Un canal KAT P fonctionnel résulte de l'association unique d'un récepteur, le récepteur de sulfonylurée (SUR), et d'un canal potassique entrant Kir6.x. On peut se demander pourquoi nous avons choisi une chaîne pour rapporter l’activité GPCR.
Structure et fonction de la membrane plasmique
Propriétés électriques des membranes et canaux ioniques
- Concepts de base
- Modèle électrique de la membrane
- Répartition ionique de part et d’autre de la membrane
- Fonctions cellulaires des canaux ioniques
Le courant dépend donc du produit de la conductance (facilité avec laquelle les ions peuvent traverser la membrane) et de la tension mesurée de part et d'autre de la membrane. Si les concentrations des deux côtés de la membrane sont identiques, le potentiel d'équilibre de l'ion, déterminé par la loi de Nernst, est nul.
Propriétés des canaux K AT P
Composition et stœchiométrie des canaux K AT P
Assemblage et adressage membranaire
Les canaux potassiques rectifiants entrants : Kir
Caractéristiques principales des canaux Kir
La comparaison de la structure du filtre sélectif de Kir3.1 avec celle de KcsA montre la conservation de l'architecture de cette région. Enfin, la structure récemment résolue du poulet Kir2.2 [304] confirme la conservation de la structure du filtre de sélectivité.
Lumière sur les canaux Kir6.1 et Kir6.2
Ainsi, un site de liaison ATP a été identifié à l'interface entre deux sous-unités Kir6.2 adjacentes, impliquant le domaine C-ter de l'une et le N-ter de l'autre [ 73 , 11 ]. PIP2 interagit électrostatiquement avec Kir6.2 au niveau de résidus chargés positivement situés en C-ter, à proximité du site de liaison de l'ATP (78, 279).
SUR, un transporteur ABC à part
La grande famille des transporteurs ABC
ABCB1 est exprimé dans la barrière hémato-encéphalique ou dans le foie. Dans le cas des porteurs dits « complets », deux NBD sont assemblés afin de disposer ces modèles tête-bêche.
Un biocapteur naturel : Le canal K AT P
Communication entre Kir6.x et SUR
Ceci suggère que ces trois acides aminés n'interagissent avec les régions cytoplasmiques de Kir6.2 qu'en cas d'activation (76). Ainsi, les délétions N-terminales de Kir6.2 provoquent une augmentation de Po uniquement en présence de SUR1 [ 21 , 248 ].
Dans ce cas, les canaux sont suractivés, ce qui induit une diminution de la sécrétion d'insuline. En cas d'hypoxie, les canaux KAT P s'ouvrent sous l'influence de la PKA et de la diminution de la concentration en ATP.
Pharmacologie des canaux K AT P
De plus, la boucle intracellulaire reliant les hélices 13 et 14 (SUR2B) constitue également un site d'action pour les KCO. L'ensemble des différences structurelles entre classes de composés et les affinités mesurées renseignent sur leur mode d'action. Pour cela, une approche chimérique a été mise en œuvre, qui montre que les hélices transmembranaires 14 à 16 de SUR1 sont nécessaires à l'action du tolbutamide, et plus précisément de Ser1237, située dans la boucle intracellulaire entre les hélices 15 et 16.
Caractéristiques générales des GPCR
Ainsi, il leur est devenu possible, à l'aide d'un tampon contenant de l'isoprotérénol (agoniste des récepteurs adrénergiques β2), de détacher les récepteurs de la matrice. Il prend en compte l'interaction du récepteur avec les protéines G et la différence d'affinité pour l'agoniste qui existe entre la forme liée aux protéines G et la forme libre. D'un point de vue physiologique, l'activité constitutive aurait une certaine importance dans le cas de récepteurs impliqués dans les phénomènes de bilan énergétique et de régulation de l'appétit.
