FACULDADE DE VETERINÁRIA
Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária
(Clínica e Reprodução Animal)
ISABELA TEBALDI POUBEL DO CARMO
“CIRCULAÇÃO DE Ehrlichia canis (DONATIEN e
LESTOQUARD, 1935) EM CÃES (Canis familiaris,
LINNAEUS, 1758) NO MUNICÍPIO DE BOM JESUS DO
ITABAPOANA NO ESTADO DO RIO DE JANEIRO.”
NITERÓI
2012
ISABELA TEBALDI POUBEL DO CARMO
“CIRCULAÇÃO DE Ehrlichia canis (DONATIEN e LESTOQUARD, 1935) EM CÃES (Canis familiaris, LINNAEUS, 1758) NO MUNICÍPIO DE BOM JESUS DO
ITABAPOANA NO ESTADO DO RIO DE JANEIRO.”
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária (Clínica e Reprodução Animal) da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para a obtenção do Grau de Mestre. Área de Concentração: Clínica e Reprodução Veterinária
Orientadora: Profª Drª NÁDIA REGINA PEREIRA ALMOSNY
NITERÓI 2012
ISABELA TEBALDI POUBEL DO CARMO
“CIRCULAÇÃO DE Ehrlichia canis (DONATIEN e LESTOQUARD, 1935) EM CÃES (Canis familiaris, LINNAEUS, 1758) NO MUNICÍPIO DE BOM JESUS DO
ITABAPOANA NO ESTADO DO RIO DE JANEIRO.”
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária (Clínica e Reprodução Animal) da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para a obtenção do Grau de Mestre. Área de Concentração: Clínica e Reprodução Veterinária
BANCA EXAMINADORA
________________________________________________________________ Profª Drª NÁDIA REGINA PEREIRA ALMOSNY - Orientadora
Universidade Federal Fluminense
________________________________________________________________ Profª Drª ROSANGELA ZACARIAS MACHADO
UNESP - Campus Jaboticabal
________________________________________________________________ Profª Drª NAMIR SANTOS MOREIRA
UNIPLI/Anhanguera
________________________________________________________________ Profª Drª ALINE MOREIRA DE SOUZA
Universidade Federal Fluminense
NITERÓI 2012
DEDICATÓRIA
Ao meu pai, Renato Poubel do Carmo, exemplo de pessoa de caráter e de generosidade, pelos ensinamentos de que a calma e a perseverança são as chaves
para a conquista,
A minha mãe, Francismeli Bernardes Tebaldi do Carmo, uma guerreira nata, pela sua compreensão e por sempre fazer questão em me orientar e apoiar
incondicionalmente nos meus desejos,
A minha irmã, Daniela Tebaldi Poubel do Carmo, sempre com palavras certeiras nos meus momentos difíceis,
Ao meu namorado, Octávio Augusto Navarro de Araújo Lima, pelo carinho e apoio nas minhas decisões.
Aos animais, fundamentais para que a elaboração dessa Dissertação tivesse sentido.
AGRADECIMENTOS
A Deus, por me dar forças e me permitir chegar até aqui.
A minha família, especialmente meu pai, minha mãe, irmã, madrinha Marilucy, tio Pierre, afilhada Renata, vó Toninha e a querida Miriam. Sempre presentes, benevolentes e compreensivos, mesmo quando da minha ausência em virtude dos estudos.
A Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, por minha formação acadêmica. A amiga e Professora Doutora Miliane Moreira Soares de Souza, pelo carinho, amizade e por me permitir iniciar a descoberta do mundo da pesquisa científica. A Universidade Federal Fluminense, por possibilitar meu crescimento profissional e incentivar a cada dia meus estudos.
A minha amiga e orientadora, Professora Doutora Nádia Regina Pereira Almosny, pelo carinho, apoio e confiança a mim dispensados. Exemplo de pessoa generosa, humilde e justa, sempre disposta a ajudar o próximo e que luta pela Instituição, por melhorias no ensino e renovação da pesquisa científica. Agradeço também pela atenção e disposição em ajudar na pesquisa de hemoparasitos.
Ao meu namorado, Octávio, pelo carinho, compreensão e amor a mim dispensados. A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), por fomentar o Curso de Mestrado em Clínica e Reprodução Animal e tornar economicamente viável a realização deste trabalho. Também agradeço à CAPES pela demanda social, que foi de fundamental importância para a minha dedicação exclusiva ao Curso durante esse período.
A Coordenação do Curso de Mestrado em Clínica e Reprodução Animal e a
secretaria do Curso, em especial aos funcionários Júlia Gleich, Ana Paula Neves e Sidney Cordeiro, por estarem sempre solícitos e prontos a ajudar.
Aos Médicos Veterinários Octávio Araújo Lima, Sabrina Emmerick, Juliane Reis e Professor Doutor Eduardo Viana, pela ajuda com a colheita e processamento das amostras e coloração dos esfregaços. A Bióloga Natália Valença pela ajuda com o processamento das amostras. As Médicas Veterinárias Professora Doutora Márcia Xavier e a Ananda Muller pela ajuda com a coloração dos esfregaços.
Ao Médico Doutor Afonso Perez, pela gentileza com a qual tirou minhas dúvidas e por estar sempre disposto a ajudar.
ajudar com o fornecimento das lâminas de Imunofluorescência Indireta.
Ao Professor Doutor Célio Machado e ao Médico Veterinário Flávio Lopes, que gentilmente se organizaram para que as lâminas de Imunofluorescência Indireta pudessem ser trazidas de Jaboticabal para o Rio de Janeiro.
A amiga Médica Veterinária Professora Doutora Namir Moreira, pela dedicação e carinho e em me ensinar tudo o que sei sobre Imunofluorescência Indireta e pela orientação e ajuda na realização desse teste.
Ao Médico Veterinário Antônio Faber, por me orientar sobre as possibilidades de coletas de sangue no município de Bom Jesus do Itabapoana.
Ao Médico Veterinário Gustavo por me fazer saber da possibilidade de presença do hemoparasito pesquisado no município de Bom Jesus do Itabapoana e por ceder o espaço da sua clínica veterinária para a colheita de algumas amostras.
A Waldinéia, Vanessa e Cristiano pela ajuda com a colheita das amostras.
Ao Médico Veterinário Antônio Faber e ao senhor José Fernando, por conseguirem os mapas do município de Bom Jesus do Itabapoana.
Ao amigo Médico Veterinário Professor Doutor Eduardo Viana, pela paciência e dedicação em me ensinar sobre diversos temas em Patologia Clínica, notadamente hematologia e pela orientação e ajuda na pesquisa de hemoparasitos.
Ao amigo e Professor Rodolpho Torres pela gentileza em orientar na tabelação e organização dos dados.
Ao amigo e Professor Joel Rosa pela paciência e presteza em ajudar na análise dos dados.
A amiga Médica Veterinária Vanessa Viscardi, pelo carinho e disposição em ajudar com a formatação da dissertação.
A equipe do laboratório de Patologia Clínica do Hospital Universitário da Universidade Federal Fluminense, em especial à amiga e técnica Camila Giesteira, sempre pronta a me ajudar, mesmo que a distância; aos demais plantonistas e amigos Eduardo Viana, Gracy Canto, Renata Guedes, Gabriel Bobany, Sabrina Emmerick, Ananda Muller, Pedro Velho e Lívia Munay, sempre prontos a ajudar; a amiga e residente, Luana Freitas, aos monitores, estagiários e alunos do Curso de Graduação em Medicina Veterinária, onde cada dúvida levantada proporcionou o aprimoramento profissional de todos.
Ao grupo de pesquisa da Professora Doutora Nádia Almosny, o grupo Hemoparasitos, pela amizade, apoio e incentivo, que me permitiram ir mais longe.
As amigas Professora Doutora Márcia Xavier e Sabrina Emmerick e aos amigos Professor Doutor Nayro Alencar e Gabriel Bobany, pela ajuda com a montagem e orientação sobre as aulas por mim ministradas.
Ao amigo Professor Doutor Daniel Macieira, pela orientação na condução da análise dos resultados encontrados no presente trabalho.
A amiga Professora Doutora Aline Moreira, pela paciência e presteza em ajudar. A equipe de funcionários da Direção da Faculdade de Veterinária - UFF, Fátima de Oliveira, Maria Nepomuceno, Carlos Adolfo Vieira, Paulo Henrique Panema, Paulo Victor de Faria e Claudio Pacheco, sempre gentis, atenciosos e prontos para ajudar em todos os momentos.
A equipe de Bibliotecários da Faculdade de Veterinária - UFF, gentis e solícitos sempre.
