EFEITOS DO EXERCÍCIO FÍSICO EM CARDIOMIÓCITOS DE RATOS DESNUTRIDOS

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

EFEITOS DO EXERCÍCIO FÍSICO EM CARDIOMIÓCITOS DE

RATOS DESNUTRIDOS

Autor: Carlos Augusto Costa Cabral

Orientador: Prof. Dr. Marcelo Eustáquio Silva (UFOP) Coorientador: Prof. Dr. Antônio José Natali (UFV)

OURO PRETO - MG 2013

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Catalogação: [email protected]

C117e Cabral, Carlos Augusto Costa.

Efeitos do exercício físico em cardiomiócitos de ratos desnutridos [manuscrito] / Carlos Augusto Costa Cabral. - 2013.

89f.: il. color.; grafs., tabs.

Orientador: Prof. Dr. Marcelo Eustáquio Silva. Coorientador: Prof. Dr. Antônio José Natali.

Tese (Doutorado) - Universidade Federal de Ouro Preto.

Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas.

Área de concentração: Bioquímica Estrutural e Fisiológica.

1. Exercícios físicos - Aspectos fisiológicos - Teses. 2. Nutrição - Teses. 3. Desnutrição - Teses. 4. Morfologia (Biologia) - Teses. 5. Miocárdio - Contratilidade - Teses. I. Silva, Marcelo Eustáquio. II. Natali, Antônio José. III. Universidade Federal de Ouro Preto. IV. Título.

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

EFEITOS DO EXERCÍCIO FÍSICO EM CARDIOMIÓCITOS DE

RATOS DESNUTRIDOS

Autor: Carlos Augusto Costa Cabral

Orientador: Prof. Dr. Marcelo Eustáquio Silva (UFOP) Coorientador: Prof. Dr. Antônio José Natali (UFV)

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como parte integrante dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas.

Área de concentração: Bioquímica Estrutural e Fisiológica.

OURO PRETO – MG 2013

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CABRAL, C. A. C. Dedicatória

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DEDICATÓRIA

Ao meu querido e único irmão, Fernando Costa Cabral, falecido em 11/10/1983, e à minha querida mãe, Léa da Costa Cabral, falecida em 31/03/2004. Vocês me ensinaram verdadeiramente o sentido da luta pela vida, pois eu, que sou judoca, passei grande parte de minha vida achando que lutava. Eu os amo e sinto falta de vocês.

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CABRAL, C. A. C. Agradecimentos

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AGRADECIMENTOS

A Deus, pelo dom da vida.

À minha família, base de sustentação de minha caminhada.

Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, pela oportunidade de realizar este Curso.

À Universidade Federal de Viçosa pelo investimento em meu treinamento. Aos professores Dr. Marcelo Eustáquio Silva e Dr. Antônio José Natali, pela acolhida, pela orientação e pelos conselhos, que me permitiram não só realizar este estudo, mas, também, crescer como pessoa e profissionalmente.

Aos professores Dr.a Maria do Carmo Gouveia Peluzio, Dr. Mauro César Isoldi e Dr. Wanderson Geraldo de Lima pela rica contribuição prestada durante o meu Exame de Qualificação.

Ao professor Dr. Carlos Henrique Osório Silva, pela ajuda nas análises estatísticas.

A todos os professores do Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, os quais, direta ou indiretamente, contribuíram para o êxito deste trabalho.

Aos funcionários do NUPEB, da Coordenação do Programa, em especial à ex-secretária Cida Trópia, pela eficiência e competência.

Aos funcionários e colegas do Laboratório de Nutrição Experimental (LABNEX), da Escola de Nutrição da UFOP, e do Laboratório de Biologia do Exercício (BIOEX), do Departamento de Educação Física da UFV.

A todos os colegas do doutorado, pela convivência, pelo aprendizado e pela força.

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CABRAL, C. A. C. Resumo

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RESUMO

Este estudo avaliou os efeitos de um programa de corrida, de baixa intensidade (50-60%

do VO2max), em esteira, nas propriedades morfológicas e mecânicas dos miócitos

cardíacos isolados do ventrículo esquerdo (VE) de ratos desnutridos. Após oito semanas de dieta hipoproteica para o grupo desnutrido e treinamento para o grupo treinado, os miócitos do VE destes animais e dos respectivos controles foram isolados, tendo suas dimensões e função contrátil medida. Não houve interação entre o exercício e estado nutricional para os parâmetros analisados, portanto, esses foram analisados separadamente: nutridos versus ratos desnutridos, e treinados contra ratos sedentários. Os resultados mostraram que os ratos desnutridos exibiram massa corporal inferior aos do controle. Notou-se que os miócitos dos animais nutridos, em comparação aos dos desnutridos, apresentaram comprimento, largura e volume celular médio superior, de acordo com o parâmetro nutrição. Entretanto, em relação ao treinamento, o comprimento celular não diferiu estatisticamente entre treinados e sedentários; já a largura e o volume celular dos treinados apresentaram valor médio superior aos dos sedentários. A restrição de proteína na dieta provocou disfunções dos miócitos, reduzindo a amplitude de contração, a velocidade de contração e relaxamento celular. O treinamento físico em contraste inverteu essas disfunções dos miócitos do VE, restaurando estes parâmetros celulares mecânicos para os níveis de controle.

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CABRAL, C. A. C. Abstract

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ABSTRACT

This study evaluated the effects of a treadmill running program on the morphological and mechanical properties of single left ventricular (LV) myocytes isolated from malnourished rats. After eight weeks of protein restricted diet (malnourished group) and exercise training (exercised group), LV myocytes were isolated from this rats and their respective controls and had its dimensions and contractile function measured. There was no interaction between the exercise and nutritional status for the analyzed parameters, thus the factors were analyzed separately: control versus malnourished rats, and trained versus sedentary rats. The results showed that malnourished rats exhibited lower body, heart and ventricular mass, and cell length, width and volume than control rats. Trained rats presented higher cell width and volume than sedentary rats. The protein restricted diet induced LV myocyte dysfunctions by reducing cell shortening amplitude and prolonging the time courses of cell shortening and relaxation. Exercise training in contrast reversed these LV myocyte dysfunctions by restoring these cell mechanical parameters to the control levels.

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CABRAL, C. A. C. Lista de Tabelas

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Dieta dos animais de experimentação e suas respectivas concentrações em g/kg ... 16 Tabela 2 - Valores médios e desvios-padrão do teste de exaustão no final do experimento com resultados* das comparações entre médias dos Grupos de animais Nutridos (NT vs NS) e Desnutridos (DT vs DS) ... 27 Tabela 3 - Valor de referência, valor médio e desvio-padrão dos parâmetros bioquímicos proteína, albumina e hemoglobina dos Grupos de animais NT, NS, DT e DS ... 28 Tabela 4 - Modelos de regressão ajustados para o perfil semanal da média de massa corporal dos Grupos NT, NS, DT e DS ... 29 Tabela 5 - Valores médios e desvios-padrão do índice de hipertrofia cardíaca (R1) com resultados* das comparações entre os Grupos de animais Nutridos vs Desnutridos e entre os Treinados vs Sedentários ... 31 Tabela 6 - Valores médios e desvios-padrão do índice de hipertrofia cardíaca (R2) com resultados* das comparações entre os Grupos ded animais Nutridos vs Desnutridos e entre os Treinados vs Sedentários ... 32 Tabela 7 - Valores médios e desvios-padrão do índice de hipertrofia ventricular (IHV) com resultados* das comparações entre os Grupos de animais Nutridos vs Desnutridos e entre os Treinados vs Sedentários ... 33 Tabela 8 - Valores médios e desvios-padrão do comprimento celular, da largura celular e do volume celular de miócitos do ventrículo esquerdo com resultados* das comparações entre os Grupos de animais Nutridos vs Desnutridos e entre os Treinados

vs Sedentários ... 35

Tabela 9 - Valores médios e desvios-padrão da amplitude de contração (PPA) de miócitos do ventrículo esquerdo com resultados* das comparações entre os Grupos de animais Nutridos vs Desnutridos e entre os Treinados vs Sedentários ... 37 Tabela 10 - Valores médios e desvios-padrão da máxima velocidade de contração (MVC) de miócitos do ventrículo esquerdo com resultados* das comparações entre os Grupos de animais Nutridos vs Desnutridos e entre os Treinados vs Sedentários ... 39 Tabela 11 - Valores médios e desvios-padrão da máxima velocidade de relaxamento (MVR) de miócitos do ventrículo esquerdo com resultados* das comparações entre os Grupos de animais Nutridos vs Desnutridos e entre os Treinados vs Sedentários ... 40

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CABRAL, C. A. C. Lista de Figuras

