acoustiques visant la biodétection rapide sur site

Au Laboratoire d'Etude de l'Intégration des Composants et Systèmes Electroniques IXL - ENSEIRB - Université Bordeaux 1 - UMR CNRS 5818. Je tiens tout particulièrement et chaleureusement à remercier le Professeur Jacques PISTRE, Professeur à l'ENSEIRB, pour son accueil au sein de l'atelier « Capteurs et Microsystèmes.

Problématique du biocapteur

Catalyse

Si les enzymes peuvent perdre leur activité lors de l’étape d’immobilisation, les coenzymes sont dans leur environnement naturel et sont donc plus stables. Ils entraînent une perte de spécificité, mais permettent la détection d’espèces plutôt que de l’analyte exact.

Affinité

Dans cette classe de récepteurs apparaissent également des protéines non catalytiques ou d'origine non immunitaire, des chimiorécepteurs membranaires, qui traversent la membrane cellulaire provoquant une modification structurelle avec ouverture d'un canal ionique (ex : l'acétylcholine utilisée comme neurorécepteur), ou activation. d'une enzyme (par exemple des lectines qui se lient spécifiquement aux sucres et aux polysaccharides, abondants en glycoprotéines à la surface de nombreuses cellules). Les trois processus pouvant se produire : liaison, ouverture d'un canal ionique et activité enzymatique, peuvent être utilisés comme moyen de reconnaissance par un biocapteur.

Hybridation

Empreinte moléculaire

L'immobilisation est donc une étape particulièrement importante dans la réalisation d'un capteur chimique ou biologique. Le biorécepteur doit être immobilisé sur (ou à proximité) de la surface du transducteur, généralement sous la forme d'un film, tout en conservant ses propriétés de reconnaissance moléculaire vis-à-vis de l'analyte d'intérêt.

Adsorption

D'autres critères permettront également de qualifier une technique d'immobilisation : la stabilité dans le temps du film biologique réalisé (lors de l'utilisation et lors du stockage), ainsi que la facilité d'adaptation aux différents biorécepteurs. Enfin, cette étape d'immobilisation s'accompagne généralement d'une étape de saturation des sites non spécifiques, importante pour la spécificité du capteur réalisé.

Piégeage

De plus, la répartition spatiale et l'orientation des biomolécules n'est pas maîtrisée, et les surfaces obtenues sont donc irrégulières et peu reproductibles, ce qui favorise les phénomènes de non-spécificité. Ce processus n'a pas été appliqué à d'autres biocapteurs, principalement en raison de la nature strictement ionique de l'interaction.

Réticulation

Cependant, en raison de sa simplicité et de son faible coût, l’adsorption directe de protéines ou d’autres biomolécules sur des puits en polystyrène est et reste une technique d’immobilisation mondiale dans tous les laboratoires de biologie pour effectuer des tests ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay). A noter l'utilisation de matériaux tels que la poly-L-lysine pour immobiliser les biorécepteurs sur les biopuces [PEL03, TAI05].

Liaison covalente

Assemblage moléculaire

En effet, de plus grandes sensibilités ont été obtenues en attachant de la biotine (réaction biotine-avidine), ou mieux encore une cystéine (réaction cystéine-thiol), à l'espèce à greffer via un bras espaceur [REN05]. En fait, les anticorps se lient, certes de manière orientée, mais uniquement sur les protéines elles-mêmes bien orientées pour les recevoir.

Techniques de dépôts

La liaison de l'analyte provoque des changements physiques dans l'élément de reconnaissance moléculaire que le transducteur doit convertir en une quantité mesurable. Certains transducteurs peuvent également être sensibles aux changements de température, ce qui est intéressant si la connexion provoque une réaction endothermique ou exothermique.

Electrochimique

Les électrodes modifiées peuvent également permettre la détection d'espèces qui ne peuvent normalement pas être détectées par ampérométrie directe, mais qui interfèrent avec les propriétés électrochimiques de l'électrode modifiée, susceptibles d'interagir spécifiquement avec ces espèces. L'électrode de mesure (ISE) est constituée d'une électrode immergée dans une solution de référence interne, séparée de l'électrolyte à analyser par une paroi spécifique : la membrane ionique, qui doit avoir des propriétés de conduction ionique ou électronique permettant l'échange sélectif des espèces cibles avec l'électrolyte, alors qu'il est insoluble dans l'eau et imperméable.

Optique ou opto-chimique

Cependant, cette technique nécessite que la longueur d'onde incidente soit adaptée au spectre d'absorption de l'espèce cible. La majeure partie de l'onde évanescente se trouve dans le diélectrique à moins de 100 nm de l'interface.

