Análise das propriedades físico-químicas e atividade biológica de méis de diferentes regiões do estado do Ceará / Analysis of physicochemical properties and biological activity of honeys from different regions of the state of Ceará

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Braz. J. of Develop.,Curitiba, v. 6, n. 8, p. 59093-59102 aug. 2020. ISSN 2525-8761

Análise das propriedades físico-químicas e atividade biológica de méis de

diferentes regiões do estado do Ceará

Analysis of physicochemical properties and biological activity of honeys from

different regions of the state of Ceará

DOI:10.34117/bjdv6n8-358

Recebimento dos originais:08/07/2020 Aceitação para publicação:19/08/2020

Francinildo da Silva Brito

Graduado em Química pela Universidade Estadual do Ceará e Pesquisador na área de Produtos Naturais

Instituição: Universidade Estadual do Ceará

Endereço: Av. Dr. Silas Munguba, 1700 - Itaperi, Fortaleza - CE, Brasil E-mail: francynyldho.bryto@gmail.com

Maria da Conceição Tavares Cavalcanti Liberato

Doutora em Biotecnologia em Recursos Naturais pela Rede Nordeste de Biotecnologia e Professora

Associada com dedicação exclusiva da Universidade Estadual do Ceará Instituição: Universidade Estadual do Ceará

Endereço: Av. Dr. Silas Munguba, 1700 - Itaperi, Fortaleza - CE, Brasil E-mail: conceicao.liberato@uece.br

Renata Almeida Farias

Graduada em Química pela Universidade Estadual do Ceará e Pesquisadora na área de Produtos Naturais

Endereço: Av. Dr. Silas Munguba, 1700 - Itaperi, Fortaleza - CE, Brasil E-mail: renata.almeidaxm@gmail.com

Geovana Costa Aguiar

Graduanda em Química pela Universidade Estadual do Ceará Instituição: Universidade Estadual do Ceará

Endereço: Av. Dr. Silas Munguba, 1700 - Itaperi, Fortaleza - CE, Brasil E-mail: geovana.aguiar@aluno.uece.br

Álvaro Ventorini Vasconcelos

Graduando em Química pela Universidade Estadual do Ceará Instituição: Universidade Estadual do Ceará

Endereço: Av. Dr. Silas Munguba, 1700 - Itaperi, Fortaleza - CE, Brasil E-mail: alvaro.ventorini@aluno.uece.br

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Kamila de Lima Barbosa

Graduada em Química pela Universidade Estadual do Ceará e Pesquisadora na área de Produtos Naturais

Endereço: Av. Dr. Silas Munguba, 1700 - Itaperi, Fortaleza - CE, Brasil E-mail: kamila-batalha@hotmail.com

Ayrton Augusto Marques dos Santos

Graduando em Química pela Universidade Estadual do Ceará Instituição: Universidade Estadual do Ceará

Endereço: Av. Dr. Silas Munguba, 1700 - Itaperi, Fortaleza - CE, Brasil E-mail: Ayrton.marques@aluno.uece.br

RESUMO

O mel sempre será um alimento muito consumido pelo homem porque este percebeu seus vários benefícios, além de ser um produto natural, é saboroso e nutritivo. As abelhas o produzem a partir de suas secreções que se nutrem do néctar das flores. Este maravilhoso alimento é utilizado na prevenção e no combate de várias doenças, tornando-se um ótimo energético, bactericida, entre outros benefícios a saúde. Porém, o mel, pode ser facilmente adulterado, prejudicando nas suas propriedades. Uma das principais propriedades diz respeito aos compostos fenólicos, pois atuam como antioxidantes combatendo os radicais livres e podem impedir a ação da Enzima Acetilcolinesterase (AChE), causador pelo desgaste do neurotransmissor acetilcolina (ACh), nos portadores da Doença de Alzheimer (DA). Essa pesquisa tem por objetivo acrescentar mais informações e analisar a qualidade dos méis de diferentes regiões cearenses, assim como, a atividade biológica dos mesmos. Para análise da qualidade dos méis foram utilizados os testes físico-químicos de Lund, Lugol, Fiehe e Acidez, e para a determinação da atividade antiacetilcolinesterase baseou-se no método de Ellman e colaboradores (1961), adaptado por RHEE et al. (2001). No teste de Lund todos os méis apresentaram precipitações dentro do permitido. No teste de Lugol, o mel de Trairi apresentou variação de coloração. Nos resultados da Reação de Fiehe, os méis de Santana do Cariri e Várzea Alegre apresentaram presença de HMF. Na atividade antiacetilcolinesterase, com exceção do mel de Várzea Alegre (6 mm), todos os méis investigados mostraram valores de inibição próximos do padrão, o alcaloide fisostigmina (9 mm). A maioria dos méis analisados apresentou bons resultados para o teste de atividade antiacetilcolinesterase, sendo possível o uso como alimento funcional inclusive no tratamento da Doença de Alzheimer.