Classification
Généralement, un pont disulfure est présent entre les boucles ECL1 et ECL2 et elles possèdent une cystéine C-ter palmitoylée. La région de liaison du ligand est située dans la partie N-ter et forme le module « Venus Fly-Trap » (VFTM). ECL1 et ECL2 ne sont pas liés par une liaison disulfure et les boucles extracellulaires jouent un rôle important dans la reconnaissance du ligand.
Structures connues de GPCR eucaryotes
Le récepteur β2-adrénergique Deux structures, obtenues par deux approches différentes, ont été publiées successivement fin 2007. Le récepteur β1-adrénergique La structure du récepteur β1-adrénergique de la dinde a été résolue en présence d'un antagoniste, le cyanopindolol [325]. La principale différence entre le récepteur β2-adrénergique et β1 est la présence d'une courte hélice dans la boucle ICL2.
Voies de signalisation
Les protéines G
Ceci a pour effet d'abroger toute voie de signalisation résultant de l'activation de la sous-unité α. Toutes les sous-unités α, à l'exception de Gαt, sont palmitoylées au niveau du N-ter au niveau d'une cystéine (modification réversible). La sous-unité α hydrolyse le GTP en GDP et se lie aux sous-unités βγ (état 1).
La signalisation indépendante des protéines G
Cette propriété de laβ-arrestine a également été démontrée avec le récepteur de l'angiotensine II de type I et le CXCR. Un phénomène similaire a ensuite été observé avec certains GPCR et plus précisément avec le récepteur 5HT2A et le récepteur de l'angiotensine II de type 1. Le récepteur adrénergique β2 étant principalement associé aux protéines Gαs, sa stimulation conduit à l'activation de la PKA.
Réponses induites à l’échelle cellulaire
Régulation de l’expression et de l’activité des GPCR
- Adressage membranaire
- Oligomérisation
- Désensibilisation
- Régulation négative
- Internalisation
L'étude de la co-expression et de l'association de plusieurs récepteurs a permis de mettre en évidence le fait que l'oligomérisation pourrait être à l'origine de la régulation de l'internalisation des GPCR. La phosphorylation par GRK provoque alors la liaison de l'arrestine à la partie intracellulaire du récepteur. La colocalisation du récepteur adrénergique β2, de la clathrine et de l'arrestine 2 a été démontrée en 1996 par Goodman et al.
Les GPCR, cibles pharmaceutiques de choix
Pathologies associées
Médicaments
GPCR étudiés
- Récepteur β 2 adrénergique
- Récepteur dopaminergique D3
- Récepteur cannabinoïde 1
- Rhodopsine
- Récepteur des CC–chimiokines 2
Son activation par la dopamine conduit à une stimulation des voies de signalisation classiques des récepteurs couplés au Gαi (activation des canaux Kir3.x, voie MAP kinase, inhibition de l'adénylate cyclase). En effet, sa présence dans l'hippocampe lui attribue un rôle important dans le processus d'apprentissage et de mémorisation [87]. L’avantage d’utiliser des canaux ioniques est qu’ils provoquent des courants facilement mesurables.
Protéines de fusion ou mutants
Canaux photoactivés
Les molécules organiques peuvent également être détectées en décorant les pores avec un adaptateur en β-cyclodextrine (interaction non covalente) [102]. La cyclodextrine fait partie d'une famille d'oligosaccharides cycliques d'origine naturelle capables de capter les molécules organiques grâce à leur centre hydrophobe. Une fois la cyclodextrine placée dans le pore, la capture d'une molécule organique va provoquer des modifications du courant (fig.
Le récepteur 5–HT 3A
Une molécule de polyéthylène glycol de 3,4 kDa est liée de manière covalente à l'intérieur du pore, et l'autre extrémité libre est liée par un ligand (biotine) [207]. Ce dernier se déplace de part et d'autre du pore (en cis et trans) et peut être capturé par la streptavidine (une protéine), ce qui provoque des variations de courant (Fig. Cette approche a permis d'élucider les bases du mécanisme de couplage entre le ligand de liaison fermeture de domaine et de canal.
