Introduits à différentes interfaces entre sous-unités d'un récepteur GluN1/GluN2, ces acides aminés non naturels (UAA), capables de photobridging, ont permis de révéler le rôle joué par deux interfaces entre les sous-unités GluN1 et GluN2, et plus précisément : (1) via l'interface entre les lobes supérieurs des ATN, dans le contrôle de l’activité « sous-unité spécifique » ; et (2) via l'interface entre les lobes inférieurs des ABD, lors de l'inhibition allostérique des récepteurs par le zinc extracellulaire. MTN dans la spécification des fonctions d'un rNMDA en fonction des sous-unités qui le composent.
INTRODUCTION SUR LES RECEPTEURS-CANAUX
- Bref historique de la recherche sur les canaux ioniques
- Aperçu général des canaux ioniques activés par les ligands
- Les récepteurs-canaux trimériques
- Les récepteurs-canaux tétramériques
- Les récepteurs-canaux pentamériques
La figure 23 représente les structures de plusieurs canaux récepteurs dont celui du récepteur GluA2 de rat AMPA (rAMPA), celui du poisson zèbre P2X4 activé par l'ATP, celui du nAChR, ainsi que les structures d'un canal potassique potentiellement activé (famille des canaux Shaker). ) et la rhodopsine du récepteur couplé aux protéines G (GPCR) (Fehrentz et al., 2011). La superfamille des récepteurs pentamères vertébrés comprend les nAChR excitateurs et perméables aux cations, les récepteurs sérotoninergiques (5-HT3) et les récepteurs activés par le zinc (ZAC), ainsi que les récepteurs inhibiteurs perméables aux anions, l'acide γ-aminobutyrique (GABAA) et l'acide glycinergique. récepteurs (GlyR) (Fig. 1.7 ; Corringer et al., 2012 ; Thompson et al., 2010).
RECEPTEURS DU GLUTAMATE
Récepteurs métabotropiques du glutamate
Il est également essentiel pour l'expression des rAMPA à la surface cellulaire (Salussolia et al., 2011). Cette approche permet notamment d'estimer la proximité de deux sous-unités adjacentes (Krovetz et al., 1997).
Récepteurs-canaux (ou ionotropiques) du glutamate
- Propriétés générales des récepteurs-canaux du glutamate
- Récepteurs AMPA
- Récepteurs kainate
- Récepteurs delta
- Récepteurs NMDA
- Diversité moléculaire et distribution des sous-unités
- Propriétés biophysiques
- Modulations allostériques
- Rôle des NTDs dans la régulation de l’activité des récepteurs NMDA
- Physio-pathologie des récepteurs NMDA
- Architecture moléculaire et organisation modulaire des récepteurs-canaux du
- Topologie membranaire et organisation modulaire
- Arrangement tétramérique des iGluRs
- Mécanismes structuraux d’activation
- Mécanismes structuraux de désensibilisation
BIOGENESE ET ARRANGEMENT DES RECEPTEURS-CANAUX DU
Assemblage des récepteurs-canaux
Cela est particulièrement vrai pour les récepteurs musculaires nicotiniques de l'acétylcholine (nAChR) ( Wanamaker et al., 2003 ) et les récepteurs NMDA (rNDMA ; Cull-Candy et al., 2001 ). L'assemblage des récepteurs des canaux pentamères a été étudié depuis le début des années 1990 avec des travaux sur le nAChR Torpedo (Green et al., 1993) puis sur les nAChR de cellules musculaires de souris (Kreienkamp et al., 1995). Enfin, le réseau aromatique d'interactions entre les trois segments transmembranaires M1, M3 et M4 s'est récemment révélé être un élément essentiel dans la composition des récepteurs glycinergiques, une sous-famille des récepteurs pentamères (Haeger et al., 2010).
Là encore, les résidus des domaines N-terminaux des sous-unités GABAA (en particulier β3 et α1) ont été désignés comme essentiels à l'assemblage des récepteurs ( Klausberger et al., 2001 ). La stœchiométrie des récepteurs contenant P2X6 dépend de l'expression relative des sous-unités dans une région donnée ( Barrera et al., 2007 ). 117 et P2X1, lorsqu'ils sont co-exprimés, forment préférentiellement des hétéromères plutôt que des homomères (Aschrafi et al., 2004).
