Le cytosquelette d'actine visualisé en épifluorescence (après transfection des cellules avec actine-GFP) peut fournir une mesure de la densité d'actine dans la cellule au fil du temps. Il a été constaté que la dynamique du développement de la densité d'actine semble être très étroitement liée à la dynamique du raidissement cellulaire en réponse à une force appliquée.
Organisation de la cellule
La cellule eucaryote et ses compartiments
Ce chapitre résume le contexte dans lequel se déroule notre étude : comprendre les propriétés mécaniques des cellules adhérentes. Ceci est rendu possible d'une part grâce au réseau dynamique de protéines en constante réorganisation qui composent l'architecture des cellules eucaryotes : le cytosquelette ; et d'autre part grâce aux molécules qui maintiennent les cellules en contact avec leur substrat : les protéines d'adhésion.
La membrane plasmique : lien entre la cellule et son environnement
Des expériences de suivi de particules uniques (petites particules d'or liées aux protéines membranaires) ont permis de mesurer les coefficients de diffusion bidimensionnelle des protéines dans la membrane plasmique : leur ordre de grandeur est de 10−12 à 10−9 m2.s−1, selon sa composition lipidique [71, 24]. Par exemple, ils sont utilisés pour créer des systèmes mimétiques minimaux de la cellule, afin d’en comprendre séquentiellement les différents aspects : les différents domaines lipidiques observés dans les membranes et leurs propriétés visqueuses [105] ; les propriétés mécaniques du cortex d'actine sous-jacent à la membrane [58] ; les forces développées par la croissance des microtubules [44].
Le cytosquelette : un réseau de polymères enchevêtrés et réticulés
- Les microtubules
- Les microfilaments d’actine
- Les filaments intermédiaires
- Un gel actif : rôle des moteurs moléculaires
Nous y reviendrons en 4.3.1, car ces systèmes modèles peuvent nous aider à mieux comprendre le rôle de l'actine dans les propriétés mécaniques des cellules [13]. De nombreuses protéines liant l'actine modifient les propriétés de l'actine G ou F, stabilisant ou déstabilisant les filaments.
Adhérence cellulaire et mécanotransduction
- Aspects biologiques
- Les molécules de l’adhérence
- Les intégrines : base de l’adhérence cellule-matrice
- Pourquoi et comment étudier l’effet de l’environnement mécanique sur les
- Les forces au niveau cellulaire
- Méthodes expérimentales
- Influence de la rigidité du substrat sur la physiologie globale des
- Aspects mécaniques et géométriques
- Confinement de cellules : effets géométriques et topologiques
- Mesures de forces d’adhérence cellule-substrat
- Application localisée de forces
- Mécanotransduction aux points de contact
- Structure des contacts
- Adhérence, mécanotransduction et signalisation
- Rôle des forces dans la régulation des adhésions focales
- Intégration des forces au niveau de l’ensemble de la cellule
1.11 – Etalement d'une cellule épithéliale en fonction de la rigidité du substrat : gauche, substrat mou (gel 1 kPa) ; à droite, substrat solide (verre) [Après [34]]. Les intégrines de contact focal permettent la transmission de forces mécaniques de l'extérieur vers l'intérieur de la cellule (et vice versa), et traduisent également ces signaux mécaniques en signaux biochimiques (et vice versa).
Viscoélasticité cellulaire
- Quelques notions de viscoélasticité
- Un modèle viscoélastique simple pour la cellule ?
- Mesures de la viscoélasticité cellulaire
- Mesures actives locales en régime sinusoïdal
- Mesures en régime de fluage
- Influence de l’application d’une force sur les propriétés viscoélastiques des
En bas à gauche : tracé de la fonction de traînée correspondante, J(t) (en Pa−1) en fonction du temps (en s). Certaines études ont commencé à s'intéresser à la réponse de la cellule à l'application d'un stress prolongé : Matthews et al.
