Faculdade de Farmácia
INFECÇÃO PELO VÍRUS DO PAPILOMA HUMANO (HPV): PATOGÉNESE E DIAGNÓSTICO / RELATÓRIO DE ESTÀGIO
Ana Rita Nunes Monteiro
Dissertação / Relatório de estágio orientada/o pelo Professor Doutor José Miguel Azevedo Pereira e, coorientada pela Professora Doutora Maria Cristina Crespo Silva Marques, com a supervisão de estágio da Doutora Maria de Fátima
Consciência.
Mestrado em Análises Clínicas
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Universidade de Lisboa
Faculdade de Farmácia
RELATÓRIO DE ESTÀGIO
Ana Rita Nunes Monteiro
Relatório de estágio orientado pela Professora Doutora Maria Cristina Crespo Silva Marques e com a supervisão de estágio da Doutora Maria de Fátima
Consciência.
Mestrado em Análises Clínicas
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ÍNDICE
Agradecimentos 12
Resumo 13
Abstract 14
Caracterização do laboratório de estágio 16
Fase Pré-Analítica 17
1. Atendimento do utente 18
2. Colheita de amostras biológicas 19
3. Triagem e conservação de amostras 25
4. Critério de rejeição de amostras 27
Fase Analítica 28
A. Hematologia 29
1. Equipamentos 30
1.1. Advia 2120i com módulo de veterinária 30
1.2. Hi-Auto A1c (HA 8160) 39
1.3. Vesmatic 30 Plus 41 1.4. Sysmex CA 500 42 2. Técnicas manuais 45 B. Microbiologia 48 1. Equipamentos 49 1.1.Vitek 2 Compact 49 2. Técnicas manuais 51 C. Imunologia e Endocrionologia 61 1. Equipamentos 62 1.1.Cobas e411 62 1.2.Unicap (Phadia 100) 66 1.3.Vidas® 68 2. Técnicas manuais 70
D. Bioquímica – Química Clínica 73
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a. Clinitek Atlas 74
b. Cobas Integra Plus 400 76
c. Hydrasys 78
2. Técnicas manuais 83
Controlo de Qualidade Interno 87
Avaliação Externa da Qualidade 90
Fase Pós-Analítica 92
1. Emissão dos boletins de resultados 92
2. Validação biopatológica 92
3. Entrega dos boletins de resultados 93
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ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 – Representação de tubos de vácuo para colheita de sangue por punção venosa 20
Figura 2 – Representação do equipamento Advia 2120i 30
Figura 3 – Representação do equipamento Hi-Auto (HA 8160) 39 Figura 4 – Representação do equipamento Vesmatic 30 Plus 41 Figura 5 – Representação do equipamento Sysmex CA 500 42
Figura 6 – Representação da cascata da coagulação 43
Figura 7 – Representação da execução de esfregaço de sangue periférico 47 Figura 8 – Representação do equipamento Vitek 2 Compact 49 Figura 9 – Representação das cartas de identificação e antibiograma 49 Figura 10 – Representação do equipamento Cobas e411 62 Figura 11 – Representação do equipamento Unicap (Phadia 100) 66
Figura 12 – Representação do equipamento Vidas 68
Figura 13 – Representação do equipamento Clinitek Atlas 74 Figura 14 – Representação do equipamento Cobas Integra Plus 400 76 Figura 15 – Representação do perfil electroforético de proteínas 78 Figura 16 – Representação do gel de imunoelectroforese 81
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ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1 – Instrução Técnica para obtenção de exsudados 22 Tabela 2 – Situações patológicas associadas à alteração de tamanho dos Glóbulos Vermelhos
31 Tabela 3 – Situações patológicas associadas à alteração de cor dos Glóbulos Vermelhos
32 Tabela 4 – Situações patológicas associadas à alteração de forma dos Glóbulos Vermelhos
33 Tabela 5 – Situações patológicas associadas às inclusões eritrocitárias 34 Tabela 6 – Situações patológicas associadas à alteração de distribuição dos Glóbulos
Vermelhos 35
Tabela 7 – Situações patológicas associadas às alterações quantitativas dos Glóbulos Brancos 36 Tabela 8 – Situações patológicas associadas às alterações quantitativas de plaquetas 37 Tabela 9 – Valores de referência do hemograma no adulto 38
Tabela 10 – Resultados possíveis de B.K. directo 57
Tabela 11 – Resultados possíveis de B.K. cultural 57
Tabela 12 – Parâmetros analíticos obtidos pelo equipamento Cobas e411 62 Tabela 13 – Análise dos resultados possíveis de infecção pelo Vírus da Hepatite B 63 Tabela 14 – Análise dos resultados possíveis de infecção pelo Citomegalovírus 64 Tabela 15 – Parâmetros analíticos obtidos pelo equipamento Unicap 66 Tabela 16 – Parâmetros analíticos obtidos pelo equipamento VIDAS 68 Tabela 17 – Parâmetros analíticos obtidos pelo equipamento Clinitek Atlas 74 Tabela 18 – Parâmetros analisados pelo equipamento Cobas Integra Plus 400 76
8 Tabela 19 – Situações patológicas associadas às diferentes fracções de proteínas 80
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LISTA DE ABREVIATURAS
β-HCG – Beta-Human Chorionic Gonadotropin γ-GT – Gamaglutamiltranspeptidase
ACTH – Adrenocorticotropic Hormone ALT – Alanina aminotransferase
APTT – Activated Partial Thromboplastin Time AST – Aspartate aminotransferase
BAAR – Bacilo álcool-ácido resistente BASO – Basófilos
CHGM – Concentração de Hemoglobina Globular média CK – Creatine Kinase
CK-MB – Creatine Kinase-MB
CLED – Cystine lactose electrolyte deficient agar CPK – Creatine phosphokinase
CQI – Controlo de Qualidade Interno
CTFF – Capacidade total de fixação de ferro FSH – Follicle-stimulating Hormone
GB – Glóbulos Brancos GN – Gram negativo GP – Gram positivo
GSGC – Gelose sabouraud gentamicina cloranfenicol GV – Glóbulos Vermelhos
10 HBs – Proteína de superfície do vírus da hepatite B
HCV – Hepatitis C Virus
HDL – High Density Lipoprotein HGM – Hemoglobina Globular média HIV – Human Immunodeficiency Virus IC – Instruções de colheita
INR – International normalised ratio
INSA – Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge IST – Infecção Sexualmente Transmissível
IT – Instrução técnica
KOH – Potassium Hydroxide LCR – Líquido cefaloraquidiano LDH – Lactate dehydrogenase LDL – Low Density Lipoprotein LH – Luteinizing Hormone NH – Neisseria haemophilus PCR – Protein C reactive
PCR-hr – Protein C reactive high sensitive PEROX – Peróxidos
PLT – Plaquetas
POCT – Point-of-care testing PSA – Prostate Specific Antigen PSM – Process systems manager
11 PTOG – Prova de tolerância oral à glucose
RA – Rheumatoid Arthritis
RAST’S – Radioallergosorbent test RBC – Eritrócitos
RETIC – Reticulócitos RF – Rheumatoid Factor
RIQAS – Randox International Quality Assessment TASO – Anti-estreptolisina O
TG – Tiroglobulina
TIBC – Total iron-binding capacity TP – Tempo de protrombina
TPO – Tireoperoxidase
TSA – Teste de susceptibilidade aos antibióticos VDRL – Veneral disease research laboratory VGM – Volume Globular médio
VS – Velocidade de sedimentação WBC – Leucócitos
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AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar agradecer à minha família pois sem eles nada disto seria possível, pais, avós e irmã. Em segundo lugar ao meu namorado e amigos por todo o apoio fora da faculdade.
Às minhas colegas de turma, por toda a entre-ajuda nesta caminhada pelo mestrado. À Dra. Fátima Consciência pela oportunidade de estágio no Biolabor, assim como a todas as colegas de laboratório por todo o ensino e ajuda.
Ao professor José Miguel, pelo apoio no desenvolvimento do tema de monografia. À professora Cristina e a todos os outros professores que colaboraram durante todo o mestrado, pois sem dúvida que sem eles não era possível atingir este nível de aprendizagem.
