1
ΠΤΥΧΙΑΚΗ
ΜΟΡΙΑΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΣΤΗΝ ΦΥΜΑΤΙΩΣΗ ΙΣΤΟΡΙΚΑ ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΚΑΙ ΠΑΡΟΥΣΑ ΚΑΤΑΣΤΑΣΗ
THESIS
MOLECULAR DIAGNOSIS IN TUBERCULOSIS PAST AND CURRENT DATA
ΓΙΑΝΝΑΚΑΚΗ ΜΑΡΙΑ Βιοπαθολόγος ΑΘΗΝΑ 2020
2 ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗΣ
ΙΩΣΗΦ ΠΑΠΑΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣ (επιβλέπων) Αναπληρωτής καθηγητής
Εργαστήριο Μικροβιολογίας Ιατρική Σχολή Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
ΙΩΑΝΝΗΣ ΡΟΥΤΣΙΑΣ
Επίκουρος Καθηγητής Μικροβιολογίας/Ανοσολογίας Εργαστήριο Μικροβιολογίας Ιατρική Σχολή
Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
ΦΑΝΟΥΡΙΟΣ ΚΟΝΤΟΣ Βιολόγος, PhD.
Υπεύθυνος Μυκοβακτηριδιολογικού Εργαστηρίου Νοσοκομείο Αττικόν
3 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ
Θα ήθελα να ευχαριστήσω το σύνολο των ανθρώπων που συνέβαλαν, ο καθένας με τον δικό του ξεχωριστό τρόπο στην ολοκλήρωση της παρούσας εργασίας.
Αρχικά θα ήθελα να ευχαριστήσω τον κο Τσακρή Αθανάσιο, Καθηγητή
Μικροβιολογίας της Ιατρικής Σχολής Αθηνών και Διευθυντή του Εργαστηρίου Μικροβιολογίας για τη δυνατότητα που παρέχει μέσω των μεταπτυχιακών σπουδών και άλλων σεμιναρίων στη δια βίου μάθηση και εκπαίδευση των ιατρών όλων των βαθμίδων.
Ένα μεγάλο ευχαριστώ θα ήθελα να απευθύνω στον κο Παπαπαρασκευά Ιωσήφ Αναπληρωτή Καθηγητή Μικροβιολογίας της Ιατρικής Σχολής Αθηνών και Διευθυντή των Εργαστηρίων του Ωνασείου για την ακούραστη προσφορά του στην επιστήμη, στη διδασκαλία και στο ανθρώπινο δυναμικό των υπηρεσιών υγείας, με την γνώση, τον ξεκάθαρο και ορθολογικό τρόπο σκέψης, τη μεταδοτικότητα και την αφοσίωση στον φοιτητή που τον διακατέχει (έχοντας παράλληλα επίγνωση πως η γνώση είναι αχανής και ο αγώνας διαρκής) αποτελώντας έτσι ένα στολίδι για το Πανεπιστήμιο.
Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά όλα τα μέλη του Εργαστηρίου του Γ.Ν.Ν.Θ.Α. Η Σωτηρία για την προτροπή της συγγραφής αυτού του θέματος και ιδιαίτερα τον πρώην Συντονιστή Διευθυντή κο Βογιατζάκη Ευάγγελο και τη νυν Συντονίστρια Διευθύντρια κα Καράμπελα Σιμόνα. Ιδιαίτερες ευχαριστίες στον Διευθυντή της Μοριακής Διάγνωσης της Φυματίωσης κο Παπαβέντζη Δημήτριο, που με την εμπειρία του με εισήγαγε στο πεδίο της συγγραφής. Θα ευχαριστήσω θερμά για τη στήριξη, κατά την διάρκεια της προετοιμασίας της εργασίας μου, και τη Βιοπαθολόγο, υπεύθυνη των μικροσκοπήσεων, με βαθμό Διευθυντή, κα
Κωνσταντινίδου Ευθυμία και την κα Ροδοπούλου Παναγιώτα, Επιμελήτρια Β στο τμήμα της Φυματίωσης.
