Camila Bonomo
Efeito da inibição da NADPH oxidase sobre o
estresse oxidativo e o fenótipo muscular
esquelético de ratos com insuficiência
cardíaca crônica induzida por estenose aórtica
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação “Fisiopatologia em Clínica Médica” da Faculdade de Medicina de Botucatu, Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho para obtenção do título de Doutor em Ciências da Saúde.
Orientadora: Profa. Adj.
Marina Politi Okoshi
Coorientadora: Profa. Adj.
Paula Felippe Martinez
Botucatu
2015
Dedico este trabalho ao meu
marido Leonardo e à minha
filha Melissa.
Agradecimento especial
À minha orientadora Prof
a.
Adjunta Dra. Marina Politi
Okoshi
, pela competência na orientação, pela paciência em todos
os momentos, por seus valiosos ensinamentos e por contribuir de
forma tão decisiva para o meu crescimento profissional e pessoal.
À fundação de Amparo à Pesquisa do Estado
de São Paulo
(FAPESP processo n
o2011/22589-0) pelo
Aos meus pais, Vicente e Rosângela, meus exemplos, por serem inspiração e exemplo em minha vida, pelo apoio em minhas decisões e por estarem sempre ao meu lado em todos os momentos.
Ao meu irmão Raphael, e a minha cunhada Larissa, pelo apoio em todos os momentos e por deixar minha vida mais alegre e completa.
Ao meu marido Leonardo, por ser meu melhor amigo, por me dar os maiores presentes que eu poderia ter, Melissa e agora, Felipe, nossos filhos, por compartilhar comigo as pequenas conquistas do dia a dia e me aconselhar nos momentos difíceis. Obrigada por todo cuidado, amor e carinho. Te amo!
À minha amada filha Melissa, que deu um sentido maior à minha vida, por tornar meus dias mais felizes, e por me mostrar a cada dia um amor enorme, além de ter me transformado depois da sua chegada. E ao seu irmão, Felipe, que está chegando, e que mesmo antes de nascer já é muito amado e ansiosamente aguardado.
Às minhas avós Dulce e Benedita, minha tia Sueli e ao João Pedro e Andréa, meus primos, por estarem sempre presentes na minha vida deixando-a mais alegre e divertida.
À Profa Adj. Paula Felippe Martinez, pela coorientação, pela amizade, por ser tão paciente e acessível, sempre esclarecendo minhas dúvidas e me ensinando muito, pela importante participação neste trabalho e na minha formação desde que comecei a pós graduação.
Ao Prof. Adjunto Dr. Katashi Okoshi, pela realização da avaliação ecocardiográfica de todos os animais. Agradeço pela disponibilidade e pela gentileza, sempre disposto a ensinar.
À Profa. Dra. Ana Angélica Henrique Fernandes, pela análise das enzimas antioxidantes, realizada no Laboratório de Pesquisa do Departamento de Química e Bioquímica do Instituto de Biociências de Botucatu, UNESP.
Ao Prof. Adj. Dr. Francisco Rafael Martins Laurindo, do Departamento de Cardio-Pneumologia, da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, por nos receber em seu laboratório para análise da atividade da NADPH oxidase e geração total de espécies reativas de oxigênio.
Aos pesquisadores Denise e João e aos técnicos do laboratório Maria Bertoline e Vitor, do Departamento de Cardio-Pneumologia, da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, pelo grande auxílio, sempre dispostos e solícitos a esclerecer as dúvidas, ajudando em todos os momentos nas análises realizadas no laboratório de Biologia Vascular.
Às professoras Dra. Bertha Furlan Polegato e Dra. Silméia Garcia Zanati Bazan pelas valiosas sugestões proferidas no exame de qualificação, contribuindo para o aperfeiçoamento deste trabalho.
Aos queridos amigos, Aline, Mariana, Daniele, Luana, Marcelo, Ricardo, Priscila, Paula e Silvio, que há 8 anos divido os meus dias de trabalho, e de lazer. Amigos que levarei para toda a vida. Aprendi muito com vocês e sou muito grata por tudo. Vocês foram imprescindíveis não só para a realização deste trabalho, mas por me acolherem em suas vidas. Muito obrigada.
Aos queridos amigos, Andrea, Bruna, Camila Rosa, Daniele T., David, Fernanda, Maria Tereza, Sandro, Regiane, Paula Grippa, pela amizade e pelos bons momentos no laboratório e fora dele.
Ao colega Dijon Campos, pela cirurgia para indução de estenose aórtica nos animais e pela amizade.
Aos alunos de iniciação científica, especialmente Vinícius e Karla, pelo grande auxílio na realização deste trabalho.
A todos os colegas e funcionários da Unipex, José Carlos Georgete, Ângelo, Camila Côrrea, Cristina, Diego, Danilo, De Lalla, Elizete, Elenize, Eduardo, Fátima, Florian, Igor, Lucas, Mário Bruno, Maria Regina, Mara, Marta, Paulinho, Regina, Renata, Rogério, Sueli Clara, Vítor, e tantos outros, pela colaboração para realização deste trabalho, convivência e bons momentos.
Aos funcionários do Departamento de Clínica Médica, Ana Maria Mengue, Alexandre Luis Loureiro, Bruno José Faiolli, Elisângela Aparecida da Silva, Laura Andrade Câmara, Mário Augusto Dallaqua, Renato Borges Pereira, pela dedicação e simpatia, sempre dispostos a ajudar todas as vezes que precisei.
Aos Funcionários da Seção de Pós Graduação, pela disponibilidade e eficiência para resolver problemas.
Aos funcionários da biblioteca, pela disponibilidade e ajuda.
A Todas as Pessoas que fizeram parte da minha vida, contribuindo para minha formação profissional e pessoal.
Sumário ii
Resumo ... 1
Summary ... 4
Introdução ... 7
Objetivos ... 13
Material e Métodos ... 15
Resultados ... 26
Discussão ... 41
Referências Bibliográficas ... 49
Lista de Tabelas iv
Tabela 1. Frequência de sinais clínico e anatomopatológicos de insuficiência
cardíaca nos grupos de ratos com estenose aórtica
30
Tabela 2. Variáveis anatômicas
30
Tabela 3. Variáveis estruturais cardíacas antes do tratamento com apocinina
31
Tabela 4. Variáveis funcionais do ventrículo esquerdo antes do tratamento
com apocinina
32
Tabela 5. Avaliação ecocardiográfica por Doppler tissular antes do
tratamento com apocinina
32
Tabela 6. Variáveis estruturais cardíacas ao final do período experimental
33
Tabela 7. Variáveis funcionais do ventrículo esquerdo ao final do período
experimental
33
Tabela 8. Avaliação ecocardiográfica por Doppler tissular ao final do período
Lista de Figuras vi
Figura 1. Porcentagem da isoforma IIa das cadeias pesadas de miosina
(MyHC) no músculo sóleo. Análise por eletroforese em gel de
poliacrilamida e duodecilsulfato de sódio
35
Figura 2. Avaliação morfométrica do músculo sóleo corados com
hematoxilina-eosina
36
Figura 3. Avaliação da concentração sérica de malonaldeído e
concentração de hidroperóxido de lipídeo no músculo sóleo
37
Figura 4. Avaliação da geração total de espécies reativas de oxigênio
(EROs) no músculo sóleo por produtos da oxidação derivados do
DHE
38
Figura 5. Avaliação da atividade da NADPH oxidase no músculo sóleo por
produtos da oxidação derivados do DHE
39
Figura 6. Avaliação da atividade das enzimas antioxidantes catalase (CAT),
superóxido dismutase (SOD) e glutationa peroxidase (GSH-Px) no
Lista de Abreviaturas viii
A’ média: pico da velocidade de deslocamento diastólico tardio do anel mitral (Média
aritmética das velocidades das paredes lateral e septal)
AE: diâmetro do átrio esquerdo
ANOVA: análise de variância
AO: diâmetro da aorta
APO: apocinina
Cat: catalase
DDVE: diâmetro diastólico do ventrículo esquerdo
DHE: dihidroetidina, hidroetidina, dihidroetídio
DNA: ácido desoxirribonucleico
DSVE: diâmetro sistólico do ventrículo esquerdo
DTPA: ácido dietileno triamino pentacético
E/A: razão entre as ondas E e A do fluxo diastólico transmitral
E/E’: razão entre as ondas E e E’
EDPP: espessura diastólica da parede posterior do ventrículo esquerdo
EDSIV: espessura diastólica do septo interventricular
EDTA: ácido etilenodiamino tetra-acético
E/DHE: razão etídio/DHE consumido
EOH: 2-hidroxietídio
EOH/DHE: razão 2-hidroxietídio/DHE consumido
EROs: espécies reativas de oxigênio
FC: frequência cardiaca
FE: fração de ejeção do ventrículo esquerdo
GSH: glutationa reduzida
GSSG: glutationa oxidada
GSH-Px: glutationa peroxidase
Lista de Abreviaturas ix
H
2O
2: peróxido de hidrogênio
HPLC: cromatografia líquida de alta eficiência
LOOH: hidroperóxido de lipídeo
IMVE: índice de massa do ventrículo esquerdo
MDA: malonaldeído
MVE: massa do ventrículo esquerdo
MyHC: cadeia pesada de miosina
mRNA: ácido ribonucleico mensageiro
NADPH: nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato
O
2: oxigênio