A todos os amigos do Curso de Mestrado e os do Doutorado em Clínica e Reprodução Animal, que para não cometer nenhuma injustiça, prefiro agradecer em grupo, pela consolidação de amizades.
A todos os outros amigos, que direta ou indiretamente, colaboraram comigo durante a minha vida acadêmica.
“A ciência não é uma ilusão, mas seria uma ilusão acreditar que poderemos encontrar noutro lugar o que ela não nos pode dar.”
SUMÁRIO
Página
LISTA DE QUADROS 10
LISTA DE TABELAS 11
LISTA DE FIGURAS 12
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 13
RESUMO 14 ABSTRACT 15 1. INTRODUÇÃO 16 2. REVISÃO DE LITERATURA 18 2.1. TAXONOMIA 18 2.2. Ehrlichia canis 18
2.2.1. MORFOLOGIA DE Ehrlichia canis 19
2.2.2. TRANSMISSÃO DE Ehrlichia canis 20
2.3. SAZONALIDADE DO VETOR 20
2.4. IDADE, SEXO E RAÇA DOS ANIMAIS ACOMETIDOS 21
2.5. PATOGENIA E MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS DA
EHRLICHIOSE CANINA
22
2.5.1. FASE AGUDA 22
2.5.2. FASE SUBCLÍNICA 23
2.5.3. FASE CRÔNICA 23
2.6.TROMBOPOIESE: ALTERAÇÕES QUALITATIVAS E
QUANTITATIVAS
24
2.6.1. TROMBOCITOPENIA E EHRLICHIOSE 25
2.7. INFECÇÕES ASSOCIADAS A OUTROS HEMOPARASITOS 25
2.8. DIAGNÓSTICO DA INFECÇÃO POR Ehrlichia canis 28
2.8.1. CLÍNICO 28
2.8.2. MICROSCOPIA ÓPTICA 29
2.8.3. SOROLOGIA - IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI) 31
3. MATERIAL E MÉTODOS 35
3.1. ÁREA DE ESTUDO 35
3.2. ANIMAIS 36
3.3. COLHEITA DAS AMOSTRAS E GRUPOS DE ESTUDO 37
3.4. CONFECÇÃO DE ESFREGAÇOS SANGUÍNEOS 37
3.5. SOROLOGIA – IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI) 38
3.6. ANÁLISE ESTATÍSTICA 38
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 40
4.1. ANÁLISEDOSESFREGAÇOSSANGUÍNEOS 40
4.2. OUTROS HEMOPARASITOS DIAGNOSTICADOS NOS ESFREGAÇOS SANGUÍNEOS
44
4.3. AVALIAÇÃO POR IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI) 47
4.3.1. PRESENÇA DE ANIMAIS POSITIVOS NA REGIÃO DE BOM JESUS DO ITABAPOANA
47
4.3.2. PRESENÇA DE ANIMAIS POSITIVOS NA REGIÃO DE BOM JESUS DO ITABAPOANA CONSIDERANDO AS AMOSTRAS OBTIDAS NA PRIMAVERA (GRUPO A) E NO VERÃO (GRUPO B)
4.4. COMPARAÇÃO DAS FAIXAS ETÁRIAS DOS CÃES POSITIVOS EM IFI NO MUNICÍPIO DE BOM JESUS DO
ITABAPOANA – RJ 50
4.5. SEXO DOS CÃES AMOSTRADOS 51
4.6. RAÇAS DOS CÃES POSITIVOS EM IFI 53
4.7. PRESENÇA DE CARRAPATOS EM CÃES DA MESMA RESIDÊNCIA
54
4.8. ANÁLISE DOS SINAIS CLÍNICOS 57
4.9. ALTERAÇÕES MORFOLÓGICAS NO ESFREGAÇO
SANGUÍNEO
58
5. CONCLUSÕES 60
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 61
LISTA DE QUADROS
Quadro Título Página
Quadro 1. Nova classificação da ordem Rickettsiales. 18
LISTA DE TABELAS
Tabela Título Página
Tabela 1. Resultado da pesquisa de mórulas da família Anaplasmataceae em esfregaços sanguíneos de cães do município de Bom Jesus do Itabapoana – RJ.
40
Tabela 2. Resultado da pesquisa de anticorpos da classe IgG para E. canis em IFI de cães do município de Bom Jesus do Itabapoana – RJ.
47 Tabela 3. Resultado da pesquisa de anticorpos da classe IgG para E. canis em
IFI, nos grupos A e B, de cães do município de Bom Jesus do Itabapoana – RJ.
49
Tabela 4. Comparação das faixas etárias dos cães positivos em IFI no município de Bom Jesus do Itabapoana – RJ.
50 Tabela 5. Raças dos cães amostrados no município de Bom Jesus do
Itabapoana (RJ), com relação a positividade na IFI. 53 Tabela 6. Cães com relação ao acesso externo e relação com presença ou
ausência de carrapatos no momento da colheita, realizada no município de Bom Jesus do Itabapoana – RJ.
54
Tabela 7. Sinais clínicos sugestivos de ehrlichiose que mais ocorreram nos cães amostrados no município de Bom Jesus do Itabapoana – RJ.
57 Tabela 8. Presença de alterações morfológicas nos esfregaços sanguíneos dos
cães dos Grupos A e B do município de Bom Jesus do Itabapoana – RJ.
LISTA DE FIGURAS
Figura Título Página
Figura 1. Regiões fisiográficas do Estado do Rio de Janeiro. O município de Bom Jesus do Itabapoana, onde foram colhidas amostras, está localizado na região noroeste, marcada com a cor bege (Fonte: www.ptb.org.br).
36
Figura 2. Comparação entre positividade para mórulas no Grupo A e Grupo B em cães do município de Bom Jesus do Itabapoana – RJ.
42
Figura 3. Presença hemoparasitos em avaliação morfológica de esfregaços sanguíneos de cães do município de Bom Jesus do Itabapoana – RJ.
45
Figura 4. Resultado da avaliação morfológica de esfregaços sanguíneos de cães do município de Bom Jesus do Itabapoana (RJ) quanto a presença de coinfecção em uma mesma amostra e de amostras positivas.
45
Figura 5. Sexo de todos os cães amostrados no município de Bom Jesus do Itabapoana – RJ.
51 Figura 6. Resultado da IFI positiva com relação ao sexo dos animais
amostrados no município de Bom Jesus do Itabapoana – RJ.
52
Figura 7. Cães da mesma residência, com relação à presença de ixodídeos no momento da colheita, realizada no município de Bom Jesus do Itabapoana – RJ.
55
Figura 8. Número de residências onde havia mais de um cão, com relação à positividade na IFI nos cães, no município de Bom Jesus do Itabapoana – RJ.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AAE Anorexia, Apatia e/ou Emagrecimento
BH Belo Horizonte
CAV-1 Adenovirus Tipo 1
CCZ Centro de Controle de Zoonoses
EDTA ácido etileno diamino tetracético
EMC Ehrlichiose Monocítica Canina
GO Goiás
IFI Imunofluorescência Indireta
IgG Imunoglobulina G
IgM Imunoglobulina M
MG Minas Gerais
MGG May Grunwald e Giemsa
MH Mucosas Hipocoradas
MT Mato Grosso
PCR Reação em Cadeia da Polimerase
PE Pernambuco
PI Piauí
RJ Rio de Janeiro
SP São Paulo
SO Secreção Ocular, Nasal e/ou Petéquias
RESUMO
Ehrlichia canis é bactéria causadora da doença infecciosa ehrlichiose monocítica
canina (EMC) em cães. Ocorre mundialmente, apresentando diversas variações na apresentação clínica e que determina, dentre outros sinais clínicos, imunodepressão, favorecendo a ocorrência de outras moléstias. Tendo em vista a importância desta doença emergente e visando avaliar a sua ocorrência analisou-se, por imunofluorescência indireta, o sangue de 83 cães do município de Bom Jesus de Itabapoana, na região no noroeste do Estado do Rio de Janeiro. Destes, 43 estavam positivos para Ehrlichia canis. Quando avaliou-se separadamente as amostras colhidas na primavera (Grupo A) e no verão (Grupo B) observou-se não ter havido diferenças entre a ocorrência da doença nas duas ocasiões. As raças mais acometidas foram Yorkshire, Poodle e Labrador Retriever, e cães sem raça definida (SRD), mas entre as raças negativas a frequência foi a mesma, mostrando não haver uma preferencia racial. Não houve diferença na idade dos animais acometidos e os sinais mais comuns foram mucosas hipocoradas; anorexia, apatia e/ou emagrecimento; e secreção ocular, nasal e/ou petéquias. Concluiu-se que Ehrlichia
canis está presente na região de Bom Jesus do Itabapoana e que novos estudos
deverão ser realizados visando conhecer as várias espécies de Anaplasmataceae que acometem os cães da região assim como outros hemoparasitas.
