Un tel dispositif nécessite la miniaturisation de toutes les fonctions (préparation, traitement, séparation, détection) nécessaires à l'analyse de l'échantillon. Pour évaluer le potentiel des cPDMS comme électrodes pour des applications microfluidiques, nous avons choisi de l'utiliser d'une part pour des mesures électrochimiques, mais également pour la manipulation de cellules.
Champs électriques dans les laboratoires sur puce
Méthodes traditionnelles
Modification des groupes chimiques en surface (notamment mise en évidence par le caractère hydrophile de la surface après traitement). La figure 4.3 montre l'évolution temporelle de la morphologie des cellules marquées et non marquées. L'intensité de Im[fCM] est maximale à la fréquence de 70 kHz, ce qui correspond presque à la fréquence à laquelle les phénomènes de rotation observés étaient les plus rapides (80 kHz).
L'évolution du contact cellule à cellule est représentée en fonction de la fréquence sur la figure 4.15.
Méthodes moins conventionnelles
Utilisation de l’électrochimie en microsystèmes
- Actionnement microfluidique
- Piles à combustible
- Synthèse électrochimique
- Analyses électrochimiques
Selon que les bulles sont générées d'un côté ou de l'autre du switch (ou « switch »), cela favorise l'orientation de la cellule vers un côté ou l'autre du canal. Le recours à la microfluidique, qui permet de concentrer les espèces à proximité de l'électrode (Figure 1.9), a réussi à inverser cette tendance.
Manipulations électrocinétiques de particules
- Manipulation électrocinétiques de particules
- Lyse cellulaire en microsystème
- Electrofusion de cellules
La direction de la force diélectrophorétique ne dépend pas de la direction du champ (E2), mais du signe de la partie réelle du facteur Clausius Mossotti (fCM). Elle est maximisée autour de la fréquence de relaxation du phénomène de polarisation dominant (polarisation de la bicouche dans le cas des billes, polarisation interfaciale dans le cas des cellules). Cependant, l’application d’un champ électrique pulsé provoque une accumulation de charges de part et d’autre de la membrane plasmique.
Un champ électrique externe induit l’accumulation de charges de part et d’autre de la membrane.
Développement d’une filière d’intégration du cPDMS en
Les matériaux nanocomposites en microsystèmes
R la résistance mesurée (Ω), la résistance électrique du matériau (Ω.m), L la longueur de la structure (m), et S la surface de la structure (m. Cette différence d'angle de contact (en l'ordre de grandeur 10 %) provient donc de la présence de carbone. La littérature est riche d'exemples de l'influence du plasma d'oxygène sur la modification de la chimie de surface des polymères [45].
Ce polymorphisme est à l'origine de la grande diversité des électrodes de carbone et de leurs propriétés. L'augmentation du nombre de sites actifs (mis en évidence par les images MEB) peut entraîner une augmentation de la surface active de l'électrode. Les phénomènes observés ont été classés selon la fréquence et l'amplitude du champ.
128 Figure 4.20 – Résumé de l'influence de la fréquence et de l'amplitude du champ sur le comportement des cellules HEK-293. Pour confirmer l'influence de l'augmentation de la longueur du canal principal, diverses simulations (de vitesse d'écoulement) ont été réalisées. Ainsi, leur combinaison a mis en évidence l’augmentation de la surface active de l’électrode après l’oxydation plasma.
Description du cPDMS
Préparation du cPDMS
Les forces (interactions électrostatiques, Van der Waals, liaisons covalentes) qui animent ces phénomènes ne sont pas particulièrement spécifiques, mais dépendent de la chimie de la surface de l'électrode. L'allure de la courbe en présence de Fe(II) et Fe(III) est caractéristique d'une réaction redox. L'aspect général des courbes montre clairement l'influence de la concentration en noir de carbone sur la réponse électrochimique du matériau.