D'autre part, le segment transmembranaire TM2 est essentiel à l'assemblage des récepteurs (Torres et al., 1999).
L’assemblage et l’arrangement des sous-unités au sein d’un récepteur AMPA
Cela explique probablement les différentes affinités d'homodimérisation observées des MTN en fonction de la sous-unité (Rossmann et al., 2011 ; Greger et al., 2007). Bien que l'assemblage des NTD à partir des sous-unités GluA2 soit très favorisé (Kd inférieur à 2 nM), les sous-unités GluA3 se dimérisent très difficilement (Kd supérieur à 1 mM). Ces affinités spécifiques aux MTN et les concentrations relatives de sous-unités, qui diffèrent en fonction de la population neuronale, sont des déterminants importants du processus d'assemblage tétramérique des rAMPA (Rossman et al., 2011).
À l’inverse, les sous-unités GluA2 abondantes dans les neurones pyramidaux se dimérisent très facilement (Kd < 2 nM) et les sous-unités GluN1 prédominantes dans les interneurones forment des assemblages d’affinité intermédiaire. D'après Rossman et al., 2011). Enfin, le domaine transmembranaire (TMD) des rAMPA est également impliqué dans la dimérisation initiale entre sous-unités, mais surtout dans l'oligomérisation ultérieure (Fig. 3.3 ; Ayalon et al., 2001). Cependant, in vivo on retrouve principalement des rAMPA hétérotétramères, qui lient le plus souvent une sous-unité GluA2 à l'une des sous-unités GluA1 ou GluA3 (Traynelis et al., 2010).
L'assemblage se termine ensuite par la tétramérisation des TMD, l'hétérodimérisation des ABD (association entre ABD de deux dimères différents), et éventuellement un réarrangement des interfaces entre NTD (Herguedas et al., 2013).
Cas particulier des récepteurs NMDA hétérotétramériques
Les sous-unités GluN2 (NTD roses) restent monomères, tandis que les sous-unités GluN1 (NTD vertes) se dimérisent via leur NTD. La composition et la disposition spatiale des sous-unités dans un canal récepteur déterminent en grande partie sa fonction (Chang et al., 2008). Trois possibilités d'arrangement relatif des sous-unités dans la couche ABD, à partir des hétérodimères GluN1/GluN2A et du modèle rAMPA-GluA2 (Sobolevsky et al., 2009).
183 sous-unités GluN1 et GluN2 dans la rNMDA et exprimées au niveau de la membrane plasmique (Fig. 1.9). Ces différentes observations suggèrent donc un arrangement non alterné des sous-unités GluN1 et GluN2A d'un rNMDA. Les données de l'AFM suggèrent un arrangement non alterné des sous-unités GluN1 et GluN2A dans l'ensemble d'un récepteur NMDA.
Cette valeur représente l'angle formé par deux sous-unités GluN1 consécutives (D) ou deux sous-unités GluN2 consécutives (E). Les sous-unités GluN1 et GluN2 ne contribuent pas de manière égale à l'activité d'un récepteur NMDA. De même, dans une rKA GluK1-K3/GluK5, les sous-unités GluK5 jouent un rôle central dans l'activation du récepteur ( Fisher et al., 2011 ).
UNE NOUVELLE APPROCHE : UTILISATION D'ACIDES-AMINES NON-
L'incorporation d’UAAs génétiquement encodés : une technologie
- Rappel historique sur la méthodologie des UAAs
- Concept d'expansion du code génétique
Applications biologiques de l'expansion du code génétique
- Etude des interactions protéine-protéine et protéine-ligand
- Détection de changements conformationnels
- Contrôle de l'état d’activation d'une protéine avec des UAAs photo-cagés
- Etude des modifications post-traductionnelles
La disposition spatiale des sous-unités autour du pore dans un rNMDA tétramère reste donc un sujet controversé. Co-exprimées, les sous-unités GluN1 et GluN2 (ou GluN3) s'oligomérisent et migrent vers la membrane plasmique (Mc Ilhinney et al., 1998 ; Atlason et al., 2007). Seul un arrangement 1-1-2-2 non alterné avec des sous-unités identiques adjacentes permet d'interpréter ce résultat.