ABSTRACT
The canine ehrlichiosis is a rickettsial worldwide distribution with many variations in clinical presentation and determines immunosuppression, favoring the occurrence of other diseases. Given the importance of this emerging disease and to evaluate their occurrence was analyzed by indirect immunofluorescence, the blood of 83 dogs in the city of Bom Jesus de Itabapoana in the region in the northwestern State of Rio de Janeiro. Of these, 43 were positive for Ehrlichia canis. When was evaluated separately the samples collected in spring (Group A) and summer (Group B), they showed there were no differences between the occurrence of the disease on two occasions. The most affected breeds were Yorkshire, Poodle, Labrador Retriever and mongrel dogs, but between the negative races the frequency was the same, showing that there is no racial preference. There was no difference in age of affected animals and the most common signs and symptoms were pale mucous membranes; anorexia, apathy and/or weight loss; and ocular discharge, nasal and/or petechiae. There were no changes in haematological values. It was concluded that Ehrlichia
canis is present in the region of Bom Jesus do Itabapoana and that new studies
should be conducted to explore the many species of Anaplasmataceae that affect dogs of the region as well as other hemoparasites.
1. INTRODUÇÃO
A infecção por Ehrlichia canis é reconhecida como importante doença infecciosa transmitida por artrópodes, potencialmente fatal tanto para cães como para humanos. Ehrlichia canis é o agente etiológico da ehrlichiose monocítica canina (EMC), doença multissistêmica que possui apresentação clínica altamente variável e de difícil diagnóstico diferencial. A bactéria E. canis é transmitida ao cão pelo carrapato Rhipicephalus sanguineus, considerado principal vetor. A ehrlichiose está amplamente distribuída no Brasil. No Rio de Janeiro, como o hospedeiro invertebrado é perfeitamente adaptado ao clima, toda a área é considerada endêmica.
O diagnóstico da infecção causada por E. canis não pode ser baseado somente em sinais clínicos ou resultados sorológicos isolados. Tal diagnóstico pode ser realizado por meio da visualização de mórulas sob microscopia óptica de imersão, pela técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) ou por imunofluorescência indireta (IFI). A técnica de IFI além de constituir em uma ferramenta valiosa para o diagnóstico e triagem de ehrlichioses, é considerada técnica de padrão-ouro sorológico, indicando exposição à Ehrlichia canis.
No Estado do Rio de Janeiro há regiões, como o município de Bom Jesus do Itabapoana, que carecem de estudos que caracterizem a presença de Ehrlichia
canis em cães, bem como as características clínicas e laboratoriais dos animais
acometidos, sendo de extrema importância tal estudo no referido município. Além disso, não há dados na literatura referentes à presença de E. canis em cães do município de Bom Jesus do Itabapoana, tendo em vista que nenhum estudo havia sido realizado no referido município.
Desta forma, o presente trabalho teve como objetivos: verificar a ocorrência de infecção por hemoparasitos da família Anaplasmataceae em cães no município
de Bom Jesus do Itabapoana (RJ), por meio da observação de mórulas em esfregaços de sangue periférico; detectar cães expostos a bactéria E. canis por meio da técnica de IFI, revelando se há circulação deste agente etiológico no município de
Bom Jesus do Itabapoana (RJ); correlacionar os cães positivos, tanto para a
presença de mórulas de hemoparasitos da família Anaplasmataceae quanto os animais positivos na IFI, com a sazonalidade do achado (primavera e verão); correlacionar os sinais clínicos apresentados pelos animais no momento da colheita e soropositividade no teste de IFI; avaliar ixodidiose em animais com acesso ou não a ambiente externo ao domicilio; avaliar se há predisposição de raças, faixa etária e sexo dos cães amostrados, com soropositividade no teste de IFI; avaliar as possíveis alterações celulares qualitativas (morfológicas) nos esfregaços sanguíneos.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. TAXONOMIA
Segundo estudos de Dumler e equipe (2001) e em decorrência de análises
das sequências genéticas obtidas a partir do GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide) uma nova
classificação foi proposta, compilada no quadro 1.
Quadro 1. Classificação da ordem Rickettsiales.
Ordem Rickettsiales Família Anaplasmataceae Gênero Espécie Ehrlichia E. canis E. chaffeensis E. ewingii E. muris E. ruminantium Anaplasma A. platys A. phagocitophila A. centrale A. marginale A. ovis A. bovis Neorickettsia N. risticii N. sennetsu N. helminthoeca Wolbachia W. pipientes
Compilado de DUMLER et al. (2001)
2.2. Ehrlichia canis
O gênero Ehrlichia compreende parasitos intracitoplasmáticos de leucócitos e plaquetas de várias espécies de mamíferos (HOSKINS, 1991; RIKIHISA, 1991; DAVOUST, 1993).
As bactérias do gênero infectam essencialmente os animais, existindo espécies que acometem naturalmente canídeos, equídeos, ruminantes e o homem. A infecção em gatos é quase inexistente, e foi demonstrada em raros casos (DAVOUST, 1993).
As seguintes espécies do gênero Ehrlichia já foram descritas causando infecções naturais em cães: E. canis, N. risticii, E. ewingii, E. chaffeensis, além de
Anaplasma platys e A. phagocytophilum (DUMLER e WALKER, 2001).
Ehrlichia canis é o agente etiológico da ehrlichiose monocítica canina (EMC)
doença multissistêmica que possui apresentação clínica altamente variável e de difícil diagnóstico diferencial (HARRUS et al., 1997a; KAKOMA et al., 2000; ALMOSNY e MASSARD, 2002). A bactéria é transmitida ao cão pelo carrapato
Rhipicephalus sanguineus, considerado principal vetor. Outros prováveis vetores de E. canis são o carrapato Dermacentor variabilis (JOHNSON et al., 1998), e de
acordo com estudos realizados no Brasil, os autores concluíram que carrapatos da espécie Amblyomma cajennense deveriam ser incluídos como um potencial vetor de
E. canis em áreas rurais do Brasil, porém ainda permaneceria a ser investigado
(COSTA Jr. et al., 2007).
2.2.1. MORFOLOGIA DE Ehrlichia canis
As inclusões das espécies do gênero Ehrlichia podem ser caracterizadas de três formas: corpúsculos elementares, corpúsculos iniciais e mórulas (McDADE, 1990; ELIAS, 1991; ALMOSNY e MASSARD, 2002; ARRAGA-ALVARADO et al., 2003).
As estruturas amorfas (corpúsculos elementares) apresentam-se
arredondadas, de vários tamanhos, podendo ser visualizadas em vacúolos no citoplasma de monócitos. A forma granular (corpúsculos iniciais) é composta de múltiplos grânulos. Tanto os corpúsculos iniciais como os corpúsculos elementares precisam ser diferenciados das granulações azurófilas, que podem ocorrer no citoplasma de células sanguíneas mononucleares de cães sadios. Já as mórulas são descritas como sendo colônias arredondadas, com grânulos que se apresentam como corpúsculos elementares corados em azul escuro pelo método de Giemsa
(ALMOSNY e MASSARD, 2002). As mórulas podem ser observadas a partir do 13o dias após a inoculação do agente (ALMOSNY, 1998).
Diversos autores postularam com relação aos possíveis diâmetros apresentados pelos corpúsculos e mórulas. Os corpúsculos elementares podem medir de 0,2 μm a 1,5 μm. Já os corpúsculos iniciais podem apresentar-se com um mínimo de 0,4 μm de diâmetro até 5 μm, e as mórulas, por sua vez, podem medir de 2,5 μm a 6,0 μm (McDADE, 1990; ELIAS, 1991; ARRAGA-ALVARADO et al., 2003).
2.2.2. TRANSMISSÃO DE Ehrlichia canis
A transmissão de E. canis para os hospedeiros vertebrados se dá de forma horizontal, através da saliva do artrópode vetor, notadamente R. sanguineus (McDADE, 1990; HARRUS et al., 1997a) principalmente durante as fases de ninfa e adulto (ALMOSNY e MASSARD, 2002). No vetor a transmissão se dá de forma transestadial (NEER, 1998; BREMER et al., 2005; DANTAS-TORRES, 2007).
2.3. SAZONALIDADE DO VETOR
Em países com climas tropical e subtropical, R. sanguineus é encontrado durante o ano todo parasitando cães (HOSKINS, 1991). Este vetor está distribuído de maneira abundante em todas as regiões do Brasil (EVANS et al., 2000).