Les mesures d'angle de contact décrites au chapitre II ont montré la modification de la surface du cPDMS par oxydation par plasma d'oxygène. Premièrement, l’influence de la durée du plasma sur la réponse électrochimique du cPDMS au Fe(CN6)3-/4- a été évaluée. L'oxydation plasma de la surface du cPDMS accélère ainsi grandement le transfert électronique entre celle-ci et l'électrolyte.
Les molécules Fe(CN6)3-/4- sont reconnues comme sensibles aux changements de surface de l'électrode, ce comportement confirme une modification de la surface du cPDMS après le plasma. La double couche se comporte comme un condensateur plan, l'augmentation de la capacité interfaciale s'expliquant notamment par l'expansion de la surface de l'électrode. Ceci confirme que l'augmentation de la longueur du canal principal favorise le passage d'une particule dans le piège.
Caractérisation du cPDMS
- Caractérisation électrique du cPDMS
- Dispositif microfluidique et caractérisations
Caractérisation électrochimique d’électrodes en cPDMS
Conductivité électrique
Toutes les formes allotropiques de carbone ne permettent pas la conduction électrique entre les atomes de carbone. On distingue donc classiquement les électrodes en graphite (HOPG1), en carbone vitreux (GCE2) et en résine pyrolysée (PPF3) [2]. Des travaux plus récents ont également démontré le potentiel de matériaux émergents tels que le graphène [3] et les nanotubes de carbone [4].
Néanmoins, il existe une exception où le diamant (hybridation sp3) est rendu conducteur après dopage avec des impuretés telles que le bore [5]. Le tableau 3.1 compare leur résistance électrique à celle obtenue pour le cPDMS au chapitre II. En électrochimie, la conductivité du matériau n’est pas la seule caractéristique importante qui affecte les performances des électrodes.
Fenêtre de potentiel électrochimique
Il est possible d'observer une augmentation du E de la réaction après traitement de l'électrode, suggérant un transfert électronique plus lent. L'augmentation corrélée de la vitesse de mouvement des particules avec le champ électrique est cohérente avec la littérature [17]. Comme décrit précédemment, ce phénomène est le résultat de la polarisation des cellules sous l'effet du champ provoquant des interactions dipôle-dipôle.
Pour caractériser les alignements cellulaires, l'évolution de la surface de contact entre cellules a été étudiée en fonction de la fréquence d'étirement. Ceci semble signifier que le marqueur est sorti presque totalement (environ 80 %) des cellules et s'est propagé progressivement dans le canal sous l'effet de la diffusion. Ainsi, la réduction de la largeur d'impulsion doit être compensée par l'augmentation du champ.
Cependant, nos mesures ont révélé que les cellules lysées ont tendance à se rapprocher de la paroi de l’électrode. Les simulations montrent ici que l'augmentation de la distance par rapport au chenal principal favorise les écoulements de pièges. Si le centre de la particule se trouve à gauche de cette ligne, elle entrera dans le piège.
Le paragraphe mettait également en évidence les effets de la fréquence du champ électrique sur les différents mécanismes de polarisation.
Modifications de surface : adsorption et oxydation
Matériels et méthodes
- Configuration d’électrodes, protocoles de fabrication
- Couples redox modèles utilisés
Résultats de voltammétrie cyclique
- Etudes préliminaires
- Influence du dopage du cPDMS
- Evaluation de l’influence du plasma oxygène sur les mesures
- Caractérisation du courant capacitif
Système expérimental
- Equipements
- Cellules eucaryotes
Electromanipulation de particules
- Manipulation électrocinétique de microbilles
- Manipulation électrocinétique de cellules
Ce phénomène semble ici très proche de la migration électrophorétique observée sous champ électrique continu. Les sphères, qui ont une charge superficielle négative (information obtenue grâce aux mesures du potentiel zêta), se déplacent sous l'influence du champ électrique appliqué [16] en direction de l'anode (chargées positivement). 116 Figure 4.7 – Schéma de synthèse des phénomènes observés pour une suspension de billes (Ø 3 μm, . dans de l'eau désionisée) dans un microcanal avec des électrodes cPDMS (50 μm d'épaisseur) séparées de 200 μm.
