Ces deux fonctions distinctes décrites pour la grande sous-unité CAF-1 impliquent différents niveaux d'organisation de la chromatine. Ainsi, mes travaux ont permis de démêler les deux fonctions de la grande sous-unité CAF-1 chez la drosophile.
La chromatine : une structure dynamique
Structure de la chromatine
- Le nucléosome, unité de base de la chromatine
- Compactions d'ordre supérieur
- Une forme de chromatine compacte : l'hétérochromatine
Les régions N- et C-terminales des histones sont faiblement structurées et dépassent de la surface du nucléosome (Luger et al., 1997). De plus, il a été récemment démontré que ces deux structures coexisteraient dans certaines conditions in vitro au sein de la fibre de 30 nm ( Grigoryev et al., 2009 ).
Organisation fonctionnelle de la chromatine
- Les variants d’histones
- Les modifications post-traductionnelles des histones
- La méthylation de l’ADN
Par exemple, les di- ou triméthylations (H3K9me2 ou H3K9me3) se retrouvent généralement au niveau de gènes réprimés, tandis que la monométhylation (H3K9me1) se retrouve au niveau de certains gènes transcrits (Barski et al., 2007). Depuis, une très faible méthylation des cytosines a été décrite chez cet organisme, retrouvée principalement dans l'embryon (Lyko et al., 2000).
La protéine d’hétérochromatine 1 (HP1)
- La variégation par effet de position
- Structure des protéines de la famille HP1
- Localisation nucléaire d’HP1
- Les multiples fonctions d’HP1
- Fonctions d’HP1 au niveau de l’hétérochromatine et de la répression
- Fonction des protéines HP1 dans la structure des chromosomes
- Fonction d’HP1a dans l’activation transcriptionnelle chez la drosophile
- Les protéines HP1 interagissent avec de nombreuses protéines
- Les différents paralogues d’HP1 chez la drosophile
C'est le cas de HP2 (Heterochromatin Protein 2), qui est également impliquée dans la répression transcriptionnelle lors du PEV (Shaffer et al., 2002). De plus, chez la drosophile, ces protéines se localisent dans les régions hétérochromatiniennes des chromosomes polytènes (Schotta et al., 2002). De plus, l'absence de Suv3-9 chez la drosophile induit une forte diminution de la méthylation de H3K9 dans les régions constitutives de l'hétérochromatine et perturbe fortement le recrutement de HP1a (Schotta et al., 2002).
De même, l'absence de Suv3-9 chez la souris induit des défauts de ségrégation chromosomique lors de la méiose ( Peters et al., 2001b ). Cette fonction des protéines HP1 dans la ségrégation des chromosomes pourrait être liée à leur interaction avec la cohésine, caractérisée jusqu'à présent chez la levure (Nonaka et al., 2002). En effet, la perte de fonction de HP1a chez la drosophile induit clairement une réduction de l'expression des gènes coiled et light situés dans les régions d'hétérochromatine ( Lu et al., 2000 ).
En effet, l'activation d'un gène de réponse au choc thermique peut induire le recrutement de HP1a dans ce gène chez la drosophile (Piacentini et al., 2003). Les différentes isoformes de HP1 peuvent ainsi interagir avec des protéines impliquées dans la ségrégation des chromosomes (INCENP), dans la régulation de la transcription (TAFII130), dans les processus de réplication (ORC), dans la réparation (Ku70) ou encore dans l'assemblage des nucléosomes (CAF-1). (pour une revue, voir (Hiragami et Festenstein, 2005 ; Lomberk et al., 2006b)). Fait intéressant, le domaine chromo-ombre des protéines HP1 peut se dimériser pour former des dimères HP1 ( Brasher et al., 2000 ; Cowieson et al., 2000 ).
LES CHAPERONS D’HISTONES
Le chaperon ASF1
- Un donneur d’histone pour l’assemblage de la chromatine
- Rôle d’ASF1 au cours de la réplication
Le rôle chaperon des histones de la protéine ASF1 a ensuite été clairement démontré par la purification, chez la drosophile, d'un complexe appelé RCAF (pour replication assembly factor) composé des histones H3-H4 et de l'homologue ASF1 (Tyler et al., 1999). ASF1 interagit également avec le suiveur HIRA (pour HIstone. Regulator A), un facteur d'assemblage dont l'activité est indépendante de la réplication (Tagami et al., 2004). La purification, à l'aide d'histones marquées, de complexes contenant les variantes d'histone H3.1 et H3.3 précédemment exclues confirme qu'ASF1 fait partie des voies canoniques et alternatives de l'assemblage de la chromatine des histones (Tagami et al., 2004).