Electro-mécanique

Les deux modes de fonctionnement nécessitent un dispositif de mesure de la flèche, statique ou dynamique, obtenue. En effet, la détection d'une nouvelle espèce cible nécessite une étude spécifique de la partie réceptrice qui en assure la reconnaissance.

De l’étude de la propagation de l’onde acoustique…

Le principe du détecteur

Le troisième concerne la sensibilité du dispositif à ondes acoustiques à une variation de chacun des paramètres de la couche réceptrice. Cette sensibilité dépend principalement de la géométrie des structures et de la nature des ondes utilisées.

La sensibilité du dispositif à ondes acoustiques

De plus, cette définition présente l'avantage de pouvoir être généralisée à l'étude de la sensibilité à des paramètres autres qu'une variation de masse surfacique. Avec cette dernière définition de Smv, généralisée à Sxv, un maximum de sensibilité correspond simplement à un maximum sur la courbe représentant cette sensibilité en fonction d'un paramètre quelconque de la structure.

Caractéristiques fréquentielles et effet d’une détection

En plaçant une ligne à retard dans l'ensemble oscillateur, tout changement dans la vitesse de phase ou le déphasage de l'onde pourra être mesuré avec une grande précision par un changement dans la fréquence d'oscillation, comme le montre le diagramme ci-dessous. On peut également observer qu'à même variation de phase, la fréquence f de l'oscillateur et donc la sensibilité du capteur sera d'autant plus grande que la pente de la phase en fonction de la fréquence, soit d /df , est faible.

Caractéristiques temporelles

Influence de la géométrie des électrodes

Les réflexions MEL1 et MEL3 sont en phase, puisque le coefficient de réflexion est le même pour ces deux ondes et que le chemin parcouru par MEL3 est celui parcouru par MEL1 augmenté d'une longueur d'onde. On appelle centres de réflexion (CR) les emplacements du transducteur pour lesquels le coefficient de réflexion acoustique local est purement imaginaire.

Les ondes de Rayleigh (SAW)

Il y aura donc une seule fréquence, appelée synchronisme ou résonance, qui correspond à la propagation effective de l'onde de Rayleigh. Des dispositifs à ondes de Rayleigh ont été étudiés et mis en œuvre pour la détection de composés gazeux, avec de bonnes performances en sensibilité et en seuil de détection [REB92, DEJ94, ZIM02 et références incluses].

Les ondes SH-APM

Ces travaux ont permis de démontrer que la sensibilité à l'effet de masse de ces dispositifs SH-APM était généralement faible, et ne pouvait dépasser celle des ondes de Rayleigh que pour des plaques très fines, de l'ordre de la longueur d'onde, typiquement quelques dizaines de micromètres. ). Figure 16 : Influence de l'épaisseur de la plaque sur la sensibilité relative à l'effet de masse (quartz coupé ST, épaisseur h, = 32 µm, couche sensible CuPC de 0,2 µm d'épaisseur).

Les ondes de Love (SH-SAW)

Modélisation

Cette étude a été réalisée pour tenir compte de la présence d'un milieu fluide adjacent tout en conservant un grand nombre d'hypothèses simplificatrices. Une approche similaire à celle utilisée pour l'étude des ondes SH-APM [TAM02] a permis de prendre en compte des paramètres tels que la piézoélectricité du substrat, les paramètres électriques du fluide adjacent (perméabilité L, conductivité), ainsi que le comportement viscoélastique de la couche fluide ou sensible.

Résultats

21 : Influence de la viscosité d'un fluide maxwellien (à gauche) et des paramètres électriques d'un fluide newtonien (à droite) sur la vitesse de l'onde de Love. Application à l'optimisation de structures et à la caractérisation de matériaux dans le but de réaliser des capteurs.

La ligne à retard

Ce chapitre présente les réalisations technologiques et les validations expérimentales des dispositifs Love Wave pour une utilisation en milieu liquide. La première partie traite de la plateforme de test, incluant les dispositifs eux-mêmes, les cellules de test, ainsi que l'électronique de conditionnement du signal et d'acquisition pour la réalisation d'un système multicapteur portable.

La cellule de mesure

Après une première phase de faisabilité et compte tenu de l'expérience et du savoir-faire acquis par l'ensemble de l'équipe sur plusieurs thématiques et domaines d'application, une nouvelle cellule de test a été créée. Nous avons retenu le principe de base de nos confrères américains, l'équipe du professeur Fabien Josse, qui consiste à réaliser une cellule de test multifonctionnelle pour recevoir l'appareil exposé, les contacts électriques étant réalisés à l'aide de contacts à ressort.