Palavras-chave: Mel, Doença de Alzheimer, antioxidante. ABSTRACT

Honey will always be a food widely consumed by man because he realized its various benefits, in addition to being a natural product, it is tasty and nutritious. Bees produce it from their secretions that feed on the nectar of flowers. This wonderful food is used to prevent and fight various diseases, making it an excellent energy source, bactericide, among other health benefits. However, honey can be easily adulterated, damaging its properties. One of the main properties concerns phenolic compounds, as they act as antioxidants fighting free radicals and can prevent the Enzyme Acetylcholinesterase (AChE), which causes the wear of the neurotransmitter acetylcholine (ACh), in patients with Alzheimer's Disease (AD). This research aims to add more information and analyze the quality of honeys from different regions of Ceará, as well as their biological activity. Lund, Lugol, Fiehe and Acidez physical-chemical tests were used to analyze the quality of the honeys, and to determine the anti-acetylcholinesterase activity, it was based on the method of Ellman et al. (1961), adapted by Rhee et al. (2001). In the Lund test, all honeys showed precipitations within the

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permitted range. In the Lugol test, Trairi's honey showed color variation. In the results of the Fiehe Reaction, the honeys from Santana do Cariri and Várzea Alegre presented HMF. In the anti-acetylcholinesterase activity, with the exception of the honey from Várzea Alegre (6 mm), all the investigated honeys showed inhibition values close to the standard, the alkaloid physostigmine (9 mm). Most of the honeys analyzed showed good results for the anti-acetylcholinesterase activity test, being possible to use it as a functional food even in the treatment of Alzheimer's Disease.

Keywords: Honey, Alzheimer Disease, antioxidant.

1 INTRODUÇÃO

O mel é produzido pelas abelhas a partir de suas secreções juntamente com o néctar extraídos das flores de plantas angiospermas. Em sua composição, existem compostos químicos que o caracterizam como uma substância aromática, viscosa e doce (LORENTE et al., 2008). É um alimento nutricional e saboroso, muito utilizado na prevenção e no combate de várias doenças, pois possuem, em sua composição, compostos antioxidantes, como flavonoides e fenóis. Além destes, o mel contém, em maiores quantidades, carboidratos simples como, por exemplo, glicose e frutose. Contém, também, em menores quantidades, água, minerais, aminoácidos, ácidos orgânicos (acético, cítrico e outros), vitaminas do complexo B e vitaminas C, D e E (GHELDOF et al., 2002).

As propriedades físico-químicas e biológicas presentes no mel se caracterizam de acordo com a florada predominante na região, pois as abelhas precisam do néctar das flores para produzi-los. De acordo com a florada, o mel pode apresentar aspectos claros ou escuros. Isso acontece porque o mel carrega com sigo propriedades das plantas que foi utilizado durante a sua produção (THENÓRIO, 2018).

O clima tropical cearense é muito propício a uma diversidade biológica de flora, aliado à presença da abelha africanizada, fatores esses permitem grande atividade apícolas, com tendência a aumentar suas práticas em proporções variadas em todo o estado (ARRUDA et al., 2011).

Dentre todos os compostos químicos presentes no mel, os que mais se destacam são os da família dos antioxidantes pois eles combatem a ação dos radicais livres, esses radicais são muito instáveis porque possuem, em suas estruturas, um ou mais elétrons desemparelhados ocasionando o envelhecimento precoce já que atuam como agentes oxidantes, fazendo com que as células percam elétrons para sua estabilidade. Portanto, é de suma importância pesquisas em alimentos com o objetivo de procurar substâncias antioxidantes pois são tão importantes à nossa saúde já que atuam na estabilização desses radicais, consequentemente previnem doenças (MEDA et al., 2005).