Objectifs de la thèse
Principe du piégeage
- Régime de Mie
- Régime de Rayleigh
- Régime intermédiaire
- Choix de la longueur d’onde
Ceci permet de calculer l'expression de la force de gradient transverse dans le plan focal. 2.3 – Représentation de l'allure de la force de gradient (courbe noire) et de l'énergie potentielle correspondante (rouge) dans le plan de piégeage, pour un rayon de w0 = 500 nm.
Notre dispositif
- Laser et chemin optique
- Le microscope : objectif et cale piézoélectrique
- Détecteur de position
Ils sont placés de manière à ce que les miroirs galvanométriques soient dans le plan conjugué de la pupille d'entrée de l'objectif. Fig.2.5 – Puissance lumineuse à la sortie de la tête laser (carrés remplis de gris) et juste avant la cible après le trajet optique (carrés noirs), en fonction de la puissance de la pompe.
Calibration du piège
Si on impose un écoulement hydrodynamique autour de la sphère piégée, on a à l'équilibre l'égalité entre la force exercée par le piège sur la sphère et la force de frottement visqueux Fvisq =−γv, où v est la vitesse de la sphère par rapport à l'écoulement . Par conséquent, nous pouvons estimer que β(a, h) est connu à un maximum de 5 % et que l’étalonnage de la force est effectué avec à peu près le même degré de précision. 2.11 – Calibrage de la force de piégeage sur billes de diamètre 2a = 3,47 µm en fonction de la distance au centre du piège en X (disques gris, courbe pleine grise) et en Y (cercles noirs, courbe pointillée noire) (combinaison de mesures réalisées à différentes puissances (PP=1 et 1,5 W) alignées sur une même courbe représentant la force divisée par la puissance lumineuse F/Popt).
Pour ce faire, on applique une force extérieure, par exemple un écoulement hydrodynamique, et il suffit alors de mesurer une seule chose : celle de la force nécessaire pour faire sortir une balle du piège.
Préparation des échantillons
Culture cellulaire
Préparation des billes
Z Ajouter 1 ml de PBS stérile au culot de billes. Conservez la suspension de base au réfrigérateur. Suspension à diluer 20 fois dans du milieu BSA, le jour même d'utilisation sur cellules : 50 µL de billes dans 950 µL de DMEM 1% BSA. U Ajouter environ 50 µL de cette suspension diluée aux lamelles ensemencées de cellules et laisser incuber 30 min à 37 °C.
Préparation des chambres expérimentales
- Ensemencement des lamelles
- Adhésion des billes aux cellules
Manipulations à force imposée
Mobilité de l’échantillon par rapport au piège optique
La rétroaction
- Principe
- La partie numérique de la rétroaction
2.13 – Schéma de la boucle de rétroaction (pour canal X uniquement) permettant de maintenir une force constante sur la balle. Cela nécessite une discrétisation du signal, ce qui introduit du bruit dans la mesure de la position de la balle. Ce sont ces tensions qui seront les valeurs de référence pour limiter la position de la balle.
Le principe de la correction PID (proportionnelle, intégrale et dérivée) est d'obtenir une boucle stable (rôle P), précise (rôle I) et rapide (rôle D).
Pourquoi manipuler à force constante ?
On commence (voir 2.1.2) par mesurer rapidement la valeur des fonctions de transfert µm→V de la diode, à l'éclairement choisi et dans la configuration exacte dans laquelle se déroulera la suite de l'expérience (c'est-à-dire pour la sphère attaché à la cellule à mesurer). Nous mesurons l'amplitude des oscillations des signaux VX et VY sortant de la diode quadrant et en déduisons les valeurs de A et A′ (V/µm). Les tensions de sortie des diodes sont ensuite décalées de leurs valeurs de référence, et une correction numérique est ensuite effectuée vers les valeurs δVX = VX,ref −VX et δVY = VY,ref−VY.
Ainsi, nous avons accès à l’évolution de la réponse cellulaire à l’application d’une force au cours du temps.