NOTA: O PRESENTE RELATÓRIO E MONOGRAFIA FOI ESCRITO AO ABRIGO DO ANTIGO ACORDO ORTOGRÁFICO
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RESUMO
O presente relatório tem como finalidade descrever as actividades realizadas no Laboratório de Análises Clínicas, Biolabor, local de realização do estágio curricular do Mestrado em Análises Clínicas, nomeadamente nas áreas de Hematologia, Microbiologia, Imunologia, Bioquímica e Virologia.
Serão descritos todos os métodos e equipamentos utilizados nas várias valências assim como a análise dos parâmetros e o controlo de qualidade do Laboratório.
O estágio decorreu num período de 6 meses. Inicialmente foi realizado um enquadramento teórico do funcionamento do laboratório, assim como de todos os procedimentos analíticos a realizar.
Na fase pré-analítica foi realizado o seguimento do utente desde a sua entrada no laboratório, confirmação das análises prescritas e finalmente a colheita do produto biológico a analisar. Ainda nesta fase foram adquiridos conhecimentos no processo de triagem, conservação de amostras e rejeição de amostras.
Na fase analítica são descritos os processos automáticos a realizar pelos diversos equipamentos assim como o enquadramento teórico. Na área da hematologia os equipamentos utilizados são: Advia 2120i, Hi-Auto A1c (HA 8160), Vesmatic 30 Plus e Sysmex CA 500. Na área da microbiologia, além das sementeiras de culturas de produtos biológicos foram realizados os testes de identificação de estirpes e o estudo de sensibilidade aos antibióticos com o apoio do aparelho automatizado Vitek 2 Compact. Nos estudos imunológicos as diversas análises são efectuadas nos equipamentos automáticos Cobas e411, Unicap (Phadia 100) e Vidas. Na área da bioquímica são utilizados os equipamentos Clinitek Atlas, o equipamento Cobas Integra Plus 400 e o equipamento Hydrasys. Além das técnicas realizadas nos equipamentos automáticos são também descritas as técnicas manuais efectuadas.
Todas as fases apresentam um controlo de qualidade interno estrito de modo a garantir a qualidade dos nossos resultados evitando situações de erros aleatórios e/ou sistemáticos. O controlo de qualidade interno é avaliado através de gráficos Levey-Jennings e pela métrica 6σ. Além do controlo de qualidade interno é realizada a avaliação externa da qualidade pela
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Como fase pós-analítica foi realizado o seguimento desde a emissão de boletins de resultados, validação biopatológica, finalizando com a entrega do boletim de resultados.
Palavras-chave: Hematologia, Microbiologia, Bioquímica, Imunologia, Virologia, Controlo
de Qualidade.
ABSTRACT
The present work describes the activities that occurred in Biolabor, a clinical laboratory, during the Master in Laboratory Medicine’s internship. The main internship areas were Hematology, Microbiology, Immunology, Biochemistry and Virology.
In this report, the methods and related equipment are described, as well as the analytical and the quality control procedures in clinical laboratory.
The internship lasted for six months, starting with the theoretical framework about laboratory activities and analytical procedures.
In the pre-analytical phase, it is described the patient follow-up since the admission in the laboratory, passing by prescribed tests’ confirmation and finally the harvest of the biological product to be analyzed. At this phase some knowledge was obtained about screening processes, preservation and rejection of samples.
In the analytical phase the automatic procedures performed by different equipment are described as well their theoretical framework. In hematology the equipment used was: Advia 2120i, Hi-Auto A1c (HA 8160), Vesmatic 30 Plus and Sysmex CA 500. In microbiology, it was performed the culture of biological samples, followed by the identification of strains and respective antibiotic sensitivity study, using the Vitek 2 Compact automated device. In immunological studies the different kinds of analyzes were performed on the following automatic equipment: Cobas e411, Unicap (Phadia 100) and Vidas. Last but not the least, in biochemistry the equipment used was: Clinitek Atlas, Cobas Integra Plus 400 and Hydrasys. In addition to the techniques performed on the automatic equipment, the manual techniques are also described.
15 All phases have presented a narrow internal quality control in order to guarantee the quality of results, avoiding situations of random and / or systematic errors. The internal quality control was evaluated through Levey-Jennings’ studies and the 6σ metrical. Beyond the internal quality control, it was also performed an external quality evaluation process using the INSA and RIQAS programs.
Finally, in the post-analytical phase, it was done the follow-up since results emission and biopathological validation until the delivery of the results bulletins.
Keywords: Hematology, Microbiology, Biochemistry, Immunology, Virology and Quality
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CARACTERIZAÇÃO DO LABORATÓRIO DE ESTÁGIO
O Biolabor, Laboratório de Análises Clínicas, Lda, situa-se na Rua Luís de Camões nº10, em Santarém. Está certificado pela IQNet - ISO 9001:2008; APCER - NP EN ISO 9001:2008; APCER - Normas para o Laboratório Clínico Edição nº 2 - Maio 2003. Mantém protocolos de colaboração técnica com várias entidades da área da saúde, como, Clínica Médica e de Diagnóstico Dr. Joaquim Chaves; Instituto Nacional Dr. Ricardo Jorge; CGC Centro de Genética Clínica; GPDN - Genética Médica e Diagnóstico Pré-Natal Dr. Sérgio Castedo, S.A. e Crioestaminal.
Apresenta controlo de qualidade interno, com a monitorização de todas as fases, Pré-analítica; Analítica e Pós-analítica. A avaliação externa da qualidade é avaliada por organismos exteriores ao laboratório, nomeadamente o INSA (Instituto Dr. Ricardo Jorge) e o RIQAS (Randox International Quality Assessment).
O laboratório apresenta a zona de recepção onde se escontra a sala de espera; duas salas de colheitas; a área analítica de Hematologia; a área analítica de Microbiologia; a área analítica de Imunologia e Bioquímica; a sala de Triagem e a sala de lavagem de material.
O laboratório encontra-se sob a responsabilidade da Directora Técnica, Dra. Maria de Fátima Consciência, Especialista em Análises Clínicas pela Ordem dos Farmacêuticos. Tem como colaboradores: uma responsável de Qualidade, Dra. Noélia Piteira, Especialista em Análises Clínicas pela Ordem dos Farmacêuticos; uma Técnica Superior de Análises; três Técnicas de Diagnóstico e Terapêutica; duas Técnicas de Análises Clínicas e três Recepcionistas. Além do laboratório central, ainda possui 4 postos de colheitas.
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FASE PRÉ-ANALÍTICA
Esta fase engloba todos os processos desde o atendimento dos utentes até à obtenção da amostra biológica a analisar. As etapas do processo pré-analítico são: o atendimento do utente, a colheita de amostras biológicas e a triagem dessas amostras.
É na fase pré-analítica que são confirmados os dados da ficha do utente assim como são confirmadas as análises prescritas. É importante antes de proceder à recolha da amostra confirmar que o utente cumpre todos os requisitos necessários.
É nesta fase que ocorre a maioria dos erros analíticos. Os principais erros que surgem nesta fase relacionam-se com a má preparação do utente como o jejum incorrecto, com a identificação incorrecta dos produtos biológicos devido a erro técnico do sistema informático ou por distracção do técnico de análises, com a má conservação de amostras como no caso de não refrigerar urinas tipo II, com a recolha reduzida de volume de sangue que altera as proporções de sangue para anticoagulante na distribuição pelos tubos, com a contaminação de amostras como quando a urina é colhida em recipientes impróprios e as amostras consideradas não conformes devido a hemólise, lipémia ou por conter coágulos.
De modo a minimizar estes erros da fase pré-analítica são estabelecidos procedimentos chave. É do dever tanto das recepcionistas como da técnica de análises verificar se o utente se encontra em condições de realizar a colheita assim como se as análises geradas pelo sistema informático coincidem com o pedido do médico prescritor. Sempre que um produto biológico não apresente condições para execução analítica deve ser rejeitado de modo a minimizar os erros que possam surgir dessa análise.
ENTRADA DO UTENTE PARA REALIZAR ANÁLISES
CLÍNICAS
ATENDIMENTO COLHEITA TRIAGEM
SAÍDA DO UTENTE. AMOSTRA IDENTIFICADA E
18 1. Atendimento do utente
O atendimento do utente é realizado pelas recepcionistas do laboratório, por ordem de chegada, excepto em situações em que o utente é prioritário, como o caso da diabetes, gravidez, pessoas com deficiência, crianças com idade inferior a 3 anos ou utentes que realizem a Prova de Tolerância Oral à Glucose (PTOG).