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Representação dos pontos de mensuração da imagem dos miócitos cardíacos. ... 18 Figura 2 - Câmara experimental acoplada ao microscópio invertido. ... 20 Figura 3 - Representação do programa utilizado para aquisição das imagens e dos registros das contrações dos miócitos cardíacos (Ionoptix, EUA). ... 20 Figura 4 - Registro experimental de encurtamento de uma célula do ventrículo esquerdo estimulada na frequência de 3 Hz, em temperatura ambiente (~25 oC)... 21 Figura 5 - Diagrama demonstrativo do encurtamento de um cardiomiócito estimulado na frequência de 3 Hz (~25 oC) e dos respectivos parâmetros da contração analisados. .... 22

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CABRAL, C. A. C. Lista de Abreviaturas e Siglas

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ANOVA – Análise de variância

ATPase – Enzimas que catalisam a hidrólise do ATP

0

C – Graus Celsius Ca2+ - Íon cálcio

CaCl2 – Cloreto de cálcio

CaMKII – Cálcio calmodulina quinase II Cl – Íon cloreto

cm – centímetro

DEP - Desnutrição energético-proteica DS – Desnutrido sedentário

DT – Desnutrido treinado

CEUA - Comissão de Ética para Uso de Animais

COBEA – Colégio Brasileiro de Experimentação Animal COMP - Comprimento celular

CO2 – Dióxido de carbono

DES-UFV – Departamento de Educação Física – Universidade Federal de Viçosa DP – Desvio padrão

EGTA – Ethylene glycol-bis (β-aminoethyl ether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid ENDO – Endocárdio

EPI - Epicárdio

g/L – Gramas por litro HCO3 – Íon bicarbonato

HEPES – N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethanesulfonic acid Hz – Hertz

IHC - Índice de hipertrofia cardíaca

IHC1 - Índice de hipertrofia cardíaca = massa coração (mg)/massa corporal (g), denominado R1

IHC2 - Índice de hipertrofia cardíaca = massa coração (g)/comprimento da tíbia (cm), denominado R2

IHV - Índice de hipertrofia ventricular K+ - Íon potássio

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xi L – Litro

LARG - Largura celular M – Molar m – Metro mg – Miligrama min – Minuto mL – Mililitro mm – Milímetro mM – Milimolar ms – Milisegundo

MVC - Máxima velocidade de contração MVR - Máxima velocidade de relaxamento min/d – Minuto por dia

m/min – Metro por minuto µL – Microlitro

µm – Micrômetro µM – Micromolar

MgCl2 – Cloreto de magnésio

Mg2+ - Íon magnésio NaCl – Cloreto de sódio Na+ - Íon sódio NCX – Trocador de sódio-cálcio NS – Nutrido sedentário NT – Nutrido treinado O2 – Oxigênio pH – Potencial hidrogeniônico pL – Picolitro PLB - Fosfolambam

PPA - Amplitude de contração RPM – Rotação por minuto RS – Retículo sarcoplasmático

RyR2 – Canais receptores de rianodina SAS - Statistical Analysis System seg – Segundo

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SERCA2a – Cálcio ATPase do retículo sarcoplasmático SO4 – Íon sulfato

TGO - Transaminase glutâmica oxalacética TGP - Transaminase glutâmica pirúvica VE – Ventrículo esquerdo

VOLM - Volume celular

VO2máx – Consumo máximo de oxigênio

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CABRAL, C. A. C. Índice xiii ÍNDICE 1. INTRODUÇÃO ... 1 2. OBJETIVOS ... 4 2.1. Objetivo geral ... 4 2.2. Objetivo específico ... 4 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 5 3.1. Desnutrição ... 5

3.3. O coração: miocárdio e miócitos ... 8

3.4. O exercício físico e as adaptações morfológicas provocadas no coração ... 9

4. MATERIAL E MÉTODOS ... 14

4.1. Animais de experimentação ... 14

4.2. Grupos experimentais ... 14

4.3. Adaptação ao treinamento físico ... 14

4.4. Teste de exaustão ... 15

4.5. Protocolo de treinamento físico ... 15

4.6. Dietas ... 15

4.7. Parâmetros sanguíneos ... 16

4.8. Análises do tecido muscular cardíaco ... 16

4.8.1. Massa do coração e dos ventrículos ... 16

4.8.2. Isolamento dos miócitos cardíacos ... 17

4.8.3. Comprimento, largura e volume celular ... 18

4.8.4. Contração celular ... 19

4.9. Soluções ... 22

4.10. Análises estatísticas ... 23

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 26

5.1. Desempenho físico dos animais ... 26

5.1.1. Teste de exaustão ... 26

5.2. Caracterização dos Grupos de animais ... 27

5.2.1. Parâmetros bioquímicos ... 27

5.2.2. Massa corporal ... 28

5.3. Tecido muscular cardíaco ... 30

5.3.1. Índice de hipertrofia cardíaca (IHC) ... 30

5.3.1.1. Variável IHC1, denominada R1 ... 31

5.3.1.2. Variável IHC2, denominada R2 ... 31

5.3.2. Índice de hipertrofia ventricular (IHV) ... 32

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CABRAL, C. A. C. Índice

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5.3.3.1. Relação de comprimento celular (COMP), largura celular (LARG) e volume celular (VOLM) entre animais nutridos versus desnutridos e treinados

versus sedentários ... 34

5.4. Propriedades mecânicas dos cardiomiócitos ... 36

5.4.1. Amplitude de contração (PPA) ... 36

5.4.2. Máxima velocidade de contração (MVC) ... 38

5.4.3. Máxima velocidade de relaxamento (MVR) ... 39

6. CONCLUSÃO ... 412

REFERÊNCIAS ... 423

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CABRAL, C. A. C. Introdução

1. INTRODUÇÃO

Nos últimos anos, o número de praticantes de atividade física cresceu vertiginosamente; entretanto, a principal causa não foi a saúde e sim a questão estética. Para atingir o “padrão” de beleza, muitos indivíduos sacrificam-se com dietas radicais e exercícios extenuantes, principalmente os de sobrecarga progressiva, não respeitando os limites como sexo, condição física etc. Dentro desse raciocínio, a fim de obter melhor

performance, há o temor em relação ao malefício do resultado de forças repetitivas

sobre uma estrutura, que, somado ao desequilíbrio nutricional, pode se tornar um agravante, potencializando os fatores de risco para a saúde do praticante

A combinação de exercícios que exaurem e dietas radicais ou comportamentos nutricionais inadequados foi pesquisada por Cabral et al. (2006), os quais diagnosticaram o estado nutricional de atletas de levantamento de peso. A restrição calórica é frequente nesse esporte, por ser uma modalidade em que se compete em categorias de peso corporal. No trabalho desses autores, foram encontrados níveis muito baixos de porcentual de gordura corporal, o que torna esse tipo de estratégia inviável ou perigoso, tanto na questão de rendimento físico como na de saúde.

A alimentação é fator primordial na rotina diária da humanidade, não apenas por se constituir em necessidade básica, mas principalmente porque a sua utilização tornou-se um problema de saúde pública, uma vez que o seu excesso ou falta pode causar doenças (WHO, 2011).

Segundo Antiwi (2008), a desnutrição energético-proteica é caracterizada pela existência de um desequilíbrio entre o fornecimento de nutrientes e a demanda corporal. O coração é um órgão cujas porções atriais e ventriculares trabalham com a função de fornecer o fluxo sanguíneo adequado a todos os órgãos do corpo, atendendo as diferentes exigências metabólicas, em resposta às interferências do meio externo, e garantindo a homeostase (MOORE; DALLEY, 2009).

O músculo cardíaco é composto por tecido que apresenta expressiva adaptação ao treinamento físico, o que torna esse músculo capaz de suportar mudanças em suas propriedades bioquímicas, funcionais e morfológicas. Os mecanismos dessas adaptações não estão completamente esclarecidos; entretanto, em nível intracelular, esses parecem ser decorrentes de estímulos externos, associados à nutrição sobre diferentes vias de sinalização, que induzem adaptações na atividade de enzimas intracelulares (DRÖGE, 2007).

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As principais adaptações morfológicas do coração ao exercício físico crônico são as alterações no tamanho do músculo, como a hipertrofia concêntrica, caracterizada pelo aumento da espessura das paredes ventriculares e a excêntrica, que é a resposta adaptativa ao aumento do volume sanguíneo, durante a diástole, que promove a adição de sarcômeros em série, resultando em aumento da dimensão interna da câmara ventricular (NATALI, 2004).

As diversas situações, que requerem adaptações do organismo para manter seu equilíbrio interno, provocam alterações no funcionamento do sistema cardiovascular por meio da regulação neuro-humoral. É o caso, por exemplo, de variações na temperatura ambiental, na mudança de altitude, nas infecções, no estresse, no envelhecimento, na atividade física e na alimentação (PENALOZA; ARIAS-STELLA, 2007).