Τέλος θα ήθελα να ευχαριστήσω τον κο Κοντο Φανούριο, Βιολόγο PhD και υπεύθυνο του τμήματος Μυκοβακτηριδιολογίας του Νοσοκομείου Αττικόν και τον κο Ρουτσιά Ιωάννη Επίκουρο καθηγητή Μικροβιολογίας/Ανοσολογίας του Εργαστηρίου
Μικροβιολογίας της Ιατρικής Σχολής Αθηνών για τη συμμετοχή τους στην τριμελή επιτροπή αξιολόγησης της διπλωματικής μου εργασίας.
4 ΠΕΡΙΛΗΨΗ
Η Φυματίωση (ΤΒ) παραμένει μία από τις μεγαλύτερες προκλήσεις για την παγκόσμια υγεία. Αποτελεί σοβαρή νόσο με αδικαιολόγητη νοσηρότητα και
θνησιμότητα. Παγκοσμίως, καταγράφονται ετησίως πάνω από 10 εκατομμύρια νέες περιπτώσεις φυματίωσης σε όλο τον κόσμο και περίπου 2 εκατομμύρια θάνατοι.
Ανησυχητικό φαινόμενο αποτελεί η αύξηση των πολυανθεκτικών και των εκτεταμένα ανθεκτικών (MDR και XDR) στελεχών.
Το Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) περιλαμβάνει οκτώ είδη, το Mycobacterium tuberculosis, το Μycobacterium africanum, το Μycobacterium canetti, το Μycobacterium bovis, το Μycobacterium bovis Bacillus Calmette Guérin (BCG) , το Μycobacterium microti , το Μycobacterium caprae και το Μycobacterium pinnipedii.
Το Mycobacterium tuberculosis (MTB) που προκαλεί τη φυματίωση είναι ένα μικρό, αργά αναπτυσσόμενο βακτήριο που μπορεί να ζήσει μόνο στους ανθρώπους. Το MTB είναι αερόβιο βακτήριο, ένας προαιρετικά ενδοκυττάριος μικροοργανισμός, συνήθως των μακροφάγων, και έχει έναν αργό ρυθμό αναπαραγωγής, 15-20 ώρες, Το διακριτό χαρακτηριστικό όλων των ειδών του γένους είναι ότι το κυτταρικό τοίχωμα είναι παχύτερο από ό,τι σε άλλα βακτήρια, και είναι υδρόφοβο, κηρώδες και πλούσιο σε μυκολικά οξέα.
Η κλωνική εξέλιξή του MTB οδήγησε σε απογόνους με διαφορετικές εξελικτικές πορείες και λοιμογονικότητα. Η μελέτη του σε μοριακό επίπεδο ανέδειξε:
α) διατηρημένους γενετικούς τόπους για την ανίχνευσή του όπως το 16S rDNA, οι ITS
β) μεταβλητούς τόπους του γονιδιώματός του (τρανσποζόνια όπως η αλληλουχία εισαγωγής IS6110)
γ) συνώνυμα και μη συνώνυμα SNP
Οι αλληλουχίες εισαγωγής και τα SNPs βοηθούν στην κατάταξή του MTB σε στελέχη και στην ανίχνευση αντοχών του στα αντιφυματικά φάρμακα.
Το σημείο εκκίνησης της διάγνωσης της φυματίωσης πρέπει να είναι η συνεργασία του κλινικού με τον εργαστηριακό ιατρό. Ο ρόλος του κλινικού εργαστηρίου
συνίσταται στην ανίχνευση, ταυτοποίηση, και επιβεβαίωση με επιστημονικά μέσα της νόσου αλλά και στη πρόληψή της που είναι τελικά ο πιο αποτελεσματικός τρόπος αντιμετώπισής της φυματίωσης. Η πιο γρήγορη εξέταση για την διάγνωση της φυματίωσης είναι η μικροσκόπηση. Είναι σημαντικό ότι η θετική μικροσκοπική εξέταση επιβεβαιώνει την κλινική εικόνα ενώ η αρνητική δεν αποκλείει τη νόσο. Η εργαστηριακή επιβεβαίωση της νόσου γίνεται με την απομόνωση του MTB στην καλλιέργεια και αυτό αποτελεί και το gold standard της διάγνωσης.