Ion Channel–Coupled Receptors
Le canal peut alors s'ouvrir. appartenant à 5-HT3A, la liaison de l'acétylcholine provoque la formation d'un courant. Un ICCR est formé par l’association du C–ter d’un GPCR avec le N–ter de Kir6.2. Pour étudier nos biocapteurs (ICCR), nous devons d’abord réaliser des fusions entre les GPCR et le canal Kir6.2, tronqué de 25 acides aminés en N–ter.
Clones et Vecteurs d’Expression
Ils sont constitués de sites de coupure d'enzymes de restriction telles que NotI, NheI.
Construction des protéines de fusion et mutants
- Sous-clonage par ligation
- Mutagénèse dirigée
- Fusions GPCR-Kir6.2
- Délétion de grands fragments
Celui-ci synthétise le nouveau brin à partir de ces oligonucléotides en utilisant la matrice d'ADN comme guide. Le produit de PCR est ensuite digéré par DpnI, éliminant ainsi l'ADN parental méthylé ou semi-méthylé. De cette manière, l'ADN polymérase du kit QuikChange synthétise le nouveau brin à partir de ces amorces et aboutit à un plasmide contenant la forme tronquée du GPCR au sein de l'ADN ICCR.
Amplification du matériel génétique
Transformation des bactéries compétentes
Tableau 4.1 - Cycles PCR – Les étapes 2 à 4 sont répétées 35 fois – *La température d'hybridation varie selon la PCR. Ainsi, nous avons utilisé des amorces qui s'hybrident aux fragments flanquant la région à déléter (Fig. 4.4).
Purification de l’ADN plasmidique
La séparation des débris bactériens (membrane plasmique, protéines, ADN chromosomique) et de l'ADN plasmidique est réalisée par centrifugation à 14 000 tr/min, 4°C, 30 minutes ou par filtration. Les tampons de remise en suspension, de lyse et de neutralisation sont ceux fournis par le kit QIAgen. De plus, comme on part d'une culture bactérienne de 50 ml en milieu LB+ampicilline, la quantité d'ADN est plus importante que dans le cas d'une miniprep.
Séquençage
Transcription in vitro
L'ovocyte de Xenopus (Xenopus laevis, fig. 5.1) est une cellule reproductrice mesurant entre 1 et 1,3 mm de diamètre. Au cours de l’ovogenèse, qui peut être décomposée en 6 étapes, l’ovocyte accumule des réserves d’énergie et d’informations. Les mailles formées par cette matrice sont suffisamment grandes pour permettre l'interaction de petites molécules avec la surface de l'ovocyte.
Extraction et préparation des ovocytes
Ces derniers communiquent électriquement entre eux et avec les ovocytes grâce à la présence de jonctions communicantes (« Gap Junctions »). Les ovocytes sont ensuite rincés au moins six fois avec la solution A et au moins six fois avec la solution isotonique A+B (NaCl 88 mM, KCl 1 mM, NaHCO3. Lors de cette étape de tri, les ovocytes sont sélectionnés sur la base de critères visuels (stade V ) .ou VI, homogénéité de la couleur du pôle animal.
Microinjection des ARNm
- Principe
- configurations utilisées en patch-clamp
- Description du poste de patch–clamp
- Conditions expérimentales
- Traitements des données
Potentiel d'équilibre d'un ion, Eion, qui dépend de sa concentration des deux côtés de la membrane et est déterminé par l'équation de Nernst. Un moniteur vidéo (2) connecté directement à un microscope inversé (9) (X4, , connecté à des seringues contenant des solutions de test). Un morceau de membrane est découpé en retirant rapidement la micropipette de la surface de l'ovocyte.
