidos graxos, especialmente dos poli-insaturados, comparado ao cultivo controle (12 h fluorescente: 12 h escuro). A produção de ficocianina (83,72±0,82 mg g-1) foi maior em fotoperíodo parcial. Sendo assim é importante essa investigação, pois os LEDs em diferentes fotoperíodos, estimulam a produção de biomassa microalgal e promovem a indução metabólica de biomoléculas de interesse comercial. ABSTRACT – In this study we sought to evaluate the influence that the light-emitting diodes (LEDs) white, in different photoperiod, have the nutritional characteristics of the biomass of Spirulina sp. LEB 18 in its phycocyanin content and fatty acid profile. The use of white LEDs in the partial photoperiod (12 h fluorescent: 06 h white LED: 06 h dark) and full photoperiod (12 h fluorescent: 12 h white LED: 00 h dark) lighting, promoted the concentration of microalgal biomass. Also stimulated the production of total lipids, and alter the profile of fatty acids, especially polyunsaturated, compared to the control culture (12 h fluorescent: 12 h dark). The production of phycocyanin (83.72 ± 0.82 mg g-1) was higher in partial photoperiod. Thus it is important to this research, because the LEDs at different photoperiods stimulate the production of microalgal biomass and promote metabolic induction commercially important biomolecules.

PALAVRAS-CHAVE: biomassa, cultivo, fotoperíodo, microalga; características nutricionais. KEYWORDS: biomass cultivation, photoperiod, microalgae; nutritional characteristics.

1. INTRODUÇÃO

Spirulina é uma microalga fotossintética procariótica (MASOJÍDEK; TORZILLO;

KOBLÍZEK, 2013), com altíssimo potencial biotecnológico, pois sua biomassa oferece produtos para utilização em alimentos, fármacos e para o setor ambiental. Salienta-se que a biomassa é fonte de aminoácidos, carboidratos, lipídios, pigmentos, enzimas, antioxidantes, exopolissacarídeos (OTERO; VINCENZINI, 2003). Ficocianina e ácidos graxos estão entre os bioprodutos extraídos das microalgas, que mais vem despertando o interesse da comunidade científica e indústrias, devido suas características e aplicabilidades.

Ficocianina (PC) é um pigmento natural, de coloração azul, hidrossolúvel, encontrado somente em cianobactérias e em algumas espécies de algas vermelhas (MARKOU; NERANTZIS, 2013). PC faz parte das ficobiliproteínas e nas células microalgais, desempenha função de captura de luz junto ao fotossistema (PSII). PC vem sendo empregada como corante em alimentos, cosméticos e fármacos (ERIKSEN, 2008; MARKOU; NERANTZIS, 2013). Recentemente foi atribuída à PC propriedades inflamatórias, oxidantes, e atividades tumorais, bem como efeitos anti-bacterianos (FERNÁNDEZ-ROJAS et al. 2014).

Os ácidos graxos (AG) nas microalgas, contém normalmente entre 12 e 22 carbonos, que podem ser saturados, mono ou poli-insaturados, estes últimos são reconhecidos pelos seus benefícios à saúde (SCHIMITZ et al. 2012). Os ácidos graxos de microalgas possuem aplicações no enriquecimento de rações animais, principalmente para peixes, fonte de ácidos graxos essenciais na dieta humana e possibilidade de uso para produção de biodiesel (OLGUÍN et al. 2001).

A luz é a fonte de energia que regula todos os organismos fotoautotróficos, por interação com os seus sistemas de captação de luz que são responsáveis pelo ajuste fino no transporte de elétrons para as reações de fotossíntese (MASOJÍDEK; TORZILLO; KOBLÍZEK, 2013). Assim, as propriedades da luz, como qualidade do espectro visível, intensidade e fotoperíodos (ciclo claro-escuro), são fundamentais para o crescimento, produtividade e composição da biomassa microalgal (MARKOU; NERANTZIS, 2013). A iluminação por LEDs (Light Emitting Diodes) em cultivos microalgais, vem ganhando espaço por se tratar de uma fonte de luz artificial mais resistente, eficiente e econômica, comparada as tradicionais lâmpadas fluorescentes (SCHULZE et al., 2014).

Diante do exposto, o objetivo do trabalho foi avaliar a influencia dos diodos emissores de luz de cor branca, em diferentes fotoperíodos, sobre as características nutricionais da biomassa de

Spirulina, teor de ficocianina e perfil de ácidos graxos.