Onda A: pico de velocidade de enchimento diastólico tardio
Onda E: pico de velocidade do enchimento diastólico inicial
PC: peso corporal
Rpm: rotações por minuto
S’ média: pico da velocidade de deslocamento sistólico do anel mitral (média
aritmética das velocidades das paredes lateral e septal)
SOD: superóxido dismutase
TDE: tempo de desaceleração da onda E
TRIV: tempo de relaxamento isovolumétrico
TRIVn: tempo de relaxamento isovolumétrico normalizado pela frequência cardíaca
VD: ventrículo direito
VE: ventrículo esquerdo
VEPP: velocidade de encurtamento da parede posterior do ventrículo esquerdo
% A endo: porcentagem de encurtamento endocárdico do ventrículo esquerdo
% A meso: porcentagem de encurtamento mesocárdico do ventrículo esquerdo
Resumo 2
A insuficiência cardíaca caracteriza-se pela diminuição da capacidade física com exacerbação precoce de fadiga e dispneia. Embora alterações intrínsecas da musculatura esquelética têm sido responsabilizadas por esses sintomas, os mecanismos envolvidos nas anormalidades musculares ainda não estão completamente esclarecidos. O estresse oxidativo miocárdico e sistêmico está aumentado na insuficiência cardíaca. Entretanto, há pouca informação sobre seu papel nas alterações da musculatura esquelética e sobre as fontes de geração de espécies reativas de oxigênio (EROs). Apesar do complexo NADPH oxidase constituir importante fonte geradora de EROs, poucos estudos avaliaram seu comportamento em músculos esqueléticos durante a insuficiência cardíaca. No miocárdio, a apocinina pode inibir o complexo NADPH oxidase e reduzir o estresse oxidativo durante agressão cardíaca. Objetivo: Avaliar os efeitos do tratamento com apocinina sobre alterações cardíacas e anormalidades fenotípicas e do estresse oxidativo do músculo sóleo de ratos com insuficiência cardíaca induzida por estenose aórtica supravalvar. Métodos: Vinte semanas após a indução da estenose aórtica, ratos Wistar foram alocados nos grupos estenose aórtica (EAo), EAo tratado com apocinina (EAo-apo) e controle (Sham). A apocinina foi administrada por oito semanas na água de beber (16 mg/kg/dia). Ecocardiograma transtorácico foi realizado antes e após o tratamento com apocinina. A atividade das enzimas antioxidantes superóxido dismutase, glutationa peroxidase e catalase e a concentração de hidroperóxido de lipídeo foram avaliadas por espectrofotometria no músculo sóleo. A concentração sérica de malonaldeído, a atividade muscular da NADPH oxidase e a geração total de EROs no músculo sóleo foram analisadas por HPLC. No sóleo, a composição das cadeias pesadas de miosina foi avaliada por eletroforese e a área seccional das fibras foi mensurada em lâminas histológicas. Análise estatística: análise de variância de uma via complementada pelo teste de Bonferroni ou Mann-Whitney. Resultados: Antes do tratamento, os grupos EAo e EAo-apo apresentaram hipertrofia concêntrica com disfunção sistólica leve e disfunção diastólica avançada. Após o tratamento, os grupos com estenose aórtica mantiveram as alterações estruturais e funcionais observadas antes do tratamento, exceto pela relação diâmetro diastólico do ventrículo esquerdo/peso corporal, que foi maior no EAo que no Sham. No EAo-apo, esta relação apresentou valores
Resumo 3
intermediários entre os dos grupos Sham e EAo, não diferindo significantemente de ambos. Ao eco-Doppler tissular, o grupo EAo apresentou redução das ondas S lateral, septal e média em relação ao Sham. No EAo-apo, essas variáveis não diferiram significantemente dos valores dos grupos Sham e EAo. O grupo EAo-apo não apresentou diferenças estatísticas em relação ao EAo. A concentração sérica de malonaldeído não diferiu entre os grupos. No sóleo, não identificamos diferenças significantes na área seccional das fibras, na composição das cadeias pesadas de miosina, na atividade da NAPDH oxidase e na geração total de EROs entre os grupos. A concentração muscular de hidroperóxido de lipídeo foi maior no grupo EAo-apo que no EAo. A atividade da catalase foi menor no grupo EAo que nos grupos Sham e EAo-apo e a atividade da superóxido dismutase foi menor no EAo que no Sham. A atividade da glutationa peroxidase não diferiu entre os grupos. Conclusão: O tratamento com apocinina atenua o grau de dilatação ventricular e disfunção sistólica induzida por sobrecarga pressórica crônica e persistente em ratos. A miopatia esquelética do sóleo é caracterizada por redução da atividade das enzimas antioxidantes catalase e superóxido dismutase. Apesar de melhorar discretamente a função cardíaca, o tratamento com apocinina aumenta o estresse oxidativo do músculo esquelético.
Palavras chave: apocinina, estenose aórtica, estresse oxidativo, insuficiência cardíaca, músculo esquelético.
Summary 5
Heart failure is characterized by a decreased functional capacity with early fatigue and dyspnea. Although intrinsic skeletal muscle changes may be at least partially responsible for these symptoms, mechanisms involved in muscle abnormalities are not completely clear. Myocardial and systemic oxidative stress is increased during heart failure. However, there is scarce information on the sources of oxygen reactive species (ROS) and on the role of oxidative stress in inducing skeletal muscle changes. NADPH oxidase complex is an important source of ROS; only a few studies have evaluated its activity in skeletal muscles during heart failure. In myocardial, apocynin can inhibit NADPH oxidase activity and reduce oxidative stress during cardiac injury. Purpose: In this study we evaluated the effects of the antioxidant apocynin on cardiac alterations and soleus muscle oxidative stress and phenotypic characteristics in rats with supravalvar aortic stenosis-induced heart failure. Methods: Twenty weeks after inducing aortic stenosis, Wistar rats were assigned into three groups: aortic stenosis (AS), AS treated with apocynin (AS-apo, 16 mg/kg/day dissolved in drinking water for eight weeks), and control (Sham). Transthoracic echocardiogram was performed before and after apocynin treatment. Activity of the antioxidant enzymes superoxide dismutase, gluthatione peroxidase, and catalase, and lipid hydroperoxide concentration were assessed by spectrophotometry in the soleus muscle. Serum concentration of malondialdehyde and soleus muscle NADPH oxidase activity and total ROS generation were analyzed by HPLC. Soleus myosin heavy chain composition was evaluated by electrophoresis and fiber cross-sectional areas were measured in hematoxylin and eosin-stained histological sections. Statistical analysis: one-way analysis of variance complemented by Bonferroni or Mann-Whitney test. Results: Before treatment, AS and AS-apo groups presented concentric hypertrophy with mild systolic dysfunction and severe diastolic dysfunction. After treatment, structural and functional changes observed before treatment were preserved in aortic stenosis groups, except by the left ventricular diastolic diameter-to-body weight ratio, which was higher in AS than Sham. In the AS-apo, this ratio had intermediate values between those in AS and Sham and did not differ significantly from each other. In tissue Doppler imaging, AS presented reduced septal, lateral, and medium mitral annular peak systolic velocity (S’) waves
Summary 6
than Sham. In AS-apo, these parameters did not differ significantly from both AS and Sham groups. Echocardiographic variables did not differ between AS and AS-apo groups. Malondialdehyde serum concentration did not differ between groups. In soleus muscle, there were no differences in fiber cross-sectional areas, myosin heavy chain composition, NAPDH oxidase activity, and total ROS generation between groups. Muscle concentration of lipid hydroperoxide was increased in AS-apo than AS. Activity of catalase was lower in AS than Sham and AS-AS-apo and superoxide dismutase activity was lower in AS than Sham. Gluthatione peroxidase activity did not differ between groups. Conclusion: Apocynin treatment attenuates left ventricular dilation and systolic dysfunction induced by chronic and persistent pressure overload in rats. Skeletal muscle myopathy is characterized by decreased activity of the antioxidant enzymes catalase and superoxide dismutase. Despite lightly improving cardiac function, apocynin increases soleus muscle oxidative stress.