De plus, toutes ces études visant à déterminer la disposition des sous-unités dans un rNMDA ont été réalisées dans un système recombinant (ovocytes de Xenopus ou cellules HEK). Prenons par exemple un rAMPA de type GluA1/GluA2, dont les sous-unités identiques sont disposées en diagonale ( Mansour et al., 2001 , Balasuriya et al., 2013 ). Notre étude a montré que dans le cas du rNMDA, les sous-unités GluN1 et GluN2A étaient disposées autour du pore dans un ordre 1-2-1-2.
L'interface de tétramérisation pour les NTD de la rKA hétérotétramère est donc assurée par les sous-unités GluK2.
Utilisation des UAAs dans l’étude des récepteurs membranaires
- Applications aux récepteurs couplés aux protéines G
- Applications aux récepteurs-canaux
Expansion du code génétique: perspectives et applications in vivo
Néanmoins, la première approche se limite aux systèmes d’expression hétérologues, qui ne conviennent pas à l’étude de la signalisation neuronale et des circuits neuronaux. A l’opposé, l’approche d’expansion du code génétique permet l’incorporation d’UAA dans des systèmes recombinants, dans des neurones en culture, mais aussi et surtout in vivo, par exemple dans le cerveau des animaux. Premièrement, les auteurs ont exprimé ces canaux mutés dans un système hétérologue, dans des cellules HEK.
En changeant le canal d'une conformation « pores bloqués » à une conformation « sans pores », sous l'effet de la lumière, les auteurs ont pu contrôler l'activation de ce « PIRK » (canal potassique photo-activable et rectifiant vers l'intérieur). ), qui leur a fourni des informations sur la relation entre la structure du canal et l'activité. Cette méthode s'est avérée concluante puisqu'elle a pu, pour la première fois, exprimer un canal potassique photo-activé dans les neurones du néocortex et du diencéphale d'embryons de souris. Il s'agit de la première application in vivo, chez les mammifères, de l'extension du code génétique.
La mutagenèse des UAA par expansion du code génétique permet des études détaillées des canaux et récepteurs ioniques, de leur structure et de leurs fonctions, avec une précision moléculaire raffinée.
ARRANGEMENT DES SOUS-UNITES AU SEIN D'UN RECEPTEUR NMDA
Contexte de l'étude
- Arrangement multimérique des récepteurs-canaux
- Arrangement des sous-unités dans un récepteur AMPA
- Le cas des récepteurs NMDA : un arrangement débattu
- Approche adoptée dans cette étude
Ainsi, différentes stœchiométries de liaison aux sous-unités sont possibles pour chacun des sous-types de récepteurs en question. Les mêmes sous-unités peuvent également être diamétralement opposées (la disposition est alors dite « alternée » ou de type 1-2-1-2 ; Fig. 1.3.B). Ces récepteurs sont en réalité constitués de deux sous-unités tandem GluN1 et/ou GluN2A.
Les auteurs concluent que dans un rNMDA fonctionnel, les sous-unités sont disposées selon un arrangement non alterné, GluN1/GluN1/GluN2A/GluN2A (Fig. 1.3.A). Ces dernières sont désignées comme les sous-unités proximales (au niveau des ABD), B et D étant les sous-unités distales. Pour déterminer la disposition relative des sous-unités GluN1 et GluN2 dans les rNMDA, Sobolevsky et al. 2009) ont introduit des cystéines dans les ABD de ces sous-unités à des positions homologues à celles correspondant à l'interface de tétramérisation rAMPA (Fig. 1.4).
Selon nos modèles, seules les cystéines des sous-unités proximales (la paire A/C) sont suffisamment proches pour établir un pont.
Article 1
Discussion
- Principaux résultats
- Quid des autres sous-types de récepteurs NMDA ?
- L'arrangement des récepteurs GluN1/GluN2 : la controverse relancée
- Perspectives
- Asymétrie structurale et fonctionnelle des sous-unités dans un récepteur-canal
Ce résultat écarte donc l'hypothèse d'une formation de pont disulfure des sous-unités GluN1 qui aurait été catalysée par CuPhen. Dans un premier temps, nous avons étudié la proximité des ABD des sous-unités GluN1 dans un rNMDA GluN1/GluN2B en utilisant une approche identique à celle développée dans notre publication (Riou et al., 2012 ; Fig. 3). Ces résultats, similaires à ceux obtenus pour les récepteurs GluN1/GluN2A, favorisent un arrangement alterné de type 1-2-1-2 avec les sous-unités GluN1 formant l'interface de tétramérisation à la sortie des pores.