No início dos estudos sobre os efeitos da desnutrição, acreditou-se que o coração seria poupado em relação aos outros órgãos. Atualmente, após mais de um século de pesquisas realizadas in vivo e in vitro, utilizando diferentes modelos experimentais, é comprovado que a desnutrição também afeta o coração e pode provocar danos à sua estrutura e função como atrofia do miocárdio, com mudanças na contratilidade e elasticidade, levando a alterações no débito cardíaco e na pressão arterial (OKOSHI et al., 2009).

Ao contrário da desnutrição, que provoca danos ao sistema cardiovascular, a prática regular de atividade física pode trazer grandes benefícios à saúde, incluindo a melhora das condições cardiorrespiratórias. Essa prática tem sido recomendada para prevenção e tratamento de doenças cardiovasculares e seus fatores de risco, como sedentarismo, diabetes, hipertensão, dislipidemia e obesidade, visando à melhoria do condicionamento físico e da qualidade de vida. O exercício físico, de acordo com a modalidade, intensidade, duração e freqüência, atua como fator de estresse fisiológico para o organismo por causa da sobrecarga energética imposta, levando a diversas adaptações hemodinâmicas e autonômicas, que diferenciam indivíduos treinados de sedentários, e tem efeito, principalmente, sobre a frequência cardíaca, contratilidade do miocárdio e pressão arterial (MORAES, 2009).

Muitos estudos demonstram as adaptações provocadas pelo exercício físico, poucos trabalhos investigam os efeitos benéficos ou estressantes da interação entre desnutrição e prática de exercício físico (OLIVEIRA, 2007). A partir dessa lacuna na literatura, objetivou-se investigar se há algum tipo de interação entre essas variáveis, avaliando a atuação do exercício físico regular de baixa intensidade, sobre as

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propriedades morfológicas e mecânicas dos cardiomiócitos do coração de ratos submetidos à desnutrição proteica desde o desmame até a eutanásia.

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CABRAL, C. A. C. Objetivos

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo geral

Avaliar os efeitos do exercício físico em cardiomiócitos de ratos desnutridos.

2.2. Objetivo específico

Verificar se um programa de corrida em esteira, de baixa intensidade (50-60%

do VO2max), altera as propriedades morfológicas (comprimento, largura e volume

celular) e mecânicas (amplitude de contração, máxima velocidade de contração e máxima velocidade de relaxamento) dos miócitos cardíacos isolados do ventrículo esquerdo de ratos desnutridos.

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CABRAL, C. A. C. Revisão Bibliográfica

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1. Desnutrição

A desnutrição energético-proteica (DEP) é caracterizada pela existência de um desequilíbrio entre o fornecimento de nutrientes e a demanda corporal, responsável por assegurar o bom funcionamento do organismo (ANTIWI, 2008).

A alimentação é fator primordial na rotina diária da humanidade, não apenas por se constituir em necessidade básica, mas principalmente porque a sua utilização tornou-se problema de saúde pública, uma vez que o seu excesso ou falta pode causar doenças. Para Lochs et al. (2006), a desnutrição está definida como o estado nutricional em que ocorre deficiência ou excesso de energia, proteína e outros nutrientes, causando alteração física, tecidual, funcional e clínica.

Hoje em dia é cada vez mais claro que, para uma compreensão real das doenças e suas conseqüências, é fundamental o entendimento dos aspectos antropológicos, o dinamismo psicológico e o diagnóstico social das pessoas em situação de debilidade física (SAWAYA, 2006). A Organização Mundial de Saúde (OMS) preconiza que, para que aconteça melhora na situação alimentar do mundo, os problemas de saúde e social precisam ser reconhecidos e corrigidos, uma vez que a desnutrição grave é uma desordem em que a situação de saúde da criança resulta, em parte, das condições sociais do domicílio em que essa vive (WHO, 2011). Por se tratar de uma doença de natureza clínico-social multifatorial, cujas raízes se encontram na pobreza, a prevenção e o controle da desnutrição dependem de medidas mais amplas e eficientes de combate à pobreza e à fome e de políticas de inclusão social. Talvez pela dificuldade de se definirem estratégias de prevenção e tratamento que englobem todas as necessidades acerca da desnutrição, a deficiência ou a falta de nutrição ainda seja responsável por 55% das mortes de crianças no mundo inteiro, estando associada a várias outras patologias e sendo considerada a doença que mais mata crianças abaixo de cinco anos (SAWAYA, 2006).

No Brasil, apesar de os estudos epidemiológicos indicarem que a prevalência da desnutrição energético-proteica tem diminuído, a doença continua a ser um relevante problema de saúde pública no País, principalmente nas regiões Norte e Nordeste, na área rural do Brasil e nos bolsões de pobreza das periferias das grandes metrópoles, com consequências desastrosas para a sobrevida e saúde das crianças (WHO, 2011).

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A desnutrição causada por deficiência proteica é também vastamente encontrada no Brasil e em países em desenvolvimento. Nesse tipo de desnutrição, a disponibilidade de calorias pode existir, porém sem ingestão de produtos ricos em proteínas. Esse fato deve-se em geral à dificuldade de obter alimentos que sejam fonte de proteínas, principalmente por se tratarem de produtos com custo mais elevado (DE SOUZA; MIRANDA-NETO, 2007). A desnutrição proteica é altamente prejudicial ao organismo uma vez que as proteínas são moléculas essenciais aos organismos dos animais, devendo, portanto, estar presentes na alimentação em quantidades adequadas. A composição de proteína da dieta é fator importante a ser considerado, a partir do momento que dos 20 aminoácidos que constituem as proteínas, nove são considerados essenciais, ou seja, não são sintetizados pelo organismo e devem ser adquiridos através da alimentação (GURMINI et al., 2005).

Sabe-se que, em humanos, estudos sobre a desnutrição são muito mais observacionais do que averiguações experimentais, tornando-se importante a avaliação por meio de práticas experimentais em modelo animal. O uso de animais em pesquisa permite controle do tempo e dos níveis desejados da carência nutricional que se pretende estudar; o rato, modelo animal mais utilizado em estudos, apresenta vantagens como facilidade de manejo e alta capacidade de adaptação aos diferentes protocolos de desnutrição empregados, bem como possui metabolismo acelerado, o que permite investigações experimentais rápidas, principalmente daqueles distúrbios promovidos pela desnutrição apenas tardiamente no ser humano (BELLO et al., 2005).

Vários são os modelos experimentais utilizados para provocar a desnutrição em ratos como a indução dessa doença durante a gestação, diminuindo o teor protéico da dieta das fêmeas grávidas ou após o nascimento; e o aumento da ninhada durante a amamentação (TATLI et al., 2007). Pode-se também reduzir o conteúdo de proteínas da dieta oferecida à fêmea que está amamentando ou, ainda diminuir esse conteúdo da dieta oferecida aos filhotes, logo após o desmame; esse último modelo foi o escolhido para este trabalho.

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3.2. Desnutrição, estresse e patologias associadas

De acordo com Vieira e De Lima (2002), a vida existe por causa da manutenção da homeostase. Essa condição de equilíbrio das propriedades físico-químicas e metabólicas do meio interno é constantemente desafiada por forças adversas intrínsecas e extrínsecas. O estresse pode ser entendido como um estado de homeostase ameaçado ou em desequilíbrio. Se os mecanismos para lidar com o enfrentamento de situações em que existem estressores não forem eficientes, ocorre o estresse via ativação de sistemas complexos, que resultam em alterações hormonais, autonômicas e comportamentais. Os estressores potenciais podem ser ambientais (frio, calor), psicológicos (depressão, ansiedade), sociais (desemprego, morte de pessoas próximas) e nutricionais (deficiência de alimentação adequada quantitativa e qualitativa); aliados às características individuais da pessoa, são determinantes na ruptura da homeostase interna do organismo humano (GREENBERG, 2002).

Diversos sistemas são afetados pela desnutrição, o que pode levar ao mau funcionamento de órgãos e, consequentemente, ao desenvolvimento de doenças. A gravidade dessas alterações é dependente do tempo de exposição e da fase da vida que o indivíduo é submetido à desnutrição. Vários autores já demonstraram em humanos que a desnutrição na fase inicial da vida leva a um crescimento deficiente, ou seja, crianças desnutridas são mais baixas e pesam menos do que deveriam para a idade delas. Em animais, também se nota um prejuízo no desenvolvimento, com depleção de massa muscular e diminuição do peso. Observou-se em ratos desnutridos, durante a gestação, significativa redução no peso e tamanho de diversos órgãos como o rim, adrenal e tecido cerebral e prejuízo na função desempenhada por esses (SAWAYA et al., 1998).