Introdução 8
A insuficiência cardíaca crônica caracteriza-se por redução da tolerância aos exercícios físicos e atividades de vida diária em razão da ocorrência precoce de fadiga e dispneia 1, 2. Embora os mecanismos responsáveis por esses
sintomas venham sendo estudados nas últimas décadas, sua fisiopatogenia ainda não está completamente esclarecida 3. Inicialmente, considerava-se que a
capacidade reduzida para exercícios e a ocorrência prematura de sintomas fossem causadas por diminuição da capacidade funcional do coração com consequente congestão pulmonar e redução da perfusão e oxigenação tecidual. Posteriormente, foi observado que há fraca associação entre variáveis hemodinâmicas ou de função ventricular em repouso e tolerância ao exercício 4-6. Como não foi confirmada a
suposição inicial que a capacidade para exercícios fosse diretamente relacionada ao grau de disfunção ventricular, foi levantada a hipótese que alterações primárias na musculatura esquelética periférica pudessem ter papel na tolerância reduzida aos exercícios físicos 7.
De fato, a partir de 1990, diversas anormalidades passaram a ser descritas em músculos esqueléticos durante a insuficiência cardíaca 8-12. O conjunto
das alterações intrínsecas da musculatura esquelética que ocorrem em doentes com insuficiência cardíaca crônica foi denominado miopatia associada à insuficiência cardíaca. Atrofia muscular foi detectada em 68% dos pacientes com insuficiência cardíaca crônica em tratamento ambulatorial 13, principalmente em músculos dos
membros inferiores 14. Em estudos experimentais, foram descritos atrofia, fibrose
e redução da densidade capilar em músculos de ratos com insuficiência cardíaca 10, 15, 16. Além das alterações morfológicas, foram descritas anormalidades metabólicas,
enzimáticas e bioquímicas na insuficiência cardíaca. Diminuição da atividade de enzimas oxidativas como citrato sintase, 3-hidroxiacil-CoA-desidrogenase e citocromo-c oxidase foi observada na musculatura esquelética periférica tanto de animais 17-21 como de pacientes com insuficiência cardíaca 22, 23. Alterações no
padrão das fibras musculares esqueléticas, com aumento das fibras tipo II, rápidas, e redução das fibras tipo I, lentas, têm sido frequentemente encontradas na insuficiência cardíaca 24. Em estudo prévio, verificamos que ratos com estenose
aórtica apresentam alteração da composição das cadeias pesadas de miosina do músculo sóleo, com diminuição das fibras do tipo I e das cadeias pesadas de miosina
Introdução 9
(MyHC) I e aumento das fibras do tipo IIa e MyHC IIa 25. Interessantemente, esta
alteração foi observada tanto na fase de hipertrofia ventricular compensada, como na fase de insuficiência cardíaca estabelecida, o que sugere que as modificações da musculatura esquelética possam ser decorrentes não somente da piora hemodinâmica característica da insuficiência cardíaca, mas também de anormalidades bioquímicas e/ou neuro-hormonais associadas ao quadro de injúria do coração.
Os fatores responsáveis pelas alterações da musculatura esquelética na insuficiência cardíaca ainda não estão completamente esclarecidos. Também não são conhecidos os mecanismos moleculares e as vias sinalizadoras que controlam as alterações dos músculos esqueléticos durante a insuficiência cardíaca.
Há substancial evidência que o estresse oxidativo está aumentado na insuficiência cardíaca, tanto no miocárdio como em nível sistêmico 26-28.
Adicionalmente, está bem documentado que aumento do estresse oxidativo desempenha papel importante em diversas alterações do músculo cardíaco como hipertrofia, apoptose, fibrose e disfunção mitocondrial 29-32. Entretanto, o papel do
estresse oxidativo nas alterações da musculatura esquelética associadas à insuficiência cardíaca ainda não foi completamente esclarecido.
O estresse oxidativo ocorre por desequilíbrio entre os sistemas oxidantes e antioxidantes, podendo ser causado por redução da atividade de enzimas antioxidantes ou por aumento na geração de espécies reativas de oxigênio (EROS) 33. As EROs são definidas como moléculas derivadas do oxigênio com
instabilidade característica e reatividade química. Quando produzidas em quantidade excessiva, causam danos celulares em proteínas, lipídeos e DNA, levando à disfunção de órgãos e consequente morte celular mediada por apoptose ou necrose 34.
Aumento do estresse oxidativo está envolvido em alterações da musculatura esquelética em situações como envelhecimento 35, diabetes mellitus
tipo 2 36, tabagismo, doenças pulmonares como asma e doença pulmonar obstrutiva
crônica 37 e após exercício físico intenso e prolongado 38.
Em pacientes com insuficiência cardíaca, verificou-se que alterações no tipo de fibra muscular esquelética estavam acompanhadas por anormalidades
Introdução 10
de enzimas antioxidantes 22. Em biopsias do músculo vasto lateral de pacientes com
insuficiência cardíaca crônica, foram verificados aumento da nitrotirosina e lipoperoxidação com redução dos níveis de mRNA e da atividade de enzimas antioxidantes glutationa peroxidase, superóxido dismutase e catalase 31. Em nosso
laboratório, observamos que ratos com insuficiência cardíaca induzida por infarto do miocárdio apresentam aumento da concentração sérica de malonaldeído e redução da atividade das enzimas antioxidantes glutationa peroxidase e superóxido dismutase no músculo sóleo, caracterizando aumento do estresse oxidativo local e sistêmico 15. Em camundongos com insuficiência cardíaca induzida por infarto do
miocárdio, foi observado aumento da geração de EROS e da lipoperoxidação mediada por EROs nos músculos sóleo e gastrocnêmio 32. Em camundongos com
insuficiência cardíaca, foi observado que aumento da lipoperoxidação lipídica está associado a atrofia do músculo plantar 39.
Embora o aumento do estresse oxidativo no músculo esquelético esteja bem caracterizado durante a insuficiência cardíaca, as fontes de geração de EROs ainda não estão completamente esclarecidas.
O complexo NADPH oxidase (NOX), presente em músculos cardíacos e esqueléticos, constitui importante fonte geradora de EROs 40, 41. A NADPH oxidase
foi originalmente identificada e caracterizada em fagócitos onde, em condições fisiológicas, exerce função essencial de defesa. Entretanto, quando se torna ativada durante a contração muscular ou por estímulos infecciosos e pró-inflamatórios, a NADPH oxidase pode gerar grandes quantidades do ânion radical superóxido, que pode ser convertido em peróxido de hidrogênio (H2O2) pela enzima antioxidante
superóxido dismutase 42, 43. Sete homólogos da subunidade NOX foram descritos e
identificados em praticamente todos os tecidos. A NADPH oxidase possui seis subunidades catalíticas: dois elementos ligados a membrana, gp91phox e p22phox, três
componentes citosólicos, p67phox, p47phox e p40phox, e proteína G de baixo peso
molecular. No músculo esquelético, duas isoformas estão expressas, a NOX2 (gp91phox) e a NOX4 34, 43, 44. Apesar de suas similaridades, as proteínas NOX diferem
entre si pela sua composição, modo de ativação, interação com a proteína transmembrana p22phox, reação de produção enzimática e necessidade de fatores
Introdução 11
ativação depende da ligação com as subunidades regulatórias citosólicas p47phox e
p67phox. Diferentemente das outras isoformas, a NOX4 é constitutivamente ativa e
independente de proteínas citosólicas regulatórias ou ativadoras. Outra diferença entre a NOX2 e a NOX4 refere-se ao produto superóxido que elas geram. A NOX2 tem como produto primário o ânion radical superóxido e como secundário o peróxido de hidrogênio (H2O2), derivado da dismutação do superóxido pela enzima
superóxido dismutase, enquanto a NOX4 pode diretamente gerar H2O2 44, 45.
Na insuficiência cardíaca, há poucos trabalhos sobre o comportamento do complexo NADPH oxidase. No miocárdio, foi descrito aumento na expressão e atividade da NADPH oxidase em modelo experimental de sobrecarga pressórica e hipertrofia cardíaca 46. No músculo esquelético, poucos autores
avaliaram o complexo da NADPH oxidase. Embora tenha sido identificado aumento na atividade da NADPH oxidase no músculo plantar de ratos com infarto do miocárdio 47 e em músculos esqueléticos de camundongos infartados 48, não
encontramos alteração em sua atividade no músculo sóleo de ratos com insuficiência cardíaca induzida por infarto do miocárdio 15.
A apocinina, ou acetovanilona, é um metóxi-catecol (4-hidroxi-3-metoxiacetofenona), que foi descrito pela primeira vez em 1883 por Schmiedeberg
49. Em 1971, em isolamento de componentes imunomoduladores, a apocinina foi
extraída da raiz da planta medicinal Picrorhiza kurroa, planta nativa da Índia, Nepal, Tibet e Paquistão, conhecida pelo uso na medicina Ayuverda 49, 50. A partir
de 1980, foi caracterizada por suas múltiplas ações biológicas e antioxidantes 51.
