! "
# $ % & '
" & '
! " #
$% &% ' (% ' '% % ) *
& % % + *+, -% . '% /% '
0% )% 1 %
2
$% &% ' '% % ) *& (%
' -% . % % + +, % 3% '% 4
0% )% 1 %
2
Ficha catalográfica – BCE/FUEM
!""# ""$"
% & ' ( )%*+ !""#
, % - . / 0
1 2 & 3 ! 4 5 6 7
8 9 : ; : < = : < $ - > ?
: =) # 27 6 1" 4 2 1 =)
11 6 1! > 15 ,! 19 ,6 &
- %@
% 2 % 7
. 2 3
+2
+2
, 2
+2 B 2
2 7
7 7 -& 7 <
C & 2 & D2 7 7
2 7
C 3 2
C - 2
B & 3 8
7 D2 7
C E 6 D2
7
C D2 7
8 3 F2 2 2
C G )* 3
C 42 7
C H 2
C A I2 B 2 &
D2 D2
C 8 - & D2
, 7 D2 & < )
2 & > * <
< ,6 * <
@ 2 < ) 2
J 2 8
%2 7 & B )
7 7 37 D2 7 )
7 3 7 3 2
K ) 2 8 D2 >
Resumo
INTRODUÇÃO E OBJETIVOS A fisetina (3,7,3´,4´-tetrahidroflavona) é
um flavonóide encontrado na árvore do fumo (Cotinus coggyria), uma
árvore ornamental e é também distribuído em frutas e vegetais tais como morango, maçã, caqui, uva, cebola e pepino.
Exibe uma ampla variedade de propriedades biológicas, incluindo efeitos neurotróficos, antioxidantes, antiinflamatórios, antidiabéticos, antiangiogênicos e anticarcinogênicos. O efeito biológico mais conhecido dos flavonóides é sua ação antioxidante. Entretanto, os efeitos potencialmente tóxicos da fisetina e outros flavonóides têm que ser levados em consideração, desde que tem sido demonstrado que em doses elevadas, os flavonóides podem atuar como mutagênicos, prooxidantes com a geração de radicais livres e como inibidores de enzimas envolvidas no metabolismo energético e hormonal. Os mecanismos precisos através dos quais os flavonóides exercem suas ações benéficas ou tóxicas não estão bem estabelecidos. O presente trabalho foi planejado para investigar a ação da fisetina sobre parâmetros relacionados ao metabolismo energético com a finalidade de ampliar nosso entendimento das inter-relações existentes entre estes parâmetros, o potencial redox NADH-NAD+ e algumas alterações metabólicas hepáticas induzidas por este flavonóide. A maioria dos experimentos do presente trabalho foi realizada em fígados perfundidos isolados de ratos, um sistema experimental que permite medir vários fenômenos metabólicos sob condições de preservação da microcirculação e da integridade celular. Foram realizados também experimentos com mitocôndrias isoladas e microssomos.