Segundo Bernardis et al. (1986), o hipotálamo é a principal região do sistema nervoso central (SNC), que atua no controle da homeostase, e seus efeitos estão diretamente envolvidos na regulação central da ingestão de alimentos, no peso corporal, no metabolismo e na atividade autonômica cardiovascular; portanto, essa área é fortemente afetada pela desnutrição.

Estudos apresentaram efeitos deletérios da desnutrição após o período de amamentação sobre o sistema cardiovascular. Tropia e colaboradores, em 2001, demonstraram aumento da sensibilidade do barorreflexo e do reflexo Bezold-Jarisch em animais submetidos a uma dieta contendo 6% de proteína. Ainda nesse trabalho, foi observado aumento do tônus vasomotor simpático nos animais.

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Utilizando o mesmo modelo animal, Oliveira e colaboradores (2004) observaram aumento dos níveis basais de frequência cardíaca (FC) e pressão arterial (PA), além do aumento da variabilidade desses parâmetros quando analisados no domínio do tempo. Loss et al., em 2007, demonstraram uma perturbação da homeostase cardiovascular decorrente da desnutrição proteica. Nesse trabalho, foram evidenciadas mudanças no ganho do barorreflexo antes e após bloqueios autonômicos, além de alteração no período de latência da resposta barorreflexa. Ainda segundo os autores, essas alterações na modulação da atividade autonômica eferente seriam responsáveis pela manutenção dos altos valores de FC e da PA média basal.

3.3. O coração: miocárdio e miócitos

O miocárdio dos mamíferos é constituído por fibras musculares cardíacas, vasos sanguíneos e tecido conjuntivo. No coração normal, esse estroma conjuntivo se distribui, formando o epimísio, que envolve toda a musculatura cardíaca (conjuntivo subepicárdico); o perimísio, que separa feixes de fibrocélulas; e o endomísio, que se dispõe ao redor de cada miócito. Esse tecido conjuntivo exerce papel importante na manutenção da integridade funcional do miocárdio (BURLEW; WEBER, 2000).

Os miócitos cardíacos são células alongadas e ramificadas, que se unem por meio dos discos intercalares. Essas células exibem estriações transversais e possuem um ou, no máximo, dois núcleos localizados centralmente. Entre os miócitos cardíacos, o tecido delicado (endomísio) sustenta uma rica rede capilar necessária para atender a elevada demanda metabólica de uma atividade contrátil forte e contínua (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2000).

Embora o volume do miocárdio seja quase inteiramente ocupado pelos miócitos, esses constituem apenas de, aproximadamente, 25% do número total de células; o restante é representado pelas células do endotélio e do conjuntivo, predominantemente fibroblastos. No coração adulto, a matriz extracelular consiste de colágenos tipos I (80%), III, IV, V e VI,proteoglicanos e fibras elásticas. Essa matriz é sintetizada por fibroblastos, dispostos ao longo dos miócitos; células endoteliais; e células musculares lisas dos vasos (COTRAN et al., 1994; AIRES, 2008).

As modificações estruturais que ocorrem no coração dependem não só do processo de desenvolvimento normal como também das exigências funcionais do órgão; com o envelhecimento e a falta de atividade física, o coração sofre também alterações

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importantes que atingem não só as suas células e o tecido adjacente, mas, sobretudo, o leito vascular terminal (ANVERSA et al., 1994).

De modo geral, a inatividade física, assim como o envelhecimento, produz, na maioria dos indivíduos, modificações cardiovasculares de caráter estrutural e, principalmente, funcional, caracterizada como perda de miócitos (com subsequente hipertrofia das células remanescentes) e diminuição da complacência das artérias. No entanto, a etiologia das modificações cardiovasculares se encontra ainda sob intensa investigação. Os mecanismos mais prováveis estão relacionados ao dano cumulativo mediado por uma diversidade de agentes agressores. Os benefícios dos exercícios continuam sendo pesquisados juntamente com a farmacoterapia, oferecendo oportunidades de se intervir nesse processo, mediante o uso de atividades e drogas que podem reduzir a rigidez arterial, a fibrose cardíaca e a hipertrofia ventricular (PUGH; WEI, 2001; FERRARI, 2002).

Diferentes estudos demonstraram os efeitos benéficos do exercício físico sobre os diversos fatores de risco isolados para a doença cardiovascular; entretanto, são escassos os trabalhos que avaliam os efeitos do treinamento físico em modelo experimental de desnutrição proteica.

Por meio desta pesquisa experimental, foram analisados os efeitos do exercício físico nos parâmetros morfológicos e mecânicos de cardiomiócitos de ratos com desnutrição proteica.

3.4. O exercício físico e as adaptações morfológicas provocadas no coração

O coração é um dos primeiros órgãos a ser formado no período embrionário; todas as etapas seguintes de desenvolvimento do embrião dependem da habilidade desse órgão de moldar o rendimento dele à demanda do organismo por oxigênio e nutrientes. A hipertrofia do músculo cardíaco é o aumento da massa muscular cardíaca (aumento da razão peso do coração/peso corporal) causado primariamente pela ampliação das dimensões dos cardiomiócitos (ATCHLEY; DOUGLAS, 2007).

O termo hipertrofia caracteriza o crescimento celular, que, na ausência de divisão celular, é usado para fazer distinção entre crescimento hiperplásico e hipertrófico. A hipertrofia ocorre em respostas a estímulos, como exercício crônico e gravidez, e apresenta ampliação das dimensões dos cardiomiócitos e do número de mitocôndrias, proporcional ao aumento do conteúdo de miofibrilas, crescimento de

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cardiomiócitos sem o desenvolvimento de fibrose ou alterações em artérias intramurais, em que a função cardíaca é mantida ou melhorada.

A hipertrofia cardíaca, em resposta ao exercício físico, que corresponde à hipertrofia fisiológica, inclui alterações morfológicas e funcionais. Esse tipo de hipertrofia ocorre em ambos os ventrículos, mas em grau mais elevado no ventrículo esquerdo. As principais adaptações ao treinamento físico no que diz respeito à morfologia do coração são alterações no tamanho do músculo e no volume das câmaras cardíacas (WANG et al., 2008).

O treinamento físico determina dois tipos de hipertrofia, a excêntrica e a concêntrica. A hipertrofia cardíaca do tipo excêntrica é induzida por exercícios de resistência aeróbica e ocorre em função do aumento no retorno venoso e sobrecarga volumétrica no músculo cardíaco, ocorrendo aumento no comprimento dos cardiomiócitos sem grandes alterações na largura. Esse tipo de adaptação pode ter impacto no aumento da dimensão interna da câmara ventricular, atenuando o estresse sobre a parede ventricular, que ocorre durante a função cardíaca em repouso ou durante o exercício, contribuindo para a função cardíaca normal (ATCHLEY; DOUGLAS, 2007). A do tipo concêntrica é induzida por exercícios de força e potência, que promovem aumento de tensão contra resistência e sobrecarga pressórica no músculo cardíaco, levando ao aumento da espessura das paredes do miocárdio (DÍAZ-HERRERA, 2001; NAYLOR et al., 2008).

Diante disso, vários estudos envolvendo o treinamento físico vêm sendo desenvolvidos, com o objetivo de verificar as adaptações morfológicas do miócito e miocárdio.

Kemi et al., em 2002, realizaram treinamento intervalado em camundongos machos e fêmeas durante oito semanas, 2 h por sessão (alternaram-se 8 min de 85-90% do VO2max e 2 min de 50-60% do VO2max), cinco dias na semana. Esses autores

verificaram o aumento do comprimento e do volume celular em ratos e ratas exercitados. Além disso, notou-se aumento da massa ventricular esquerda e direita de ambos os grupos treinados.

No estudo de Kemi et al., em 2004, em que os animais foram treinados aerobicamente de forma intervalada na esteira, por 1 h a sessão (alternando 8 min de 85-90% do VO2max e 2 min de 50-60% do VO2max,) cinco dias por semana, durante 10

semanas, verificou-se aumento no comprimento, na largura e no volume celular. Posteriormente, esses autores realizaram um trabalho em que camundongos fêmeas

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treinaram em esteira inclinada em 25º, durante 1h30 (alternaram-se 8 min de 85-90% do VO2max e 2 min de 50-60% do VO2max) a sessão, cinco dias na semana, no decorrer de

oito semanas. Ao final do experimento, o comprimento relativo dos cardiomiócitos dos animais treinados foi maior que o dos controles (KEMI et al., 2007).

Outros estudos evidenciaram resultados opostos em relação ao que foi relatado anteriormente. Diffee et al., em 2001, utilizaram ratas treinadas em esteira de forma intensa, com 20% de inclinação, 1 h por sessão, cinco dias por semana, durante 11 semanas, não observando alterações no comprimento e na largura dos sarcômeros.