D'après nos observations, la vitesse de déplacement des balles dépend de l'intensité du champ, la fréquence du champ déterminant la durée du mouvement. Pour les fréquences comprises entre 1 et 50 kHz, les cellules forment des chaînes tout en restant au centre du canal, comme le montre la figure 4.11.a. Ainsi, si l'on suit la bosse sur la membrane cellulaire (représentée par le point rouge sur la figure 4.12) et connaît la vitesse de capture de la caméra, il est possible de revenir à la vitesse de rotation de la cellule.
L’effet de la déformation cellulaire au cours de l’expérience est également limité en supposant que le périmètre reste constant. Sans tenir compte de l'utilisation de fréquences supérieures à MHz en raison de la limitation de bande passante de l'amplificateur, nous reconnaîtrons dans la suite du manuscrit que des alignements optimaux sont obtenus pour des fréquences comprises entre 500 kHz et 1 MHz. De plus, les alignements réalisés à basse fréquence ont mis en évidence l’apparition de phénomènes de lyse avec une amplitude de champ croissante.
Lyse de cellules
- Protocoles électriques
- Résultats de lyse de cellules HEK-293
Résultats d'éclairage induit par un signal pulsé La figure 4.16 montre un résultat d'éclairage obtenu avec un champ pulsé. Le changement de contraste des membranes cellulaires suggère une destruction de la membrane, bien que les cellules conservent une apparence sphérique. Une diminution de la fluorescence de près de 50 % est observée, ce qui peut signifier que près de la moitié du cytoplasme a quitté la cellule (en négligeant l'extinction, figure 4.17.b).
La figure 4.18 met en évidence la relation entre la durée d'impulsion et l'amplitude d'impulsion. Il est à noter que la détermination des conditions limites de lyse renseigne sur le seuil de réversibilité de la membrane cellulaire. À 10 kHz, les cellules sous l'influence du nDEP s'assemblent en filaments généralement centrés au milieu du canal.
Ce phénomène reflétant le passage du nDEP au pDEP est cohérent avec les observations décrites dans la littérature [30][31]. La figure 4.20 montre le comportement différent des cellules HEK-293 en fonction des paramètres de terrain testés. Afin d'évaluer la cohérence de ces observations, l'évolution théorique du TMP (pour un champ donné) est tracée en fonction de la fréquence du champ selon la relation de Schwann (Équation 1.14).
Electrofusion de cellules
- Expériences préliminaires
- Mise au point d’un microsystème dédié à l’électrofusion
Le paragraphe suivant présente les étapes de développement d’un dispositif microfluidique avec des électrodes cPDMS pour l’électrofusion cellulaire. Le développement et l'optimisation du système ont été réalisés à l'aide d'un logiciel de simulation par éléments finis (Comsol®). Ainsi, la longueur du canal principal doit être supérieure à 800 m pour que la cellule passe préférentiellement dans le piège hydrodynamique.
Ainsi à 250 m (Figure 4.27.a), la résistance fluide du canal principal étant bien inférieure à celle du piège, l'écoulement se développe préférentiellement dans le canal principal. La ligne pointillée blanche (Figure 4.27) met en évidence l'influence du rapport Pp/Pc sur le mouvement d'une particule (représentée ici par des lignes noires) à l'intersection. Ces simulations, en accord avec les travaux de Washizu [38], mettent en évidence l'intérêt d'une telle géométrie pour l'électrofusion cellulaire.
Ce chapitre a démontré que tous les phénomènes électrocinétiques (alignement dipolaire, vortex, diélectrophorèse, électrorotation) testés peuvent être réalisés à l'aide d'un dispositif intégrant des électrodes cPDMS. Cependant, ce processus nécessite le développement d’un microsystème complexe pour résoudre le problème de l’appariement cellulaire spécifique. Ce phénomène, qui résulte d'une chute ohmique dans le matériau, nécessite alors de travailler avec des électrodes cPDMS les plus fines possibles (< 100 μm).