Double micro–électrodes
- Principe
- Conditions expérimentales
- Traitement des données
- Position du problème
- Test de composés sur le canal K AT P
Ce composé a été testé en l'absence d'ATP et n'a montré aucun effet sur SUR2A + Kir6.2 dans ces conditions (Figure 7.5). De plus, son application à SUR2A + Kir6.2 n'entraîne pas de changement significatif du courant, quelle que soit la présence ou l'absence d'ATP (Figure 7.5). Nous avons cependant tenté de les tester en préparant une solution dans la boîte à gants, mais les résultats obtenus n'ont pas montré d'effet convaincant sur SUR1 + Kir6.2 et SUR2A + Kir6.2.
Etude de l’effet de pesticides sur le canal K AT P
Position du problème
Le DSU R étant très proche du SUR humain, nous avons décidé d'étudier les effets du diflubenzuron sur le canal KAT P. De même, nous n’observons aucun changement de courant significatif induit par le diflubenzuron appliqué à 10 µM en présence d’ATP à 100 µM. L'ajout simultané d'amitraz à 10 µM et d'ATP à 10 µM ne provoque pas de changement significatif du courant, fait également observé en présence de 100 µM d'ATP.
Discussion
L'amitraze ne semble pas moduler l'activité des canaux KAT P constitués de SUR1 + Kir6.2 et SUR2A + Kir6.2.
Position du problème
L'alignement des extrémités C-ter de M2, D2 et β2 est possible grâce à la présence de l'hélice H8 et d'une cystéine palmitoylée conservée. Le récepteur β2adrénergique possède 62 résidus C-ter de plus que M2 et 73 de plus que D2. communication) par génie génétique. Les choix de l'opsine et du récepteur β2-adrénergique pourraient s'avérer utiles dans la compréhension du mécanisme de l'ICCR et dans le développement de modèles moléculaires, puisque les structures de ces GPCR sont connues.
Construction des couples β 2 –Kir6.2
On peut donc conclure que la longueur du lien entre β2 et Kir6.2 joue un rôle primordial dans la qualité du couplage. TMD0, protéine accessoire nécessaire à l'adressage des paires β2-Kir6.2 Dans le cadre de l'étude des paires β2-Kir6.2, nous avons dû trouver un moyen d'augmenter leur expression. Cela pourrait être à l'origine d'une partie de l'augmentation du courant basal mesuré dans le cas des couples β2 – Kir6.2 co-exprimés avec TMD0.
Le couple D3–Kir6.2
Ces données peuvent nous fournir des informations sur le mécanisme de couplage entre les GPCR et Kir6.2, nous permettant de comprendre pourquoi le profil de réponse entre D2 – K0-25, D3 – K0-25 et M2 – K0-25, β2 – K0- différence 25. L’effet observé résulterait en fait de la somme de l’inhibition de D3-K0-25 et de l’activation de Kir3.4*. Un effet surprenant est celui de la co-expression de D3-K0-25 et de TMD0 qui augmente très efficacement (décuplé) le courant basal, mais élimine l'effet provoqué par l'activation de D3.
Le couple CB1–Kir6.2
Comme décrit précédemment, nous avons co-exprimé CB1-K0-25 et TMD0 dans l'espoir d'augmenter le courant basal et donc le niveau d'expression. Il semble que CB1 couplé à Kir6.2 ait quelque peu perdu sa capacité à interagir avec les protéines G. CB1-K0-25 est un nouvel exemple montrant l'efficacité de TMD0 en tant que promoteur de l'expression de l'ICCR.
Le couple opsine–Kir6.2
Figure 8.19 – Activation de l'opsine par tout-trans rétinien (noté atret). a) Enregistrements représentatifs obtenus avec la technique à double microélectrode. On observe donc que la liaison du tout-trans-rétinien à l'opsine est capable de générer une activation de Kir3.1* de l'ordre de 250% (à 5 et 10 µM). Un autre point est le caractère irréversible de l’activation provoquée par le tout-trans rétinien.