Cabe às recepcionistas a realização de um pequeno inquérito, relativamente à preparação correcta do utente para a colheita da amostra biológica. É realizada a marcação de análises e é fornecida a informação necessária à preparação de determinadas análises, como o tempo de jejum e a colecta correcta de amostras.
Quando necessário, é entregue ao utente a Instrução de colheita (IC) específica relativamente à colheita de um produto biológico específico, como no caso da colheita de urina de 24H.
É na zona de atendimento do utente que se realiza a abertura da ficha de utente. Cada utente apresenta um código exclusivo que é gerado a partir do sistema informático. Assim, o utente tem associado neste código todas as análises prescritas pelo seu médico.
19 2. Colheita de amostras biológicas
A colheita de amostras biológicas é realizada pela técnica de análises ou pela técnica de terapêutica e diagnóstico, na sala de colheitas. Antes da entrada do utente na sala de colheitas, esta deve estar previamente preparada com todo o material necessário à colheita.
É da responsabilidade do técnico que realiza a colheita de amostras biológicas a confirmação das análises prescritas pelo médico. O técnico deve confirmar novamente com o utente se este cumpre os requisitos necessários à análise.
Acoplado à ficha do utente, seguem as etiquetas com o código de barras que é gerado para o utente. Estas etiquetas são distribuídas correctamente pelos recipientes que irão conter as amostras biológicas garantindo a rastreabilidade de todo o processo analítico, minimizando os erros da fase pré-analítica.
2.1. Colheita de sangue venoso
Para a colheira do sangue venoso o utente deve estar sentado ou deitado com o braço estendido e sem roupa apertada.
O material para a colher deve estar preparado. Inicia-se o processo de colheita ao enroscar a agulha na seringa sem retirar a cápsula de protecção e posteriormente são identificados os tubos necessários.
Para proceder à punção venosa, é colocado o garrote aproximadamente a 10 cm da zona de punção, faz-se a palpação da veia a puncionar e desinfecta-se a zona com álcool a 70° ou betadine. Deve-se pedir ao utente para fechar a mão.
As veias a examinar durante a palpação devem seguir a ordem: fossa antecubital (veias medianas, basílica e cefálica), antebraço e dorso de ambas as mãos.
Durante a punção deve-se desapertar o garrote. Se as veias são finas o garrote deve permanecer até acabar de puncionar o local. No final do processo pedir ao utente para abrir a mão e verificar se este se encontra bem disposto. Pressionar a zona de punção até verificar que há paragem de sangue e colocar um penso.
20 Deve ser descartada a agulha para o contentor
próprio para perfurantes. A zona de descarte da agulha deve ser sempre limpa após a sua utilização com álcool.
Após puncionar, distribuir o sangue venoso pelos diferentes tubos, requeridos para a análise do utente.
Neste laboratório não é utilizado o sistema de vácuo (Figura 1), mas é mantida a distribuição dos tubos pela seguinte ordem: Hemocultura, Tubo de soro; Tubo com citrato (coagulação e VS); Tubo com heparinato e Tubo com EDTA (hemograma).
2.2. Colheita de urina
O utente é informado do processo de colheita de urina através da Instrução de Colheita (IC) específica.
Para a análise de urina tipo II deve ser colhida a 1ª urina da manhã e entregar o mais rápido possível para a análise no laboratório. Caso não seja possível guardar no frigorífico por um curto período de tempo.
Para a colheita de urina de 24H, deve ser registada a hora do início de colheita. A 1ª urina é rejeitada e as seguintes são aproveitadas para um recipiente próprio de modo a evitar contaminações até perfazer as 24H ou seja, até à hora em que se deu início a colheita. Durante a colheita, a urina deve ser refrigerada e após concluir a colheita também deve ser entregue de imediato no laboratório.
Na colheita de urina para urocultura o utente deve passar com uma toalhita de limpeza seguida da passagem de gaze com soro fisiológico no meato urinário. O primeiro jacto de urina não deve ser aproveitado e é aconselhável que para esta colheita seja utilizada a 1ª urina da manhã.
Figura 1 - Representação de tubos de vácuo
para colheita de sangue por punção venosa.
Adaptado de http://pt.made-in- china.com/co_chinaglass/product_Blood-Collect-Tube-Pack_hhosiyyiy.html
21 2.3. Colheita de fezes
O utente é informado do processo de colheita através da IC específica. Para a análise de sangue oculto e também na pesquisa de ovos, quistos e parasitas devem ser recolhidas as fezes de 3 dias diferentes. As amostras devem ser recolhidas para recipiente próprio de modo a evitar contaminações, devem ser refrigeradas e conservadas ao abrigo da luz.
Para a coprocultura, na pesquisa de Salmonella, Shigella e Campylobacter a amostra de fezes deve ser colocada em recipiente esterilizado e entregue até 1H após a colheita ou em frasco com meio ETM de modo a que a quantidade não ultrapasse o limite indicado e neste caso as amostras são estáveis até 3 dias.
2.4. Colheita de exsudados
Para a colheita de exsudados é utilizada uma zaragatoa estéril adequada ao produto a recolher. Se a colheita não é feita no laboratório, mas sim num posto de colheitas, a amostra deve seguir de imediato para o laboratório em meio de transporte adequado.
Os vários tipos de exsudados apresentam diferentes instruções técnicas (IT) de colheita, como os descritos na tabela 1.
22 Tabela 1 - Instrução Técnica para a obtenção de exsudados
Tipos de Exsudados Instrução Técnica
Exsudado amigdalino
O utente inclina a cabeça para trás, abre bem a boca e baixa a língua. Passar a zaragatoa na
zona das amígdalas, incluindo as zonas vermelhas e pontos brancos (se existentes). Pode ser utilizado um baixa língua para facilitar
a colheita.
Exsudado auricular
Passar a zaragatoa no ouvido direito ou esquerdo ou em ambos. Utiliza-se uma
zaragatoa diferente para cada um.
Exsudado faríngeo; orofaríngeo ou rinofaríngeo
O utente inclina a cabeça para trás, abre bem a boca e baixa a língua. Passar a zaragatoa na zona rinofaríngea. Pode ser utilizado um baixa
língua para facilitar a colheita.
Exsudado nasal
O utente inclina a cabeça para trás. Passar a zaragatoa na narina esquerda e direita até que encontre resistência (até virem as lágrimas aos
olhos). Para a pesquisa de Staphylococccus aureus, não é necessária a introdução muito
profunda da zaragatoa.
Exsudado nasofaríngeo
O utente inclina a cabeça para trás. Passar uma zaragatoa flexível na narina esquerda e direita
com cuidado e o mais fundo possível.
Exsudado ocular
Passar a zaragatoa no olho direito ou esquerdo ou ambos (a colheita é feita na zona interna da pálpebra inferior). Utiliza-se uma zaragatoa
diferente para cada um.
[Escreva um trecho do documento ou o resumo de um ponto
interessante. Pode posicionar a caixa de texto em qualquer ponto do documento. Utilize o separador Ferramentas de Desenho para alterar a formatação da caixa de texto do trecho em destaque.]
23
Tipos de Exsudados Instrução Técnica
Exsudado vaginal
O utente deita-se em posição ginecológica. Passar a zaragatoa de alginato de cálcio ou de dacron na zona de maior exsudado ou no fundo
do saco vaginal posterior e colo do útero. Para auxiliar a colheita utiliza-se um espéculo (excepto em crianças e mulheres virgens). O
procedimento é repetido com uma segunda zaragatoa. Uma das zaragatoas serve para realizar
o esfregaço (no acto da colheita) e a outra serve para efectuar a análise em sementeira.
Exsudado uretral
Na mulher, a colheita é feita com uma zaragatoa a nível da uretra, antes de se realizar qualquer
lavagem local.
No homem, a colheita é feita através de pressão do pénis para que apareça uma gota de secreção que é colhida com a zaragatoa. Se não existir essa
gota é introduzida uma zaragatoa fina na uretra com rotação suave. Esta colheita é feita de manhã
antes da 1ª micção ou no mínimo 3 horas após a última micção e antes de se lavar.