Somente mais recentemente, foi observado que pode inibir o complexo NADPH oxidase em células fagociticas e não fagocíticas 49, 52. Estudos experimentais em
ratos mostraram efeitos benéficos da administração de apocinina como redução da produção de ânion superóxido e de produtos avançados de oxidação protéica, induzidos por angiotensina II, no ventrículo esquerdo 53. Também em ratos
espontaneamente hipertensos, a administração de apocinina foi seguida de diminuição da produção de EROs no ventrículo esquerdo 54. Somente mais
recentemente, foi observado que a administração de apocinina a ratos infartados reduz a geração muscular de EROs e previne a ocorrência de atrofia plantar 47. O
Introdução 12
na literatura estudos que tenham avaliado os efeitos da administração de apocinina sobre músculo esquelético de metabolismo predominantemente oxidativo constituído, principalmente, por fibras do tipo I, de contração lenta e resistente a fadiga 56.
Indução de estenose aórtica ascendente em ratos jovens tem sido considerada bom modelo para estudo da insuficiência cardíaca experimental 57.
Neste modelo, clip de prata não obstrutivo é colocado ao redor da aorta ascendente. À medida em que os animais crescem, passam a manifestar a estenose aórtica e a desenvolver hipertrofia ventricular esquerda concêntrica com disfunção diastólica. Mais tardiamente, ocorrem redução do desempenho ventricular sistólico e insuficiência cardíaca 58, 59. Além disso, a estenose aórtica ascendente tem se
mostrado bom modelo para estudo da miopatia associada à insuficiência cardíaca
25, 60, 61.
Neste projeto, testamos a hipótese que o tratamento com o anti-oxidante apocinina atenua o processo de remodelação cardíaca induzida por sobrecarga pressórica crônica persistente e alterações do músculo esquelético sóleo associadas à insuficiência cardíaca crônica.
Justificativa do estudo
A identificação de mecanismos fisiopatológicos envolvidos nas alterações da musculatura esquelética associadas à insuficiência cardíaca crônica é importante para o desenvolvimento de estratégias para prevenção e tratamento da progressiva deterioração muscular. Atualmente, não há terapia farmacológica disponível para tratamento das alterações musculares decorrentes da insuficiência cardíaca.
Objetivo 14
Avaliar os efeitos do tratamento com o antioxidante apocinina sobre alterações cardíacas estruturais e funcionais do ventrículo esquerdo e sobre o estresse oxidativo e características fenotípicas do músculo esquelético sóleo de ratos com insuficiência cardíaca crônica induzida por estenose aórtica supravalvar.
Material e Métodos 16
Grupos experimentais
Foram utilizados Ratos Wistar machos, com 21 dias de idade e peso corporal entre 90 a 100 g, provenientes do Biotério do Campus de Botucatu da Universidade Estadual Paulista (UNESP). Os animais foram mantidos em gaiolas individuais, em ambiente com temperatura controlada (24 ± 2 °C), com ciclos de luminosidade de 12 h, e alimentados com ração comercial Purina
e água ad
libitum. O protocolo de estudo foi aprovado pela Comissão de Ética em
Experimentação Animal da Faculdade de Medicina de Botucatu, UNESP (Processo no
927).
Para a indução da estenose aórtica, os animais foram anestesiados com cloridrato de cetamina (50 mg/kg por via intramuscular) e cloridrato de xilidino (10 mg/kg por via intramuscular) e submetidos a toracotomia mediana. A seguir, a aorta ascendente foi dissecada e um clipe de prata, com 0,6 mm de diâmetro interno, foi colocado a aproximadamente 3 mm da raiz da aorta 58.
Durante a cirurgia, os ratos foram ventilados manualmente a pressão positiva. Os animais pertencentes ao grupo controle (Sham, n=15) foram submetidos ao mesmo procedimento cirúrgico, porém sem a colocação do clipe. Como estudos prévios não mostraram efeitos da apocinina sobre o coração e músculos esqueléticos de camundongos normais, neste estudo não constituímos o grupo Sham tratado com apocinina 48.
Estudos prévios de nosso laboratório mostraram que, em ratos com estenose aórtica ascendente, insuficiência cardíaca manifesta-se 18 a 28 semanas após o procedimento cirúrgico 25, 58, 59. Portanto, vinte semanas após a cirurgia, os
ratos foram submetidos a ecocardiograma transtorácico para determinar o grau de comprometimento cardíaco decorrente da estenose aórtica e divididos em dois grupos: estenose aórtica (EAo, n=18) e EAo tratados com apocinina (EAo-apo, n=17) por oito semanas.
O grupo EAo-apo recebeu, diariamente, o inibidor da NADPH oxidase apocinina (Sigma Chemicals Company), na concentração de 16 mg/kg/dia. A apocinina foi diluída em etanol e, a seguir, colocada na água de beber 62, 63. A
Material e Métodos 17
de apocinina na água de beber, o consumo de água foi medido diariamente, e os animais pesados semanalmente em balança digital (Metttel® modelo Spider 2). Os grupos EAo e Sham receberam somente solução veículo com etanol na água de beber. Como em ratos, a apocinina tem sido utilizada em doses de 5 a 30 mg/kg/dia
54, 64, podemos considerar que, neste estudo usamos dose moderada para ratos.
Ao final do período experimental, de 28 semanas, os animais foram submetidos a ecocardiograma transtorácico e eutanasiados no dia seguinte. No momento da eutanásia, os ratos foram avaliados por dois examinadores para verificação do sinal clínico de insuficiência cardíaca, taquipneia/respiração laboriosa. No exame post mortem, foram pesquisados sinais patológicos compatíveis com o diagnóstico de insuficiência cardíaca como ascite, derrame pleural e pericárdico, trombo em átrio esquerdo, congestão hepática, hipertrofia do ventrículo direito (relação peso do ventrículo direito/peso corporal maior que 0,8 mg/g) e congestão pulmonar (peso dos pulmões, em valores absolutos e normalizados pelo peso corporal, maior que dois desvios padrão acima da média do grupo Sham) 12, 65.
Avaliação estrutural e funcional do coração por ecocardiograma
O ecocardiograma foi realizado antes e após o tratamento com apocinina. Os ratos foram anestesiados com cloridrato de cetamina (50 mg/kg) e cloridrato de xilidino (1 mg/kg) por via intraperitoneal. Após tricotomia da região anterior do tórax, os animais foram posicionados em decúbito lateral esquerdo para a realização do exame. Foi utilizado o equipamento modelo Vivid S6 (General
Electric Medical Systems, Israel) equipado com transdutor multifrequencial de
5,0-11,5 MHz. Para realizar as medidas estruturais do coração, foram obtidas imagens em modo monodimensional (modo-M) orientado pelas imagens em modo bidimensional, com o transdutor em posição para-esternal, eixo menor. A avaliação do ventrículo esquerdo (VE) foi realizada posicionando o cursor do modo-M logo abaixo do plano da valva mitral ao nível dos músculos papilares 65. As imagens da
aorta e do átrio esquerdo foram obtidas posicionando-se o cursor do modo-M ao nível do plano da valva aórtica. As imagens obtidas no modo-M foram registradas
Material e Métodos 18
em impressora modelo UP-895 (Sony Co., Japan). Posteriormente, as estruturas cardíacas foram medidas, manualmente, com o auxílio de paquímetro (Mitutoyo, Japan).
As seguintes estruturas cardíacas foram medidas: diâmetros diastólico (DDVE) e sistólico (DSVE) do VE espessuras diastólica (EDPP) e sistólica (ESPP) da parede posterior do VE e do septo interventricular (EDSIV e ESSIV, respectivamente), e diâmetros da aorta (AO) e do átrio esquerdo (AE). A espessura relativa do VE (ERVE) foi calculada de acordo com a fórmula:
EDPP x 2 DDVE
A massa do VE (MVE) foi calculada pela fórmula:
(DDVE+EDPP+EDSIV)3–DDVE3) x 1,04
onde 1,04 representa a densidade específica do miocárdio 66. O índice de MVE
(IMVE) foi calculado normalizando a MVE para o peso corporal.
A função sistólica do VE foi avaliada pelos seguintes índices: 1) porcentagem de encurtamento endocárdico (ΔD Endo), calculada pela fórmula:
(DDVE - DSVE
DDVE x 100
2) porcentagem de encurtamento mesocárdico (ΔD Meso), calculada pela fórmula:
DDVE + 1/2 EDPP + 1/2 EDSIV) - ( DSVE + 1/2 ESPP + 1/2 ESSIV
(DDVE + 1/2 EDPP + 1/2 EDSIV) x 100
3) velocidade de encurtamento da parede posterior (VEPP), que é a tangente máxima do movimento sistólico da parede posterior. A função diastólica do VE foi avaliada pelos seguintes índices: 1) pico de velocidade do enchimento diastólico inicial (onda E); 2) pico de velocidade do enchimento diastólico tardio (onda A); 3)
Material e Métodos 19
razão entre as ondas E e A (E/A); 4) tempo de desaceleração da onda E (TDE); 3) tempo de relaxamento isovolumétrico em valores absolutos (TRIV) e normalizados pela frequência cardíaca: TRIVn=TRIV/R-R0,5. Avaliação conjunta da função sistólica
e diastólica do VE foi realizada pelo índice de desempenho miocárdico (índice de Tei), calculado pela soma do tempo de contração isovolumétrica e do TRIV, dividido pelo tempo de ejeção do VE 67. O estudo foi complementado pela avaliação por
Doppler tissular dos deslocamentos sistólico (S’), diastólico inicial (E’) e diastólico tardio (A’) do anel mitral e pela razão entre as ondas E e E’ (E/E’).