No Brasil, em estudo realizado em Goiânia (Goiás - GO) foi descrito que R.
sanguineus realiza uatro era es por ano no município em questão (LOULY,
2007). Em estudo com cães da zona rural de Minas Gerais (MG), a taxa de infestação dos animais foi similar tanto na estação seca (18,85%) quanto na estação chuvosa (18,18%) (COSTA Jr. et al., 2006). Rodrigues et al. (2001) relataram a presença de R. sanguineus em 104 cães de Juiz de Fora (MG), onde o clima é do tipo tropical, em estudo realizado em duas estações: inverno seco (maio a setembro), com temperaturas mais baixas e verão chuvoso (outubro a abril), com temperaturas mais altas. O ixodídeo em questão ocorreu tanto no inverno quanto no verão e não foi observada diferença significativa (p<0,05) para sua prevalência no inverno (60,8%) e no verão (60,3%) em Juiz de Fora. Porém a intensidade média de parasitismo nos cães foi significativamente maior no período de verão (4,80
parasitos/hospedeiro) comparado ao período de inverno (2,96 parasitos/hospedeiro). Os meses mais quentes foram os que apresentaram maior intensidade média de R.
sanguineus e outros ixodídeos, e este aumento da infestação resulta em aumento da
infecção por hemoparasitos transmitidos pelos vetores (MURATA et al., 199 ; MUNDIM et al., 1994; MORALES-SOTO e CRU - UE , 199 . Em Belo orizonte (B , o inverno é seco e o ver o, c uvoso, e todos os está ios do ciclo ioló ico (larva, nin a e adulto mac o mea e oram encontrados nos c es durante todos os meses do estudo, entretanto, oi constatada varia o si ni icativa (p 0,05 na ta a de in esta o nos c es dentre as esta es do ano, com maior taxa de infestação de R. sanguineus ocorrendo durante a estação seca (outono e inverno). Também foi observada rande capacidade de adapta o de R. sanguineus. O autores ressaltaram neste estudo ue os atores climáticos e ercem acentuada in lu ncia no ciclo ioló ico de R. sanguineus, porém nos resultados encontrados, as varia es climáticas n o oram atores limitantes ao seu desenvolvimento, uando ouve disponi ilidade de alimento e locais propícios ao desenvolvimento das ases de vida livre desse i odídeo (SIL EIRA et al., 200 .
Uma melhor compreensão da ecologia do carrapato pode fornecer informações úteis sobre a dinâmica de doenças transmitidas por carrapatos (PAROLA et al., 2005; DANTAS-TORRES, 2007).
2.4. IDADE, SEXO E RAÇA DOS ANIMAIS ACOMETIDOS
A idade dos cães acometidos pela ehrlichiose é variável, havendo relato de casos da enfermidade em cães de dois meses até treze anos de idade (WADDLE e LITTMAN, 1987; ELIAS 1991; NEER e HARRUS, 2006; MANOEL, 2010).
Em Israel (HARRUS et al., 1997a) não foi observada predisposição da infecção por E. canis com relação a idade.
Em trabalho desenvolvido no Brasil, Manoel (2010) observou que cães com faixa etária mais elevada (acima de oito anos, em média) possuíam infecção por E.
canis em percentual maior que animais mais jovens. A maioria dos cães em faixa
etária mais elevada incluídos no estudo apresentava manifestações clínicas sugestivas da fase crônica.
raça definida seriam mais resistentes à infecção por E. canis. Em 2004, Tilley e Smith relataram maior gravidade da doença crônica em cães das raças Dobermann Pinscher e Pastor Alemão. Neer e Harrus, em estudo em 2006, sugeriram que cães da raça Pastor Alemão pareciam mais suscetíveis à infecção por E. canis, apresentando doença mais severa e de pior prognóstico do que outras raças. Manoel, em 2010, afirmou que não havia aparente predisposição racial em cães infectados pela EMC.
2.5. PATOGENIA E MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS DA EHRLICHIOSE CANINA
A ehrlichiose canina possui um período de incubação que dura de oito a 20 dias (HARRUS et al., 1997a), seguido de três fases: aguda, subclínica e crônica (RIKIHISA, 1991; WOODY e HOSKINS, 1991; RIKIHISA et al., 1992; HARRUS et al., 1997a; NEER, 1998; BREITSCHWERDT, 2000; COHN, 2003). A bactéria replica-se nas células mononucleares circulantes, principalmente no sistema fagocitário mononuclear (COUTO, 1998). As células infectadas são transportadas via corrente sanguínea para outros tecidos do organismo, especialmente pulmões, rins e meninges. Essas células infectadas aderem ao endotélio vascular, induzindo uma vasculite e infecção de tecido subendotelial (BREITSCHWERDT, 2000).
2.5.1. FASE AGUDA
Ocorre de duas a quatro semanas após período de incubação, podendo apresentar diversos sinais clínicos, como: febre, anorexia, perda de peso, mucosas hipocoradas (MH), vômitos, linfadenopatia, epistaxe, anemia, edema de membros e de saco escrotal, equimoses no abdômen, petéquias em mucosas, melena e hifema, e ainda manifestações do sistema nervoso central, oculares e respiratórias (HARRUS et al., 1998; MARTIN, 1999; WOODY e HOSKINS, 1991; ALMOSNY, 1998; BREISCHWERDT, 2000; CASTRO et al., 2004; NEER e HARRUS, 2006).
Quadros agudos mais graves parecem ocorrer em regiões onde a infecção dos animais por E. canis é mais recente (ALMOSNY e MASSARD, 2002) ou quando a doença for causada por algumas cepas de E. canis, ou ainda, em casos de coinfecção por hemoparasitos (UNVER et al., 2009).
No animal imunocompetente, os sinais clínicos desaparecem sem tratamento e o cão entra na fase subclínica. Os cães que não obtiverem sucesso na eliminação do parasito durante a fase subclínica podem se manter nessa fase por anos ou ingressar na fase crônica da doença (McDADE, 1990; WOODY e HOSKINS, 1991; HARRUS et al., 1997a; BREITSCHWERDT, 2000).
2.5.2. FASE SUBCLÍNICA
Esta fase pode perdurar por vários anos, não havendo sintomatologia clínica evidente (WOODY e HOSKINS, 1991; DAVOUST, 1993).
2.5.3. FASE CRÔNICA
Na fase crônica, os sinais clínicos demoram em média de um a quatro meses após a inoculação da bactéria para ocorrerem, e podem variar de ausentes até extremamente graves (COUTO, 1998; NEER, 1998; BREITSCHWERDT, 2000).
Para alguns cães, uma forma grave e potencialmente fatal de ehrlichiose crônica pode se desenvolver. Sinais clínicos diversos podem ocorrer como anorexia, febre e perda de peso, acompanhados de mialgia, tendências a sangramento, lesões oculares, debilidade, gastroenterites, artrite, polimiosite, sensibilidade abdominal, alterações neurológicas com sinais consistentes com meningoencefalite, ataxia, insuficiência renal, acentuada nefropatia por perda de proteínas. A estimulação antigênica crônica pode levar a uma glomerulonefrite por acúmulo de imunocomplexos. Várias formas hemorrágicas podem ocorrer, como epistaxe, petéquias, equimose, palidez de mucosas devido à anemia, hifema, hemorragia de retina e/ou uveíte anterior com alterações na retina e hematúria. Devido à imunossupressão presente em animais na fase crônica da ehrlichiose, infecções secundárias podem ser reportadas, como pneumonia (ALMOSNY, 1998; COUTO, 1998; BREITSCHWERDT, 2000; HARRUS e WANNER, 2011).
2.6.TROMBOPOIESE: ALTERAÇÕES QUALITATIVAS E QUANTITATIVAS
As plaquetas circulam no sangue durante 10 a 15 dias na maioria das espécies de mamíferos, sendo removidas da circulação dependendo da idade das mesmas (RUSSEL e GRIDEM, 2000). Quando há uma queda na meia-vida das plaquetas, a medula óssea tenta compensar o problema com uma hiperplasia megacariocítica (JAIN, 1993).
A trombocitopenia imunomediada primária - idiopática ou autoimune - é causada por autoanticorpos que geralmente são reativos com autoantígenos em plaquetas. Qualquer trombocitopenia imunomediada associada a uma condição pré-existente, como por exemplo, neoplasias, doenças infecciosas, é dita secundária (SCOTT, 2000). A trombocitopenia pode ser causada por doenças infecciosas, como a ehrlichiose canina. Algumas causas infecciosas de trombocitopenia em cães foram sumarizadas no quadro 2.