Pús – Supurações superficiais
É utilizada uma zaragatoa ou agulha e seringa. É efectuada a limpeza do local com solução salina
estéril e retirado o pús, secreções ou tecidos desvitalizados. A colheita de pús deve ser realizada na zona mais profunda da ferida. Pús – Supurações fechadas É utilizada uma agulha e seringa. Após a colheita
é feito o transporte da seringa sem a agulha. Tabela 1 – Instrução Técnica para a obtenção de exsudados (continuação)
24 2.5. Prova de Tolerância Oral à Glucose
O jejum deve ser de 8 horas e nunca superior a 14 horas. Nos 3 dias que antecedem a colheita o utente deve manter a sua actividade física regular e não fazer restrições na sua dieta.
Nas provas de Tolerância Oral à Glucose (PTOG), a solução de glucose deve ser ingerida no espaço máximo de 5 minutos e o utente não deve comer, nem fumar e manter-se em repouso (é permitido ingerir 1 copo de água). A PTOG é contra-indicada para utentes que apresentem glicémia de jejum > 140 mg/dl.
GRÁVIDAS: é feita a colheita de sangue em jejum, após a ingestão de 75g de glucose dissolvida em cerca 300 ml de água e é realizada nova colheita aos 60 e 120 minutos.
FORA DO CONTEXTO DE GRAVIDEZ: é feita a colheita de sangue em jejum, após a ingestão de 75g de glucose dissolvida em cerca de 300ml de água e é realizada nova colheita aos 120 minutos.
CRIANÇAS: é feita a colheita de sangue em jejum., após a ingestão de 1.75g de glucose por cada kg de peso da criança (mínimo 10 g e máximo 75 g) dissolvidos em 200ml de água e é realizada nova colheita aos 60 minutos e 120 minutos.
APÓS REFEIÇÃO: é feita a colheita de sangue em jejum. Após a ingestão de pequeno-almoço enriquecido em hidratos de carbono é feita nova colheita de sangue após 120 minutos. Se o utente já apresentar diagnóstico de diabetes é recomendado que faça o seu pequeno-almoço/almoço habitual e a sua medicação.
25 3. Triagem e conservação de amostras
Neste laboratório existe sistema informático de triagem, Process Systems Manager (PSM) fornecido pela Roche Sistemas de Diagnóstico. Através do PSM as amostras seguem uma linha de análise.
O PSM é uma interface entre plataformas informáticas e tem como objectivo canalizar os processos laboratoriais. Estes processos englobam a colheita de amostras biológicas, monitorização do controlo de qualidade e sua validação, distribuição das amostras pelos sectores e equipamentos onde são realizadas as análises, arquivo de amostras biológicas e finalmente descarte das amostras.
O PSM é adaptado e programado para as necessidades do nosso laboratório. É na recepção que se obtêm as etiquetas segundo o processo do utente. Estas etiquetas apresentam um código de barras que é único para cada utente.
Após a colheita do produto biológico, o PSM auxilia no processo de triagem. Os tubos secos ou com gel para a obtenção de soro são centrifugados e encaminhados para a secção de Química analítica/ Imunologia. Os tubos de coagulação para a obtenção de plasma são centrifugados e encaminhados para a secção de Hematologia. Os restantes tubos são distribuídos pelas secções conforme o pedido de análise. No caso de envio de tubos para laboratório exterior há separação de alíquotas e o acondicionamento devido.
Sempre que a amostra acaba a análise num dos equipamentos esta passa no PSM para sabermos qual o processo a seguir. Caso a amostra já tenha sido analisada na totalidade é dada a informação de arquivo.
Muitas amostras são ainda distribuídas em alíquotas para posterior análise. Estas alíquotas também seguem um padrão de arquivo que pode ser de refrigeração ou congelação.
É o PSM que nos indica quais as amostras que podem ser descartadas após estarem arquivadas.
Os tempos de arquivo assim como o seguimento do processo de análise são configurados por cada laboratório.
Para a obtenção de soros e plasmas as amostras também seguem uma linha de processo.
26 Para a obtenção de soro os tubos devem permanecer no mínimo 30 minutos à temperatura ambiente para que ocorre a coagulação completa. Após coagulação centrifugar 10 minutos a 2500 rpm. Após a centrifugação deve verificar-se se amostra está bem separada, caso contrário voltar a centrifugar. Se a amostra apresentar fibrina, mexer o soro com um palito de uso único e voltar a centrifugar. A centrifugação deve ocorrer até 60 minutos após a colheita de modo a evitar a diminuição da glucose. De modo geral é aceitável o período de 2 horas para que se realiza a centrifugação, uma vez que após este período há alterações significativas além da glucose de potássio, fósforo, creatinina e as transaminases (AST e ALT).
Para a obtenção de plasma os tubos podem ser directamente centrifugados durante 15 minutos entre 2000-3000 rpm. Os tubos de plasma para a análise da coagulação não devem ser centrifugados nos postos de colheita.
Nos postos de colheita as amostras biológicas seguem regras de conservação e transporte.
As amostras para exame microbiológico como as uroculturas devem ser conservadas entre 2 a 8°C e no transporte devem ser acondicionadas em malas térmicas refrigeradas. Os tubos de hemograma, soro e plasma devem ser mantidos em suporte e no transporte devem ser acondicionados numa mala térmica sem refrigeração. As amostras que necessitem de refrigeração ou congelamento imediato devem ser transportadas em mala térmica acondicionados em cooler refrigerado ou congelado e estes em caixas de esferovite próprias. Se estas amostras apresentarem doseamento de potássio ou ionograma deve ser realizada a separação do gel para não haver difusão dos iões potássio dos glóbulos para o soro. Deve ser realizada a separação em alíquota. Finalmente amostras que necessitem de transporte à temperatura ambiente, como os exsudados para exame microbiológico ou as fezes em ETM para coprocultura, devem seguir em mala térmica sem refrigeração.
27 4. Critério de rejeição de amostras
A rejeição de amostras pode ocorrer em três níveis. Ao nível da recepção, durante o atendimento do utente, na colheita do produto biológico pelo técnico de colheitas e ainda na secção onde se irá analisar a amostra.
Assim, é da responsabilidade da recepção rejeitar amostras que não tenho sido colhidas em recipiente adequado ou que não cumpram os requisitos necessários.
O técnico de colheita deve proceder à rejeição da amostra, sempre que na punção venosa se forme coágulo (excepto análise em que só é necessário tubo de soro); quando o volume é insuficiente para a análise a realizar; sempre que as amostras se encontrem em tubos que não são adequados para a análise (troca de tubos/etiquetas) e sempre que se verifique que o utente não se encontre nas condições específicas para realizar a análise (jejum correcto).
Na secção são rejeitadas todas as amostras que não estejam identificadas ou em que a identificação não seja perceptível; amostras lipémicas, hemolisadas ou ictéricas, consoante a análise a realizar; amostras de sangue total coaguladas ou com micro-coágulos; sempre que a amostra não apresente volume suficiente para a análise e amostras em que os resultados sugiram que há interferência, mas que esta não tenha sido identificada anteriormente.
28
FASE ANALÍTICA
Esta fase engloba todo o processo analítico desde a execução analítica pelos equipamentos automatizados ou pelas técnicas manuais até à validação técnica dos resultados. O controlo de qualidade interno (CQI) é aplicado em todas as etapas do processo.
Antes do processo analítico é realizado nos vários equipamentos o controlo de qualidade interno. Este é validado segundo as normas descritas pelas Instruções Técnicas (IT). O processamento analítico é realizado seguindo as determinações específicas de cada equipamento, pela bula de cada técnica ou pela IT respectiva.
A preparação, utilização, segurança e conservação dos reagentes assim como a calibração analítica a executar está descrita nas bulas ou IT respectivas.
A aceitação ou rejeição dos resultados analíticos é analisada segundo a leges artis (“leis da arte médica”). São verificados numa primeira fase a conformidade das condições de execução dos procedimentos, a conformidade com o Manual de Boas Práticas Laboratoriais (MBPL) e se há conformidade entre os resultados obtidos pelas amostras controlo relacionando-os com os limites definidos para a técnica analítica. Se há conformidade entre todos os pontos referidos anteriormente, podem ser aceites os resultados analíticos, validando-os. Se não se verificar qualquer um dos pontos é realizada a repetição da análise em causa.