Quando foram comparadas as respostas em relação às regiões do epicárdio e endocárdio de ratas treinadas aerobicamente, de forma intermitente e em alta intensidade, verificou-se que as células do endocárdio de animais treinados obtiveram valores superiores, confrontando aos seus pares sedentários, quanto a largura e ao volume, podendo sugerir que houve hipertrofia concêntrica (NATALI et al., 2001).

Esses resultados divergentes indicam que fatores como: diferença nos modelos de exercício; condições experimentais; propriedades morfológicas, mecânicas, bioquímicas e elétricas dos miócitos nas diferentes regiões da parede do miocárdio; sexo; e idade podem ter influenciado tais resultados (NATALI, 2004).

Mesmo que haja estudos com resultados diferentes, a maioria desses evidencia que o exercício físico é capaz de promover adaptações morfológicas em níveis celular e tecidual, contribuindo para a melhora da capacidade cardíaca, tanto em corações normais quanto na presença de alguma cardiomiopatia.

3.5. O exercício físico e as adaptações mecânicas provocadas no coração

Durante o exercício, o coração se ajusta aos requeridos aumentos das atividades metabólicas e mecânicas. O treinamento físico provoca adaptações bioquímicas, elétricas, morfológicas e mecânicas no músculo cardíaco, proporcionando melhora na função cardíaca. Essas adaptações ocorrem basicamente para reduzir o estresse sobre as paredes ventriculares e, ao mesmo tempo, atender a maior demanda de suprimento sanguíneo dos músculos em exercício (KEMI et al., 2007).

Com o propósito de investigar as adaptações que levam à melhora da função contrátil do coração pelo treinamento físico, muitos estudos com modelos animais têm sido realizados com protocolos e intensidades variadas (NATALI et al., 2001; NATALI et al., 2002; WISLOFF et al., 2002; KEMI et al., 2004; KEMI et al., 2005).

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No que diz respeito à bioquímica da contração, sabe-se que a excitação elétrica causada pelo potencial de ação faz com que aumente a concentração de ions Ca2+ no retículo sarcoplasmático (RS), promovendo a contração (AIRES et al., 2008). Com o potencial de ação despolarizando a membrana, ions de Ca2+ entram na célula pelos canais de Ca2+ tipo L, ativando os RyR2 que estão na membrana do retículo sarcoplasmático, fazendo com que seja liberado Ca2+ de dentro do RS, processo conhecido como liberação de Ca2+ induzido por Ca2+. Ca2+ se juntam à outra parte que entrou na célula pelos canais de Ca2+ tipo L para que se liguem à troponina C e ativem a contração (BERS, 2002).

No relaxamento, ocorre a dissociação do Ca2+ da troponina C. Dessa forma, o Ca2+ é transportado para fora do citosol, processo realizado pela SERCA2a, pelo transporte de Ca2+ mitocondrial para o sarcolema, via trocador de Na+/Ca2+ (NCX) e pela Ca2+ ATPase presente no sarcolema (BERS, 2002).

Com base nisso, estudos recentes demonstraram que o exercício altera a homeostasia de Ca2+ em animais normais por meio do aumento da expressão de proteínas reguladoras do ciclo do Ca2+ no cardiomiócito, como SERCA2a, fosfolambam (proteína que regula a função da SERCA2a), NCX e cálcio calmodulina quinase II (CaMKII), proteína que fosforila a treonina, bem como é a responsável pela ativação da fosfolambam (WISLOFF et al., 2002; KEMI et al., 2007; KEMI et al., 2008).

Além disso, o exercício pode aumentar a sensibilidade dos miofilamentos ao Ca2+ (WISLOFF et al., 2002; KEMI et al., 2007). Outros estudos apresentam que essas adaptações promovem alterações contráteis em nível celular durante estimulação elétrica, melhorando, assim, a função cardíaca em animais treinados aerobicamente (WISLOFF et al., 2005; KEMI et al., 2007). A partir disso, alguns trabalhos verificaram as respostas contráteis do cardiomiócito diante do treinamento físico.

Wisloff et al. (2001), utilizando ratas treinadas em esteira, 2 h por sessão, cinco sessões por semana, durante quatro semanas, verificaram a diminuição no tempo para o pico de Ca2+ e no tempo para o decaimento do Ca2+ intracelular, além do aumento do número de SERCA2a e fosfolambam nos cardiomiócitos dos animais treinados. Essas adaptações colaboram para a melhora da função contrátil do coração (WISLOFF et al., 2001).

Já no estudo de Kemi et al. (2004), os animais foram treinados aerobicamente de forma intervalada na esteira, durante 1 h por sessão, cinco sessões na semana, em um período de 13 semanas. Observou-se que quando os cardiomiócitos foram estimulados

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em frequências de 7-10 Hz, os animais treinados obtiveram maior fração de encurtamento e fluxo de Ca2+ nas células. Além disso, o tempo de contração, o tempo para o relaxamento, o tempo para o pico de Ca2+ e o tempo para o decaimento do Ca2+ intracelular foram reduzidos nos animais treinados. Os mesmos autores, em um estudo posterior, utilizaram ratas adultas, treinadas de forma intervalada em esteira, 1 h por sessão, cinco sessões por semana, durante 10 semanas. Nesse estudo, uma parte dos animais treinou a uma intensidade alta (85-90% do VO2max) e a outra, em uma

moderada (65-70% do VO2max). Verificou-se que ambos os grupos diminuíram o tempo

para o pico de contração, em comparação aos seus pares sedentários. (KEMI et al., 2005).

As ratas, que foram submetidas a um treinamento intervalado que consistia em sessões de 1h30, cinco sessões por semana e durante seis semanas, obtiveram diminuição do tempo para o relaxamento do cardiomiócito, em relação aos animais- controle. Além disso, foi verificada diminuição do tempo para o decaimento de Ca2+ intracelular e aumento da amplitude do fluxo de Ca2+. Foram observados aumento no conteúdo de SERCA2a e maior expressão de CaMKII, nos miócitos dos animais treinados (KEMI et al., 2007).

Stolen et al. (2009) submeteram camundongos com sete semanas de vida a um treinamento aeróbico e intervalado, alternando entre 4 min de 85-90% do VO2max e 2

min de 50% do VO2max, 80 min/dia, uma sessão por dia, cinco dias/semana, durante 13

semanas. O treinamento aumentou a fração de encurtamento celular, além de diminuir o tempo para o decaimento dos íons Ca2+ presentes no citosol.

Essas alterações em nível celular, em resposta aos treinamentos físicos reportados por Wisloff et al. (2001), Kemi et al. (2002) e Wisloff et al. (2002), acarretaram adaptações funcionais em nível de órgão, como maior fração de encurtamento ventricular esquerdo, menor frequência cardíaca de repouso e aumento do VO2max, o que contribuiu para a melhora do funcionamento cardíaco, justificando a

importância dos estudos que analisam as adaptações mecânicas no miócito cardíaco de animais treinados.

O aumento na contratilidade intrínseca dos miócitos é um mecanismo em potencial para explicar a melhora da função contrátil do miocárdio induzida pelo exercício, que pode estar associado ao processo de aumento do volume dos miócitos cardíacos (NATALI, 2004).

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CABRAL, C. A. C. Material e Métodos

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1. Animais de experimentação

Foram utilizados 24 ratos machos (Rattus novergicus) da linhagem Wistar, com 30 dias de idade, após o desmame, provenientes do Biotério Central do Centro de Ciências Biológicas e da Saúde da Universidade Federal de Viçosa. Os animais foram identificados com uma numeração na cauda, alojados em gaiolas coletivas, com seis animais cada, recebendo água e ração própria ad libitum e mantidos em ambiente com temperatura média de 22 oC e regime de luminosidade de 12 h de escuridão por 12 h de claridade. Os animais foram pesados no início do experimento; semanalmente, durante a fase de treinamento em esteira rolante; e no dia da eutanásia, utilizando-se balança eletrônica digital (Marte – Brasil, modelo AS5500C) com precisão de 0,01 g.

4.2. Grupos experimentais

Os animais foram divididos em quatro grupos: Nutrido Treinado (NT), n=6; Nutrido Sedentário (NS), n=6; Desnutrido Treinado (DT), n=6; e Desnutrido Sedentário (DS), n=6. Para a definição desses grupos, foi realizado o teste de exaustão, em que, após os resultados, os animais foram divididos em dois grupos homogêneos, em igualdade de massa corporal e desempenho no teste, definindo-se que animal pertenceria a cada Grupo (Treinado ou Sedentário).