La présence d'ASF1 dans ces complexes et son incapacité à incorporer ces histones dans la chromatine suggèrent que ce chaperon pourrait servir de fournisseur d'histone pour CAF-1 et HIRA. Ces deux derniers assureraient alors l’incorporation des dimères H3-H4 dans la chromatine par différents mécanismes. La réplication est une étape cruciale dans la dynamique de la chromatine, car la progression des fourches nécessite le déploiement des nucléosomes situés en amont et leur réassemblage en aval sur des brins nouvellement synthétisés.
De plus, ASF1 a été co-purifié avec des hélicases MCM (maintenance des minichromosomes) chargées de séparer les deux brins d'ADN en amont de la fourche de réplication (Groth et al., 2007). Enfin, la déplétion en ASF1 conduit à une accumulation de cellules en phase S, illustrant une prolongation significative de la phase S (Groth et al., 2007). Ces résultats indiquent que le chaperon ASF1 pourrait être recruté par les MCM et participer au désassemblage des nucléosomes en amont de la fourche de réplication.
Le complexe HIRA
- L’assemblage de la chromatine indépendant de la réplication
- Importance fonctionnelle d’HIRA au cours de l’embryogenèse
Lorsqu'une protéine impliquée dans le dépôt des histones est épuisée, ces extraits perdent leur capacité à favoriser l'assemblage de la chromatine, mais cette propriété peut être restaurée en ajoutant la protéine manquante ( Ray-Gallet et Almouzni, 2004 ). Cette méthode a été utilisée avec succès pour identifier la protéine HIRA (Histone Regulator A) en tant que facteur de dépôt d'histone H3-H4 de manière indépendante de la synthèse de l'ADN (Ray-Gallet et al., 2002). Alors que CAF-1 fonctionne spécifiquement dans l'assemblage de nouvelles histones H3.1-H4 de manière couplée à la réplication (voir chapitre III.3), HIRA permet l'incorporation des histones H3.3-H4 sous forme de dimères de réplication. manière indépendante (Tagami et al, 2004).
Des études récentes suggèrent que HIRA participe plus spécifiquement à l'incorporation de H3.3 au niveau des régions génétiques, mais pas au niveau des régions répétitives telles que les télomères (Elsaesser et al, 2010; Goldberg et al, 2010). De plus, au cours du développement de la drosophile, HIRA joue également un rôle essentiel dans l'assemblage de H3.3 dans la chromatine du génome paternel lors de la fécondation (Bonnefoy et al, 2007). La fécondation provoque des changements importants dans la structure chromatinienne du génome paternel transmis par les spermatozoïdes.
Pour permettre le bon développement de l'ovocyte, de nombreuses étapes sont nécessaires qui impliquent la décondensation de ce noyau et l'échange de protamines par les histones du cytoplasme de l'ovocyte. L'étude d'un mutant ponctuel du gène codant pour la protéine HIRA chez la drosophile a révélé le rôle essentiel de ce chaperon dans ce processus (Loppin et al. 2005). Contrairement aux embryons de type sauvage, les embryons de femelles mutantes homozygotes HIRA n'incorporent pas le variant H3.3 dans ce pronoyau en formation.
Le complexe protéique CAF-1
- Structure et domaines des sous-unités de CAF-1
- CAF-1 et l’assemblage couplé à la synthèse d’ADN
- Rôle de CAF-1 dans les différents organismes
- Rôle de la grande sous-unité de CAF-1 dans le maintien de
- Rôle de P180 dans la ségrégation des chromosomes pendant la méiose
La grande sous-unité interagit avec P60 via le domaine C-terminal, essentiel au bon fonctionnement du complexe CAF-1 (Kaufman et al. 1995). Chez l'homme et le Xenopus, un domaine de dimérisation a également été identifié à l'extrémité C-terminale des grandes sous-unités CAF-1 (Quivy et al. 2001). Par exemple, l’injection d’ARN messager codant pour la grande sous-unité humaine CAF-1 dans des embryons de Xenopus entraîne un arrêt rapide du développement embryonnaire précoce (Quivy et al. 2001).
Enfin, les embryons de souris mutants pour la grande sous-unité arrêtent leur développement au stade seize cellules et présentent des défauts d'organisation nucléaire importants (Houlard et al. 2006). L'analyse de la grande sous-unité mutante de CAF-1 a révélé dans ces cellules des défauts de réplication des régions euchromatiques, une accumulation de cassures d'ADN et un défaut d'organisation des nucléosomes sur l'ADN nouvellement synthétisé (Klapholz et al., 2009). De nombreuses expériences sur des cellules en culture ont également montré que l'épuisement de la grande sous-unité du complexe CAF-1 induit un fort défaut de prolifération pouvant conduire à la mort cellulaire (Hoek et Stillman, 2003 ; Houlard et al., 2006 ; Quivy et al. ., 2004 ; Takami et al., 2007 ; Ye et al., 2003).