2. MATERIAL E MÉTODOS

Para este estudo utilizou-se a microalga Spirulina sp. LEB 18 (MORAIS et al., 2008) e o meio de cultivo empregado foi o Zarrouk (1966).

2.2 Condições de Cultivo

Os cultivos foram realizados em fotobiorreatores tubulares verticais de 2 L, com volume útil de 1,8 L, a concentração inicial do inóculo foi de 0,2 g L-1.Os mesmos foram mantidos com agitação contínua (injeção de ar estéril, à 0,05 vvm). Para iluminação utilizaram-se lâmpadas fluorescentes a 3200 lux e fitas de LEDS na cor branca fria (380-700 nm). Os cultivos foram incubados por 30 ± 1 °C em câmara BOD termostatizada, equipada com timer de ajuste do fotoperíodo. Foram testados duas condições de iluminação, variando o fotoperíodo. O ensaio um denominado FP, com fotoperíodo

parcial (12 h fluorescente: 06 h LED: 06 h Escuro = 12F: 6L: 6E) e o ensaio dois, denominado FI, com fotoperíodo integral (12 h fluorescente: 12 h LED: 00 h Escuro= 12F: 12L: 00E). Também realizou-se um ensaio denominado controle (C) (12 h fluorescente: 12 h Escuro = 12F:12E). Ao término dos experimentos a biomassa foi centrifugada (8200 rpm por 12 min a 20 ºC), e posteriormente liofilizada.

2.3 Concentração de biomassa e monitoramento

Para determinar a concentração de biomassa e cálculos cinéticos, as amostras dos cultivos foram recolhidas assepticamente a cada 24 horas durante os 10 dias de crescimento. A concentração da biomassa (X, g L-1) foi determinada a partir da leitura de absorbância no espectrofotômetro a 670 nm, relacionando-a com uma curva padrão anterior (SCHIMIDEL et al., 2001).

2.3.1 Determinação dos parâmetros cinéticos

A concentração máxima de biomassa (Xmax) foi definida a partir do mais elevado valor de X

(g.l-1) em cada cultivo. A produtividade total (P, g L-1.d-1) foi calculada de acordo com a equação P = XT-X0 / T-T0, Xt (g L

-1

), sendo a concentração de biomassa no momento t (d) e X0 (g L -1

) a concentração de biomassa no momento t0 (d) (SCHIMIDEL et al., 2001). A taxa específica de

crescimento máximo (μmax, d -1

) foi obtida por regressão exponencial na fase logarítmica de multiplicação celular (BAILEY; OLLIS, 1986).

2.4 Determinações analíticas

2.4.1 Caracterização nutricional da biomassa

A determinação de carboidratos seguiu o método de Dubois et al. (1956), lípideos (FOLCH, LES, 1957) e proteínas (LOWRY et al., 1951), ambos resultados expressos em base seca.

2.4.2 Extração e determinação de ficocianina

A extração de ficocianina foi realizada segundo metodologia modificada de Silveira et al. (2007). As amostras liofilizadas e trituradas (0,08 g) foram imersas em 1 mL de tampão fosfato de sódio 0,1 M (pH 6,9) e mantidas no ultrassom por 15 min. Posteriormente, as amostras foram centrifugadas a 6000 rpm por 10 min, e o sobrenadante reservado, o sedimento resultante da centrifugação foi submetido a mais duas reextrações. As alíquotas dos três sobrenadantes foram misturadas, e imediatamente analisadas. A absorbância foi medida a 620 e 652 nm em espectrofotômetro UV-vis. O conteúdo total de ficocianina nas amostras foi determinado segundo o método de Bennett e Bogorad (1973).

2.4.3 Determinação de ácidos graxos

A análise dos ácidos graxos foi feita a partir da fração oleosa obtida na análise de lipídios. A derivatização foi baseada no estudo de Joseph e Ackman (1992). A determinação de ésteres metílicos de ácidos graxos (FAMEs) foi realizada segundo as condições adaptadas do método descrito por David, Sandra e Vickers (2005), utilizando um cromatógrafo a gás Agilent 7890A (Agilent Technologies, Alemanha), equipado com uma coluna capilar de sílica fundida com fase estacionária (50%-cianopropil)-metilpolisiloxano (60 m x 0,25 mm d.i x 0,25 µm de espessura de filme) (J & W GC Columns, Agilent Technologies, Alemanha) e um detector por ionização em chama (FID). A quantificação foi realizada por normalização de área, calculando-se a porcentagem relativa de área do éster metílico de ácido graxo identificado em relação ao somatório das áreas de todos os ésteres metílicos do cromatograma (área total). A identificação dos picos foi realizada por comparação do tempo de retenção dos padrões de 37 FAMEs (Supelco, EUA) com as dos picos observados nas amostras analisadas sob as mesmas condições. A confirmação dos compostos foi feita utilizando um GC-MS Agilent 7890 acoplado com um analisador de massas, do tipo quadrupolo (Agilent 5975c),