ENTRADA DE AMOSTRAS BIOLÓGICAS IDENTIFICADAS E
TRIADAS
CQI PROCESSAMENTO ANALÍTICO VALIDAÇÃO ANALÍTICA
SAÍDA DOS RESULTADOS
VALIDADOS TECNICAMENTE
29 A. HEMATOLOGIA
É a área das análises clínicas onde são estudados os parâmetros fisiológicos relativos aos elementos figurados do sangue (glóbulos vermelhos, glóbulos brancos e plaquetas) e orgãos hematopoiéticos, analisando se há normalidade de valores ou por outro lado se há valores patológicos a ter em conta.
A amostra utilizada nos equipamentos de hematologia é sangue colhido em tubo de EDTA para a realização de hemograma, electroforese e hemoglobina glicada (estudo incluído na secção de hematologia) e sangue colhido em tubo de citrato para a realização do estudo da coagulação e da velocidade de sedimentação. Os tubos de citrato variam na proporção de citrato conforme o estudo. Para a coagulação a proporção é de 1:9 (9 volumes de sangue para 1 de citrato) e na VS a proporção é de 1:4 (4 volumes de sangue para 1 de citrato).
30 1. Equipamentos
1.1. Advia 2120i, com módulo de veterinária
O funcionamento deste equipamento (Figura 2) é bastante simplificado, uma vez que o processamento da amostra é automático, permitindo aumentar o rendimento. Outro beneficio deste aparelho é a integração do módulo de veterinária, que permite também de forma automática analisar amostras de animais. Este equipamento tem a capacidade de analisar 120 amostras por hora.
Antes de analisar a amostra esta é identificada assim como os testes a serem realizados. A amostra pode ser analisada por aspiração automática, em tubo fechado ou em tubo aberto. Este equipamento apresenta cinco câmaras onde ocorre a reacção citoquímica da amostra e dos reagentes. A câmara de reacção de Hemoglobina, BASO, RBC, RETIC e Perox.
A medição e dispersão celular é realizada pela dispersão e absorção de luz promovida pela lâmpada de tungsténio-alogénio localizada no fluxo Perox. No canal RBC é utilizado um díodo de laser que foca o fluxo celular dos glóbulos vermelhos.
Utiliza como coloração a peroxidase que permite uma boa diferenciação dos vários tipos celulares. É feita uma diferenciação citoquímica entre as células da linhagem mielóide e linfóide e a contagem exacta das plaquetas, permitindo excluir falsos diagnósticos provocados por glóbulos vermelhos microcíticos ou pelos fragmentos celulares.
São avaliados na contagem sanguínea completa (CBC): WBC (glóbulos brancos - GB), RBC (glóbulos vermelhos - GV), HGB (hemoglobina), HCT (hematócrito), MCV (volume corpuscular médio), MCH (hemoglobina corpuscular média), MCHC (concentração média de hemoglobina corpuscular), RDW (coeficiente de dispersão eritrocitária), HDW (distribuição de hemoglobina), CH, CHDW e PLT (plaquetas). Os resultados diferenciais de neutrófilos, linfócitos, monócitos, eosinófilos, basófilos e LUC são avaliados resultado absoluto e em percentagem. Os resultados plaquetários englobam: Plaquetas, MPV, PDW e PCT. Ao nível dos resultados dos reticulócitos são avaliados a % de reticulócitos, #RETIC, MCVr, CHCMr e CHr.
Figura 2 – Representação do equipamento Advia 2120i.
Adaptado de
https://www.healthcare.siemens.pt/hematology/systems/advi a-2120-hematology-system-with-autoslide.
31 Os resultados morfológicos são avaliados no canal WBC (GB) e RBC (GV). O canal WBC avalia os desvios à esquerda, os linfócitos atípicos, a presença de blastos, os granulócitos imaturos e a deficiência em mieloperoxidase. O canal RBC avalia a anisocitose, macro e microcitose, HC VAR, hipocromia, sombras de GV, NRBC, aglomerados plaquetários e plaquetas gigantes.
Para este aparelho são fornecidos 3 níveis de controlo, baixo, normal e alto. Estes controlos são usados diariamente, sendo um dos níveis usado no início do dia de trabalho e o outro de 20 em 20 amostras. O controlo normal é sempre utilizado e mensalmente varia-se entre controlo baixo e alto.
Os glóbulos vermelhos (GV) com tamanho normal são classificados como normocítcos. A este parâmetro corresponde ao Volume Globular médio (VGM). É representado pela fórmula: 𝑉𝐺𝑀 (𝑓𝐿) = 𝐻𝑡
𝐺𝑉 (Ht corresponde ao Hematócrito em L/L e GV em 10¹²/L). As alterações de tamanho dos glóbulos vermelhos que estão na origem de patologias são a microcitose e a macrocitose (tabela 2). Pode-se verificar ainda uma anisocitose quando existem GV microcíticos e macrocíticos, podendo haver predomínio de um deles, apesar de valores normais.
Tabela 2 – Situações patológicas associadas às alterações de tamanho dos Glóbulos Vermelhos
Alteração ao tamanho dos GV Situações patológicas associadas
Microcitose: GV diminuem de tamanho com VGM < 80fL.
Anemia por deficiência em ferro; Anemia sideroblástica; Anemia da doença crónica; Talassémias; Intoxicação por chumbo e
Deficiência em vitamina B6.
Macrocitose: GV aumentam de tamanho com VGM > 96 fL.
Anemia megaloblástica; Anemia aplásica; Doença hepática; Cirrose; Alcoolismo crónico; Síndromes
mielodisplásicas e como consequência do tratamento com quimioterapia.
32 Para análise da série eritrocitária também é utilizado o coeficiente de dispersão eritrocitária, que avalia a distribuição do volume eritrocitários. Resultados superiores a 14,5% são indicativos de anisocitose.
Os glóbulos vermelhos que não apresentam alterações de cor são classificados como normocrómicos. A cromia é avaliada pela Concentração de hemoglobina globular média (CHGM), ou seja, é a concentração média de hemoglobina de um indivíduo por glóbulo vermelho. É expressa pela fórmula: 𝐶𝐻𝐺𝑀 (𝑔
𝑑𝑙) = 𝐻𝑏
𝐻𝑡 (Hb corresponde à hemoglobina em g/dl). Na tabela 3, estão descritas as patologias associadas às alterações de cromia.
Tabela 3 – Situações patológicas associadas à alteração de cor dos Glóbulos Vermelhos
Alteração à cor dos GV Situações patológicas associadas
Hipocromia: diminuição da concentração de hemoglobina nos GV com CHGM < 32g/dl.
Anemia da doença crónica; Deficiência em ferro e Talassémias.
Não existe hipercromia, mas sim esferocitose (alteração de forma dos glóbulos vermelhos). Pode ser verificada uma anisocromia, quando estão presentes glóbulos vermelhos hipocrómicos e normocrómicos. Esta situação é associada a anemias sideroblásticas, anemias por deficiência em ferro em tratamento ou doenças inflamatórias em desenvolvimento ou regressão.
Outro parâmetro a ter em conta nos índices eritrocitários é a Hemoglobina Globular média (HGM), ou seja, o peso médio de hemoglobina num glóbulo vermelho médio por indivíduo. É representado pela fórmula: 𝐻𝐺𝑀(𝑝𝑔) =𝐻𝑏
𝐺𝑉.
A alteração da forma dos Glóbulos vermelhos é designada de poiquilocitose. Acontece quando os glóbulos vermelhos apresentam formas muito variadas e está associada a anemias ferropénicas, anemias megaloblásticas, anemias hemolíticas, talassémias e mielofibrose. Na tabela 4 é realizada a associação entre as patologias que resultam da forma alterada dos glóbulos vermelhos.
33 Tabela 4 – Situações patológicas associadas à alteração de forma dos Glóbulos Vermelhos
Alteração à forma dos GV Situações patológicas associadas
Esferócitos
Esferocitose hereditária; Doença hemolítica do recém-nascido (por incompatibilidade AB0); Reacção a transfusão sanguínea; Anemia hemolítica auto-imune e
Queimadura grave (com a presença de microesferócitos).