De plus, l'épuisement de mP150 entraîne des défauts de réplication importants spécifiques aux régions d'hétérochromatine enrichies en protéines HP1 (Quivy et al., 2008). Le rôle de la grande sous-unité du complexe CAF-1 dans le maintien de l'hétérochromatine a également été démontré chez la drosophile. En effet, la déplétion de la grande sous-unité de CAF-1 chez la drosophile, P180, par des approches d'interférence d'ARN d'organisme entier montre des défauts dans le recrutement de nombreuses marques d'hétérochromatine dans les régions péricentriques des chromosomes qui dépendent de la dose de P180 exprimée (Huang et al. , 2010).
RESULTATS PRELIMINAIRES OBTENUS AU LABORATOIRE
Analyse du mutant p180 3
- Obtention du mutant p180 3
- La contribution maternelle de P180
- Rôle de CAF-1 dans l’organisation de la chromatine
Ces expériences démontrent en outre que les larves mutantes éclosent et se développent pendant 48 h en l'absence de la protéine zygote détectable P180. De plus, l'acquisition de clones germinaux mutants qui ne parviennent pas à se développer indique que CAF-1 est essentiel au développement de la lignée germinale femelle au cours de l'ovogenèse. Connaissant la fonction biochimique du CAF-1 pour assembler des nucléosomes sur l'ADN lors de la réplication, Benjamin Klapholz a tenté d'analyser l'organisation des nucléosomes chez des larves mutantes qui passent plusieurs heures en l'absence de la protéine détectrice P180.
De plus, chez les mutants p1803, Benjamin Klapholz a observé une diminution de l'efficacité de la réplication, comme le montre le marquage DAPI des cellules des glandes salivaires endocytaires et la mesure de la quantité d'ADN par cellule. cellule. En effet, les noyaux du mutant apparaissent plus petits et la quantité d'ADN répliqué plus faible, comme le montre d'une part la faible incorporation du nucléotide synthétique BrdU (Bromodeoxyuridine) dans les mutants p1803 et d'autre part l'analyse de détection quantitative. régions spécifiques du génome. Également lié au rôle de la grande sous-unité de CAF-1 dans l'incorporation de nucléosomes sur l'ADN nouvellement synthétisé, le marquage des extrémités 3'-OH de l'ADN des noyaux des cellules des glandes salivaires a montré une augmentation significative des cassures de l'ADN dans mouches exprimant l’allèle nul de p180.
Enfin, la létalité des mouches et ces défauts ont été sauvés grâce à l'expression omniprésente dans le transgène P180 en utilisant la technique Gal4/UAS ( Brand et al. 1993 ). Tous ces résultats rassemblés dans une seule publication (Klapholz et al., 2009) ont permis de mettre en évidence le rôle de la grande sous-unité de CAF-1 dans l'organisation de la chromatine et dans l'efficacité du processus de réplication chez la Drosophile.
Analyse du rôle de P180 dans le système de ségrégation achiasmatique
- Défauts de ségrégation
- Maintien de l’appariement péricentrique
- Rôle d’HP1a dans la ségrégation achiasmatique
- P150 murin : un outil pour séparer les fonctions de P180
Mutations in the folding domain of heterochromatin protein 1 (HP1) affect HP1 protein interactions and chromosome distribution. A mutation in a chromosomal heterochromatin-specific protein is associated with suppression of position-effect variegation in Drosophila melanogaster. Molecular basis for differentiation of repressive methyl-lysine marks in histone H3 by Polycomb and HP1 chromodomains.
Molecular cloning of a human homologue of Drosophila heterochromatin protein HP1 using anti-centromeric autoantibodies with anti-chromo specificity. Establishment of Histone H3 methylation on the inactive X chromosome requires transient recruitment of Eed-Enx1 Polycomb group complexes. SET domain-containing protein, G9a, is a novel lysine-preferring mammalian chitone methyltransferase with hyperactivity and specific selectivity for lysines 9 and 27 of histone H3.
Positive selection drives the evolution of rhino, a member of the heterochromatin protein 1 family in Drosophila. Phosphorylation of heterochromatin protein 1 by casein kinase II is required for efficient heterochromatin binding in Drosophila.