Coleta do músculo esquelético sóleo e de outros tecidos para análise
A coleta do material foi realizada no Laboratório Experimental do Departamento de Clínica Médica da Faculdade de Medicina de Botucatu, UNESP. Após 12 horas de jejum, os animais foram pesados e, a seguir, anestesiados com injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico (50 mg/kg). Os ratos foram sacrificados por decapitação e o sangue foi coletado em tubo heparinizado e centrifugado a 4 °C. Amostras de soro foram separadas e armazenadas a –80 °C. O coração foi retirado por toracotomia mediana. Os átrios foram removidos e os ventrículos direito e esquerdo pesados separadamente. A seguir, o tecido epitelial do membro pélvico foi removido e o músculo sóleo retirado. Imediatamente após a dissecção, as amostras musculares foram pesadas e em seguida congeladas em nitrogênio líquido e conservadas a -80 °C. O peso dos pulmões foi utilizado para avaliar o grau de congestão pulmonar. Fragmentos de pulmão e fígado foram pesados antes e após desidratação em estufa a 65 °C por 72 h para determinar o grau de edema dos tecidos.
Avaliação das isoformas das cadeias pesadas de miosina por eletroforese
A análise das isoformas das cadeias pesadas de miosina foi realizada por eletroforese em gel de poliacrilamida duodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE). Fragmentos congelados do músculo sóleo (100 a 150 mg) foram triturados, homogeneizados em 800 µL de solução de extração (pH 7,0) composta por tampão
Material e Métodos 20
fosfato de potássio 50 mM, sucrose 0,3 M, ditiotreitol (DTT) 0,5 mM, ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 1 mM (pH 8,0), fenilmetilsulfonilfluoreto (PMSF) 0,3 nM, fluoreto de sódio (NaF) 10 mM e inibidor de protease (diluição final 1:100), e centrifugados a 12.000 rpm, a 4 °C, durante 20 min. Alíquota de 5 µL do sobrenadante foi utilizada para quantificação de proteína total, segundo o método de Bradford. As amostras foram colocadas em banho seco a 100 °C por 5 min. Gel de separação SDS-PAGE foi preparado com espessura de 1,5 mm com gradiente de 7 e 10 %. A solução do gel foi desgaseificada em bomba a vácuo por 10 min. As duas concentrações do gel foram então colocadas em bomba peristáltica para a colocação na placa. Após a polimerização do gel na placa, os pocinhos foram lavados 3 vezes com azul de bromofenol diluído (1%). As amostras foram pipetadas juntamente com o azul de bromofenol. A seguir, a cuba foi instalada com circulação de água a 20 °C, por 30 h, a 120 V. O gel foi, então, retirado e mergulhado em solução fixadora por 10 min, em solução corante (Comassie Blue) por 30 min agitando a 35 rpm e, finalmente, em solução descorante por 12 a 15 h. As isoformas das cadeias pesadas de miosina foram identificadas de acordo com a massa molecular, e suas porcentagens relativas quantificadas por densitometria.
Análise histológica da musculatura esquelética
Para preparo das lâminas histológicas, as amostras de tecido muscular foram transferidas para câmara de micrótomo criostato (-20 °C), onde permaneceram por 20 a 30 min para estabelecimento de equilíbrio térmico. Os blocos de tecido muscular foram, então, fixados em suportes metálicos do criostato (JUNG CM 1800 - Leica) por pequenas quantidades de adesivo (OCT – Tissue Tek Compound) e orientados de modo que os cortes fossem feitos transversalmente às fibras musculares. A seguir, os cortes foram corados com hematoxilina e eosina para análise morfológica geral. A área seccional das fibras musculares foi avaliada por sistema de análise por imagem computadorizada, segundo os critérios preconizados por Dubowitz. Para cada animal, em média, foram medidos 15 campos, totalizando 150 a 200 fibras.
Material e Métodos 21
Avaliação do estresse oxidativo
O grau de estresse oxidativo foi analisado por meio da quantificação do marcador de lipoperoxidação malonaldeído no soro e do hidroperóxido de lipídeo no músculo sóleo. Adicionalmente, foram avaliadas a geração total de EROs e a atividade da NADPH oxidase e das enzimas antioxidantes glutationa peroxidase, superóxido dismutase e catalase no músculo sóleo.
Quantificação de malonaldeído e hidroperóxido de lipídeo
A análise da concentração muscular de hidroperóxido de lipídeo e a atividade das enzimas antioxidantes foram realizadas no Laboratório de Pesquisa do Departamento de Química e Bioquímica do Instituto de Biociências de Botucatu, UNESP, sob orientação da Profa. Dra. Ana Angélica Henrique Fernandes.
A concentração sérica de malonaldeído foi avaliada por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) 68. Resumidamente, 100 µL de soro foram tratados
com butil hidroxitolueno (5% em etanol), seguido por precipitação da proteína com ácido tricloroacético (10% massa/volume) a 95 °C por 20 min. A amostra foi, então, resfriada em gelo por 5 min e centrifugada a 14.000 rpm por 10 min para precipitação do material insolúvel. Alíquota do sobrenadante (300 µL) foi acrescida de 650 µL de ácido tiobarbitúrico (0,4% massa/volume, em tampão acetato, pH 3,5) e 50 µL de KOH 3,065 M, aquecida novamente a 95 °C por 45 min, e resfriada em gelo por 5 min. A seguir, 50 µL da amostra foram injetados no cromatógrafo e analisados utilizando-se Coluna C18 (0,46 x 8,3 cm) e detector de fluorescência (Waters 2475), com excitação 515 nm e emissão 553 nm. A fase móvel do HPLC foi constituída por tampão fosfato 20 nM e acetonitrila (80:20, por volume) e o fluxo foi estabelecido em 0,8 mL/min. O tempo de corrida foi de 20 min. A quantificação do MDA foi realizada por comparação das integrais das áreas dos picos correspondentes com as integrais obtidas com padrões submetidos às mesmas condições cromatográficas.
Material e Métodos 22
A concentração muscular de hidroperóxido de lipídeo foi analisada por espectrofotometria. Amostras de músculo (200 mg) foram descongeladas, homogeneizadas em Potter Elvehjem com pistilo de teflon, com 5 mL de tampão fosfato de sódio 0,1 M (pH 7,0) contendo EDTA 1 mM, sob imersão em gelo, e centrifugadas a 10.000 rpm por 15 min, a 4 °C. O sobrenadante foi utilizado para a quantificação de proteínas e da concentração de hidroperóxido de lipídeo, que foi determinada pela oxidação de Fe2+ (sulfato ferroso amoniacal). O Fe3+ formado
reage com alaranjado de xilenol formando composto colorido. As leituras foram realizadas no espectrofotômetro Pharmacia Biotech (com software Swift II, England) e em leitor de microplaca (µQuant-MQX 200 com Kcjunior software, Bio-Tec Instruments, MO, USA). As leituras foram realizadas a 560 nm 69. Todos os
reagentes foram de procedência da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
Avaliação da geração total de EROs
A avaliação da geração total de EROs e da atividade da NADPH oxidase foi realizada no Laboratório de Pesquisa do Prof. Adjunto Dr. Francisco Rafael Martins Laurindo, do Departamento de Cardio-Pneumologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, sob orientação da pesquisadora Dra. Denise de Castro Fernandes, de acordo com a técnica previamente descrita 70, 71. O tecido
muscular (100 mg) foi cuidadosamente lavado em PBS para remoção de coágulos sanguíneos e trombos. O tecido foi cortado em fragmentos de 3 mm com peso aproximado de 2 a 10 mg. O tecido foi incubado em 500 μL de solução PBS/DTPA contendo DHE 150 μM por 25 min, a 37 °C, em ambiente sem luz. A seguir, o tecido foi lavado com PBS, transferido para nitrogênio líquido, e homogeneizado com almofariz e pistilo. O homogenato foi ressuspenso em solução de acetonitrila (0,5 mL), sonicado (3 ciclos de 8 W por 10 seg) e centrifugado (12.000 g por 10 min a 4 °C). O sobrenadante foi seco sob vácuo (Speed Vac Plus modelo SC-110, Thermo Savant) e o pellet mantido a 20 °C em ambiente sem luz. As amostras foram ressuspensas em 80 µL de água deionizada e injetadas no aparelho de HPLC. A geração total de EROS foi avaliada no músculo sóleo pela quantificação dos derivados de oxidação dos compostos fluorescentes dihidroetídio (DHE),
2-Material e Métodos 23
hidroxietídio (EOH) e etídio. EOH é gerada quando o DHE é oxidado por ânion superóxido, enquanto a produção de etídio está associada, principalmente, a níveis de proteínas heme e peroxidases. Os resultados foram expressos pelas razões EOH/DHE consumido e etídio/DHE consumido. O DHE consumido foi calculado como a diferença entre a concentração inicial adicionada às amostras e o DHE remanescente quantificado por HPLC.