Quadro 2. Algumas causas infecciosas de trombocitopenia em cães. Etiologia da
doença Doença Agente causador
Viral
Hepatite infecciosa canina Adenovirus Tipo 1 (CAV-1) Infecção por herpesvirus canino Herpesvirus
Infecção por parvovirus canino Parvovirus
Cinomose canina Paramyxovirus
Rickettsial
Ehrlichiose Ehrlichia canis
Febre maculosa das montanhas
rochosas Rickettsia rickettsii
Trombocitopenia cíclica Anaplasma platys
Ehrlichiose granulocítica Ehrlichia equi e Ehrlichia ewingii
Hemobartonelose Mycoplasma hameocanis
Bacteriana
Bacteremia Diversos microrganismos
Endotoxemia Endotoxinas
Leptospirose Leptospira icterohaemorrhagiae, L.
canicola
Salmonelose Diversos sorotipos
Protozoa
Babesiose Babesia canis, B. gibsoni
Fúngica
Histoplasmose Histoplasma capsulatum
Candidíase disseminada Candida albicans, C. parapsilosis (Adaptado de BREITSCHWERDT, 1988)
2.6.1. TROMBOCITOPENIA E EHRLICHIOSE
A trombocitopenia é uma das características fisiopatogênicas mais comuns na ehrlichiose canina. A queda na contagem de plaquetas começa poucos dias após a infecção por E. canis e pode ser causada por diversos mecanismos. Pode ocorrer devido à hipoplasia de medula óssea e também por sequestro esplênico e/ou hepático, além de aumento de consumo, podendo contribuir para ocorrência de distúrbios hemorrágicos (NEER e HARRUS, 2006; WOODY e HOSKINS, 1991). A patogênese da trombocitopenia causada por agentes infecciosos ainda não está completamente elucidada, entretanto, é relevante saber que doenças causadas por hemoparasitos são causas infecciosas comuns de trombocitopenia em áreas endêmicas (SCOTT, 2000; HARRUS e WANER, 2011).
Diversos autores citaram a trombocitopenia como um achado consistente em todas as fases da infecção por E. canis (HOSKINS, 1991; WOODY e HOSKINS, 1991; ALMOSNY, 1998; HARRUS et al., 1997b; NEER, 1998; HARRUS et al., 1999; NEER e HARRUS, 2006; SOUSA et al., 2010; MANOEL, 2010; XAVIER, 2011).
Macieira (2003) concluiu que a ehrlichiose deve ser considerada na realização do diagnóstico diferencial das causas de trombocitopenia, entretanto, uma plaquetometria dentro dos valores de referência não exclui a ehrlichiose da lista de prováveis diagnósticos de uma determinada suspeita clínica. Postulou ainda que a contagem de plaquetas não deve ser utilizada de forma isolada como uma ferramenta no diagnóstico presuntivo da ehrlichiose. Desta forma, outras causas, diferentes de ehrlichiose, devem ser pesquisadas para a obtenção de um diagnóstico preciso e etiológico das trombocitopenias.
2.7. INFECÇÕES ASSOCIADAS A OUTROS HEMOPARASITOS
Diversos hemoparasitos podem ser encontrados simultaneamente no mesmo hospedeiro. É comum a infecção por Ehrlichia concomitantemente a outros hemoparasitos como Babesia sp., Hepatozoon canis e outras espécies do gênero
Ehrlichia (BREITSCHWERDT et al., 1998; SUKASAWAT et al., 2001; SHAW et al.,
2001). Um fator determinante para tal é que muitos desses parasitos compartilham o mesmo carrapato vetor (SHAW et al., 2001). Desta forma, cães de locais com alta
exposição a carrapatos podem estar infectados simultaneamente com diversos patógenos transmitidos pelos vetores (KORDICK et al., 1999).
É frequente a coinfecção por E. canis e Babesia canis em cães (TRAPP et al., 2006). E há relatos da possibilidade de infeção associada de E. canis com A.
phagocytophilum.
Casos de coinfecção com bactérias do gênero Ehrlichia e A. platys têm sido descritos, no entanto, as consequências da coinfecção não estão bem estabelecidas nas espécies, em comparação com a infecção com um único organismo. Kordick et al. (1999) mostraram numerosos exemplos de coinfecções com E. canis, E.
chaffeensis e/ou E. ewingii, B. canis, Anaplasma platys além de outros parasitos
transmitidos, em um canil infestado de carrapatos. No mesmo trabalho, foi reportado que quase metade dos cães testados apresentaram resultado positivo (PCR) para infecções com quatro ou mais espécies ou gêneros de patógenos, inclusive
Bartonella sp. A infecção simultânea com múltiplos agentes pode ser responsável
por algumas diferenças observadas entre os casos clínicos, com apresentação de quadros clínicos mais graves.
Em estudo de um caso clínico em Israel, o paciente apresentou anorexia, apatia, febre e os achados laboratoriais semelhantes aos da infecção por E. canis como anemia, leucopenia e trombocitopenia. O diagnóstico foi definido através da pesquisa em esfregaço sanguíneo, pois foram encontradas mórulas em plaquetas. O animal apresentava sorologia positiva para A. platys e negativa para E. canis, mas não se descartou completamente a possibilidade de coinfecção (WANER, 1993).
Little (2010) em trabalho de revisão, postulou que na infecção por A. platys a trombocitopenia é a alteração mais frequente, no entanto, aumenta e diminui, em um ciclo de 10 a 14 dias, durante a fase aguda da doença, porém, em coinfecção com
E. canis, a trombocitopenia pode ser mais severa.
No Brasil vários estudos mostram presença de coinfecção entre Ehrlichia sp.,
Anaplasma sp. e/ou outros hemoparasitos (O’DWYER et al., 2001; XAVIER et al.,
2002; MOREIRA et al., 2003; ACCETTA, 2008; SANTOS et al., 2009; SOUSA et al., 2009; FREIRE et al., 2009; RAMOS et al. 2009; RAMOS et al., 2010; XAVIER, 2011).
Numa população canina de Ribeirão Preto (São Paulo - SP), foi observado que de 107 cães trombocitopênicos, 85 positivos para E. canis (PCR), e destes, 28 (26,1%) estavam coinfectados com A. platys e/ou Babesia spp. Já no grupo de 114
cães não trombocitopênicos, dos 34 positivos para E. canis (PCR), cinco estavam coinfectados com um ou ambos desses hemoparasitos (SANTOS et al., 2009).
Na capital de MG, de 194 cães suspeitos de possuir hemoparasitose, 145 apresentaram-se positivos para algum tipo de parasito, e destes, houve 35,9% (52/194) de positividade para Ehrlichia spp. (E. canis e/ou A. platys) com 10% de coinfecção com Mycoplasma haemocanis e Babesia canis (MOREIRA et al., 2003).
O’dwyer et al. (2001 relataram coin ec o de E. canis com Hepatozoon
canis, em um cão no Estado do Rio de Janeiro (RJ). Xavier et al. (2002) relataram
caso onde foram visualizados simultaneamente E. canis e Hepatozoon canis em um mesmo monócito, além da visualização de Babesia sp. na mesma amostra, de um canino procedente de Seropédica (RJ).
Santos (2008) estudou uma população canina do Centro de Controle de Zoonoses (CCZ) Paulo Darcoso Filho, no município do RJ, e detectou coinfecção em 36 cães (95%), de 38 animais estudados, sendo 22 animais com presença de coinfecção por E. canis e A. platys.
Ainda no Estado do RJ, em estudo com 3019 amostras de sangue encaminhadas a um laboratório particular, houve 1% de coinfecção de Ehrlichia spp. com Babesia spp. (ACCETTA, 2008).
Xavier (2011) relatou a presença de coinfecção por diversos hemoparasitos em amostras de Maricá. Foi relatada a presença de um animal positivo para E. canis e A. platys. E outros casos de coinfecções foram encontrados, com o achado de parasitas de diferentes grupos taxonômicos durante a pesquisa microscópica como
Babesia sp., Hepatozoon sp. e microfilárias.
Em Cuiabá, no Estado do Mato Grosso (MT), houve a descrição de dois casos de coinfecção entre E. canis e A. platys (SOUSA et al., 2009).
Em Salvador (BA) foram analisados 472 cães e 32 carrapatos para a presença de três espécies de Ehrlichia e só foi detectada E. canis (SOUSA et al., 2010). Em outro estudo, no mesmo município, mas em microrregiões diferentes, foram analisados 100 cães suspeitos de possuir hemoparasitose e houve 24% de coinfecção de E. canis com A. platys (FREIRE et al., 2009).
Em Recife (PE), de 100 cães suspeitos, 32% possuíam coinfecção de E.
canis com A. platys (RAMOS et al. 2009). Neste mesmo município, de 205 cães
estudados para ocorrência de diversos hemoparasitos, em 23,9% dos animais a coinfecção estava presente (RAMOS et al., 2010).
