Par Pierre LEHN Examinateur, PU-PH, Université de Bretagne Occidentale, Brest Pr. Chantal PICHON Directrice de thèse, Pr, Université d'Orléans. Je tiens à remercier le professeur Chantal Pichon et le Dr. Patrick Midoux, co-encadrant cette thèse, de m'avoir accueilli dans leur équipe sur le projet Thérapie Génique et Vaccinologie. Je tiens à remercier tous les membres de l'équipe du Dr. Claudine Kiéda et le Dr. Véronique Piller, qui a participé directement ou indirectement à la réalisation de ces travaux.
C] Ce que l'on sait du comportement des polyplexes PEI et pLK dans le sang.
INTRODUCTION
La recherche génomique a permis des progrès significatifs dans le décryptage de la carte du génome humain. Jusqu’à présent, il existe peu de solutions pour transférer avec succès et en toute sécurité des gènes dans les cellules d’un patient. Des vecteurs non viraux, tels que des polymères cationiques ou des lipides cationiques, sont activement développés en parallèle pour transférer des gènes dans des cellules avec une meilleure sécurité que les vecteurs viraux.
En particulier, j'ai étudié l'intériorisation et le passage transendothélial des polyplexes dans un modèle endothélial de poumon humain. Cette étude a été réalisée avec des polyplexes formés de polylysine histidylée et de polyéthylèneimine. Enfin, je termine par une enquête sur la fixation des polyplexes dans des conditions d'écoulement.
GÉNÉRALITÉS
Les cancers primitifs peuvent être différenciés par un examen pathologique basé sur la taille des cellules tumorales (Hoffman et al., 2000). Séquences peptidiques Nom Références GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYG (souche X31F/68) HA-2 White, 1990 GLFGAIAGFIEGGWTGMIDGWYG (souche A/PR/8/34) HA-2 Murata et al., 1987. Les résultats obtenus avec le peptide H5WMYG et al. , 1998) ont conduit au développement de la polylysine histidylée.
Un polymère de N-Ac-poly(L-histidine) greffé sur polylysine a été synthétisé (Benns et al., 2000). En effet, le récepteur EGF est surexprimé dans le cancer du poumon (Hirsch et al., 2003). Il permet également la phosphorylation de la VASP (phosphoprotéine stimulée par un vasodilatateur), qui s'associe à ZO-1 dans les jonctions serrées (Comerford et al., 2002).
Cependant, la cavéoline-1 est exclue de la région fenestrée de l'endothélium glomérulaire (Sorensson et al., 2002). Un grand nombre de ces mécanocapteurs sont situés dans les cavéoles (Rizzo et al., 2003).
MATÉRIELS ET MÉTHODES
La solution contenant la polylysine a ensuite été neutralisée avec une solution d'acide p-toluènesulfonique à 10 % dans l'eau puis lyophilisée. Le culot est lavé à l'isopropanol, centrifugé, dissous dans de l'eau distillée et lyophilisé. Les cellules HLMEC sont cultivées à raison de 10 5 cellules dans des boîtes de culture (75 cm2).
Le milieu de culture est OptiMEM (Life Technologies Gibco, Renfrewshire, UK) contenant 2 % de sérum de veau fœtal décomplémenté par la chaleur (FBS, Gibco), avec 2 mM de L-glutamine, des antibiotiques (100 unités/ml de pénicilline et 100 µg/ml de streptomycine, Gibco) et un agent antifongique, Fungizone (Sigma, St. Louis, MO, USA). Les cellules ΣCFTE290 sont cultivées à raison de 5.105 cellules dans des boîtes de culture (75 cm2). Les cellules ΣCFTE290 sont cultivées au dos du filtre, prétraitées avec le mélange fibronectine/collagène I/SAB à raison de 1,105 cellules pendant 4 heures à 37°C tout en étant fixées.
Les études d'internalisation des polyplexes marqués au YOYO-1 ne nécessitent pas l'utilisation de monensin. La fluorescence est enregistrée à 520 nm après excitation à 488 nm et est exprimée comme l'intensité moyenne de fluorescence de 10 000 cellules. Les cellules HLMEC ont été ensemencées à raison de 2,105 cellules sur des lames de culture cellulaire (marque NUNC, Nadge Nunc International, Rochester, NY, USA).
L'entrée de la chambre est reliée via une vanne trois voies au réservoir contenant le milieu, avec ou sans polyplexes. Le débit (Q) requis pour obtenir la contrainte de cisaillement de paroi τ souhaitée est calculé en fonction des dimensions de la chambre d'écoulement et de la viscosité du milieu suivant. L'image sommée à t = 0 est soustraite de l'image sommée à t = 30 min pour donner une image de tous les polyplexes fixés dans les conditions d'écoulement pendant 30 min.
Lors de la dissociation de l'ADN du polymère avec le sulfate de dextrane, un polymère anionique, SYBER® Green I en solution va s'intercaler entre les bases de l'ADN et émettre une fluorescence.
RÉSULTATS
La polarisation cellulaire abroge fortement cette voie d'endocytose, ce qui réduit considérablement l'accumulation de polyplexes pLK-His dans les cellules HLMEC. Suite aux études réalisées précédemment, nous avons entrepris d'étudier le passage transendothélial des polyplexes pLK-His et PEI. Elle est exprimée en pourcentage de la fluorescence des polyplexes situés dans l'insert au début de l'expérience.