Avaliação da atividade da NADPH oxidase
A atividade da NADPH oxidase foi avaliada em frações enriquecidas de membrana celular pela quantificação dos compostos fluorescentes EOH e etídio derivados da oxidação do DHE. O músculo sóleo foi cuidadosamente lavado em PBS para remoção de coágulos sanguíneos e trombos. Fragmentos de músculo (∼200 mg) foram homogeneizados com auxílio de Polytron, em gelo, com 1 mL de tampão de lise contendo Tris 50 mM (pH 7,4), DTPA 100 mM, β-mercaptoetanol 0,1 % e inibidores de protease. A seguir, as amostras foram submetidas a sonicação (3 ciclos de 10 s a 8 W) e centrifugação a 1.000 g, por 3 min, a 4 °C. O sobrenadante foi transferido para novo tubo e centrifugado a 18.000 g, por 10 min, a 4 °C. A seguir, o sobrenadante foi transferido para tubo de ultra-centrífuga e centrifugado a 100.000 g por 45 min a 4 °C. Após desprezar o sobrenadante, o precipitado (pellet) foi ressuspenso em 100 µL de tampão de lise, obtendo-se, assim, a fração enriquecida de membrana. Quantificação de proteínas foi realizada pelo método de Bradford.
A fração enriquecida de membrana (20 µg) foi encubada em 100 µL de solução tampão fosfato (50 mM, pH 7,4, com DTPA 0,1 mM) contendo DHE (50 µM) e NADPH (300 µM), por 30 min, a 37 °C, em banho-maria protegido da luz. Após adição de 40 µL de ácido tricloroacético 10 %, as amostras foram mantidas em gelo e protegidas da luz por 10 min e, a seguir, foram centrifugadas a 12.000 rpm por 10 min, a 4 °C. O sobrenadante foi transferido de tubo e analisado em HPLC para quantificação de produtos de fluorescência derivados do DHE, de acordo com o método previamente descrito por Laurindo et al. 70, 71. A quantificação dos
Material e Métodos 24
correspondentes com as integrais obtidas com padrões submetidos às mesmas condições cromatográficas. Os resultados foram expressos pelas razões EOH/DHE e etídio/DHE consumido. O DHE consumido foi calculado como a diferença entre a concentração inicial adicionada às amostras e o DHE remanescente quantificado por HPLC.
Análise da atividade de enzimas antioxidantes
Amostras de músculo esquelético (200 mg) foram descongeladas, homogeneizadas em Potter Elvehjem com pistilo de teflon, com 5 mL de tampão fosfato de sódio 0,1 M (pH 7,0) contendo EDTA 1 mM, sob imersão em gelo, e centrifugadas a 10.000 rpm por 15 min, a 4 °C. O sobrenadante foi utilizado para a quantificação de proteínas totais 72 e da atividade das enzimas antioxidantes
superóxido dismutase (SOD), glutationa peroxidase (GSH-Px) e catalase (Cat). As leituras foram realizadas no espectrofotômetro Pharmacia Biotech (com software Swift II, England) e em leitor de microplaca (µQuant-MQX 200 com Kcjunior software, Bio-Tec Instruments, MO, USA). Todos os reagentes foram de procedência da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
A atividade da enzima GSH-Px (E.C 1.11.1.9) foi determinada por meio da oxidação da glutationa em presença de peróxido de hidrogênio e cumene hidroperóxido 73. A atividade da SOD (E.C. 1.15.1.1) foi determinada pela alteração
na redução do nitroblue-tetrazólio (NBT) por radicais superóxido gerados pela mistura nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzido (NADH) e fenazina metassulfato em pH fisiológico. A atividade enzimática da Cat (E.C. 1.11.1.6) foi determinada em tampão fosfato pH 7,0, utilizando-se 12,5 dL de amostra e peróxido de hidrogênio (30%). As leituras espectrofotométricas foram realizadas a 240 nm 74.
Material e Métodos 25
Análise estatística
Os dados foram expressos em média e desvio padrão ou mediana e percentis 25 e 75. Para as variáveis com distribuição normal, as comparações entre os grupos foram realizadas por análise de variância (ANOVA) de uma via complementada pelo teste de Bonferroni. Para as variáveis com distribuição não normal, as comparações foram realizadas pelo teste de Dunn. A comparação da frequência dos sinais de insuficiência cardíaca entre os grupos foi analisada pelo teste de Goodman. O nível de significância considerado foi de 5%.
Resultados 27
Caracterização dos grupos experimentais e variáveis anatômicas
Ao final do período experimental, a mortalidade foi de dois ratos no grupo EAo (n=16) e um no EAo-apo (n=16); todos os ratos do grupo Sham sobreviveram até o final do estudo (n=15). Na Tabela 1, está apresentada a frequência dos sinais de insuficiência cardíaca dos grupos EAo e EAo-apo. No grupo Sham, nenhum rato apresentou qualquer evidência de insuficiência cardíaca. A frequência de ascite e derrame pleural foi maior no grupo EAo que no Sham. A frequência de trombo em átrio esquerdo, hipertrofia do ventrículo direito e congestão pulmonar foi maior nos grupos EAo e EAo-apo que no Sham. Não houve diferenças significantes entre os grupos EAo-apo e EAo.
As variáveis anatômicas estão apresentadas na Tabela 2. O peso do corpo e dos músculos sóleo e gastrocnêmio não diferiu entre os grupos. O peso do VE, ventrículo direito, átrios e pulmões, em valores absolutos ou normalizados pelo peso corporal, foi maior nos grupos EAo e EAo-apo que no Sham e não diferiu estatisticamente entre os grupos com estenose aórtica.
Avaliação ecocardiográfica
Os resultados do estudo ecocardiográfico realizado antes do tratamento com apocinina estão apresentados nas Tabelas 3 a 5. Os grupos com estenose aórtica apresentaram aumento das espessuras das paredes do VE, do diâmetro do átrio esquerdo, da relação diâmetro diastólico do VE/peso corporal, da massa do VE e da espessura relativa do VE em relação ao grupo Sham. Funcionalmente, os grupos com estenose aórtica apresentaram redução da velocidade de encurtamento da parede posterior do VE, da onda S lateral e do tempo de desaceleração da onda E, e aumento da onda E, da relação E/A e da relação E/E’.
Os resultados do estudo ecocardiográfico final estão apresentados nas Tabelas 6 a 8. Os grupos com estenose aórtica apresentaram as mesmas alterações estruturais observadas antes do tratamento em relação ao grupo Sham, exceto pela relação diâmetro diastólico do VE/peso corporal. Esta variável foi maior no grupo
Resultados 28
EAo que no Sham; no grupo EAo-apo, apresentou valores intermediários entre Sham e EAo, não diferindo significantemente de ambos. As alterações funcionais se mantiveram e foram acrescidas de redução da onda A e do tempo de relaxamento isovolumétrico nos grupos EAo e EAo-apo em relação ao Sham. Ao Doppler tissular, o grupo EAo apresentou redução das ondas S lateral, septal e média em relação ao Sham. No grupo EAo-apo, essas variáveis não diferiram significantemente dos valores dos grupos Sham e EAo. O grupo EAo-apo não apresentou diferenças estatísticas em relação ao EAo.
Avaliação da composição das cadeias pesadas de miosina
Em lisado de proteínas do músculo sóleo, foram detectadas as isoformas I e IIa das cadeias pesadas de miosina. Na Figura 1, estão apresentadas as porcentagens da isoforma IIa em relação ao total das cadeias pesadas de miosina. Não observamos diferenças significantes entre os grupos (Sham 10,7±6,74; EAo 20,4±9,99; EAo-apo 13,1±7,17 %; p=0,12).
Análise histológica do músculo sóleo
Em lâminas histológicas, foram mensuradas as áreas seccionais transversas das fibras do músculo sóleo (Figura 2). A área seccional não diferiu entre os grupos (Sham 4152±1226; EAo 3499±376; EAo-apo 3337±794 µm2;
p=0,45).