2.8. DIAGNÓSTICO DA INFECÇÃO POR Ehrlichia canis
Vinasco et al. (2007) relataram que a EMC constitui em doença potencialmente fatal e o diagnóstico não pode ser baseado somente em sinais clínicos ou resultados sorológicos isolados, porém Little (2010) descreveu que o diagnóstico da ehrlichiose canina geralmente começa com a avaliação clínica.
O diagnóstico laboratorial da infecção causada por E. canis pode ser suspeitado por meio da visualização de mórulas sob microscopia óptica de imersão e pode ser feito através da amplificação de uma porção do genoma do parasito por meio da PCR, ou indiretamente pela detecção de anticorpos (BREITSCHWERDT, 2000). Entretanto, Harrus e Waner (2011) mostraram que a hematologia, a sorologia, a citologia e o isolamento são ferramentas diagnósticas valiosas, porém afirmaram que técnicas moleculares são necessárias para o diagnóstico definitivo.
2.8.1. CLÍNICO
Por não ser uma patologia de sinais clínicos específicos, podemos suspeitar de ehrlichiose quando os achados na anamnese e no exame físico são apatia, mucosas pálidas, anorexia, febre, hemorragias espontâneas, petéquias, e histórico de infestação por carrapatos (BICHARD e SCHERDING, 2003). Assim sendo, o diagnóstico clínico é difícil de ser feito, pois há muitas outras doenças que apresentam os mesmos sinais e sintomas que podem estar acometendo os cães de forma isolada, ou em conjunto com a infecção por E. canis (coinfecção) (NEITZ e THOMAS, 1938). Portanto, a realização de exames laboratoriais para confirmação da suspeita é essencial (RIKIHISA, 1991; NEER, 1998; ALMOSNY, 1998; UNVER, 2009).
2.8.2. MICROSCOPIA ÓPTICA
A observação morfológica de hemoparasitos nas formas de mórulas ou de corpúsculos elementares isolados vem sendo usada para diagnosticar hemoparasitoses. Os achados em esfregaço sanguíneo de sangue periférico ou de
aspirados de tecidos constituem em diagnóstico definitivo para as ehrlichioses. Porém, o achado de mórulas é difícil, e costuma ocorrer somente na fase aguda da infecção. Também requer muito tempo e paciência do profissional que estiver avaliando o esfregaço sanguíneo, e por isso apresenta baixa sensibilidade e frequentes falsos negativos (RIKIHISA, 1991; NEER, 1998). Além disso, poucas células circulantes contêm mórulas, que são achadas em pequeno número (WOODY e HOSKINS, 1991; SUKSAWAT et al., 2000).
A observação de corpúsculos iniciais, a realização de esfregaço de concentrado leucocitário e o esfregaço sanguíneo a partir da primeira gota de sangue periférico podem aumentar significativamente a sensibilidade da observação microscópica como forma de diagnóstico de infecção por Ehrlichia sp. (NEITZ e THOMAS, 1938; ELIAS, 1991; ALMOSNY, 1998).
Constitui em fator de relevância diagnóstica saber a ocorrência geográfica dessas espécies parasitas e seus vetores, para indicar meios diagnósticos concretos para diferenciá-las (HARRUS e WANER, 2011).
No Estado do RJ, na microrregião norte do estado, no município de Campos dos Goytacazes, Almeida et al. (2002) visualizaram esfregaços coletados de cães domiciliados, onde observaram 32,39% de esfregaços sugestivos para Ehrlichia spp. e em outro estudo realizado pelos mesmos autores, também no ano de 2002, amostras de cães apreendidos pelo CCZ do mesmo município, houve a porcentagem de 39,73% de mórulas sugestivas para Ehrlichia spp. Em estudo posterior, com novas amostras, Almeida et al. (2006) encontraram 7,78% de inclusões sugestivas de Ehrlichia spp. em cães domiciliados e em outro estudo, no mesmo ano, visualizaram 9,72% de mórulas em esfregaços sanguíneos de cães de rua. Miranda et al. (2006), coletaram amostras de sangue de cães atendidos em clínicas e hospitais veterinários do município de Campos dos Goytacazes e encontraram 14,82% de positividade para inclusões de Ehrlichia spp. nos esfregaços sanguíneos avaliados. Ainda no município supracitado, Albernaz et al. (2007) detectaram 13,89% de inclusões sugestivas para Ehrlichia spp. em pesquisa de hemoparasitos em sangue de cães naturalmente infectados. Na Região dos Lagos foi observada positividade em 1,8% para Ehrlichia sp. e 1% para A. platys (ACCETTA, 2008).
Na região metropolitana do RJ, em estudo com amostras obtidas de cães sem sintomatologia de doença, da área urbana de Niterói, 4,28% apresentaram
positividade para E. canis (MOREIRA e CASTRO, 2004). Em Maricá, amostras colhidas de cães que compareceram à campanha de vacinação, 23% das amostras foram positivas para E. canis e 2,6% para A. platys (XAVIER, 2011), e houve 1,7% de positividade quanto à presença de inclusões sugestivas de E. canis/ A. platys em sangue de cães atendidos em clínicas particulares nos municípios de Duque de Caxias, Maricá e Cachoeiras de Macacu (FERREIRA, 2012).
Na re i o do médio Paraí a, O’dwyer et al. (2001 encontraram preval ncia de 4,8% de infecção por E. canis.
No Estado do Espírito Santo, Moreira et al. (2004) encontraram 14,89% de positividade de mórulas sugestivas de Ehrlichia spp. em esfregaços de sangue de cães do município de Barra de São Francisco.
No Estado de MG, em Juiz de Fora, Soares et al. (2006) pesquisaram mórulas em esfregaços de sangue de cães domiciliados e encontraram 16% de positividade para E. canis. Em estudo em áreas rurais, Rodrigues et al. (2004) encontraram prevalência de 17,82% para E. canis nos esfregaços sanguíneos pesquisados. Rodrigues-Daemon et al. (2006) visualizaram esfregaços sanguíneos de cães suspeitos de possuir ehrlichiose, e encontraram 77,97% das amostras com presença de mórulas de E. canis. Em BH, capital do Estado de MG, Moreira et al. (2003) relatou que de 194 cães suspeitos de possuir hemoparasitose, 145 apresentaram-se positivos para algum tipo de parasito, e destes, houve 35,9% de positividade para Ehrlichia spp. Na área urbana de Uberlândia, localizada no mesmo estado supracitado, Santos et al. (2004) encontraram 14,16% de esfregaços sanguíneos de cães com inclusões sugestivas de Ehrlichia spp.
No Estado de SP, na região de São Carlos, foram estudados esfregaços de sangue de cães suspeitos de possuir hemoparasitos, dos quais 29% apresentaram esfregaços sanguíneos com mórulas de E. canis (PEREIRA et al., 2006). No hospital veterinário de Botucatu (SP) foi realizado estudo com 70 cães suspeitos de ehrlichiose canina, e destes, cinco (7,14%) apresentaram inclusões características de Ehrlichia sp. (UENO et al., 2009).
Na região nordeste, no município de Recife, Estado de Pernambuco (PE), Lima et al. (2006) detectaram 5,51% de positividade para mórulas de E. canis em cães atendidos no hospital veterinário da Universidade Federal Rural de Pernambuco. Na Bahia, 7% das amostras colhidas de cães das áreas urbanas de Ilhéus e Itabuna, apresentaram inclusões de E. canis (CARLOS et al., 2006). Na
capital da Bahia (Salvador) e região metropolitana, foram analisados 75 cães suspeitos de ehrlichiose. Apenas quatro (5,33%) amostras apresentaram mórulas observadas em esfregaços (MENESES et al., 2008).
Na região centro-oeste do Brasil, no hospital veterinário da Universidade Federal do Mato Grosso, Sousa et al. (2010) avaliaram 70 amostras de cães suspeitos de ehrlichiose e destas, 12 (17%) apresentaram mórulas sugestivas de
Ehrlichia sp.
Na região sul, no município de Porto Alegre, capital do Estado do Rio Grande do Sul, Olicheski (2003) coletou sangue de cães com sinais clínicos de doença e observou na pesquisa em lâmina, 18% de cães com mórulas sugestivas de Ehrlichia spp.
No Distrito Federal, Paludo et al. (2002) pesquisaram por inclusões sugestivas de Ehrlichia spp. em cães do Batalhão de Operações Especiais da Polícia Militar do Distrito Federal, onde apenas um animal (1,75%) apresentou-se positivo para mórula.