Nous avons ensuite évalué l’efficacité de transfection des polyplexes filtrés par rapport aux polyplexes non filtrés. Pour une quantité sensiblement égale de polyplexes, l'efficacité de transfection des polyplexes filtrés est donc plus élevée. La quantification des polyplexes pLK-His et PEI dans le milieu d'insert et de puits a été réalisée comme précédemment, mais en présence de la monocouche de cellules endothéliales HLMEC cultivée sur le filtre.
Malgré cette réduction de la quantité de polyplexes pLK-His et PEI présents au contact des cellules ΣCFTE290, l'efficacité de transfection de ces polyplexes est assez similaire à celle des polyplexes filtrés (Figure 24). Le passage transendothélial des polyplexes pLK-His et PEI dans des conditions inflammatoires a été examiné avec ces deux concentrations de cytokines (Figure 28). La perméabilité est exprimée en pourcentage de passage transendothélial des polyplexes dans des conditions non inflammatoires.
Malgré ce faible passage, l'efficacité de transfection des polyplexes PEI filtrés est similaire à celle de tous les polyplexes introduits dans l'insert. Sur ce modèle, nous avons réalisé des études préliminaires du passage transendothélial en mesurant l'efficacité de la transfection des polyplexes pLK-His et PEI dans les cellules épithéliales. ETUDES SUR LA FIXATION DE POLYPLEXES SUR UNE MONOCOUCHE DE CELLULES HLMEC EN CONDITIONS D'ECOULEMENT.
Notre objectif était d'analyser les effets du flux rencontré dans les microvaisseaux et levales sur l'adhésion des polyplexes pLK-His et PEI à une monocouche de cellules HLMEC. Les résultats montrent que l'adhésion des polyplexes aux cellules HLMEC dépend de leur taille, des forces de cisaillement et de la quantité de sérum. Cependant, la liaison des polyplexes PEI est légèrement supérieure à celle des polyplexes pLK-His.
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
Les virus sont les organismes les plus efficaces pour transférer des gènes dans les cellules animales. Nous avons d'abord développé un modèle d'endothélium microvasculaire pulmonaire qui nous a permis de déterminer les voies d'internalisation des complexes, leur capacité à traverser la barrière endothéliale pour transfecter les cellules sous-jacentes, et d'étudier leur adhésion dans des conditions d'écoulement. En effet, la polarisation des cellules endothéliales modifie les voies d'internalisation des polyplexes pLK-His.
Ces polyplexes sont internalisés par la voie dépendante de la clathrine dans les cellules non polarisées et polarisées. Les polyplexes pLK-His sont très inefficaces pour transfecter les cellules endothéliales polarisées. De même, les polyplexes PEI, internalisés du côté basolatéral, transfectent les cellules épithéliales polarisées ΣCFTE29o aussi efficacement que les cellules endothéliales.
En revanche, les polyplexes pLK-His sont 1000 fois plus efficaces pour transfecter les cellules épithéliales que les cellules endothéliales, leur efficacité étant proche de celle du PEI. PLK-His représente potentiellement un meilleur candidat que le PEI pour le transfert sélectif de gènes dans les cellules épithéliales humaines, à condition que les polyplexes soient capables de traverser la barrière endothéliale intacte. Par conséquent, nous avons examiné l’effet de ces cytokines sur le passage transendothélial des polyplexes pLK-His et PEI.
Enfin, l’attachement des polyplexes PEI et pLK-His a été étudié par vidéomicroscopie dans des conditions d’écoulement. Nous disposons donc désormais de modèles in vitro puissants de la barrière endothéliale pulmonaire pour étudier le comportement des vecteurs synthétiques dans la circulation sanguine, leur capacité à adhérer aux cellules endothéliales et à traverser cette barrière. Ces systèmes de vectorisation multiligands pourraient induire l’attachement des leucocytes aux cellules endothéliales et leur passage à travers la barrière vasculaire.
Les sélectines permettent aux leucocytes d'adhérer aux cellules endothéliales malgré le flux sanguin.
BIBLIOGRAPHIE
34; Bronchial artery delivery of viral vectors for gene delivery in cystic fibrosis; superior to airway delivery?" BMC Pulm Med. Epidermal growth factor/DNA polyplex gene delivery to small cell lung cancer cell lines expressing low levels of the epidermal growth factor receptor. Tumor-targeted gene delivery of tumor necrosis factor alpha induces tumor necrosis and regression tumor without systemic toxicity.
The role of focal adhesion kinase dynamics in endothelial cell mechanotaxis. Targeting endothelium and its dynamic caveolae for tissue-specific transcytosis in vivo: a route to overcome cell barriers to drug and gene delivery. PEGylated DNA/transferrin-PEI complexes: reduced interaction with blood components, prolonged blood circulation and potential for systemic gene delivery.
Importance of lateral and steric stabilization of polyelectrolyte gene delivery vectors for extended systemic circulation. Branched cationic peptides for gene delivery: the role of the type and number of cationic residues in the formation and in vitro activity of DNA polyplexes. Activation of the complement system by synthetic DNA complexes: a potential barrier to intravenous gene delivery.
Novel basic membrane destabilizing peptides for plasmid-based gene delivery in vitro and in vivo. A comparison of linear and branched polyethyleneimine (PEI) with DCChol/DOPE liposomes for gene delivery to epithelial cells in vitro and in vivo.