MÉTODOSRatos Wistar machos, com 200 a 280 g, alimentados com
ração padronizada (Nuvital - Nuvilab CR-1) foram utilizados. O fígado foi perfundido isoladamente no modo não-recirculante. O líquido de perfusão foi o tampão Krebs/Henseleit-bicarbonato (pH 7,4), saturado com uma mistura de O2 e CO2 (95:5) através de um oxigenador de membrana e
simultaneamente aquecido a 37oC. Para medir o catabolismo do glicogênio (glicogenólise e glicólise) foram utilizados fígados de ratos alimentados ad
libitum. Para medir a glicólise a partir da frutose e a neoglicogênese,
fígados de ratos em jejum de 24 horas foram utilizados. Microssomos foram isolados para medir a atividade da glicose 6-fosfatase. A fosforilação oxidativa e a transdução de energia foram avaliados em mitocôndrias isoladas. Os seguintes compostos foram dosados através de procedimentos enzimáticos padronizados: lactato, piruvato, AMP, ADP, ATP e glicose 6-fosfato. A glicose foi medida pelo método da orto-toluidina. A concentração de oxigênio no perfusado efluente foi monitorada continuamente por polarografia, utilizando um eletrodo de platina revestido com membrana de teflon. Este eletrodo estava posicionado adequadamente numa câmara de acrílico na saída do perfusado. Fluxos metabólicos foram calculados a partir de diferenças porto-venosas e do fluxo total pelo fígado e referidos ao peso úmido do órgão. As enzimas glicose 6-fosfatase e a frutose-1,6-bisfosfatase foram também ensaiadas colorimetricamente. A atividade da piruvato carboxilase foi medida pela incorporação de 14C. Quando [1-14C]oleato foi infundido, as amostras foram fracionadas em intervalos de 2 minutos e coletadas em frascos Erlenmeyer para a dosagem de 14CO2. Acetoacetato e β-hidroxibutirato do perfusado efluente foram
dosados enzimaticamente utilizando a β-hidroxibutirato desidrogenase. A interferência pela fisetina (absorbância em 340 nm) foi descontada através de brancos. A produção de CO2 a partir de [1-14C]oleato foi medida pela
captura de 14CO2 em feniletilamina. A radioatividade foi medida por
cintilação líquida. A oxidação de NADH foi medida em 340 nm na presença de peroxidase e H2O2 com um espectrofotômetro.
RESULTADOS Os principais resultados foram os seguintes:
1) No fígado de ratos alimentados a fisetina inibiu a glicogenólise, como foi revelado pelo decréscimo da liberação de glicose, lactato e piruvato provenientes de glicogênio endógeno. Este efeito já foi evidente na concentração de fisetina 50 µM. A inibição do consumo de oxigênio (5%), assim como a inibição máxima da glicogenólise (49%) e glicólise (59%) foram obtidas com a concentração de 200 µM.
2) Os efeitos glicogenolíticos do glucagon e do 2,4-dinitrofenol foram suprimidos pela fisetina 300 µM.
pela fisetina, a diminuição na produção de piruvato sendo menos pronunciada. A razão lactato/piruvato foi, portanto, diminuída.
4) A neoglicogênese a partir de lactato e piruvato no fígado de ratos jejuados foi inibida de uma maneira dependente da concentração. A inibição já foi evidente em 50 µM de fisetina e quase completa em 300 µM. A transformação de frutose a glicose e o aumento do consumo de oxigênio que acompanha a neoglicogênese foram também inibidos pela fisetina.
5) A carboxilação do piruvato em mitocôndrias intactas isoladas foi inibida (IC50 = 163,10 ± 12,28 µM); tal efeito não foi observado em
mitocôndrias rompidas.
6) Em mitocôndrias isoladas, a fisetina diminuiu o estado III da respiração dependente de succinato ou α-cetoglutarato, aumentou o estado IV da respiração com o substrato FAD-dependente e diminuiu o controle respiratório e a razão ADP/O. Isto implica em uma diminuição da eficiência da transdução de energia possivelmente por ação desacoplante ou inibição da atividade da ATP-sintase.
7) A atividade ATPásica de mitocôndrias acopladas foi aumentada em uma maneira dose-dependente; estimulação máxima de 134% (p<0.001)
foi obtida na concentração de 400 µM. Quando mitocôndrias rompidas e desacopladas foram usadas como fonte de enzima, a atividade ATPásica foi inibida 43,6%e 36,7%respectivamente pela fisetina 300 µM.
8) A atividade NADH oxidase foi inibida, mas a fisetina não alterou a atividade succinato oxidase e a oxidação do TMPD/ascorbato.
9) Baixas concentrações de fisetina promoveram a oxidação do NADH pela peroxidase e na presença de quantidades catalíticas de H2O2.
10) A fisetina inibiu a atividade da glicose 6-fosfatase de microssomos isolados; IC50 = 294,40 ± 34,83 µM.