Os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com os Princípios Éticos na Experimentação Animal, elaborados pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA). O projeto recebeu aprovação da Comissão de Ética para Uso de Animais (CEUA), do Departamento de Veterinária da Universidade Federal de Viçosa, Processo nº 39/2010 (Anexo).

4.3. Adaptação ao treinamento físico

Durante quatro dias consecutivos, foi realizada a adaptação desses animais à corrida em esteira rolante (Insight Instrumentos – Ribeirão Preto, SP), à velocidade constante de 10 m/min, durante 10 min/d, conforme o protocolo de Moraes-Silva et al.

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(2010). No quinto dia, realizou-se o teste de exaustão, para avaliar a condição física inicial dos animais e definir os grupos experimentais.

4.4. Teste de exaustão

Com a esteira rolante na posição plana, iniciou-se a corrida a 10 m/min e, a cada 3 min, aumentou-se a velocidade em 3 m/min, até a exaustão do animal, momento em que esse era retirado da esteira, anotando-se o tempo, a velocidade final e a distância percorrida (MORAES-SILVA et al., 2010).

Esse procedimento foi realizado no início do experimento, para a definição dos grupos experimentais, e, também, no final, a fim de avaliar o efeito do treinamento.

4.5. Protocolo de treinamento físico

Os animais do Grupo NT e os do Grupo DT foram submetidos a um programa de corrida de baixa intensidade (50-60% do VO2max), cinco vezes por semana, 60 min

por sessão, com aumento gradual na velocidade de 1 m/min por semana, durante oito semanas, conforme o protocolo descrito por Moraes-Silva et al. (2010), usando-se uma esteira rolante (Insight Instrumentos – Ribeirão Preto, SP).

4.6. Dietas

Trinta dias após o nascimento e definidos os grupos experimentais, os animais começaram a alimentar das suas respectivas dietas.

Em razão da variação dos modelos experimentais encontrados na literatura, e no intuito de facilitar comparações com dados semelhantes, optou-se pelo modelo modificado de desnutrição de Oliveira (2007), em que os animais desnutridos receberam dieta hipoproteica, AIN-93G (REEVES et al., 1993), que modifica o teor de proteína para 6%, sendo a diferença substituída por amido; e, os do grupo-controle, dieta normoproteica, contendo 12% de proteína (caseína de alto valor biológico), conforme descrita na Tabela 1.

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Tabela 1 - Dieta dos animais de experimentação e suas respectivas concentrações em g/kg Componente Concentração (g/kg) Normoproteica (12% de proteína) Concentração (g/kg) Hipoproteica (6% de proteína) Caseína* 150 75 Amido 608,9 683,9 Sacarose 100 100 DL-metionina 3,6 3,6 Mistura de sais** 35 35 Mistura de vitaminas*** 10 10 Colina cloridrato 2,5 2,5 Celulose 50 50 Óleo de milho 40 40

* Valor corrigido para o teor de proteína contido na caseína. ** (REEVES et al., 1993 – AIN-93G-MX)

*** (REEVES et al., 1993 – AIN-93-GX)

4.7. Parâmetros sanguíneos

Durante a eutanásia, foram coletadas amostras de sangue da aorta, para avaliação das dosagens das concentrações séricas de proteínas totais (g/dL), albumina (g/dL) e hemoglobina (g/dL).

Os métodos e equipamentos utilizados para as análises foram, respectivamente: colorimétrico (Cobas Mira – EUA), para proteínas totais e albumina; e cianometahemoglina (ABX micros – França), para hemoglobina.

4.8. Análises do tecido muscular cardíaco

4.8.1. Massa do coração e dos ventrículos

Quarenta e oito horas após a última sessão do treinamento físico, o animal foi pesado, realizando-se a eutanásia, com inalação de gás carbônico, em dois animais por dia, alternando os dos Grupos NT e NS e, posteriormente, DT e DS. Após a eutanásia, o coração foi removido, lavado em solução contendo 750 mM de CaCl2, para retirar o

excesso de sangue, e, imediatamente, pesado em balança de precisão (Gehaka – Brasil, modelo AG 200). Além do coração, também foi retirada a tíbia direita para medição do

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comprimento, distância da borda distal até a borda proximal. Para esse procedimento, foi utilizado um paquímetro de aço inox (Stainless Hardened – China).

Após a perfusão, os ventrículos (direito e esquerdo) foram separados dos átrios e pesados. O índice de hipertrofia cardíaca foi calculado pela razão entre a massa do coração (mg) e a massa corporal (g) e também pela razão entre a massa do coração (g) e o comprimento da tíbia (cm). Já o índice de hipertrofia ventricular, foi calculado pela razão entre a massa do ventrículo (mg) e a massa corporal (g).

4.8.2. Isolamento dos miócitos cardíacos

Após a remoção, o coração foi canulado via aorta e perfundido com solução de isolamento, contendo 750 µM de CaCl2 (solução A, item 4.6), em fluxo constante até

que os vasos coronarianos estivessem limpos de sangue. Em seguida, trocou-se a perfusão para a solução livre de cálcio, contendo 0,1 mM de ethylene glycol-bis

(β-aminoethyl ether)-N, N, N’, N’-tetraacetic acid (EGTA) (solução B, item 4.6), durante 4

a 6 min, para a destruição das bandas escalariformes. Na sequência, o coração foi perfundido com solução 1 mg. Ml-1 de colagenase tipo 2 (Worthington, EUA) e 100 µM de CaCl2 (solução C, item 4.6), durante 20 a 25 min, para a destruição das fibras de

colágeno e matriz extracelular. Todas as soluções utilizadas no procedimento de isolamento foram oxigenadas (O2 100% - White Martins, Brasil) e mantidas em

temperatura de 35 oC. Ao final da perfusão, os ventrículos foram separados dos átrios e pesados. O ventrículo direito foi removido e o esquerdo, aberto na região do septo interventricular. Fragmentos finos (< 1 mm) foram obtidos das regiões próximas ao epicárdio (EPI) e ao endocárdio (ENDO), que foram colocados, separadamente, em frascos contendo 5 mL da solução enzimática (colagenase) e albumina sérica bovina (solução D, item 4.6). Agitaram-se os frascos, moderadamente, durante 5 min, em banho-maria, à temperatura de 37 oC, sendo o tecido cardíaco oxigenado (O2 100% -

White Martins, Brasil). Em seguida, retiraram-se os fragmentos de tecido dos frascos e o

restante foi centrifugado (3.000 rpm). O sobrenadante foi removido e os miócitos cardíacos foram suspendidos em solução contendo 750 µM de CaCl2 (solução A, item

4.6). Esse processo foi repetido e os miócitos cardíacos foram armazenados em placas de Petri, em refrigerador (5 oC), até serem utilizados.

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4.8.3. Comprimento, largura e volume celular

Acomodaram-se os miócitos cardíacos em uma câmara experimental (Figura 2), banhados em solução-tampão de perfusão (item 5.6), em temperatura ambiente (~25

o

C). O comprimento e a largura dos miócitos foram medidos, usando-se sistema de captação de imagens. Visualizaram-se as imagens das células horizontalmente (aumento de 40 x – lente de imersão em óleo S Flúor) no monitor de um microcomputador, por meio de uma câmera (Myocam, Ionoptix, EUA) acoplada a um microscópio invertido (Nikon Eclipse – TS100, EUA), utilizando-se um programa de captação de imagens

(M-Vision 5X, Ionoptix, EUA). O comprimento celular foi determinado, medindo-se a

imagem da célula gerada no monitor, desde a borda direita até a esquerda, no ponto médio da largura do cardiomiócito. A largura celular foi medida com a imagem gerada da mesma forma; entretanto, desde a borda superior até a inferior, no ponto médio do comprimento dos miócitos cardíacos (Figura 1).

As linhas indicam como foram obtidos o comprimento (verde) e a largura (amarelo).

Figura 1 - Representação dos pontos de mensuração da imagem dos miócitos cardíacos.

Para a mensuração do comprimento e da largura dos miócitos cardíacos, usou-se uma régua com precisão de 1 mm. Na calibração do sistema, cada centímetro correspondia a 12 µm. Utilizaram-se somente as células que estavam em boas condições, com as bordas (direita/esquerda e superior/inferior) e estriações sarcoméricas bem definidas, relaxadas em repouso, sem apresentarem contrações voluntárias.

O volume celular foi calculado, usando-se a fórmula proposta por Satoh et al. (1996):

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Volume (pL) = comprimento (µm) x largura (µm) x (7,59 x 10- 3_pL/µm2

)

em que pL é picolitros; µm, micrômetros; e 7,59 x 10- 3 pL/µm2, constante obtida pela medida direta do volume celular, por meio de microscopia confocal, dada em picolitros por micrômetros ao quadrado.