utilizando EI como fonte de ionização. A análise foi feita no modo scan (50-550m/z) e a identificação foi feita utilizando a biblioteca de espectros de massas da NIST11 observando a concordância de, no mínimo, 80 % dos espectros obtidos com os espectros da biblioteca.

2.5 Análise estatística

Os resultados obtidos foram avaliados a partir da Análise de Variância (ANOVA), seguida de teste de Tukey para comparação entre médias, com nível de 5 % de significância (p<0,05).

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

De acordo com a Tabela 1, pode-se observar que a maior concentração de biomassa de

Spirulina sp. LEB 18 foi proveniente do cultivo que empregou o LED branco em fotoperíodo integral.

A condição de iluminação contínua estimulou expressivamente os teores de biomassa de Spirulina sp. LEB 18, sendo que essa microalga teve em média sua biomassa concentrada 1,28 vezes mais, comparada ao ensaio controle (0,87 ± 0,01 g L-1).

Tabela 1 - Concentração máxima de biomassa (Xmáx), produtividade máxima (Pmáx), velocidade

específica máxima de crescimento (µmáx) de Spirulina sp. LEB 18 cultivada em diferentes fotoperíodos

Ensaios Luz de origem Fotoperíodo (h) Xmáx (g L-1) Pmáx (g L-1 d-1) µmáx (d-1) 1 Branco 12F: 6L: 6E 1,08±0,001a 0,12±0,001a 0,114±0,004ab 2 Branco 12F: 12L: 00E 1,15±0,001a 0,14±0,001a 0,125±0,010a 3 Controle 12F:12E 0,87±0,001b 0,10±0,01b 0,0800±0,001b

Fotoperíodo parcial de iluminação (12 h fluorescente: 6 h LED: 6 h Escuro) = 12F: 6L: 6E; Controle (12 h fluorescente: 12 h Escuro) = 12F:12E; Fotoperíodo Integral de iluminação (12 h fluorescente: 12 h LED: 00 h Escuro) = 12F: 12L: 00E; Resultados expressos como média e desvio padrão de três determinações. Letras diferentes na mesma coluna indicam que há diferença estatística significativa (p<0,05).

Proteínas, carboidratos e lipídios são as principais macromoléculas que compõem a biomassa das microalgas, os teores desses componentes e os teores de ficocianina estão apresentados na Tabela 2. Observou-se a partir da Tabela 2 um aumento no teor lipídico na biomassa dos cultivos que tiveram a iluminação por LEDs brancos, comparados ao cultivo controle. Estudos relatam que o teor lipídico pode ser influenciado pela intensidade luminosa, e regime de fotoperíodo. A maior exposição a luz, promove o metabolismo fotossintético, o qual pode estimular o acúmulo de lipídios de reserva (SCHIMITZ et al. 2012).

Tabela 2 - Caracterização nutricional da biomassa de Spirulina sp. LEB 18 e teor de ficocianina

cultivada em diferentes fotoperíodo

Fotoperíodo Proteínas (%, m/m) Carboidratos (%, m/m) Lipídios (%, mm-1) Ficocianina (mg g-1) Parcial 54,53±0,5a 14,01±1,96a 13,75±0,16a 83,72±0,82a Integral 52,96±0,36a 12,23±0,09a 13,24±0,17a 54,27±2,28b Controle 51,98±1,13a 11,72 ±0,44a 10,45±0,4b 46,36±0,45c Médias±desvios padrões (n=3);. Letras minúsculas diferentes na mesma coluna indicam que há diferença

significativa entre os diferentes fotoperíodos testados e o ensaio controle, ao nível de 95 % de confiança (p<0,05). Fotoperíodo parcial (FP): 12 h fluorescente: 06 h LED branco : 06 h escuro; Fotoperíodo integral (FI): 12 h fluorescente: 12 h LED branco : 00 h escuro; Ensaio controle: 12 h fluorescente: 12 h

Em relação a ficocianina (PC), pode-se observar que os maiores teores foram conseguidos a partir dos ensaios com LEDS, comparados ao controle. Os cultivos com FP de iluminação concentraram PC em média 1,54 vezes, comparado ao cultivo com FI. Esse fato indicou que a iluminação contínua não estimulou a produção desse pigmento, sendo este fato interessante, pois não necessita fornecer iluminação ininterrupta para concentrar esse bioproduto, que possui alto valor agregado e distintas aplicações.