Eliptócitos Eliptocitose hereditária; Anemia megaloblástica;
Anemia ferropénica e Talassémia.
Estomatócitos
Estomatocitose hereditária; Alcoolismo e cirrose alcoólica; Doença hepática obstrutiva e Desequilíbrio
electrolítico.
Pinch cells ou Knizocytes Anemia hemolítica; Hemoglobinopatia e Pancreatite.
Dianócitos ou Target cells
Hemoglobinopatia; Talassémia; Drepanocitose; Doenças da Hb C ou SC ou S (β-talassémia); Doença
hepática; Anemia ferropénica; Anemia hemolítica e após esplenectomia.
Drepanócitos ou células falciformes Anemia falciforme; Doença da Hb S (homozigotia) e Hemoglobinopatia.
Acantócitos ou Spur cells
Acantocitose hereditária (abetalipoproteinémia); Anemia a “spur cells”; Doença hepática; Após esplenectomia; Má absorção lipídica e Anorexia
nervosa.
Equinócitos Insuficiência renal; Urémia e Carcinoma do estômago.
*Podem representar artefactos.
Dacriócitos
Talassémia; Anemia ferropénica; Anemia megaloblástica; Mielofibrose; Esplenomegália e
Doença renal.
Queratinócitos
Anemia hemolítica microangiopática; Coagulação intravascular disseminada (CID) e Anemia hemolítica
secundária a implantes.
Esquisócitos
Anemia hemolíticassecundáris a implantes; Anemia hemolítica microangiopática; Coagulação intravascular
34 Os GV podem ainda ter outras alterações que não sejam propriamente a sua conformação de que são exemplo as inclusões eritrocitárias, como demonstrado na tabela 5.
Tabela 5 – Situações patológicas associadas às inclusões eritrocitárias
Inclusões eritrocitárias dos GV Situações patológicas associadas
Pontuado basófilo: grânulos finos e redondos azul-arroxeados por todo o GV
Perturbações da eritropoiese; Intoxicação por chumbo; Alteração da biossíntese da Hb;
Talassémia; Drepanocitose; Anemia megaloblástica; Anemia sideroblástica; Doença
hepática e Infecção bacteriana severa. Anel de Cabot: inclusão ovalada num GV
com coloração vermelho-violáceo. Anemia perninciosa e Intoxicação por chumbo. Corpos de Howell-Jolly: inclusões redondas
bem visíveis e que coram de azul escuro/ púrpula.
Atrofia esplénica após a esplenectomia; Anemia megaloblástica; Anemia ferropénica e Anemia
hemolítica.
Corpos de Heinz: inclusões que se encontram junto à membrana que podem levar à sua hemólise.
Deficiência em G6PD e outras enzimopatias dos GV; Anemia hemolítica secundária a intoxicação com drogas oxidantes e Hemoglobinopatia
(β-talassémia). Inclusões de Hb H: tetrâmeros das cadeias β
e são caracterizados por várias inclusões esféricas.
Doenças da hemoglobina H (α-talassémia); Doenças da hemoglobina H, adquirida (síndrome mieloproliferativo ou mielodisplásico) e Anemia
sideroblástica refratária. Cristais de Hb C: inclusões angulares ou em
forma de roda e podem ser localizados intra ou extracelularmente.
Doença da hemoglobina C nos homozigóticos e nos heterozigotos Hb SC.
Corpos de Pappenheimer: grânulos
formados de depósitos de ferro, que se dispõe em grupos à periferia dos GV e são altamente basófilos.
Anemia sideroblástica; Anemia por sobrecarga de ferro; Anemia hemolítica; Talassémia; Hipoesplenismo e após esplenectomia.
35 Quando à distribuição dos glóbulos vermelhos são consideradas como alterações os rouleaux e a aglutinação, como demonstrado na tabela 6.
Tabela 6 – Situações patológicas associadas à alteração de distribuição dos Glóbulos Vermelhos
Alteração à distribuição dos GV Situações patológicas associadas
Rouleaux: empilhamento dos glóbulos vermelhos que tem como consequência o aumento da VS.
Aumento das proteínas plasmáticas (fribrinogénio e globinas) na gravidez; Inflamação; Infecção e
Mieloma. Aglutinação: amontoados irregulares de GV
devido à ligação dos anticorpos aos antigénios membranares.
Exposição a variados anticorpos; Anemia hemolítica auto-imune e Doença das aglutininas
frias – crioaglutininas.
Ainda na série vermelha são avaliados os reticulócitos. Quando há aumento da eritropoiese há aumento de reticulócitos no sangue periférico e consequentemente eritroblastos. Na anemia hemolítica do recém-nascido em que há incompatibilidade feto-maternal de Rh, existem vários eritroblastos.
Os glóbulos brancos (GB) – leucócitos, são avaliados pela fórmula leucocitária que pode ser representada por valores em forma absoluta ou relativa. A fórmula leucocitária avalia os neutrófilos, linfócitos, monócitos, esosinófilos e basófilos.
A linhagem granulocítica é composta por: mieloblasto; promielócito; mielócito; metamielócito, neutrófilo em banda e neutrófilo segmentado. Os neutrófilos podem ser classificados pela sua segmentação, isto é, hiposegmentação com desvio à esquerda, em que o neutrófilo se encontra em banda ou tem dois lóbulos, ou hipersegmentação com desvio à direita em que o neutrófilo pode apresentar desde 4 a 6 lóbulos. As alterações morfológicas que os neutrófilos podem apresentar são: granulações tóxicas, corpúsculos de Dӧhle, Pseudo-Pelger_Huët, vacuolização tóxica, hipersegmentação e gigantismo celular. As alterações quantitativas dos glóbulos brancos também estão associadas a patologias, como demonstrado na tabela 7.
36 Tabela 7 – Situações patológicas associadas às alterações quantitativas dos Glóbulos Brancos
Alterações quantitativas dos GB Situações patológicas associadas
Neutrofilia: aumento do número de neutrófilos circulantes. 1. Causa primária a. Hereditária; b. Idiopática crónica; c. Outros. 2. Causa secundária a. Infecção; b. Inflamação crónica;
c. Neoplásica (leucemia mielóide crónica).
Neutropénia: diminuição do número de neutrófilos circulantes.
1. Congénita
a. Síndrome Kostmann’s. 2. Adquirida
a. Induzida por drogas anti-inflamatórias ou anti-bacterianas.
3. Imune
a. LES – Lúpus eritomatoso sistémico. 4. Infecciosa
a. HIV.
São alterações quantitativas dos eosinófilos, a eosinofilia, com o aumento do número de eosinófilos no sangue periférico. Este aumento tem como causas as situações de doença alérgica, doenças parasitárias e também acontece na recuperação de uma infecção aguda. A linhagem granulocítica é composta por: promielócito eosinófilo; mielócito eosinófilo; metamielócito eosinófilo.
Os basófilos têm a função de intervir no processo de inflamação aguda e nas reacções de hipersensibilidade. A linhagem granulocítica é composta por: promielócito basófilo; mielócito basófilo e metamielócito basófilo.
As alterações quantitativas dos linfócitos são a linfocitose, quando há aumento do número de linfócitos em circulação. Este aumento está associado a infecções agudas de origem viral ou bacteriana; a infecções crónicas (como a tuberculose) e estar associado a causas primárias, como a leucemia linfoblástica aguda ou o linfoma não-Hodgkin. Os linfócitos intervém na resposta imunológica humoral através dos linfócitos B e na resposta
37 imunológica celular através dos linfócitos T. A linhagem linfocítica é composta por: linfoblasto; prolinfócito; pequeno linfócito e grande linfócito.
As alterações quantitativas dos monócitos são a monocitose, quando há aumento do número de monócitos na circulação. Este aumento é devido a infecções bacterianas crónicas, doenças do tecido conectivo (artrite reumatóide) ou devido a infecções por protozoários. Os monócitos têm como funções a quimiotaxia, a fagocitose, a resposta inflamatória e imunitária, a actividade antitumoral e a regulação da hematopoiese. A linhagem monocítica é composta por: monoblasto; promonócito e monócito.
As alterações quantitativas das plaquetas são a trombocitose e a trombocitopenia. Estas são associadas a algumas situações patológicas, como demonstrado na tabela 8.