L’oscillateur

Les images suivantes représentent ainsi la cellule proprement dite, en trois éléments : un socle destiné à recevoir l'appareil, une pièce intermédiaire qui assure les connexions électriques (contacts à ressort sur les lignes à retard, connecteurs HF sur les sorties axiales) et enfin un couvercle, qui comprend un joint usiné pour assurer l'étanchéité et insérer une cellule d'un volume de 250 à 500 mL dans le capteur. Ces éléments sont particulièrement essentiels lorsqu'ils sont utilisés en présence d'un milieu de test conducteur adjacent, ou d'un plan de surface métallique, utilisé pour annuler l'effet d'un changement de conductivité électrique sur le capteur.

De l’acquisition du signal au système multicapteur portable

Le débit vers le capteur est maintenu constant, grâce à une pompe péristaltique, qui peut être complétée par un limiteur d'amplitude de pulsation et un capteur de pression, en amont de l'entrée. D'autre part, un traitement du signal exploitant le régime de réponse dynamique de capteurs utilisant un réseau de neurones a été étudié pour fournir des informations en temps réel de type alarme [BOR98].

Corrélation des variations de vitesse et de fréquence

Une conception originale, basée autour d'un microcontrôleur de type HC11, avait permis l'acquisition d'un à quatre canaux de fréquence à environ 100 MHz avec une précision de 1 Hz, nécessaire aux capteurs [CAZ99]. Le point central réside désormais dans les performances de ces capteurs en milieu liquide, qui, du fait d'un milieu de test plus complexe et d'interactions très différentes, jusqu'ici moins connues et moins maîtrisées, sont encore inférieures à celles obtenues en milieu gazeux. et sont insuffisants pour un grand nombre d’applications.

Influence du volume de liquide

Influence de la viscosité

Ils ont également étudié l'effet de la viscosité sur les pertes de transfert en mesurant les pertes à l'aide d'un analyseur de maillage et comparé avec un résultat théorique reliant les variations de perte de transfert aux variations de vitesse de phase dues à la variation de viscosité dans le régime newtonien [ JAK98 ].

Influence de la permittivité électrique

En effet, l'admittance ramenée par le fluide modifie la valeur des paramètres de l'admittance équivalente du transducteur (cf. §1.5), sauf Rs, notamment en raison de sa permittivité électrique [JAK97]. Ainsi, une variation expérimentale de fréquence relative due à la présence d'eau de -1270 ppm a été compilée pour environ -580 ppm d'effets mécaniques (valeur théorique vérifiée à l'aide d'une ligne à retard dont la surface est métallisée pour annuler les effets électriques), pendant environ - 280 ppm d'effets électriques sur la propagation des ondes et environ -410 ppm d'effets électriques sur les transducteurs.

Influence de la conductivité électrique

Concernant les paramètres électriques (conductivité, permittivité), la comparaison a montré l'importance des effets sur la réception des transducteurs interdigitaux par rapport à ceux sur la propagation des ondes, les seuls étudiés avec le modèle actuel. Une telle enceinte est intéressante pour plusieurs raisons : volume réduit de l'échantillon à analyser (1 mm3= 1μL, 1μm3= 1 fL), enceinte du milieu réactionnel proche de la surface sensible (sensibilité et vitesse de réaction), production en série et parallélisation.

Application à la biodétection

Bactéries

Parmi elles, la bactérie Escherichia coli (E. coli) mesure environ 1 μm de long, les Pseudomonas environ 3 μm. Citons notamment le streptomyces coelicolor qui constitue les deux tiers des antibiotiques, ou encore la bien connue Escherichia coli (E. coli) dont la présence dans nos intestins contribue à la digestion.

Virus et bactériophages

Autres espèces cibles et données récapitulatives

La masse des protéines ou groupes de protéines est généralement exprimée en Da, cependant, une masse molaire équivalente est donnée ici, en italique dans ce cas, pour comparer les masses respectives des espèces entre elles.

Interactions antigènes - anticorps

Les forces impliquées dans les interactions entre l’antigène et l’anticorps sont des liaisons chimiques faibles. La cohésion est également assurée par la pression hydrostatique exercée par les molécules d'eau adjacentes.

Choix de modèle biologique

Cependant, puisque l’anticorps est dirigé contre la protéine g8p, qui est absente des extrémités des phages, l’amarrage ne devrait pouvoir se produire qu’en présence d’un très grand nombre de phages. La première étape permettant d'avoir une ligne à retard dans le montage du capteur consiste à déposer une membrane d'anticorps AM13 sur la surface SiO2, en fonction de la propagation des ondes de Love et à maintenir ses propriétés d'immobilisation sélective par rapport à celles-ci. du bactériophage cible.