11) Em fígados perfundidos de ratos alimentados a fisetina (300 µM) não alterou significativamente as concentrações de AMP, ADP e ATP. Houve um incremento significativo, entretanto, na concentração celular de glicose 6-fosfato.
12) A cetogênese (produções de β-hidroxibutirato e acetoacetato) proveniente de fonte endógena foi inibida pela fisetina em toda a faixa de concentração (50-200 µM). A razão β-hidroxibutirato/acetoacetato foi também reduzida.
13) A produção de 14CO2 proveniente de [1-14C]-oleato exógena foi
aumentada pela fisetina.
DISCUSSÃO E CONCLUSÕES Os resultados da presente investigação
permitem concluir que a fisetina inibe a liberação de glicose pelo fígado e é, ainda, capaz de aumentar a razão NAD+/NADH mitocondrial e
para a mitocôndria. Este mecanismo é indicado pela inibição da carboxilação do piruvato na mitocôndria intacta e ausência de tal efeito na mitocôndria rompida. A redução do potential redox NADH-NAD+ citosólico também poderia contribuir para a limitação da neoglicogênese. A inibição concomitante do consumo de oxigênio está provavelmente relacionada à demanda reduzida de ATP provocada pela inibição desta rota biossintética. Uma possível ação inibitória da fisetina sobre a atividade da glicogênio fosforilase em fígados de ratos alimentados não pode ser excluída.
Os efeitos observados em mitocôndrias isoladas mostraram que a fisetina, como a quercetina, afeta o metabolismo energético mitocondrial.
A estimulação do consumo de oxigênio com o substrato FAD-dependente, a redução do estado III da respiração, controle respiratório e razão ADP/O, e também o aumento da hidrólise de ATP de mitocôndrias intactas acopladas sugeriram que a fisetina poderia atuar como um desacoplador da fosforilação oxidativa. A sua ação inibitória sobre a ATP-sintetase foi confirmada pela inibição da respiração na presença de ADP e pela inibição da atividade ATPásica de mitocôndrias rompidas ou desacopladas. Reduções nos níveis celulares de ATP e inibição de processos dependentes de energia são respostas esperadas quando a eficiência da transdução de energia mitocondrial é diminuída.
Entretanto, os dados encontrados em perfusão de fígado de rato forneceram evidências de que o metabolismo energético de células intactas não foi afetado na mesma extensão. Isto foi indicado pelos níveis de adenina nucleotídeos que não foram alterados em fígados de ratos alimentados perfundidos com a fisetina 300 µM. Ainda em fígados perfundidos, a cetogênese a partir de fontes endógenas foi parcialmente inibida pela fisetina em concentrações até 200 µM, mas a cetogênese a partir de oleato exógeno não foi modificada pela fisetina.
A fisetina também reduziu a razão β-hidroxibutirato/acetoacetato que é considerado como o indicador do potential redox NADH/NAD+ mitocondrial. É bem conhecido que muitos sistemas enzimáticos presentes no fígado são capazes de produzir radicais livres a partir de compostos fenólicos ou polifenólicos, como a fisetina, na presença de peróxido de hidrogênio. Provavelmente este processo também ocorre no fígado intacto, como foi indicado pela habilidade da fisetina para aumentar a razão NAD+/NADH mitocondrial e citosólica.
Abstract
INTRODUCTION AND AIMS Fisetin (3,7,3´,4´-tetrahydroflavone) is a
flavonoid dietary ingredient found in the smoke tree (Cotinus coggyria), a
ornamental tree and is also distributed in fruits and vegetables such as strawberry, apple, persimmon, grape, onion, and cucumber.