Tabela 8 – Situações patológicas associadas às alterações quantitativas das plaquetas
Alterações quantitativas das plaquetas Situações patológicas associadas
Trombocitose: aumento do número de plaquetas circulantes.
1. Doenças mieloproliferativas e Doenças inflamatórias crónicas.
Trombocitopénia: diminuição do número de plaquetas circulantes.
1. Diminuição de plaquetas e megacariócitos a. Infiltração da medula óssea; Linfoma e
Infecção viral.
2. Aumento da destruição de plaquetas
a. Aumento do consumo e Patologias imunes ou não-imunes.
3. Aumento do sequestro esplénico a. Esplenomegália.
São alterações qualitativas das plaquetas a anisocitose plaquetária, os agregados plaquetários, a desgranulação e o satelismo plaquetário. A linhagem plaquetária ou megacariocítica é composta por. megacarioblasto; megacariócito basófilo; megacariócito granuloso; megacariócito plaquetário e plaqueta. As plaquetas têm a função de protecção do endotélio vascular, intervêm na formação do rolhão plaquetário e retracção do coágulo e no processo inflamatório.
38 Tabela 9 - Valores de referência do hemograma no adulto
Parâmetro Valores de referência
Hemoglobina Homem: 13,5 – 18 g/dL Mulher: 12,5 – 16 g/dL Eritrócitos Homem: 4,70×10¹² – 6,0 ×10¹²/L Mulher: 4,20×10¹² – 5,40 ×10¹²/L Hematócrito Homem: 42,0 – 52,0% Mulher: 37,0- 47,0% VGM 80-96 fL HGM 27-32 pg CHGM 32-36g/dl RDW 11,5-14,5 % Leucócitos 4,0×10^9 – 11,0×10^9/L Neutrófilo 1,5×10^9– 6,6 ×10^9/L Eosinófilos 0,1×10^9 – 1,0×10^9/L Basófilos 0,01×10^9– 0,1×10^9/L Linfócitos 1,5×10^9– 3,5×10^9/L Monócitos < 0,1×109/L Plaquetas 150×109 – 400×10^9/L
39 1.2. Hi-Auto (HA 8160)
Este equipamento (Figura 3) permite quantificar a hemoglobina glicada, assim como as fracções de hemoglobina A1; A2 e F que constituem os resultados apresentados na electroforese de hemoglobinas.
Apresenta como metodologia a Cromatografia Líquida de Alta Pressão (HPLC). Este princípio é baseado na ligação da glicose ao grupo amina terminal da cadeiaα que leva a alterações na carga total da hemoglobina. A fracção glicada tem assim uma migração mais rápida. Neste aparelho é também promovida a separação das diferentes fracções de hemoglobinas pela redução das partículas que se encontram na fase estacionária (localizada na coluna cromatográfica).
Este aparelho faz automaticamente a hemólise da amostra a processar. Caso seja necessário analisar uma amostra com pouco volume é realizada a hemólise manual segundo o procedimento técnico descrito no manual do equipamento e selecciona-se o método de análise a efectuar.
São utilizados dois níveis de controlo, alto e baixo. Estes controlos são utilizados diariamente, sendo um deles utilizado no início do dia de trabalho e outro no final. Estes controlos são distribuídos em alíquotas que são depois congeladas. A hemólise é manual e faz-se quando se procede à análise do controlo.
A avaliação da hemoglobina glicada dependente da concentração de glucose no sangue e do tempo médio de vida dos glóbulos vermelhos (120 dias). Esta análise representa valores que antecedem em 6 – 8 semanas a determinação do valor de HbA1c. Os valores normais encontram-se entre 4,0 – 6,0 %. O controlo da diabetes, além da HbA1c é feito pelo doseamento da glucose no soro e na urina e pela avaliação dos resultados da PTOG. Este é um método de análise bioquímico, mas neste laboratório está incluído na secção da hematologia, uma vez que também nos permite realizar a electroforese de hemoglobinas.
Na electroforese de hemoglobinas são avaliadas HbA1, HbA2 e HbF. A obtenção de resultados com outras variáveis de hemoglobinas que não as descritas não são avaliadas neste laboratório. Alterações a estas fracções de hemoglobinas indicam hemoglobinopatias Figura 3 – Representação do equipamento
Hi-Auto (HA 8160). Adaptado de http://www.medicalexpo.com/prod/menarini-diagnostics/product-79119-628131.html
40 associadas a variantes de hemoglobina como a drepanocitose ou talassémias (β, α e persistência hereditária da hemoglobina fetal). São valores normais para HbA1 95-98%, para a HbA2 2,5% e para a HbF 1%.
41 1.3. Vesmatic 30 Plus
Este aparelho (Figura 4) é utilizado para a medição da VS. É um método automático que utiliza a metodologia de Westergren, onde são utilizados tubos específicos, que contêm 0,36 ml de citrato de sódio a 0,105 M. o tempo de
realização da análise é de cerca de 26 minutos para o valor da 1ª hora e de 46 minutos para o valor de 2ª hora.
Possuí dois níveis de controlo. Nível de controlo com valor normal e nível de controlo com valor patológico. Estes controlos são efectuados todos os dias antes de se iniciar a análise das amostras.
Entende-se por VS a velocidade de queda dos elementos figurados do sangue em suspensão de plasma durante uma hora. Este processo consiste em três etapas: a agregação, com a formação de rouleaux de glóbulos vermelhos; a sedimentação, com a queda desses rouleux a uma velocidade constante e a sedimentação final, onde há acumulação dos glóbulos vermelhos no fundo do tubo.
A VS apresenta resultado patológico quando há aumento ou diminuição em relação ao valor normal. O valor normal até aos 50 anos é de 10 mm para os homens e 13 mm para as mulheres. Depois dos 50 anos há aumento da VS por factores fisiológicos e nesse caso os valores normais para os homens são 13 mm e para as mulheres 20 mm. Estes valores são sempre obtidos após 1 hora. As situações patológicas relacionadas com o aumento da VS são: infecções agudas e crónicas, inflamações, doenças reumáticas, anemias, hemólise, necrose tecidular e neoplasias. A diminuição da VS está relacionada com as poliglobulias, as policitémias, a hipofibrinogenémia, a diminuição das globinas plasmáticas e situações associadas a poiquilocitose (alteração de forma dos glóbulos vermelhos).
A VS é afectada por factores globulares (formação de rouleaux e alterações do número, forma e tamanho dos GV), por factores plasmáticos (viscosidade do sangue, aumento de fibrinogénio ou globinas plasmáticas) e por factores mecânicos (tipo de tubo utilizado, correcta manipulação da amostra, temperatura do aparelho, tipo de anticoagulante, etc).
Figura 4 – Representação do equipamento Vesmatic
30 Plus. Adaptado de http://www.medicalexpo.es/prod/diesse-diagnostica-senese/product-68223-720535.html
42 1.4. Sysmex CA 500
Este aparelho (Figura 5) permite avaliar os parâmetros TP, APTT, INR e o fibrinogénio. Utiliza um método de detecção de luz difusa e um método colorimétrico.
Como controlos são utilizadas uma Pool patológica (INR > 2,0) e uma Pool 100%. Estas Pool´s são realizadas nos laboratório a partir de plasma dos nossos doentes, garantindo assim um controlo mais apertado. Estas Pool’s são congeladas e utilizadas diariamente no início do dia e sempre que se utilize um novo reagente com nova hidratação. Caso haja pedidos de fibrinogénio é realizado controlo com Citrol 1. Mensalmente são realizados Citrol 1, 2 ou 3 e sempre que é feita a calibração do tempo de protrombina (TP), são realizados os três níveis. Os valores de desvio padrão utilizados são os facultados pelo fornecedor.
A hemostase é dividida em hemostase primária, secundária e terciária. A sua avaliação ocorre através da via intrínseca, via extrínseca e via comum.
Na hemostase primária ocorre a formação de trombo pela adesão de plaquetas no local de lesão.
A hemostase secundária é caracterizada pelo processo de coagulação, que ocorre pela via intrínseca, via extrínseca e via comum (Figura 6).