Le couple CCR2–Kir6.2
Nous souhaitions toujours vérifier la capacité de CCR2 à activer des protéines G hétérotrimériques, seules ou en fusion avec Kir6.2. Pour ce faire, nous avons utilisé l’un des ligands du CCR2, MCP-1 (Monocyte Chemotactic Protein-1 également appelé CCL2). Ainsi, CCR2-K0-25 est actuellement non fonctionnel, mais nous avons la preuve que cela n’est pas dû à une perte de fonction de CCR2, mais plutôt à un manque de couplage entre les deux composants de la fusion.
M2–Kir6.2, outil d’exploration de l’arrangement du complexe
Sensibilité à l’ATP
En supprimant trente résidus N – ter de Kir6.2, nous avons sûrement dû modifier la sensibilité ATP du canal. Ainsi, nous pouvons supposer que la liaison covalente de M2 au N – ter de Kir6.2 est un obstacle au couplage. Cela suggère que l'interaction entre SUR1 et Kir6.2 dans la construction est affaiblie.
Association SUR/M2–K0-25
Discussion
Ceci confirme la présence de SUR2A dans le complexe formé par M2 – K0-25, ce qui altère la qualité du couplage entre SUR2A et Kir6.2. Ensuite, nous avons criblé environ dix composés pour SUR1 + Kir6.2 et SUR2A + Kir6.2. Nous avons exposé deux ouvreurs SUR1 + Kir6.2 et deux ouvreurs SUR2A + Kir6.2.
Topologie du canal K AT P
Arbre phylogénétique des 15 membres de la famille Kir
Courbe i-V d’un canal rectifiant entrant
Circulation des ions au niveau du filtre de sélectivité de KcsA
Positionnement des ions au niveau du filtre de sélectivité de KcsA
Structures de KcsA et MthK
Structures de Kirbac1.1, Kir3.1 et Kir2.2
Régulation du "gating" des canaux Kir par PIP 2
Récapitulatif des différents acteurs de la régulation des canaux Kir
Classification et topologie des transporteurs ABC
Structures disponibles de transporteurs ABC
Séquences consensus des NBD
Mécanisme de transport des protéines ABC
Rôle des canaux K AT P dans la sécrétion d’insuline
Rôle des canaux K AT P dans la cellule nerveuse
Rôle des canaux K AT P dans la cellule musculaire lisse
Rôle des canaux K AT P dans la cellule musculaire squelettique
Rôle des canaux K AT P dans le myocarde
Formules chimiques de quelques ouvreurs potassiques agissant sur le
Formules chimiques développées des inhibiteurs utilisés au laboratoire. 46
Modèle du complexe ternaire
Modèle ternaire étendu
Classification GRAFS des GPCR
Structures connues de GPCR [110]
Le cycle fonctionnel des protéines G
Structure des protéines G hétérotrimériques
Voies de signalisation des GPCR
Mode d’action de la β–arrestine
Interaction entre le récepteur glutamate métabotropique et les pro-
Activation de la voie JAK–STAT indépendante des protéines G par
Internalisation des GPCR par la voie des clathrines
Principe de l’utilisation de l’hémolysine modifiée en tant que biocapteur. 81
Principe de fonctionnement des ICCR
Récapitulatif de l’ensemble des étapes mises en œuvre dans le cadre
Représentation schématique de pGEMHE, vecteur d’expression pro-
Principe de la mutagénèse dirigée réalisée avec le kit QuikChange Site-
Stratégie utilisée pour réaliser les fusions GPCR–Kir6.2 par PCR
Stratégie mise en œuvre pour supprimer de grands fragments par PCR. 94
Xenopus laevis
Représentation d’un ovocyte de xénope au stade V ou VI
Différentes étapes de l’expression de canaux ioniques dans l’ovocyte
Configurations utilisées en patch–clamp
Poste de patch–clamp
Schéma représentant les connections entre les différents composants