It exhibits a wide variety of pharmacological properties, including neurotrophic, antioxidant, anti-inflammatory, antidiabetic, antioangiogenic and anticarcinogenic effects. The most known biological effect of flavonoids is their antioxidant action. At high doses, however, the potentially toxic effects of fisetin and other flavonoids have to be taken into account, because it has been shown that in elevated doses, flavonoids, can act as mutagens, prooxidants with the generation of free radicals and as inhibitors of enzymes involved in energy and hormonal metabolism. The precise mechanisms by which flavonoids exert their beneficial or toxic actions remain unclear. The present work was planned to investigate the action of fisetin on parameters related to energy metabolism in order to improve our understanding of the interrelationships between these parameters, the NADH-NAD+ redox potential and some hepatic metabolic changes induced by this particular flavonoid. Most experiments of the present work were done in the isolated perfused rat liver, an experimental system which allows the measurement of metabolic phenomena under conditions of preservation of the microcirculation and cell integrity. Experiments were also performed with isolated mitochondria and microsomes.
METHODS Male Wistar rats, weighing 200 to 280 g, fed with a
standard laboratory diet (Nuvital - Nuvilab CR-1) were utilized. The isolated liver was perfused in the non-recirculating system. The perfusion fluid was Krebs/Henseleit-bicarbonate buffer (pH 7.4), saturated with a mixture of O2 and CO2 (95:5) by means of a membrane oxygenator and
simultaneously heated to 37oC. For measuring glycogen catabolism (glycogenolysis and glycolysis) livers from ad libitum fed rats were
utilized. Livers from 24-hours fasted rats were used for measuring
gluconeogenesis and glycolysis from fructose. Microsomes were isolated for the measurement of the glucose 6-phosphatase activity. Oxidative phosphorylation and energy transduction were evaluated in isolated mitochondria. Mitochondrial respiration was measured polarographically. The following compounds were assayed by means of standard enzymatic procedures: lactate, pyruvate, AMP, ADP, ATP, and glucose 6-phosphate. Glucose was measured by the ortho toluidine method. The oxygen concentration in the outflowing perfusate was monitored continuously by means of polarography using a teflon coated platinum electrode. This electrode was positioned in a plexiglass chamber at the exit of the perfusate. The metabolic fluxes were calculated from the porto-venous differences and the total flow through the liver and referred to the wet weight of the organ. The enzymes glucose 6-phosphatase and fructose 1,6-bisphosphatase were also assayed colorimetrically. Pyruvate carboxylase activity was measured by 14C incorporation. When [1-14C]oleate was
infused, the effluent perfusion fluid was fractionated in 2 minute intervals and collected in Erlenmeyer flasks for 14CO2 measurement. Acetoacetate
and β-hydroxybutyrate in the outflowing perfusate were measured
enzymatically using β-hydroxybutyrate dehydrogenase. Interference by
fisetin (absorbance at 340 nm) was excluded by running blanks. The carbon dioxide production from [1-14C]oleate was measured by trapping 14CO2 in
phenylethylamine. Radioactivity was measured by liquid scintillation spectroscopy. NADH oxidation was measured at 340 nm in the presence of peroxidase and H2O2 with a spectrophotometer.
RESULTSThe main results were the following:
1) In livers from fed rats fisetin inhibited glycogenolysis, as revealed by the decrease of glucose, lactate and pyruvate release from endogenous glycogen. This effect was already evident at a fisetin concentration of 50
µM. Maximal inhibition of oxygen uptake (5%) as well as maximal inhibition of glycogenolysis (49%) and glycolysis (59%) were obtained with the concentration of 200 µM.
3) Lactate and pyruvate productions from endogenous glycogen (glycolysis) in livers from fed rats were diminished by fisetin, the diminution in pyruvate production being less pronounced. The lactate to pyruvate ratio was thus diminished.
4) Gluconeogenesis from lactate and pyruvate in the liver from fasted rats was inhibited in a concentration-dependent manner. Inhibition was already evident at 50 µM fisetin and almost complete at 300 µM. Transformation of fructose into glucose and the oxygen uptake increase accompanying gluconeogenesis were also inhibited by fisetin.
5) Pyruvate carboxylation in isolated intact mitochondria was inhibited (IC50 = 163.10 ± 12.28 µM); no such effect was observed in freeze-thawing
disrupted mitochondria.