Avaliação do estresse oxidativo
Marcadores de estresse oxidativo
A concentração sérica de malonaldeído (Sham 1,43±0,27; EAo 0,94±1,12; EAo-apo 1,06±0,07 µmol/L; p=0,07) não diferiu entre os grupos. A concentração muscular de hidroperóxido de lipídeo (Sham 338±56,1; EAo
Resultados 29
285±37,7; EAo-apo 376±49,6 nmol/g tecido; p<0,05) foi maior no grupo EAo-apo que no EAo (Figura 3).
Geração total de EROs
No músculo sóleo, as relações EOH/DHE (Sham 27,1±18,7; EAo 42,4±25,1; EAo-apo 28,6±25,5 nmol/µmol/g tecido; p=0,43) e etídio/DHE (Sham 686±111; EAo 852±325; EAo-apo 756±191 nmol/ µmol/g tecido; p=0,47) não diferiram entre os grupos (Figura 4).
Atividade da NADPH oxidase
As relações EOH/DHE [Sham (n=8) 0,062 (0,057-0,078); EAo (n=8) 0,050 (0,027-0,096); EAo-apo (n=9) 0,075 (0,046-0,081) nmol/µmol/g tecido;
p=0,47] e etídio/DHE [Sham (n=8) 0,80 (0,76-1,08); EAo (n=8) 0,85 (0,34-1,07);
EAo-apo (n=9) 0,93 (0,86-1,26) nmol/µmol/g tecido; p=0,47] não diferiram estatisticamente entre os grupos estudados (Figura 5).
Atividade das enzimas antioxidantes
A atividade da catalase foi menor no grupo EAo que nos grupos Sham e EAo-apo e a atividade da superóxido dismutase foi menor no grupo EAo que no Sham. Não houve diferença significante entre os grupos para a atividade da glutationa peroxidase (Figura 6).
Resultados 30
Tabela 1. Frequência de sinais clínico e anátomo-patológicos de insuficiência cardíaca nos grupos de ratos com estenose aórtica
Sinais, % EAo (n=16) EAo-apo (n=16)
Taquipneia 0 6,3
Congestão hepática 12,5 0
Ascite 43,8 * 18,8
Derrame pleuropericárdico 31,8 * 12,5
Trombo em átrio esquerdo 43,8 * 43,8 *
Hipertrofia do ventrículo direito 62,5 * 81,2 *
Congestão pulmonar 68,7 * 75 *
EAo: ratos com estenose aórtica; EAo-apo: ratos com estenose aórtica tratados com apocinina; n: número de animais. Teste de Goodman; * p<0,05 vs Sham.
Tabela 2. Variáveis anatômicas
Variáveis Sham (n=15) EAo (n=16) EAo-apo (n=16) PC (g) 497 ± 74 445 ± 41 445 ± 41 VE (g) 0,45 ± 0,07 0,91 ± 0,15* 0,92 ± 0,19* VD (g) 0,30 ± 0,05 0,47 ± 0,19* 0,56 ± 0,11* Átrios (g) 0,10 ± 0,02 0,32 ± 0,07* 0,34 ± 0,10* Sóleo (g) 0,24 ± 0,04 0,21 ± 0,03 0,19 ± 0,03 Gastrocnêmio (g) 2,62 ± 0,42 2,42 ± 0,41 2,33 ± 0,16 VE/PC (mg/g) 0,92 ± 0,15 2,11 ± 0,21* 2,06 ± 0,37* VD/PC (mg/g) 0,60 ± 0,07 1,10 ± 0,44* 1,26 ± 0,20* Átrios/PC (mg/g) 0,21 ± 0,03 0,77 ± 0,25* 0,77 ± 0,23* Sóleo/PC (mg/g) 0,47 ± 0,03 0,48 ± 0,05 0,43 ± 0,09 Gastrocnêmio/PC (mg/g) 5,27 ± 0,30 5,57 ± 0,36 5,24 ± 0,29 Pulmão (g) 1,94 ± 0,51 3,49 ± 0,83* 3,91 ± 0,70* Pulmão/PC (mg/g) 3,90 ± 0,74 8,15 ± 2,09* 8,75 ± 1,37*
Sham: ratos submetidos a cirurgia simulada para indução de estenose aórtica; EAo: ratos com estenose aórtica; EAo-apo: ratos com estenose aórtica tratados com apocinina; n: número de animais; PC: peso corporal; VE: peso do ventrículo esquerdo; VD: peso do ventrículo direito. Dados expressos em média ± desvio padrão; * p<0,05 vs Sham; ANOVA e Bonferroni.
Resultados 31
Tabela 3. Variáveis estruturais cardíacas antes do tratamento com apocinina Variáveis Sham (n=15) EAo (n=15) EAo-apo (n=14)
DDVE (mm) 7,73±0,67 8,28±0,83 8,37±0,99 DSVE (mm) 3,44±0,77 3,65±1,07 3,60±1,21 EDPP (mm) 1,47 (1,41-1,56) 2,17 (2,07-2,25)* 2,13(1,94-2,30)* ESPP (mm) 3,09±0,29 4,16±0,41* 4,15±0,56* EDSIV (mm) 1,47 (1,41-1,56) 2,19 (2,08-2,25)* 2,10 (1,94-2,30) * ESSIV (mm) 2,68 (2,63-2,79) 3,59 (3,21-3,80)* 3,60 (2,99-3,72)* AO (mm) 3,72 (3,65-3,94) 3,72 (3,61-3,94) 3,94 (3,80-4,09) AE (mm) 5,26 (4,97-5,63) 7,99 (7,55-8,54)* 8,18 (6,26-8,75)* AE/AO 1,42±0,17 2,09±0,27* 2,01±0,41* DDVE/PC (mm/kg) 17,3±1,9 19,7±2,39* 19,5±2,36* AE/PC (mm/kg) 12,0 (10,7-13,1) 19,0 (16,5-21,2)* 18,3 (15,7-19,9)* Esp. Rel. VE 0,40 (0,35-0,43) 0,53 (0,50-0,56)* 0,49 (0,45-0,56)* MVE 0,72 (0,71-0,84) 1,61 (1,23-1,69)* 1,41 (1,11-2,02)* Índice MVE 1,80 (1,55-1,89) 3,67 (3,25-4,04)* 3,37 (2,81-4,72)*
Sham: ratos submetidos a cirurgia simulada para indução de estenose aórtica; EAo: ratos com estenose aórtica; EAo-apo: ratos com estenose aórtica tratados com apocinina; n: número de animais; DDVE e DSVE: diâmetros diastólico e sistólico do ventrículo esquerdo (VE), respectivamente; EDPP: espessura diastólica da parede posterior do VE; ESPP: espessura sistólica da parede posterior do VE; EDSIV: espessura diastólica do septo interventricular; ESSIV: espessura sistólica do septo interventricular; AO: diâmetro da aorta; AE: diâmetro do átrio esquerdo; PC: peso corporal; Esp. Rel. VE: espessura relativa do VE; MVE: massa do VE; Índice MVE: índice de massa do VE. Dados expressos em média ± desvio padrão ou mediana e percentis 25 e 75; * p<0,05 vs Sham; ANOVA e Bonferroni ou Dunn.
Resultados 32
Tabela 4. Variáveis funcionais do ventrículo esquerdo antes do tratamento com apocinina
Variáveis Sham (n=15) EAo (n=15) EAo-apo (n=14) FC (bpm) 295 (259-347) 285 (264-291) 290 (272-315) ΔD Endo (%) 54,8±7,81 56,3±9,56 57,6±11,1 ΔD Meso (%) 30,1±5,56 28,3±6,08 29,9±7,55 VEPP (mm/s) 36,3±6,1 29,1±3,67* 30,6±4,99* Onda E (cm/s) 73,0 (70,2-75,7) 129 (93,5-137)* 114 (86,5-150)* Onda A (cm/s) 54,0 (48,2-59,7) 39,0 (22,0-62,0) 38,0 (22,0-71,5) E/A 1,40 (1,21-1,55) 2,99 (1,53-6,34)* 5,46±3,18* TDE (ms) 46,3±7,95 33,3±8,11* 29,9±8,46* TRIV (ms) 26,0 (22,0-26,0) 20,0 (18,0-28,0) 22,0 (17,2-26,0) TRIV/R-R 53,9 (1,74-59,3) 44,1 (38,7-60,5) 47,9 (36,7-57,3) Tei 0,49± 0,07 0,42±0,11 0,49±0,12
Sham: ratos submetidos a cirurgia simulada para indução de estenose aórtica; EAo: ratos com estenose aórtica; EAo-apo: ratos com estenose aórtica tratados com apocinina; n: número de animais; FC: frequência cardíaca; ΔD Endo: encurtamento endocárdico; ΔD Meso: encurtamento mesocárdico; VEPP: velocidade de encurtamento da parede posterior do ventrículo esquerdo (VE); E/A: razão entre picos de fluxo de enchimento inicial (onda E) e da contração atrial (onda A) do fluxo transmitral; TDE: tempo de desaceleração da onda E mitral; TRIV: tempo de relaxamento isovolumétrico do VE; TRIV/R-R: TRIV normalizado pela frequência cardíaca; Tei: índice de performance miocárdica. Dados expressos em média ± desvio padrão ou mediana e percentis 25 e 75; * p<0,05 vs Sham; ANOVA e Bonferroni ou Dunn.