2.8.3. SOROLOGIA - IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI)
O teste de IFI pode ser indicado para pesquisa de soroprevalência da ehrlichiose em determinada região de estudo, para a identificação de áreas endêmicas, com o teste realizado em um grande número de cães sadios em uma ampla região geográfica (NEER et al., 2002) e pode ser realizado a partir da análise de uma única amostra de soro, quando o objetivo é apenas avaliar a exposição à
bactéria (Rikihisa, 1991).
A técnica de IFI além de constituir em ferramenta valiosa para o diagnóstico e triagem de ehrlichioses, é considerada técnica de padrão-ouro sorológico, indicando exposição a E. canis (HARRUS e WANER, 2011). Anticorpos da classe Imunoglobulina M (IgM) não são consideradas indicadoras fidedignas de exposição a E. canis devido a inconsistência do desenvolvimento de anticorpos dessa classe durante o curso da doença. No entanto, títulos de anticorpos da classe Imunoglobulina (IgG) maiores ou iguais a 1:40 são considerados positivos, revelando exposição a E. canis (RISTIC et al., 1972; HARRUS e WANER, 2011).
Em cães com infecção mais recente, pode não ter havido tempo hábil para soroconversão, portanto, esses animais podem apresentar resultado negativo na IFI (WANER et al., 2001; NEER et al., 2002). Neste caso, o diagnóstico deve ser baseado na associação das alterações hematológicas com os resultados da PCR (WEN et al., 1997). Sendo assim, na infecção aguda, são recomendados dois testes consecutivos de IFI para diagnóstico, e o aumento no título de anticorpos em torno de duas a quatro vezes, indica infecção ativa. Os anticorpos da classe IgG persistem por vários meses a anos após tratamento e eliminação da bactéria (HARRUS e WANER, 2011).
Testes sorológicos pareados podem indicar soroconversão dos cães ou ascensão dos títulos (HARRUS et al., 2002; NEER et al., 2002). A soroconversão ou a ascensão dos títulos de anticorpos anti-E. canis é considerada indicativa de infecção presente (PERRILLE e MATUS, 1991), assim como a queda do título de anticorpos em animais tratados é indicativa de eliminação da infecção (PERRILLE e MATUS, 1991; WANER et al., 2001). Sabe-se ainda que o tempo para o declínio dos níveis de anticorpos é diretamente proporcional ao título de anticorpos inicial. O teste padrão-ouro para se determinar a eliminação da infecção por E. canis nos cães ainda não foi estabelecido (NEER et al., 2002), porém a presença de sinais clínicos e alterações hematológicas associados a resultados positivos de IFI constitui no padrão diagnóstico mais fidedigno de E. canis e PCR (WANER et al., 2001; NEER et al., 2002).
A persistência de títulos de anticorpos positivos para E. canis pode indicar infecção não debelada, reinfecção, ou mesmo indicar uma infecção passada (WANER et al., 2001).
Na fase crônica, terminal da doença, os cães podem apresentar diminuição acentuada no título de anticorpos para E. canis, talvez por causa da resposta imunológica reduzida, aparentemente causada pela pancitopenia típica da fase final da doença (RISTIC et al., 1972).
French e Harvey (1983) e Waner et al. (2001) postularam que a IFI é altamente específica, não havendo reação cruzada entre E. canis e A. platys
Estudos foram realizados por diversos autores. Neer et al. (2002) postularam que um título menor que 1:80 (< 1:80) deve ser considerado suspeito, e o exame deve ser repetido dentro de duas a três semanas, assim como os exames negativos e cujos sinais e sintomas sejam condizentes com a ehrlichiose, pois o teste
sorológico pode apresentar títulos muito baixos, ou até mesmo negativos, ou no início da fase aguda da infecção. Bélanger et al. (2002) consideraram positivos animais que possuíam sinais condizentes com ehrlichiose e título de anticorpos contra E. canis maiores ou i uais a 1:40 (≥ 1:40 . Waner et al. (2001 relataram que um título maior ou i ual a 1:64 (≥ 1:64 deve ser interpretado como suspeita de exposição prévia ao agente etiológico, e que a presença de sinais clínicos sugestivos de ehrlichiose acrescidos de um título situado entre 1:64 e 1:128 indicam uma provável infecção, e que o diagnóstico definitivo de ehrlichiose pode ser realizado através de sinais clínicos e hematológicos que sustentem a suspeita acrescidos de um título de I G maior ou i ual a 1:256 (≥ 1:256 .
No norte do Brasil, em Monte Negro, no Estado de Rondônia (na Amazônia Ocidental Brasileira), Aguiar et al. (2007) avaliaram a prevalência de E. canis em 314 cães. Destes, 153 pertenciam à área urbana e 161 à área rural. Das amostras obtidas da área urbana 37,9% (58/153) apresentaram anticorpos anti-E. canis e dos cães coletados na área rural 24,8% (40/161) apresentaram positividade no teste.
No nordeste, em estudo realizado em 472 cães da cidade de Salvador (BA) observou-se 168 animais positivos, com uma prevalência de anticorpos anti-E. canis em 35,6% deles (SOUZA et al., 2010). Na Paraíba a soroprevalência encontrada por Azevedo et al. (2011) foi de 72,5%, de 109 amostras testadas para anticorpos anti-E.
canis.
Na região sudeste, em trabalho desenvolvido por Moreira (2011) na região do médio Paraíba, Estado do RJ, o percentual de cães positivos no teste de IFI para E.
canis foi de 23,8% (45/189).
Na região centro-oeste do Brasil, no Estado de MT, em Cuiabá foi observada a prevalência de anticorpos anti-E. canis em 42,5% (108/254) dos cães estudados. Os títulos de anticorpos variaram entre 1:40 a 1:2.560 (SILVA et al., 2010).
Melo et al. (2011) em estudo no Estado do MT, na região do Pantanal, estudaram 227 cães e verificaram uma soroprevalência de 70,9% de anticorpos
anti-Ehrlichia spp. nos animais da região. Os títulos variaram de 40 a 81.920 em cães
residentes na área urbana e de 40 a 327.680 em cães da área rural.
No sul do Brasil, apenas 4,8% (19/389) dos cães testados apesentaram anticorpos anti-E. canis (SAITO et al., 2008).
Altos títulos de anticorpos foram relatados por Manoel (2010) em SP. O estudo foi realizado em cães sabidamente infectados por E. canis e a média do título de
todos os animais infectados foi de 26.400. O referido autor afirmou que a grande maioria dos cães infectados por E. canis estudados em seu trabalho, apresentavam títulos altos de anticorpos, e sugeriu a possibilidade de inferir que os títulos maiores ou iguais a 2.560 são altamente sugestivos de infecção atual ou persistente, se o
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. ÁREA DE ESTUDO
O município de Bom Jesus do Itabapoana localiza-se a uma latitude -21º 0 ’ 02’’ e lon itude -41º 40’47’’, com uma área de apro imadamente 600 km² (APOLO 11). Situado na mesorregião noroeste do Estado do RJ, conforme ilustrado na Figura 1 possui clima tropical com temperatura média de 27,6ºC e está a uma altitude de 88 metros. Em 2010 a população humana foi estimada em 35.384 habitantes (IBGE) e a população estimada de cães foi de 4.426, no Município estudado. O cálculo da população canina foi realizado com informações da Assessoria de Zoonoses da Secretaria de Estado de Saúde do RJ, baseado em orientações da Secretaria de Vigilância em Saúde, do Ministério da Saúde – SVS/MS. O município de Bom Jesus do Itabapoana possui seis distritos: 1o distrito Bom Jesus do Itabapoana – sede da cidade, 2o distrito: Calheiros, 3o distrito: Rosal, 4o distrito: Carabuçu, 5o distrito: Pirapetinga, 6o distrito: Serrinha (Prefeitura Municipal de Bom Jesus do Itabapoana). Amostras foram colhidas nos distritos de Bom Jesus do Itabapoana, Calheiros e Pirapetinga.
3.2. ANIMAIS
Foram colhidas amostras de sangue de 84 cães do município de Bom Jesus do Itabapoana, localizado na região noroeste do Estado do RJ. Estes cães foram provenientes de pet shop, clínicas e de residências localizadas no Município acima citado, durante o período de setembro a dezembro de 2010. As amostras de sangue foram colhidas em setembro (Grupo A) e em dezembro (Grupo B) sem nenhum tipo de requisito pré-estabelecido, como raça, idade, sexo ou apresentação de sinais clínicos específicos.
O projeto de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais, sob o número 62/2011 (anexo 1). Os cães foram incluídos no estudo após assinatura pelos proprietários, do Termo de Consentimento para a colheita de sangue (anexo 2).