Greffage des anticorps sur la ligne à retard

Ce test a également permis de valider la fonctionnalité de l'anticorps en mesurant la possibilité qu'un anticorps anti-salmonelle se lie à son antigène (une bactérie salmonelle) après avoir été inoculé à la surface de la ligne à retard. Leur présence effective valide le protocole de dépôt et la fonctionnalité de la couche d’anticorps sensible.

Réponse temps réel du capteur au greffage des anticorps

Figure 13 : Réponse en fréquence de la ligne à retard (en haut) et en température (en bas) du système lors du dépôt de la couche sensible. Nous distinguons alors trois domaines distincts qui dépendent de la cinétique de dépôt des couches.

Amélioration du greffage des anticorps

15 : Représentation symbolique du GPTS ((3-Glycidoxypropyl)triméthoxysilane) (à droite) et de la surface Si/SiO2 silanisée au GPTS. Avec la protéine G, le greffon n'est pas covalent, mais il est fort du fait de la forte affinité entre la protéine et l'anticorps.

Immobilisation sur le capteur

Le volume et la concentration en pfu.mL-1 de la solution de bactériophages sont choisis en fonction de l'application souhaitée. La procédure de titrage consiste tout d'abord à diluer plusieurs fois la solution de bactériophage.

Réponse temps réel du capteur

Dans la figure précédente, pour la plus petite concentration de phage injecté (1,6.109pfu.mL-1), on observe avec le dispositif Love wave une variation de la fréquence d'oscillation du capteur d'environ –1,15 kHz après 10 minutes et –6 kHz après deux . heure (correspondant à une variation relative de fréquence de 14 ppm et 69 ppm, respectivement). De plus, l’appareil Love wave est loin de la saturation au bout de 10 min, contrairement aux QCM.

Analyse de la sensibilité du capteur

En utilisant la relation précédente nous estimons une sensibilité à la vitesse à l'effet de masse expérimental de l'ordre de 1 m2.kg-1. La plus petite densité de masse détectable serait alors d'environ une dizaine de ng.mm-2.

Investigations préliminaires

Par exemple, comme l'illustre la figure suivante, l'injection d'anticorps secondaires a permis une amplification de la réaction d'un facteur d'environ 10, par rapport à la détection directe initiale de l'entérotoxine B staphylococcique, avec une limite de détection de 0,5 ng.mL. -1 [HOM02]. De plus, l’amélioration de la sensibilité des capteurs à ondes acoustiques dans le cas de la détection de bactéries n’a pas encore été expliquée.

Bilan et nouvelle approche immunologique

D'une première étape qui a validé la détection d'un bactériophage et d'autres petites espèces (protéines, anticorps, bactéries lysées), un vaste travail de fond associant très étroitement électroniciens, chimistes et immunologistes a finalement permis la détection de bactéries entières, vivantes. La réalisation de dispositifs et d'une plateforme de test multicapteurs adaptés pour fonctionner en milieu liquide est ensuite présentée, jusqu'à un prototype de système multicapteurs connectant un système millifluidique en vue d'une automatisation complète du système à terme.

Principe de la technique ELISA

Un autre ensemble de noms et d'unités est également utilisé : le coefficient d'extinction molaire pour (L.mol-1.cm-1), l'épaisseur de la solution (cm) et la concentration c (mol.L -1).

Variantes de la technique ELISA

Le test direct est efficace lorsque l’antigène cible est petit, ne possède qu’un nombre limité d’épitopes et se lie facilement au puits. Le test indirect ou sandwich sera privilégié si l'antigène cible ne s'adsorbe pas bien sur le puits.

Modes et techniques de détection

Une technique utilisant des particules magnétiques d'environ 1µm, sur lesquelles les anticorps sont fixés de manière covalente, a également été développée par la société Ohmicron. Après incubation et avant lavage, un champ magnétique permet d'attirer les anticorps vers les parois du puits via les billes magnétiques.

Bilan

De plus, la quantité d’anticorps peut être plus importante, car ils peuvent recouvrir la surface des billes magnétiques, permettant ainsi d’améliorer la réponse globale. Un grand avantage du biocapteur dans le cas d’une détection directe est la possibilité de suivre l’immobilisation de l’espèce cible, sans marquage ni injection d’un autre anticorps.

Anticorps polyclonaux (Pab)

Nous présentons ici seulement les grandes lignes d'un protocole classique de production d'anticorps polyclonaux, de [ROU97] et monoclonaux, de [KOO04].

Anticorps monoclonaux (Mab)

C'est une partie non protéique, généralement composée d'un oligoélément ou d'une vitamine, de faible poids moléculaire (ATP : 500 ; biotine : 185). Structure présente à la surface d'une molécule d'antigène capable de se combiner avec une seule molécule d'anticorps.