Tabela 5. Avaliação ecocardiográfica por Doppler tissular antes do tratamento com apocinina
Variáveis Sham (n=15) EAo (n=15) EAo-apo (n=14) S lateral 3,50 (3,00-3,62) 3,00 (2,00-3,00)* 3,00 (2,50-3,00)* S septal 3,19±0,43 2,80±0,70 2,89±0,66 S média 3,25 (2,75-3,5) 2,75 (2,5-2,94) 2,75 (2,5-3,25) E’ lateral 3,81±0,75 3,93±1,41 4,08±1,06 E’ septal 3,50 (3,50-4,62) 3,00 (2,50-3,87) 3,50 (3,50-4,25) E’ média 3,75 (3,25-4,25) 3,50 (2,75-4,19) 4,00 (2,93-4,50) A’ lateral 3,92±1,00 3,27±0,99 3,58±1,10 A’ septal 3,50 (3,00-4,50) 3,00 (2,50-3,50) 3,00 (2,50-4,25) A’ média 3,26±1,57 3,13±0,63 3,15±1,31 E/E’ 19,5 (17,8–21,5) 33,2 (24,8–41,3)* 30,5 (19,4–37,3)* E’/A’ 1,07±0,23 1,24±0,53 1,26±0,50
Sham: ratos submetidos a cirurgia simulada para indução de estenose aórtica; EAo: ratos com estenose aórtica; EAo-apo: ratos com estenose aórtica tratados com apocinina; n: número de animais. S’: pico da velocidade de deslocamento sistólico do anel mitral (média das paredes lateral e septal, cm/s); pico da velocidade de deslocamento diastólico inicial (E’) e tardio (A’) do anel mitral (média das paredes lateral e septal). Dados expressos em média ± desvio padrão ou mediana e percentis 25 e 75; * p<0,05 vs Sham; ANOVA e Bonferroni ou Dunn.
Resultados 33
Tabela 6. Variáveis estruturais cardíacas ao final do período experimental Variáveis Sham (n=13) EAo (n=15) EAo-apo (n=13) DDVE (mm) 7,80±0,74 8,85±0,95* 8,90±0,96* DSVE (mm) 3,57±0,54 4,78±1,41 4,79±1,27 EDPP (mm) 1,37±0,10 2,18±0,18* 2,09±0,27* ESPP (mm) 3,05±0,20 3,94±0,35* 3,81±0,50* EDSIV (mm) 1,38±0,08 2,21±0,22* 2,10±0,27* ESSIV (mm) 2,79±0,22 3,54±0,17* 3,34±0,41* AO (mm) 3,88±0,16 3,92±0,22 3,80±0,12 AE (mm) 5,00±0,39 9,05±1,02* 8,56±0,75* AE/AO 1,29±0,11 2,31±0,25* 2,25±0,23* DDVE/PC (mm/kg) 17,8±2,28 20,1±3,28* 19,3±2,03 AE/PC (mm/kg) 11,4±1,08 20,6±4,15* 18,5±1,42* Esp. Rel. VE 0,34±0,04 0,50±0,07* 0,45±0,08* MVE 0,80 (0,69-0,94) 1,63 (1,43-1,72)* 1,59 (1,08-1,83)* Índice MVE 1,62 (1,52-1,75) 3,57 (2,97-4,27)* 3,39 (2,33-3,82)*
Sham: ratos submetidos a cirurgia simulada para indução de estenose aórtica; EAo: ratos com estenose aórtica; EAo-apo: ratos com estenose aórtica tratados com apocinina; n: número de animais; DDVE e DSVE: diâmetros diastólico e sistólico do ventrículo esquerdo (VE), respectivamente; EDPP: espessura diastólica da parede posterior do VE; ESPP: espessura sistólica da parede posterior do VE; EDSIV: espessura diastólica do septo interventricular; ESSIV: espessura sistólica do septo interventricular; AO: diâmetro da aorta; AE: diâmetro do átrio esquerdo; PC: peso corporal; Esp. Rel. VE: espessura relativa do VE; MVE: massa do VE. Índice de MVE: índice de massa do VE. Dados expressos em média ± desvio padrão ou mediana e percentis 25 e 75; * p<0,05 vs Sham; ANOVA e Bonferroni ou Dunn.
Tabela 7. Variáveis funcionais do ventrículo esquerdo ao final do período experimental
Variáveis Sham (n=13) EAo (n=15) EAo-apo (n=13)
FC (bpm) 262±24 286±34 293±38 ΔD Endo (%) 54,2±4,66 46,8±11,3 46,8±9,72 ΔD Meso (%) 30,1±5,56 28,3±6,08 29,9±7,55 VEPP (mm/s) 35,4±2,60 27,45±4,98* 26,3±3,73* Onda E (cm/s) 77,2±9,39 129±23,3* 126,4±36,1* Onda A (cm/s) 50,3±12,4 23,1±9,77* 32,1±18,6* E/A 1,62±0,41 6,76±3,19* 5,46±3,18* TDE (ms) 41,7±5,17 26,7±7,40* 27,4±6,59* TRIV (ms) 26,9±3,33 21,34±4,15* 21,3±4,37* TRIV/R-R 56,1±6,72 46,5±8,56 47,3±11,0 Tei 0,43 (0,42-0,46) 0,40 (0,38-0,45) 0,41 (0,38-0,46)
Sham: ratos submetidos a cirurgia simulada para indução de estenose aórtica; EAo: ratos com estenose aórtica; EAo-apo: ratos com estenose aórtica tratados com apocinina; n: número de animais; FC: frequência cardíaca; ΔD Endo: encurtamento endocárdico; ΔD Meso: encurtamento mesocárdico; VEPP: velocidade de encurtamento da parede posterior do ventrículo esquerdo (VE); E/A: razão entre picos de fluxo de enchimento inicial (onda E) e da contração atrial (onda A) do fluxo transmitral; TDE: tempo de desaceleração da onda E mitral; TRIV: tempo de relaxamento isovolumétrico do VE; TRIV/R-R: TRIV normalizado pela frequência cardíaca; Tei: índice de performance miocárdica. Dados expressos em média ± desvio padrão; * p<0,05 vs Sham; ANOVA e Bonferroni.
Resultados 34
Tabela 8. Avaliação ecocardiográfica por Doppler tissular ao final do período experimental
Variáveis Sham (n=13) EAo (n=15) EAo-apo (n=13) S lateral 3,10±0,53 2,32±0,44* 2,88±0,66 S septal 3,20±0,76 2,33±0,57* 2,54±0,62 S média 3,15±0,51 2,32±0,38* 2,71±0,41 E’ lateral 4,14±0,65 3,49±1,24 3,84±1,46 E’ septal 3,69±1,68 3,69±1,68 3,69±1,68 E’ média 4,01±0,52 3,59±1,22 3,68±1,20 A’ lateral 3,53±1,14 3,46±1,49 4,88±1,98 A’ septal 3,30±1,14 2,46±0,74 2,93±0,74 A’ média 3,42±0,94 2,96±1,00 3,90±1,10 E/E’ 18,8 (17,8–21,5) 39,5 (27,3 – 42,7)* 32,1 (28,4 – 39,4)* E’/A’ 1,25 (0,96-1,35) 1,16 (0,70-1,74) 0,98 (0,64-1,51) Sham: ratos submetidos a cirurgia simulada para indução de estenose aórtica; EAo: ratos com estenose aórtica; EAo-apo: ratos com estenose aórtica tratados com apocinina; n: número de animais. S’: pico da velocidade de deslocamento sistólico do anel mitral (média das paredes lateral e septal, cm/s); pico da velocidade de deslocamento diastólico inicial (E’) e tardio (A’) do anel mitral (média das paredes lateral e septal). Dados expressos em média ± desvio padrão ou mediana e percentis 25 e 75; * p<0,05 vs Sham; ANOVA e Bonferroni ou Dunn.
Resultados 35
Figura 1. Porcentagem da isoforma IIa das cadeias pesadas de miosina (MyHC) no músculo sóleo. Análise por eletroforese em gel de poliacrilamida e duodecilsulfato de sódio. Sham: ratos submetidos a cirurgia simulada para indução de estenose aórtica; EAo: ratos com estenose aórtica; EAo-apo: ratos com estenose aórtica tratados com apocinina; n: número de animais; média±desvio padrão; ANOVA (p=0,12).
0 5 10 15 20 25
Sham (n=6) EAo (n=6) EAo-apo (n=5)
M yH C I Ia (% )