Fluorescence : mise en oeuvre, détection, et principe des mesures
- Transfection des cellules
- Prise d’image : contraintes en tous genres
- Relations contrainte/déformation dans les expériences de pinces optiques . 73
- Cas d’un fluide visqueux, de viscosité η
- Cas d’un milieu viscoélastique, de module viscoélastique G(ω) . 76
- La cellule : une rhéologie en loi de puissance
La moyenne sur la surface de la balle donne un déplacement global r, dans la direction de la force appliquée F. On peut alors mesurer grossièrement, dans l'image, l'angle d'insertion θ de la balle dans la cellule. 3.3 – Mesures de position de bille x(t) (courbe noire) et y(t) (courbe grise), et force calculée F(t) (courbe rouge) lors d'une expérience de fluage dans une cellule C2C12.
Pour maintenir la bille à (x = 0, y = 0), le coin piézoélectrique doit être déplacé de X(t), Y(t) pour suivre le fluage de la cellule.
Caractérisation mécanique des cellules
Statistiques sur différents types de cellules
- Lignée A549
- Comparaison avec les lignées C2 et C2C12
En effet, nous avons supposé que l’on restait dans le régime de déformation linéaire, c’est à dire que l’élasticité mesurée ne dépendait pas de la force appliquée. En effet, pour déplacer cette balle avec sensibilité sans l'arracher, on choisit la force que l'on lui applique, et elle peut être d'autant plus grande que la raideur est plus grande. Cela ne signifie pas que la rigidité d’une cellule dépend de la contrainte qui lui est appliquée, mais plutôt qu’une contrainte plus importante est appliquée aux cellules que nous évaluons comme plus rigides.
De plus, pour confirmer que l'on reste dans le régime de déformation linéaire, on peut s'appuyer sur les expériences réalisées avec la même pince optique en régime sinusoïdal [8, 10] : nous avons vérifié que la linéarité y était respectée, et ce pour des valeurs de force comparables à celles appliquées dans nos expériences de fluage.
Influence de la densité de coating des billes
G0 augmente parce que le réseau d'actine est plus dense et plus complexe (les myosines agissent comme des agents de réticulation très efficaces). Et dans ce cas, le module viscoélastique et l’exposant de puissance diminuent, ce qui pourrait être comparé à ce que l’on voit lorsque l’on diminue la concentration de revêtement des billes. 3.13 – Variations de l'exposant β du déplacement carré moyen MSD =D∗tβ et du module viscoélastique à 0,75 Hz G′ avec densité d'enrobage RGD (disques noirs) des billes (les cercles vides correspondent à l'enrobage des LDL, liaison des protéines aux récepteurs membranaires libres , pas de liaison basique au cytosquelette d'actine) [De [19]].
Or cet exposant est, en théorie, lié à l'exposant de la loi de puissance duG(ω)[73] par une loi du type β = 1 + 2α, ce qui signifie que l'exposant α associé va également augmenter avec la densité de couverture .
Récapitulatif des mesures en régime de fluage
Si, au contraire, ils se déforment après l’application d’une force, alors leur conformation doit entrer en jeu dans le cadre de la réponse cytosquelettique. L'allongement d'une molécule ou la force d'une liaison en réponse à une force dépend généralement de la vitesse à laquelle cette force est appliquée [36]. Si son effet n’est pas totalement négligeable comparé aux effets de déformation du cytosquelette lui-même, cette signature fréquentielle peut faire partie de la réponse que nous mesurons.
Cependant, dans les expériences de fluage, nous mesurons l'intégrale de la réponse du système étudié à toutes les fréquences, contrairement aux expériences en régime sinusoïdal où nous étudions la réponse du système à une certaine fréquence.
Renforcement : réponse à l’application prolongée d’une force
- Evolution de la rigidité cellulaire pendant l’application d’une force
- Echelle de temps du renforcement
- Exemple et notations
- Résultats sur les C2C12
- Expériences préliminaires
- Analyse quantitative des images
- Définition des zones d’intérêt
- Quantité d’actine contenue dans les contacts
- Densité d’actine dans le réseau du cytosquelette
- Caractérisation du phénomène de recrutement
- Expériences de contrôle
- Recrutement dans les contacts
- Recrutement dans le réseau
Pour une cellule donnée, nous suivons l'évolution du module d'élasticité G0,n en fonction du temps d'action de la force. 4.4 – Schéma de reconstitution des taches d'actine apparaissant autour de la bille (même expérience que sur la Figure 4.1). 4.5 – Histogramme représentant tous les angles entre la direction des taches détectées et la direction de la force appliquée (42 mesures, sur 7 cellules).