Les auteurs ont décoré les sous-unités GluN1 et GluN2A séparément, avec des anticorps différents, dirigés contre les NTD ou contre les ABD des sous-unités (Fig. 1.9.A). En particulier, nous avons évalué la sensibilité des récepteurs au glutamate, un agoniste du rNMDA qui se lie aux ABD des sous-unités GluN2A. Malgré de nombreuses études, dont la nôtre, en faveur d'un arrangement de sous-unités de type 1-2-1-2 autour du pore dans un rNMDA, cela reste controversé.
Déterminer la disposition des sous-unités dans l’ensemble du récepteur iGluR est la première étape vers la compréhension de l’organisation globale du récepteur.
INCORPORATION D’ACIDES-AMINES NON-NATURELS DANS LES
Incorporation d’acides-aminés non-naturels génétiquement encodés dans les
- Contexte de l'étude
- Article 2
- Discussion
Le FRET intramoléculaire est basé sur l'incorporation de fluorophores donneurs et accepteurs à différentes positions de la protéine d'intérêt. Les modifications des valeurs de FRET permettent de suivre la dynamique moléculaire à l'échelle de la milliseconde et fournissent, dans le cas des canaux récepteurs, des informations essentielles sur la dynamique conformationnelle lors de l'activation, de la désensibilisation, etc. Expression directe maintenant dans le système de paires orthogonales sélectionné {suppresseur d’ARNt et aminoacyl-ARNt synthétase (aaRS)}.
Elle permet également de multiples recharges d’ANRt et son amplification au fur et à mesure de la traduction des protéines, contrairement à l’approche chimique pour laquelle l’ARNt, consommé stœchiométriquement lors de la synthèse de la protéine d’intérêt, s’épuise progressivement. Cependant, les exigences de la méthode, notamment la nécessité d'obtenir des couples {aaRS/tRNA-suppressor} strictement orthogonaux (c'est-à-dire n'interférant pas avec la machinerie de traduction endogène), freinent son développement. L'ovocyte présente des avantages pour l'inclusion d'UAA, car il se caractérise par sa très grande taille, qui permet de micro-injecter directement le matériel génétique dans le noyau cellulaire, sans qu'il soit nécessaire de réaliser des transfections d'ADN.
Le but de notre travail était de vérifier que la co-injection, dans un ovocyte de Xenopus, d'un ARNt suppresseur issu de Bacillus stearothermophilus, de l'enzyme synthétase correspondante, issue de E. coli, et des ADNc des -unités de rNMDA , dont l'un a introduit le codon stop ambre à une position spécifique, a conduit à l'expression de récepteurs entiers, membranaires et fonctionnels, lorsque les ovocytes ont été incubés, après injection, avec l'UAA d'intérêt, en l'occurrence des analogues de la tyrosine, p -azido-L-phénylalanine (AzF) ou p-benzoyl-L-phénylalanine (Bpa).
Création d'un récepteur NMDA contrôlé par la lumière par incorporation
- Contexte de l'étude
- Article 3
- Supplément d'informations
- Discussion
- Conclusions de l'étude et perspectives
- L'expansion du code génétique, une nouvelle méthode pour obtenir des
Photo-pontage "état-dépendant" de récepteurs NMDA-GluN1/GluN2A
- Contexte de l'étude
- Méthodes
- Résultats
- Modélisation par homologie d'un dimère d'ABDs GluN1/GluN2A dans
- Incorporation dacides-aminés non-naturels photo-réactifs dans la région
- Caractérisation de la photo-inactivation du récepteur GluN1wt/
- Propriétés fonctionnelles du récepteur GluN1wt/GluN2A-N697AzF
- Pontage inter-sous-unités du récepteur GluN1wt/GluN2A-N697AzF
- Le récepteur GluN1wt/GluN2A-N697AzF est aussi photo-inactivé dans
- Discussion
- Conclusions de l'étude
- Perspectives de l'étude
RESULTATS