Os estudos dos produtos naturais de plantas têm como objetivo encontrar substâncias químicas que curam ou previnem alguns males à nossa saúde, essa linha de raciocínio é denominada de fitoquímica. Existem vários alimentos, extraídos da natureza, que contém substâncias que atuam

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como antioxidantes como, por exemplo, os compostos fenólicos e os flavonoides pois eles neutralizam a ação dos radicais livres presentes em nosso organismo, resultantes de um processo natural de forma equilibrada, pois quando gera um desiquilíbrio entre eles, radicais livres e antioxidantes, podem ocasionar o estresse oxidativo, resultando em mortes de células (GIADA e MANCINI, 2006). Outro importante estudo, já que afeta milhões de pessoas no mundo todo, é sobre a inibição da Enzima Acetilcolinesterase (AChE) pois está diretamente relacionada a Doença de Alzheimer. Estudos comprovam que essa enzima hidrolisa o neurotransmissor acetilcolina em colina e ácido acético (PETRONILHO et al., 2011).

2 MATERIAIS E MÉTODOS

Foram utilizados, nesse trabalho, 4 tipos de méis diferentes produzidos por abelhas do gênero

Apis mellifera de floradas silvestres, sendo todos os méis oriundos do estado do Ceará, identificados

conforme descrito na Tabela 1.

Tabela 1 – Identificação dos méis utilizados nas análises

Mel Abelha Produtora Florada Local de Origem

Mel P1 Apis melífera Silvestre Itatira

Mel P2 Apis melífera Silvestre Trairi

Mel P3 Apis melífera Silvestre Santana do Cariri

Mel P4 Apis melífera Silvestre Várzea Alegre

Fonte: Elaboração própria

2.1 REAÇÃO DE FIEHE

O teste de Fiehe é uma reação qualitativa que detecta a presença de hidroximetilfurfural (HMF) no mel (IAL, 1985). Este teste será realizado segundo os métodos analíticos do Laboratório Nacional de Referência Animal (LANARA, 1981).

O procedimento envolveu-se da seguinte forma: Pesou-se 5g da amostra homogeneizada de mel em um béquer de 50 mL, adicionou-se 5 mL de éter etílico, agitou-se vagarosamente e transfere-se a camada etérea para um tubo de ensaio, deixando que o éter evapore em condições ambientes. Em seguida adicionou-se 5 gotas de solução clorídrica de resorcina à 1%. A leitura dos resultados deverá ser realizada aproximadamente 5 a 10 minutos depois do fim do procedimento.

O resultado desta análise qualitativa está diretamente ligado a cor vermelha presente na reação do HMF com a solução clorídrica de resorcina. O vermelho persistente indicará positividade ou presença elevada de HMF na amostra (possivelmente mais de 200 mg/Kg). A coloração vermelho-cereja indica mel de má qualidade.

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Braz. J. of Develop.,Curitiba, v. 6, n. 8, p. 59093-59102 aug. 2020. ISSN 2525-8761 2.2 REAÇÃO DE LUGOL

O método que utiliza a reação de Lugol se baseará na reação que ocorre com as dextrinas e o amido presentes no mel (CANO et al., 2005). É um teste relativamente simples utilizado para a detecção de fraude em mel por adição de glicose comercial (IAL, 1985).

O procedimento envolveu-se da seguinte forma: Pesou-se 10 g da amostra em um béquer de 50 mL. Adicionou-se 20 mL de água destilada e agitou-se. Deixou-se no banho-maria por uma hora e em seguida resfriou-se à temperatura ambiente. Após o resfriamento do sistema, adicionou-se 5 a 10 gotas de solução de Lugol, que é uma solução formada a partir do Iodo ressublimado I2 (1%) com iodeto de potássio KI (2%) em solução com água destilada.

A solução de Lugol apresenta coloração amarela proporcionando a interação do iodo contido na solução com o amido contido nas amostras de méis. Na presença de glicose comercial ou xaropes de açúcar, o que caracteriza adulteração, a solução assumirá uma variação de coloração que tenderá do marrom-avermelhado ao azul. A intensidade da cor depende da qualidade e da quantidade das dextrinas ou amido presentes.