Au début de l'expérience, la répartition de l'actine est approximativement homogène autour de la bille.
Couplage entre renforcement et recrutement d’actine
Dynamiques comparées
De plus, la proximité des valeurs de τG et τQ′ signifie probablement que la rigidité mesurée localement dans nos expériences de fluage est déterminée par la densité locale du réseau d'actine, plus que par la densité des contacts entre la bille et la cellule. . Cependant, ce résultat est relativement nouveau : le renforcement des cellules sous stress était jusqu'à présent davantage attribué à un renforcement des contacts [22] qu'à une réorganisation globale du réseau d'actine à courte et moyenne portée (jusqu'à 3,5 fois la taille du réseau d'actine). balle , comme indiqué précédemment). Le tableau 4.1 résume toutes les valeurs minimales, maximales, moyennes et médianes obtenues sur 11 cellules C2C12 pour les grandeurs G0 (mesurées au début (t= 0) et à la fin (t=tN) de l'expérience), et pour les tempsτG ,τQetτQ′ (à partir des ajustements sigmoïdes des croissances temporelles deg,q et q′).
Influence de divers paramètres
- Effet de la transfection
- Dépendance en force
- Relaxation de la fluorescence ?
- Temps mesuré et temps effectif
4.12 – Quantité d'actine dans les contacts (Q, carrés gris pleins) et densité de fluorescence dans le réseau (Q′, losanges noirs vides) en fonction de l'amplitude de la force appliquée. On voit que la quantité d'actine dans les contactsQ est quasiment nulle tant que la force appliquée est inférieure à une valeur seuil, qui vaut ici Fthseuil~75pN. 4.13 – Evolution de la densité d'actine dans les contacts (carrés oranges) et dans le réseau (losanges bleus) ainsi que du module élastique (disques gris, uniquement à droite) en fonction du temps d'application de la force (symboles remplis) puis pendant la relaxation (symboles pointus), pour deux expériences différentes.
Cette incohérence des situations observées ne permet pas de tirer des conclusions sur l'existence ou non d'une relaxation de densité d'actine dans le réseau ou dans les contacts après l'arrêt de la force appliquée.
Un modèle pour le couplage renforcement/recrutement ?
Elasticité des gels d’actine in vitro
- Solutions de polymères semi-flexibles
- Effet des agents réticulants : gels de polymères
- Effet des moteurs moléculaires
- Effet de la précontrainte
- Lien avec nos mesures
À une concentration très élevée d'agents de réticulation, Lc devient même égale à la taille des mailles du réseau ξ, et la dépendance du module élastique en fonction de la concentration d'actine devient un peu plus claire [80]. Nous pouvons comparer les prédictions dérivées de ces systèmes modèles avec nos mesures de la rigidité cellulaire et de la quantité d'actine. Les graphiques de la figure 4.14 montrent G0 en fonction de la quantité d'actine Q dans les contacts (à gauche) ou Q' dans le réseau (à droite).
4.14 – Valeurs mesurées pour la rigidité G0 en fonction de la quantité d'actine au niveau des contacts (Q, à gauche, pour lequel les valeurs Q = 0 ont été supprimées) ou dans le réseau (Q ', sur la droite) .
Actine intracellulaire : agrégation dans les contacts et densité du réseau . 115
- Lien avec nos expériences de recrutement
1] Alberts et al., Biologie moléculaire de la cellule (troisième édition), Flammarion Médecine- Sciences pour l'édition française (1995). 2] Abraham et al., Nanomachines à base d'actine à la pointe des cellules migratrices, Biophys.