Tabela 2 - Perfil de ácidos graxos em Spirulina sp. LEB 18 cultivada em diferentes fotoperíodos Ácidos graxos Fotoperíodo parcial (12 h fluorescente: 06 h LED branco : 06 h escuro) Fotoperíodo Integral (12 h fluorescente: 12 h LED branco : 00 h escuro)

Controle (12 h fluorescente: 12 h escuro) Saturados C10:0 5,94±1,08a 5,73±0,02a 4,86±2,15a C12:0 0,42±0,04ab 0,52±0,01ab 0,59±0,0 a C14:0 0,28±0,03a 0,20±0,01a 0,36±0,02a C15:0 0,07±0,01a 0,05±0,01a * C16:0 44,68±0,05a 45,28±0,01a 41,29±1,33a C18:0 1,95±0,02a 1,40±0,01a 1,64±0,55a Insaturados C14:1 0,43±0,06a 0,45±0,01a 0,25±0,01b C15:1 1,26±0,18a 0,61±0,01a 0,89±0,04a C16:1 4,40±0,43a 4,43±0,01a 4,94±0,31a C18:1c 3,18±0,55ab 3,73±0,01ab 2,80±0,05b C18:2c 13,76±0,21a 14,09±0,001a 15,61±0,04a C18:3n-6 23,26±0,08a 23,04±0,01a 26,87±1,79a C20:1n-9 0,06±0,01a 0,05±0,01a * C20:2 0,17±0,01ab 0,21±0,01a * C20:3n-6 0,14±0,01a 0,2±0,02a *

(C10:0) ácido cáprico; (C12:0) ácido docecanóico; (C14:0) ácido mirístico; (C14:1); ácido miristoléico; (C15:0) ácido pentanóico; (C15:1) ácido monopentanóico; (C16:0) ácido palmítico; (C16:1) ácido palmitoléico; (C18:0) ácido esteárico; (C18:1, cis) ácido oleico; (C18:2, cis) ácido linoléico; (C18:3 n-6) ácido γ - linolênico; (C20:1n-9) ácido gadoléico; (C20:2) ácido eicosadienóico; (C20:3n-6) ácido eicosatrienóico. *Não detectado. Médias seguidas pelas mesmas letras na mesma linha não diferem entre si pelo Teste de Tukey, ao nível de 95% de confiança (p<0,05).

Na Tabela 3, percebe-se que os teores de ácidos graxos não diferiram significativamente, exceto para o ácido miristoléico, que foi maior nos cultivos com LEDs. Observa-se também que a iluminação com os LEDs promoveram um perfil diferenciado comparado ao cultivo controle, sendo que os cultivos com FP e FI produziram um ácidos graxos saturado (pentanóico) e três insaturados (ácido gadoléico; ácido eicosadienóico e ácido eicosatrienóico) a mais que a biomassa obtida através do cultivo controle.

4. CONCLUSÕES

O emprego de diodos emissores de luz (LEDs) brancos no fotoperíodo parcial (12 h fluorescente: 06 h LED : 06 h escuro) e no fotoperíodo integral (12 h fluorescente: 12 h LED : 00 h escuro) de iluminação, em cultivos de Spirulina sp. LEB 18, promoveram um incremento na concentração de biomassa. Da mesma forma que estimularam a produção de lipídios totais, e alteram o perfil de ácidos graxos comparado ao cultivo controle (12 h fluorescente: 12 h escuro). A maior

produção de ficocianina foi alcançada com fotoperíodo parcial, indicando que a microalga não necessita ser exposta integralmente a luz em ciclos de 24 h para concentrar esse pigmento. Assim, foi importante investigar a fotoestimulação através dos LEDs em diferentes fotoperíodos nos cultivos microalgais para a produção de biomassa e biomoléculas de interesse.

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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