Οι πρώτες μέθοδοι ανίχνευσης βασίστηκαν σε φαινοτυπικά χαρακτηριστικά, όπως η μορφολογία των αποικιών, η ευαισθησία σε φάρμακα κατά της φυματίωσης κα. Η χρησιμότητα αυτών των μεθόδων περιορίζεται σοβαρά από τη φαινοτυπική
5
μεταβλητότητα των μυκοβακτηριδίων. Ο διαχωρισμός μεταξύ των στελεχών με βάση τα βιοχημικά και ορολογικά χαρακτηριστικά τους είναι ακόμη πιο ανεπιτυχής. Ένα σημείο καμπής σε αυτήν την αναζήτηση ήταν η ανάπτυξη των εργαλείων της μοριακής βιολογίας στα μέσα της δεκαετίας του 1980. Οι μοριακές μέθοδοι, κυρίως οι δοκιμασίες που βασίζονται σε ανιχνευτές και στην PCR έχουν μεγάλη αξία σήμερα στην παροχή έγκαιρης διάγνωσης λόγω της ευαισθησίας και της ταχύτητάς τους στην παροχή αποτελεσμάτων. Η γονοτύπηση (genotyping) χρησιμοποιείται για την
ανίχνευση διαφορετικών στελεχών του MTB, τόσο σε εθνικό όσο και σε διεθνές επίπεδο, προκειμένου να ληφθούν πληροφορίες σχετικά με τα μοτίβα των στελεχών εξάπλωσης, λοιμογονικότητας και παθογένειας. Οι τεχνικές που βασίζονται στο DNA έχουν φέρει επανάσταση στην επιδημιολογία της φυματίωσης και άλλων
μυκοβακτηριδιακών νόσων, καθώς επιτρέπουν την εξέταση ολόκληρου του γονιδιώματος που είναι μοναδικό και σχετικά σταθερό για κάθε στέλεχος.
Επί του παρόντος, αναπτύσσεται και αξιολογείται ένα ευρύ φάσμα μοριακών δοκιμών για την ανίχνευση της φυματίωσης και ενώ ορισμένες δοκιμές προορίζονται για εργαστήρια αναφοράς, άλλες στοχεύουν σε χρήση παρά την κλίνη του ασθενούς και άλλες σε εγκαταστάσεις περιφερειακής υγειονομικής περίθαλψης. Αυτές οι εξελίξεις αναμένεται να αυξήσουν την πρόσβαση σε μοριακής δοκιμές φυματίωσης για
μεγαλύτερους πληθυσμούς ασθενών. Όσον αφορά τον έλεγχο ευαισθησίας στα φάρμακα, τα NAAT και η αλληλούχηση επόμενης γενιάς μπορούν να παρέχουν αποτελέσματα πολύ ταχύτερα από την παραδοσιακή φαινοτυπική καλλιέργεια.
Πράγματι η πρόοδος στη μοριακή διάγνωση της φυματίωσης την τελευταία δεκαετία οδήγησε σε δοκιμές φυματίωσης που είναι πολύ ακριβείς και γρηγορότερες από τις συμβατικές μικροβιολογικές δοκιμές και οι αναδυόμενες τεχνολογίες υπόσχονται να συνεχίσουν αυτήν την τάση. Πχ τα NAAT έχουν θετικό κλινικό αντίκτυπο. γιατί οδηγούν σε μείωση του χρόνου έως τη διάγνωση της φυματίωσης και του χρόνου για την έναρξη της θεραπείας, και η χρήση τους οδηγεί σε ολοένα αυξανόμενους αριθμός ασθενών που εξετάζονται και ξεκινούν θεραπεία κατά της ΤΒ. Παρόλο που
εξακολουθούν να είναι ακριβές ακόμη και σήμερα, θα βοηθήσουν στη συνολική εξοικονόμηση για τον ασθενή παρέχοντας έγκαιρη διάγνωση.