6) In isolated mitochondria, fisetin diminished state III respiration dependent on succinate or α-ketoglutarate, increased state IV respiration with the FAD-dependent substrate and diminished the respiratory control and ADP/O ratios. This implies in a diminution of the efficiency of energy transduction possibly by an uncoupling action or an inhibition of the ATP-synthase activity.
7) The ATPase activity of coupled mitochondria was increased in a dose-dependent manner; maximal stimulation of 134% (p<0.001) was
achieved at the concentration of 400 µM. When disrupted or uncoupled mitochondria were used as the enzyme source, the ATPase activity was inhibited by 43.6% (p<0.05) and 36.7% (p<0.05), respectively, by fisetin
300 µM.
8) The NADH oxidase activity was inhibited, but fisetin did not change the succinate oxidase activity and the TMPD/ascorbate oxidation.
9) Low concentrations of fisetin promoted NADH oxidation by peroxidase in the presence of catalytic amounts of H2O2.
10) Fisetin inhibited the activity of glucose 6-phosphatase of isolated microsomes; IC50 = 294.40 ± 34.83 µM.
11) In livers from fed rats 300 µM fisetin did not change significantly the cellular concentrations of AMP, ADP and ATP. There was a significant increment, however, in the cellular concentration of glucose 6-phosphate.
12) Ketogenesis (β-hydroxybutyrate and acetoacetoacetate production) from endogenous sources was inhibited by fisetin in the whole concentration range (50-200 µM). The β-hydroxybutyrate to acetoacetoacetate ratio was also reduced.
13) 14CO2 production from exogenous [1-14C]-oleate was increased by
fisetin.
DISCUSSION AND CONCLUSIONS The results of the present
NAD+/NADH ratio. The primary cause for the diminished gluconeogenesis from lactate and pyruvate is probably the inhibition of pyruvate transport into the mitochondria. This mechanism is indicated by the inhibition of pyruvate carboxylation in intact mitochondria and the absence of such effect in disrupted mitochondria. The reduction of the cytosolic NADH-NAD+ redox potential could also contribute to the limitation of gluconeogenesis. The concomitant inhibition of oxygen uptake is probably related to the reduced ATP demand caused by the inhibition of this biossynthetic route. A possible inhibitory action of fisetin on the glycogen phosphorylase activity in livers from fed rats cannot be excluded.
The effects observed in isolated mitochondria showed that fisetin, like quercetin, affects mitochondrial energy metabolism. The stimulation of oxygen consumption with the FAD-dependent substrate, the reduction of state III respiration, respiratory control and ADP/O ratios and also the increase of ATP hydrolysis of intact coupled mitochondria suggested that fisetin could be acting as an uncoupler of oxidative phosphorylation. Its inhibitory action on ATP-synthase was confirmed by the inhibition of respiration in the presence of ADP and by the inhibition of the ATPase activity of disrupted or uncoupled mitochondria. Reductions in the cellular ATP levels and inhibition of energy-dependent processes are expected responses when the efficiency of mitochondrial energy transduction is decreased.
However, the data found in rat liver perfusion provided evidence that the energy metabolism of intact cells was not affected to the same extent. This was indicated by the adenine nucleotide levels that were not changed in livers from fed rats perfused with 300 µM fisetin. Still in perfused livers, ketogenesis from endogenous sources was partly inhibited by fisetin at concentrations up to 200 µM, but ketogenesis from exogenous oleate was not modified by fisetin.
Fisetin also reduced the β-hydroxybutyrate/acetoacetate ratio which is considered as the indicator of the mitochondrial NADH/NAD+ redox potential. It is well known that many enzymatic systems present in the liver are capable of producing free radicals from phenolic or polyphenolic compounds like fisetin in the presence of hydrogen peroxide. Probably this process also occurs in the intact liver, as indicated by the ability of fisetin to increase the mitochondrial and cytosolic NAD+/NADH ratio.