Cada cão teve preenchida uma ficha clínica, com dados diversos, como: história pregressa, observação da presença ou ausência de ectoparasitas, sinais
Figura 1. Regiões fisiográficas do Estado do Rio de Janeiro. O município de Bom
Jesus do Itabapoana, onde foram colhidas amostras, está localizado na região noroeste, marcada com a cor bege (Fonte:ptb.org.br).
clínicos e outros dados (anexo 3).
3.3. COLHEITA DAS AMOSTRAS E GRUPOS DE ESTUDO
Após a devida contenção do animal, foi realizada a antissepsia do local de colheita de sangue. As colheitas foram provenientes da veia cefálica ou da safena dependendo do tamanho e o temperamento do animal, utilizando-se seringas de 5 mL acopladas a agulhas 25 x 7 mm (BD®, São Paulo, Brasil) estéreis. Parte do sangue total foi acondicionada em tubos contendo o anticoagulante ácido etileno diamino tetracético (EDTA) a 10% para a realização do hemograma completo, e parte colocada em tubos sem EDTA para obtenção de soro, para realizar a sorologia. As amostras foram processadas nas dependências do Laboratório de Patologia Clínica Veterinária, da Faculdade de Veterinária da Universidade Federal Fluminense (UFF). No momento da colheita eram confeccionados esfregaços de sangue total e de sangue periférico. Até o processamento, as amostras dos tubos com e sem EDTA foram mantidas sob refrigeração (4ºC).
As amostras de sangue colhidas foram separadas por grupos de estudo, sendo considerados dois grupos: A e B. As amostras do grupo A foram colhidas na primavera, de c es ue tin am acesso ao “pet s op” e ou ao Médico eterinário e as do grupo B no verão, de cães que praticamente só compareciam à Clínica Veterinária para vacinação, e ainda havia casos de cães que nunca haviam ido ao Médico Veterinário, somente possuindo a prevenção por vacinação contra raiva, oferecida pela Prefeitura do Município/ Governo Federal.
3.4. CONFECÇÃO DE ESFREGAÇOS SANGUÍNEOS
Foram confeccionados, esfregaços de sangue periférico corados com Panótico Rápido (Laborclin®, Pinhais, Brasil), para pesquisa de hemoparasitos e esfregaços de sangue total, corados por métodos de Romanowsky (JAIN, 1993), para contagem diferencial de células.
3.5. SOROLOGIA – IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI)
As amostras de soro dos cães do município de Bom Jesus do Itabapoana foram testadas pelo método de IFI, buscando a presença de anticorpos IgG anti-E. canis pelo kit de E. canis IFA (Imunodot®, Jaboticabal, Brasil), usando como controle positivo uma amostra sabidamente positiva e como controle negativo soro da PANBIO universal. O teste de IFI foi realizado em 83 amostras (n=84), pois em um animal a quantidade de soro obtida não foi suficiente para realizar a análise.
A detecção de anticorpos da classe IgG anti-E. canis foi realizada pelo teste de IFI a partir da análise de uma única diluição, uma vez que o objetivo do trabalho foi demonstrar a soropositividade dos cães a E. canis. O ponto de corte para considerar a amostra reagente foi de 1:64 (Rikihisa, 1991). A análise sorológica das amostras de soro dos cães foi realizada no Laboratório de Pesquisa Clínica e Molecular Marcílio Dias do Nascimento da Faculdade de Veterinária / UFF, seguindo protocolos previamente estabelecidos e validados.
Após diluição de 1:64, foram depositados 10µL em cada poço da lâmina contendo os antígenos. As lâminas foram incubadas por 30 minutos em estufa a 37°C, em câmara úmida. Posteriormente, foram lavadas cinco vezes em PBS diluído (pH 7,4 +- 0,2) e deixadas por cinco minutos imersas na solução (em cuba de vidro). As lâminas foram secas, e em seguida adicionou-se 10 µL de conjugado (anti-IgG de gato e anti-IgG de cão, marcados pelo isoticianato de fluoresceína) em cada poço das lâminas. As lâminas foram novamente incubadas por 30 minutos em estufa a 37°C, em câmara úmida e lavadas cinco vezes em PBS diluído (pH 7,4 +- 0,2) e deixadas imersas por cinco minutos em cuba de vidro. Foram secas em temperatura ambiente e posteriormente montadas com glicerina tamponada, entre lâmina e lamínula, e lidas em microscópio equipado com luz fluorescente (Olympus BX 60®) usando objetiva de 40X.
3.6. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para a análise estatística foram utilizados métodos descritivos e testes para associação. A associação entre variáveis qualitativas foi realizada através dos testes qui-quadrado e exato de Fisher. A significância da associação entre uma variável
quantitativa e uma variável qualitativa foi feita pelo teste t de Student (software pacote R; r-project.org).
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. ANÁLISE DOS ESFREGAÇOS SANGUÍNEOS
Dentre as 84 amostras de sangue de cães do município de Bom Jesus do Itabapoana, analisadas por microscopia óptica em aumento de 1000 vezes, 29 esfregaços de sangue apresentaram inclusões em plaquetas sugestivas de mórulas da família Anaplasmataceae, conforme demonstrado na tabela 1. Em nenhum dos animais observou-se mórulas em leucócitos. A ausência de inclusões em leucócitos, entretanto, não elimina a hipótese de infecção por E. canis, uma vez que este é um teste pouco sensível (ALMOSNY, 1998), notadamente na fase crônica da ehrlichiose.
Tabela 1. Resultado da pesquisa de mórulas da família Anaplasmataceae em esfregaços
sanguíneos de cães do município de Bom Jesus do Itabapoana – RJ.
Mórulas Número de amostras Percentual
Positivo 29 35%
Negativo 55 65%
Total 84 100%
A presença de mórulas de E. canis em plaquetas foi sugerida por Almosny (1998), em estudo com infecção experimental. Também por Mylonakis et al. (2003) e Dagnone et al. (2009). No presente estudo, todas as amostras apresentaram inclusões em plaquetas, e não foram observadas inclusões em leucócitos. A análise morfológica, portanto, não é um teste sensível para o diagnóstico de E. canis e animais positivos podem, frequentemente, não apresentar mórulas (ALMOSNY, 1998; BREITSCHWERDT, 2000; ALMOSNY e MASSARD, 2002; FERREIRA et al., 2007).
A presença de inclusões em plaquetas também pode sugerir infecção por A.
platys, nas quais diferentes estádios de desenvolvimento do parasito podem ser
observadas, notadamente na fase aguda da infecção (INOKUMA et al., 2002). Há relatos de cães com mórulas em plaquetas que apresentaram-se positivos para A.
platys, e negativos para E. canis em sorologia, mas o autor não descartou
completamente a possibilidade de infecção conjunta (WANER, 1993). O diagnóstico de A. platys em esfregaço sanguíneo pode ser difícil, pois a parasitemia possui caráter cíclico (INOKUMA et al., 2002) e o diagnóstico definitivo pode ser realizado por meio da PCR, que possui alta sensibilidade e especificidade comparada a pesquisa morfológica intraplaquetária em esfregaço sanguíneo (BREITSCHWERDT, 2000; FERREIRA et al., 2007) ou por meio da IFI, que constitui em método diagnóstico importante, e possui alta especificidade, não havendo reação cruzada entre A. platys e E. canis (FRENCH e HARVEY, 1983; WANER et al., 2001; HARRUS e WANER, 2011).
Apesar do achado de mórulas ser difícil e de frequentemente ocorrer somente na fase aguda da infecção, também requer muito tempo e paciência do profissional que estiver avaliando o esfregaço sanguíneo, e por isso apresenta baixa sensibilidade e frequentes falsos negativos (RIKIHISA, 1991; NEER, 1998). Além disso, poucas células circulantes contêm mórulas, que são achadas em pequeno número (WOODY e HOSKINS, 1991; SUKSAWAT et al., 2000). Harrus et al. (1997a), afirmaram que testes de IFI e outros (como PCR, cultivo e Immunoblot) precisam de pelo menos 14 a 21 dias para apresentar-se positivos. Desta forma, o diagnóstico da infecção pela observação de mórulas e corpúsculos iniciais é de grande valia.
A observação de mórulas em esfregaços de sangue periférico foi efetuada de acordo com Neitz e Thomas (1938), que indicavam a utilização apenas da primeira gota de sangue para a confecção do esfregaço, pois esta corresponde verdadeiramente ao sangue periférico. As gotas seguintes constituem sangue circulante. Em estudo experimental, Almosny (1998) observou que o número de mórulas foi acentuadamente maior nos esfregaços efetuados com a primeira gota de sangue. Neitz e Thomas (1938), postularam que as mórulas podem ser observadas a partir do 3° ao 10° dias após o início da fase febril. Já Almosny (1998) observou mórulas de E. canis em plaquetas a partir do 12° dia após a inoculação, e em