2.3 REAÇÃO DE LUND

O teste de Lund consiste na precipitação de proteínas naturais do mel pelo ácido tânico (IAL, 2005) permitindo a detecção da presença de albuminoides.

O procedimento envolveu-se da seguinte forma: Pesou-se 2g de amostra. Em seguida transferiu-se para uma proveta de 50 mL, com o auxílio de 20 mL de água destilada, adicionou-se 5 mL da solução de ácido tânico a 0,5%. Adicionou-se água até completar o volume de 40 mL. Logo após, agitou-se e deixou-se repousar por 24 horas.

Na presença de mel puro, forma-se um depósito que poderá variar entre 0,6 a 3,0 mL. Na presença de mel adulterado, não haverá formação de depósito ou ele será desprezível. Um depósito acima de 3,0 mL indicará um mel de má qualidade.

2.4 TESTE DE ACIDEZ

O teste de acidez é baseado em uma neutralização da solução ácida de mel, mediante o uso de uma solução de hidróxido de sódio (NaOH), titulando até pH = 8,3. Este método é recomendado pela Legislação Brasileira e pela AOAC (Association of Official Analytical Chemists).

O procedimento envolveu-se da seguinte forma: Pesou-se 10g da amostra para ser diluída em 75 mL de água livre de CO2. Em seguida, transferiu-se a solução para um béquer e

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adicionou-Braz. J. of Develop.,Curitiba, v. 6, n. 8, p. 59093-59102 aug. 2020. ISSN 2525-8761

se a ela a solução de NaOH 0,1 N até atingir o pH = 8,3. Usando um pHmetro (calibrado com soluções de pH = 4 e pH = 7) aferiu-se o volume gasto.

3 MÉTODOS BIOLÓGICOS

3.1 ENSAIO DA ATIVIDADE DE INIBIÇÃO DA ENZIMA ACETILCOLINESTERASE

O teste consiste em um ensaio enzimático descrito por Ellman e colaboradores (1961) e adaptado para cromatografia em camada delgada por RHEE et al. (2001).

Foram-se utilizadas soluções dos reagentes: Ácido 5,5’-ditiobis-2-nitrobenzóico (DTNB) e Iodeto de Acetilcolina (ATCI) em tampão aplicando-se, posteriormente, a enzima AChE (3 U/mL). O procedimento envolveu-se da seguinte forma: Após a evaporação do solvente pulverizou-se o substrato (ATCI, 1 mmol em tampão) e o reagente de Ellman (DTNB, 1 mmol novamente em solução tampão). Após secagem (3 a 5 minutos) borrifou-se a enzima a uma concentração de 3 U/mL. Observou-se uma coloração amarela na cromatoplaca após aproximadamente 10 minutos.

O aparecimento de halos brancos em torno dos “spots” das amostras indica que ocorreu a inibição da enzima AChE, responsável pela hidrólise do substrato. Após a verificação do tamanho dos halos será realizada a comparação com o padrão fisostigmina.

4 RESULTADOS E DISCUSSÕES

4.1 ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS

De acordo com a Legislação Brasileira sobre o mel de abelha Apis mellifera os parâmetros físico-químicos, para um mel de qualidade, devem apresentar os seguintes resultados: para a reação de Fiehe: negativa; reação de Lugol: negativa; reação de Lund: um depósito mínimo de 0,6 mL e máximo de 3,0 mL de precipitação e quanto ao pH um valor variando entre 3,35 e 4,50.

4.1.1 Reação de Fiehe

Nos testes realizados mostrou-se que os méis P3 (Figura 1) e P4 (Figura 2) tinham uma quantidade expressiva de HMF. A explicação pode estar no fato dessas amostras terem passado por superaquecimento ou estarem com muito tempo de estocagem.

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Figura 1 – Mel P3 Figura 2 – Mel P4

Fonte: Próprio autor Fonte: Próprio autor

As outras amostras não apresentaram quantidades relevantes de HMF, muito embora, também tenham apresentado o composto. No entanto, sua presença pode ser explicada em virtude da própria condição climática do Nordeste brasileiro, onde o Ceará está inserido, uma vez que a formação desse aldeído cíclico por desidratação da frutose em meio ácido (pH ± 3,9), é acelerado pelo calor.