A via instrínseca é avaliada pelo tempo de tromboplastina parcialmente activada (APTT). Caracteriza-se pelo tempo que demora a recalcificação do plasma citratado e pobre em plaquetas, na presença de fosfolípidos e de um activador de superfície (caulino, celite ou sílica micronizada). Através do APTT são avaliados os factores VIII, IX, XI, XII, X, V, a protrombina e o fibrinogénio. Esta análise é utilizada no controlo da terapêutica com heparina e na detecção de deficiências congénitas ou adquiridas relacionadas com estes factores, nomeadamente a doença do factor de von Willebrand, a Hemofília A e B.
A via extrínseca é avaliada pelo tempo de protrombina (PT). É caracterizada pelo tempo que demora a formação do coágulo de fibrina, ou seja, é o tempo que demora a Figura 5 – Representação do equipamento Sysmex
CA 500. Adaptado de http://www.medlab.com.cy/index.php/products/lab- automation/hemostasis/diamond-sysmex-coagulation-ref
43 recalcificação do plasma citratado e pobre em plaquetas na presença de elevada quantidade de tromboplastina e iões de cálcio. Permite avaliar a via extrínseca e comum da coagulação, nomeadamente os factores VII, X, V, a protrombina e o fibrinogénio. Serve para controlar os utentes que necessitam de anticoagulantes orais, além de ser uma análise de rotina que permite avaliar o sistema de coagulação do utente por exemplo caso este necessite ser operado. As patologias associadas a alterações de PT são: doença hemorrágica do recém-nascido, deficiência de vitamina K ou tratamento com seus antagonistas, deficiências congénitas associadas aos factores a cima descritos e coagulação intravascular disseminada.
Na monitorização da terapêutica com antagonistas da vitamina K, avalia-se o tempo de protrombina em segundos – International Normalised Ratio (INR). Este é calculado pela razão: 𝐼𝑁𝑅 = ( 𝑃𝑇
𝑀𝑁𝑃𝑇)
𝐼𝑆𝐼, onde MNPT corresponde aos valores de PT obtidos em amostras normais e ISI corresponde ao índice de sensibilidade internacional.
A via comum é avaliada pelo valor directo do Fibrinogénio. É nesta via que a trombina degrada o Fibrinogénio com libertação de monómeros fibrina. Também a trombina promove a activação do factor XIII que estabiliza os polímeros de fibrina. Avalia o processo de transformação de fibrina e a via da trombina.
Figura 6 - Representação da cascata da coagulação. Adaptado de
44 A última etapa é a hemostase terciária, onde há destruição do coágulo de fibrina para evitar a oclusão dos vasos sanguíneos. Esta via pode ser avaliada através de D-dímeros (esta análise não é realizada no nosso laboratório).
45 2. Técnicas manuais
2.1. Grupo sanguíneo – Método Beth-Vicent
É um método de aglutinação entre anticorpo e antigénio. São utilizados os reagentes anti-A e anti-B e a amostra utilizada é sangue total colhido em EDTA. O resultado deriva da aglutinação formada pela adição de sangue aos reagentes.
A determinação do grupo AB0 consiste na presença à superfície dos glóbulos vermelhos de antigénios A e B e de anticorpos no soro anti-A e anti-B, que são determinados pelo cromossoma 9.
Assim para o grupo sanguíneo A, as células apresentam antigénio A e soro com anticorpo anti-B. No grupo sanguíneo AB, apresenta antigénio A e B e não apresenta anticorpos. No grupo sanguíneo 0, não apresenta antigénios e tem anticorpos anti-A e anti-B.
2.1.1. Factor Rh
Para o factor Rh, o processo é semelhante ao descrito anteriormente, apenas utiliza-se como reagente o anti-D (IgG + IgM).
Para a confirmação do factor Rh¯, é utilizado o Card da casa comercial DIAMED/BIO RAD.
Prepara-se uma suspensão de células a 5% (50 μl de sangue + 0,5 ml de ID-Diluent 1), que vai a incubar 10 minutos à temperatura ambiente. Coloca-se 10 μl no Card ID-GEL ANTI-D seguindo-se a centrifugação na centrífuga DIAMED e fazer a leitura dos resultados.
2.1.2. Factor Du
É preparada uma suspensão de 3-5% GV a testar que devem ser previamente lavados com soro fisiológico 3-4 vezes (adicionar por exemplo 50 μl de GV a 950 μl de soro fisiológico).
Num tubo devidamente identificado é colocada uma gota de reagente anti-D e uma gota da solução anteriormente preparada. Deve-se misturar e incubar a 37°C durante 15 minutos.
46 Lavar com soro fisiológico duas vezes rejeitando completamente o sobrenadante na última lavagem.
Adicionar 2 gotas de globina anti-humana de Coombs, misturar bem e centrifugar a 1000 rpm durante 20 segundos.
Agitar o tubo com cuidado e verificar macro ou microscopicamente a existência de aglutinação (Du positivo).
2.2. Teste de Coombs
É utilizado um método de centrifugação em gel, com o Card ID- LISS/COOMBS. Os reagentes são ID DIA-CELL I e ID DIA-CELL II e a cada um é adicionado sangue total com EDTA.
Este teste serve para avaliar os anticorpos circulantes que actuam contra os glóbulos vermelhos levando a hemólise.
É utilizado nas mulheres grávidas na detecção de anti-D em mães Rh¯ ou antes de ser realizada uma transfusão sanguínea.
2.3. Estudo morfológico de sangue periférico
Para efectuar o esfregaço (Figura 7) deve-se colocar uma gota de sangue na extremidade de uma lâmina limpa. Com o auxílio de outra lâmina a formar um ângulo de 45° apoiar na gota e de maneira firme e com movimento uniforme espalhar a gota até esgotar o sangue. O esfregaço deve ser fino e conter cabeça e cauda e corpo. É no centro que vão estar agrupados os pequenos linfócitos e nas bordas irão estar as células monocíticas e granulocíticas. Deve-se deixar secar bem ao ar antes de fazer a coloração, para evitar contaminação e perda dos elementos figurados do sangue.
É utilizada a coloração Hemacolor-Merck. Colocar as lâminas na Solução Hemacolor 1 por 5 vezes durante 1 segundo; de seguida na Solução Hemacolor 2 por 3 vezes durante 1 segundo; posteriormente na Solução Hemacolor 3 por 6 vezes 1 segundo e finalmente na Solução Tampão (diluição de 1 ampola de Titrisol pH 7.2 com água destilada até perfazer 1000 ml) durante 45 segundos. Deixar secar ao ar e observar ao microscópio.
47 2.4. Micrométodo – VS
É utilizado quando a quantidade de amostra não é suficiente para os tubos de citrato que são utilizados no aparelho automático.
Faz-se uso de uma micropipeta, onde é pipetado citrato sódio até à primeira marca (70 na escala de leitura) e pipetado sangue total (colhido com EDTA) até à última marca. O conteúdo total da micropipeta deve ser escoado sobre uma lâmina de vidro de modo a misturar bem o citrato com o sangue, voltando a pipetar até à marca 0 da escala de leitura.
A micropipeta é colocada num suporte adequado e os resultados são lidos após 1 hora. Figura 7 – Representação da execução de esfregaço de sangue periférico.
Adaptado de http://biologia206.blogspot.pt/2011/07/tecnica-de-esfregaco-de-sangue.html
48 B. MICROBIOLOGIA
Na secção de Microbiologia são analisados todos os produtos biológicos, para a pesquisa de bactérias, fungos ou parasitas. É nesta área também que se testa a sensibilidade de determinados microrganismos aos antibióticos, quando identificados em cultura.
Os produtos biológicos analisados nesta secção são principalmente fezes, urinas e exsudados. Na urina é feita sementeira em placa para a verificação de infecções bacterianas ou micológicas, variando o método de trabalho consoante o que é prescrito. Os exsudados consoante os seus tipos também são feitos em diversas sementeiras (consoante a prescrição médica), para posteriormente identificarmos o microrganismo causador de infecção.
É uma secção onde a maioria do trabalho ainda é manual. Todos os produtos biológicos são semeados nas diversas placas manualmente, assim como a observação do seu crescimento em placa e posterior decisão é feita pelo Técnico de Análise ou pelo Especialista.
A única automatização desta secção consiste no equipamento Vitek 2 Compact, que após todo o processo referido acima é utilizada para a identificação de patogenes e realização de antibiogramas para testar a sensibilidade aos antibióticos.