4.8.4. Contração celular

As contrações celulares foram medidas por meio da técnica de alteração do comprimento dos miócitos cardíacos, utilizando-se o sistema de detecção de bordas (Ionoptix, EUA), montado num microscópio invertido (Nikon Eclipse – TS100, EUA).

Os miócitos foram acomodados em câmara experimental, com a base de vidro, banhados em solução-tampão de perfusão (item 5.6), em temperatura ambiente, ~25 oC, (Figura 2), e visualizados em monitor, com aumento de 40x, por meio de lente de imersão em óleo S Flúor, 40x (Nikon, EUA). Utilizaram-se, para as análises das contrações, somente os miócitos cardíacos que estavam em boas condições, com as bordas (direita e esquerda) e estriações sarcoméricas bem definidas, relaxadas em repouso, sem apresentarem contrações voluntárias.

Os miócitos cardíacos foram estimulados externamente na frequência de 3 Hz (10 v, duração de 5 ms), usando-se um par de eletrodos de aço, colado nas bordas internas da câmara, por meio de um estimulador elétrico de campo (Myopacer, Ionoptix, EUA). Esses miócitos foram visualizados em um monitor por meio de uma câmara (Myocam, Ionoptix, EUA) acoplada ao microscópio invertido, utilizando-se um programa de detecção de imagens (Ionwizard, Ionoptix, EUA), com frequência de 240 Hz.

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Observam-se o par de eletrodos conectados ao estimulador (fios preto e vermelho) e os tubos usados para levar e retirar a solução de perfusão dessa câmara.

Figura 2 - Câmara experimental acoplada ao microscópio invertido.

Identificaram-se as bordas dos miócitos cardíacos com duas janelas (direita e esquerda), alinhadas ao longo do comprimento das células. A definição das bordas foi ajustada por meio do contraste (preto e branco), gerado pela qualidade da imagem projetada dos miócitos cardíacos (Figura 3).

A borda direita e a esquerda da célula são projetadas pelos picos verde e vermelho para baixo. Figura 3 - Representação do programa utilizado para aquisição das imagens e dos

registros das contrações dos miócitos cardíacos (Ionoptix, EUA).

Os movimentos das bordas dos miócitos foram capturados pelo sistema de detecção de bordas (Ionwizard, Ionoptix, EUA) (Figura 3), durante 30 s, e armazenados para análise posterior (Figura 4).

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Figura 4 - Registro experimental de encurtamento de uma célula do ventrículo esquerdo estimulada na frequência de 3 Hz, em temperatura ambiente (~25 oC).

Analisaram-se a amplitude de contração (PPA), que é a variação do comprimento celular em repouso, em %; a máxima velocidade de contração (MVC), que é a velocidade pico de encurtamento celular, em µm/s; e a máxima velocidade de relaxamento (MVR), que compreende a velocidade pico de relaxamento celular, em µm/s (Figura 5). Esses parâmetros foram analisados após a sobreposição de pelo menos seis contrações estáveis de cada cardiomiócito, conforme Roman-Campus et al. (2009).

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O ponto inicial representa um estímulo elétrico (célula em repouso) e o ponto final, o fim do estímulo (célula em repouso).

Figura 5 - Diagrama demonstrativo do encurtamento de um cardiomiócito estimulado na frequência de 3 Hz (~25 oC) e dos respectivos parâmetros da contração analisados.

4.9. Soluções

As soluções utilizadas para o isolamento dos miócitos cardíacos ventriculares foram feitas, usando-se uma solução básica com água milli-Q e a seguinte composição (em mM): NaCl (130) – 7,6 g/L; MgCl2 (1,43) – 0,28 g/L; KCl (5,4) – 0,4 g/L;

N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethanesulfonic acid (HEPES) (5) – 0,062 g/L; glicose (10)

– 1,8 g/L; taurina (20) – 2,38 g/L; creatina (10) – 1,3 g/L; e pH = 7,3, em temperatura ambiente.

Solução A

Para fazer a solução de isolamento, contendo Ca2+, adicionaram-se 375 µL de CaCl2 (1 M), em 500 mL da solução básica.

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23 Solução B

Para a solução de isolamento livre de Ca2+, acrescentaram-se 250 µL de EGTA (100 mM), em 250 mL da solução básica.

Solução C

Para a solução enzimática de isolamento, foram acrescidos 20 mg de colagenase e 15 µL de CaCl2 (100 mM), em 20 mL da solução básica.

Solução D

Para a solução com 1% de albumina bovina, adicionaram-se 500 mg de albumina sérica bovina, em 5 mL de solução básica. Após o isolamento, 1 mL de albumina foi adicionado para cada 10 mL da solução enzimática C.

Solução de Perfusão Tampão HEPES

Para fazer um litro da solução de perfusão tampão HEPES, foram acrescentados 100 mL da solução-estoque, 10 mL da solução-sopa e 1 mL de CaCl2 (1)

em água milli-Q. Essa solução foi equilibrada para um pH=7,4 e mantida em temperatura ambiente.

Solução-estoque (em mM): NaCl (113) – 65,99 g/L; HEPES (5) – 11,9 g/L; NaH2PO4 (1) – 1,42 g/L; MgSO4 (1) – 2,46 g/L; e KCl (5) – 3,72 g/L.

Solução-sopa (em mM): Na acetato (20) – 16,4 g/100 mL; glicose (10) – 18,1g/100 mL; e insulina (5µ/L) – 0,5 g/100 mL.

4.10. Análises estatísticas

As médias e os desvios-padrão, referentes aos valores das variáveis respostas estudados, foram comparados entre os Grupos, por meio de análise de variância (ANOVA), seguido do teste de Tukey, com a correção de Kramer para dados desbalanceados. As análises foram implementadas com o auxílio do sistema SAS (Statistical Analysis System, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA - versão 9.2), licenciado para a Universidade Federal de Viçosa, em 2012.

Os dados das massas corporais dos animais, em cada um dos quatro Grupos, foram avaliados individualmente, durante oito semanas. O ganho de massa corporal médio (𝑌𝑌_𝑖𝑖) semanal (𝑋𝑋_𝑖𝑖), em cada Grupo, foi descrito por análise de regressão, tendo-se

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ajustado um modelo linear simples (𝑌𝑌_𝑖𝑖 = 𝛽𝛽₀+ 𝛽𝛽₁𝑋𝑋_𝑖𝑖 + 𝜀𝜀_𝑖𝑖), que se denominou completo, pois foram alocados parâmetros (𝛽𝛽₀ 𝑒𝑒 𝛽𝛽₁) específicos para cada Grupo, em que (β0) é a

estimativa do peso médio inicial; (β1), o acréscimo médio estimado no peso para cada

semana; e (𝜖𝜖_𝑖𝑖), o efeito do erro aleatório não observável associado à i-ésima observação. Esse modelo permitiu testes de igualdade entre os parâmetros dos Grupos NS, DS e DT, com os respectivos parâmetros do Grupo NT, tomado como referência.

Após a análise de variância, teste F (ANOVA), dos dados de morfologia e contratilidade, considerando os fatores treinamento (treinados e sedentários) e nutrição (nutridos e desnutridos) e as regiões EPI (epicárdio) e ENDO (endocárdio), observou-se que não houve diferença estatística entre o p-valor obtido nessas regiões (p > 0,05). Os dados dessas regiões foram colocados juntos e analisados como os dos miócitos isolados do ventrículo esquerdo (VE) como um todo.

Convencionaram-se as seguintes variáveis respostas:

− IHC = índice de hipertrofia cardíaca, que pode ser calculado pela razão entre a massa do coração e a massa corporal ou pela razão entre a massa do coração e o comprimento da tíbia.

− IHC1 = massa do coração (mg)/massa corporal (g), denominou-se R1. − IHC2 = massa do coração (g)/comprimento da tíbia (cm), denominou-se R2.

− IHV = índice de hipertrofia ventricular, que é a razão entre a massa do ventrículo (mg) e a massa corporal (g).

− COMP = comprimento celular (µm). − LARG = largura celular (µm). − VOLM = volume celular (pL). − PPA = amplitude de contração (%).

− MVC = máxima velocidade de contração (µm/s). − MVR = máxima velocidade de relaxamento (µm/s).