4.1.2 Reação de Lugol

Das 4 amostras de méis, somente o P2 testou positivo para a reação de Lugol, o que significa dizer que este mel foi adulterado pela adição de glicose ou similares não devendo estar sendo disponibilizado ao consumidor.

Nas figuras 3 e 4 podemos ver, respectivamente, o antes e o depois da reação e consequente constatação da adulteração.

Figura 3 – Antes da reação Figura 4 – Depois da reação

Fonte: Próprio autor Fonte: Próprio autor

4.1.3 Teste de Lund

O teste de Lund é um procedimento quantitativo, por isso foi realizado em triplicatas. É um teste simples, de rápida realização baseado na precipitação de proteínas por desnaturação com ácido tânico. Todas as amostras se encontravam dentro dos limites estabelecidos pela Legislação

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Brasileira, não contendo nenhuma delas depósitos de proteínas inferiores a 0,6 mL e nem superiores a 3,0 mL (Tabela 2). O resultado foi expresso por média e desvio padrão.

Tabela 2 – Precipitação de proteínas no teste de Lund.

1ª amostra 2ª amostra 3ª amostra Média e desvio

MEL I 2,0 Ml 1,7 mL 1,9 mL 1,9 mL ± 0,15

MEL II 2,1 Ml 1,9 mL 2,0 mL 2,0 mL ± 0,1

MEL III 1,8 Ml 1,7 mL 1,9 mL 1,8 mL ± 0,1

MEL IV 1,5 Ml 1,6 mL 1,6 mL 1,6 mL ± 0,06

Fonte: Próprio autor

4.1.4 Teste de Acidez

A acidez do mel influencia diretamente no seu sabor, contribuindo significativamente na estabilidade frente a microrganismos. É desta forma, uma variável auxiliar, bastante importante na avaliação de qualidade.

Dentro dos parâmetros estabelecidos pela legislação brasileira (pH variando entre 3,35 e 4,50) todas as amostras obtiveram resultados satisfatórios (Tabela 3).

Tabela 3 – Resultados do teste de pH das amostras de méis.

Amostra pH Temperatura

MEL I 4,48 26,0° C

MEL II 4,02 25,9° C

MEL III 4,46 26,0° C

MEL IV 3,82 25,9° C

5 RESULTADOS BIOLÓGICOS

5.1 ATIVIDADE ANTIACETILCOLINESTERASE

A inibição da enzima acetilcolinesterase, é um teste enzimático, que se baseia no aparecimento de halos brancos em torno dos “spots” das amostras, formam-se indicativos de que ocorreu a inibição da enzima AChE, responsável pela hidrólise do substrato. Depois da verificação do tamanho dos halos foi realizada uma comparação com o padrão fisostigmina.

Quase todas as amostras dos méis analisados apresentaram valores de inibição (Tabela 4) próximos do padrão, o alcaloide fisostigmina (9 mm). Com destaque para o mel de Santana do Cariri (P3), que entre os méis avaliados, obteve o melhor resultado com um halo de inibição de 9 mm, igual ao do padrão utilizado. No entanto, o mel de Várzea Alegre (P4), obteve o valor mais baixo com um halo de inibição de apenas 6 mm. Os outros méis apresentaram resultados um pouco abaixo do padrão, 8 mm, porém, ainda continuam com uma boa capacidade de inibição da enzima, no entanto, em menor escala. Vale ressaltar que nenhuma das amostras apresentou atividade nula para inibição da enzima AChE.

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Tabela 4 – Valores de inibição da enzima AChE.

Mel Abelha Produtora Local de Origem Valores de inibição

Mel P1 Apis melífera Itatira 8 mm

Mel P2 Apis melífera Trairi 8 mm

Mel P3 Apis melífera Santana do Cariri 9 mm

Mel P4 Apis melífera Várzea Alegre 6 mm

Liberato et al., (2011) analisando 23 amostras de méis de abelhas Apis mellifera provenientes de localidades cearenses, também obteve valores para a inibição da enzima acetilcolinesterase que variaram de 4 a 9 mm.