Os dados de IHC, IHV, COMP, LARG, VOLM, PPA, MVC e MVR (variáveis respostas Y) foram submetidos à análise de variância (ANOVA), tendo como fontes de variação o treinamento (exer=tre, para o Grupo Treinado; e exer=sed, para o Grupo Sedentário) e a nutrição (alim=nutr, para o Grupo Nutrido; e alim=desn, para o Grupo Desnutrido). Adotou-se o seguinte modelo de efeitos fixos: 𝑌𝑌_{𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖} = 𝜇𝜇 + 𝐸𝐸_𝑖𝑖+ 𝑁𝑁_𝑖𝑖 + (𝐸𝐸x𝑁𝑁) 𝑖𝑖𝑖𝑖 + 𝜖𝜖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖, em que 𝑌𝑌𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖 é a variável resposta avaliada no i-ésimo nível de

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desnutridos); 𝜇𝜇, a média geral; 𝐸𝐸x𝑁𝑁, o efeito aleatório da interação entre exercício e nutrição; e 𝜖𝜖_{𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖}, o efeito do erro aleatório não observável associado à k-ésima observação, com as pressuposições usuais de normalidade e homogeneidade de variâncias entre os Grupos.

A estratégia adotada nas análises foi de comparar os efeitos separadamente: treinados versus sedentários, bem como nutridos versus desnutridos, pois o efeito da interação 𝐸𝐸x𝑁𝑁 não foi significativo (valor p > 0,05).

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CABRAL, C. A. C. Resultados e Discussão

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. Desempenho físico dos animais

5.1.1. Teste de exaustão

O efeito do treinamento foi evidenciado, de acordo com a Tabela 2, com os resultados do desempenho físico dos animais no final do experimento.

Para o Grupo Nutrido (treinados versus sedentários), a velocidade final, o tempo final e a distância percorrida dos animais treinados foram significativamente superiores aos valores médios dos sedentários (treinados = 31,80 ± 4,16 m/min vs sedentários = 20,00 ± 3,13 m/min; treinados = 22,23 ± 4,54 min vs sedentários = 11,48 ± 2,71 min; e treinados = 744,01 ± 223,78 m vs sedentários 310,67 ± 269,66 m, respectivamente; p < 1%), conforme a Tabela 2.

Em relação ao Grupo Desnutrido (treinados versus sedentários), a velocidade final, o tempo final e a distância percorrida dos animais treinados também foram significativamente superiores aos valores médios dos sedentários (treinados = 38,33 ± 6,89 m/min vs sedentários = 20,80 ± 5,69 m/min; treinados = 29,14 ± 6,82 min vs sedentários = 12,10 ± 5,75 min; e treinados = 1.158,75 ± 475,19 m vs sedentários 280,75 ± 179,24 m, respectivamente, p < 1%), de acordo com a Tabela 2.

Quanto ao desempenho físico do Grupo DT ser melhor que o grupo-controle (NT), isso poderia ser explicado em razão de o peso dos animais desnutridos ser bem menor que o dos nutridos, pois esses são animais mais leves e ágeis. Estes resultados poderiam sugerir um efeito modulador do exercício físico para aumentar a biodisponibilidade dos aminoácidos para o coração, à custa de reduzir o crescimento do corpo, a fim de assegurar uma função cardíaca adequada, em condições de sobrecarga cardiovascular, minimizando o risco de insuficiência cardíaca mecânica em animais treinados e submetidos à restrição de proteínas na dieta.

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Tabela 2 - Valores médios e desvios-padrão do teste de exaustão no final do experimento com resultados* das comparações entre médias dos Grupos de animais Nutridos (NT vs NS) e Desnutridos (DT vs DS)

Grupos Velocidade final

(m/min) Tempo final (min)

Distância percorrida (m) NT (n=6) 31,80 ± 4,16a 22,23 ± 4,54a 744,01 ± 223,78a NS (n=6) 20,00 ± 3,13b 11,48 ± 2,71b 310,67 ± 269,66b DT (n=6) 38,33 ± 6,89a 29,14 ± 6,82a 1.158,75 ± 475,19a DS (n=6) 20,80 ± 5,69b 12,10 ± 5,75b 280,75 ± 179,24b *Pares de médias seguidas pela mesma letra, em cada coluna, não diferem a 1% pelo Teste de

Tukey-Kramer.

5.2. Caracterização dos Grupos de animais

5.2.1. Parâmetros bioquímicos

A avaliação bioquímica representa importante área de estudo sobre o estado de saúde dos animais, que pode auxiliar o diagnóstico e o prognóstico de diversas enfermidades (CUBAS et al., 2007).

Os valores médios dos parâmetros bioquímicos dos animais, caracterizando o estado de nutrição e desnutrição, são apresentados na Tabela 3.

Observou-se que os parâmetros bioquímicos proteína, albumina e hemoglobina dos animais do Grupo DT e o do DS apresentaram valores médios inferiores aos de referência (CUBAS et al., 2007), caracterizando a condição de desnutrição proteica.

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Tabela 3 - Valor de referência, valor médio e desvio-padrão dos parâmetros bioquímicos proteína, albumina e hemoglobina dos Grupos de animais NT, NS, DT e DS Parâmetro bioquímico Valor de referência Nutrido treinado (NT) n=6 Nutrido sedentário (NS) n=6 Desnutrido treinado (DT) n=6 Desnutrido sedentário (DS) n=6 Proteína (g/dL) 5,6 – 7,6 7,03 ± 0,18 7,10 ± 0,15 5,46 ± 0,39 5,1 ± 0,20 Albumina (g/dL) 3,3 – 4,9 4,15 ± 0,20 4,17 ± 0,16 3,17 ± 0,15 3,05 ± 0,15 Hemoglobina (g/dL) 12,8 – 17,8 13,76 ± 1,54 14,25 ± 2,23 11,63 ± 0,60 12 ± 0,95

Valor de referência: Cubas et al. (2007).

5.2.2. Massa corporal

A fim de confirmar o efeito da desnutrição em cada grupo de animais, na Figura 6 e na Tabela 4, são apresentados os modelos de regressão ajustados para a perda de massa corporal média por semana, com os respectivos testes de igualdade dos parâmetros, para os Grupos NS, DS e DT, comparados ao NT.

Os animais do Grupo Desnutrido (DT e DS) comprovaram que tiveram o crescimento prejudicado em relação aos do Grupo Nutrido (NT e NS), ao longo do experimento.

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Figura 6 - Modelos ajustados do perfil semanal da média de massa corporal dos Grupos NT, NS (Control), DS (MS) e DT (MT).

Tabela 4 - Modelos de regressão ajustados para o perfil semanal da média de massa corporal dos Grupos NT, NS, DT e DS

Grupo Y = β0 + β1 x semana β0 β1 NT (n=6) 104,51 30,01 NS (n=6) (=) (=) DT (n=6) (=) 10,080,02% DS (n=6) (=) 16,900,67%

(=) indica que o Teste T não rejeitou a hipótese de igualdade entre os parâmetros do modelo e os do Grupo de referência (NT), valor p > 5%. As estimativas foram apresentadas somente quando o Teste t indicou diferença significativa.

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Entre os nutrientes necessários à manutenção da homeostase, podem-se destacar as proteínas, definidas como moléculas de estruturas complexas que desempenham papéis fundamentais no corpo humano. Essas moléculas devem ser continuamente ressintetizadas pelo organismo, por meio da ingestão de proteínas pela dieta, em que veicularão os aminoácidos essenciais e os não essenciais. A desnutrição hipoproteica no período inicial da vida do animal pode afetar a proliferação celular, acarretando prejuízo ao desenvolvimento corporal por meio da depleção da massa muscular e diminuição de peso (ALBUQUERQUE, 2009).

A diferença de peso entre os Grupos Nutridos e Desnutridos foi estatisticamente diferente, o que garante que a dieta hipoproteica oferecida foi eficiente em promover a desnutrição, uma vez que a redução do peso corporal pode ser utilizada como indicador básico dessa condição (SAWAYA, 2006). O reduzido de ganho de peso observada nos animais desnutridos utilizados nesse trabalho ganhou respaldo na literatura, sugerindo que o baixo teor proteico da dieta, provavelmente, não disponibilizou aminoácidos suficientes para que o organismo pudesse ter seu desenvolvimento ideal.

Outros trabalhos desenvolvidos com ratos sugeriram que há associação entre a desnutrição e o peso corporal, em razão dos processos adaptativos, que acontecem fundamentalmente para se ajustarem às condições nutricionais adversas, às quais o animal está sendo submetido (OLIVEIRA, 2007). Diante desses parâmetros, é possível afirmar que a dieta composta de 6% de proteína (caseína) é eficaz na promoção de um quadro de desnutrição experimental.

5.3. Tecido muscular cardíaco

5.3.1. Índice de hipertrofia cardíaca (IHC)

Para as variáveis IHC1 (R1) e IHC2 (R2), não se observou efeito significativo (valor p > 5%) da interação entre treinamento (treinados e sedentários) e nutrição (nutridos e desnutridos), com valor de p igual a 37,69%, para R1; e 28,55%, para R2. Os resultados foram analisados, separadamente, entre os animais nutridos versus desnutridos, bem como entre treinados versus sedentários, conforme as Tabelas 5 e 6.