6 CONCLUSÃO

Todos os méis avaliados apresentaram resultados satisfatórios em relação ao teor de proteínas e açúcares. Apesar disso, foi detectada a presença de HMF em alguns méis, o que pode ser um indicativo de superaquecimento ou de uma possível adulteração. Embora esses resultados que indicaram a presença de hidroximetilfurfural possam ser explicados devido às altas temperaturas no estado do Ceará, uma vez que o mesmo é marcado por um verão seco, havendo presença de sol na maior parte do ano. Entretanto, testes posteriores confirmaram adulteração em uma amostra analisada, sendo a mesma reprovada no teste de qualidade e considerada não apta para o consumo. Quanto à atividade da enzima acetilcolinesterase, todas as amostras apresentaram atividade inibitória da enzima, identificando-se resultados equivalentes ao padrão utilizado. Em virtude dos dados apresentados, pode-se considerar viável o uso dos méis cearenses como alimento funcional podendo ajudar na prevenção de doenças, inclusive para aquelas consideradas mais complexas como a Doença de Alzheimer.

REFERÊNCIAS

ARRUDA, J. B. F.; BOTELHO, B. D.; CARVALHO, T. C. Diagnóstico da cadeia produtiva da apicultura: um estudo de caso. In: ENCONTRO NACIONAL DE ENGENHARIA DE

PRODUÇÃO. 31., 2011, Belo Horizonte. Anais... Belo Horizonte: ABEPRO, 2011.

CANO, C. B.; NAGATO, L. A. F.; DURAN, M. C. et al. Açúcares e produtos correlatos. In: INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Métodos físico-químicos para análise de alimentos. 4 ed. Brasília: ANVISA, Cap.7, p.321-343, 2005.

GHELDOF, N., Wang, X., Engeseth, N. Identification and Quantification of Antioxidant Components of Honeys from Various Floral Sources, Journal of Agricultural and Food

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GIADA, M. de L. R.; MANCINI, J. F. Importância dos Compostos Fenólicos da Dieta na Promoção da Saúde Humana. Public UEPG Biology Health Science, v. 12, n.4, p. 7-15, 2006.

INSTITUTO ADOLFO LUTZ - IAL. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. Vol. 1 Métodos Químicos e Físicos para Análise de Alimentos. São Paulo: IAL, 1985.

INSTITUTO ADOLFO LUTZ - IAL. Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz: métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 4 ed. Brasília: Ministério da Saúde, 1018 p, 2005.

LANARA - Laboratório Nacional de Referencia Animal. Métodos analíticos oficiais para

controle de produtos de origem animal e seus ingredientes: II - métodos físicos e químicos.

Brasília: Ministério da Agricultura, v.2, cap.25, p. 1-15, 1981.

LIBERATO, M. C. T. C. 2011. Estudo químico e bioprospecção de produtos da abelha Apis

mellifera L. do Estado do Ceará – Fortaleza, 2011. Tese (Doutorado em Biotecnologia) –

Universidade Estadual do Ceará. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Rede Nordeste de Biotecnologia. 2011. 232p.

LORENTE, M. G.; CARRETERO, C. L.; MARTÍN, R. A. P. Sensory attributes and antioxidant capacity of spanhish honeys. Journal of Sensory Studies, v. 23, p. 293-302, 2008.

MEDA, A., LAMIEN, C. E., ROMITO, M., MILLOGO, J., NACOULMA, O. G. Determination of the Total Phenolic, Flavonoid and Proline Contents in Burkina Fasan Honey, as well as their Radical Scavenging activity. FoodChemistry, 91: 571-577. 2005.

PETRONILHO, E. C.; PINTO, A. C.; VILLARA, J. D. F. ACETILCOLINESTERASE: ALZHEIMER E GUERRA QUÍMICA. Ciência e Tecnologia, v. 28, n. 3, p. 3-14, 2011.

RHEE, I. K.; MEENT, M.; INGKANINAN, K.; VERPOORTE, R. Screening for acetylcholinesterase inhibitors from Amaryllidaceae using silica gel thin-layer chromatography in combination with bioactivity staining. JournalofChromatography A, v.915, p. 217-223, 2001.

THENÓRIO, I. Manual do Mundo. Youtube. 6 de jan. 2018. Disponível em: https://www.youtube.com/watch?v=T8_5B6V6D-Y. Acesso em: 25 jan. 2020.