Πρέπει εδω να τονιστεί ότι χωρίς την κατάλληλη χρήση των ΝΑΑΤ (στέρεα συστήματα υγείας, επίτευξη της παρακολούθησης του ασθενούς κα) ο κλινικός αντίκτυπός τους δηλαδή η μείωση της θνητότητας ή της υποτροπής της ΤΒ θα είναι μικρότερος από τον αναμενόμενο. Έτσι, για να βελτιωθεί ο κλινικός αντίκτυπος των μοριακών δοκιμών για τη φυματίωση απαιτείται η εισαγωγή τους σε λειτουργικά και ενισχυμένα συστήματα υγειονομικής περίθαλψης (είτε αυτά αφορούν κάποια
νοσοκομειακή εγκατάσταση είτε το σημείο φροντίδας του ασθενούς) τα οποία θα μπορούν να ανταποκριθούν σε εστίες επιδημιών όπου και απαιτείται εξέταση πολλών ασθενών. Είναι πλέον επιτακτική ανάγκη η διαμόρφωση συστημάτων υγείας υψηλής ποιότητας παντού που θα επιτρέψουν στα NAAT να αξιοποιήσουν πλήρως τις
δυνατότητές τους και να αποτελέσουν αναπόσπαστο μέρος ενός ψηφιακά
6
συνδεδεμένου, επανασχεδιασμένου συστήματος φροντίδας φυματίωσης με επίκεντρο τον ασθενή.
ABSTRACT
Tuberculosis (TB) remains one of the major health problems worldwide. It is a serious disease with reasonless morbidity and mortality. Around the world more than 10 million new cases of tuberculosis are reported each year and approximately 2 million deaths occur from the same reason. An increase in multi-resistant and extensively resistant (MDR and XDR) strains is an emerging and worrying phenomenon.
The Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) includes eight species, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium africanum, Mycobacterium canetti, Mycobacterium bovis, Mycobacterium bovis Bacillus Calmette Guérin (BCG), Μycobacterium microti, Mycobacterium caprae and Mycobacterium pinnipedii.
Mycobacterium tuberculosis (MTB), the causative agent for tuberculosis, is a small, slow-growing bacterium that can only live in humans. MTB is an aerobic bacterium, an optional intracellular microorganism, usually inside the macrophages with a slow growing rate, 15-20 hours. The main characteristic of all species is that the cell wall is thicker than in other bacteria, hydrophobic, waxy and rich in mycolic acids.
The evolution of MTB is clonal and has led to strains with different evolutionary pathways and infectiousness. Its analysis in molecular level showed:
a) conserved genetic locus such as 16S rDNA and ITS for its detection
b) locus of its genome with high variability (transposons such as the IS6110 insertion sequence)
c) synonymous and non synonymous SNPs
Insertion sequences and SNPs are useful when typing MTB into isolates and detect its resistance to anti-tubercular drugs.
The main point for the diagnosis of tuberculosis should be the collaboration of the clinician and the laboratory physician. The role of the clinical laboratory is to detect, identify, and confirm scientifically the disease but also to prevent it. The last is the most effective way to treat tuberculosis. The fastest test for diagnosing tuberculosis is microscopy. It is important to note that a positive smear microscopy confirms the disease while a negative one does not rule it out. However the most sensitive and specific way of establishing the disease in the laboratory is by isolating MTB in bacteriological culture and this is the gold standard of the diagnosis.
The first tests of detection were based on phenotypic characteristics, such as the morphology of the colonies, the sensitivity to antitubercular drugs, etc. The usefulness of these methods is severely limited by the phenotypic variability of Mycobacteria.
Differentiation between strains based on their biochemical and serological
characteristics is even more unsuccessful. A turning point was the development of the
7
molecular biology methods in the mid-1980s. Molecular methods, especially probe- based assays and PCR, are of great value today in providing early diagnosis due to their increased sensitivity and speed. Genotyping is used to differentiate strains of MTB, both nationally and internationally, in order to obtain information about the patterns of spreading strains, their infectiousness and pathogenesis. DNA-based techniques have revolutionized the epidemiology field of tuberculosis and other mycobacterial diseases, as they allow the examination of the whole genome, which is unique and relatively stable for each strain.
A wide range of molecular tests for the detection of tuberculosis is currently being developed and evaluated, while some of them are intended for reference laboratories, others for POC use and others for peripheral healthcare facilities. All these are expected to increase access to molecular TB testing for even larger patient populations. In terms of drug susceptibility testing, NAAT and next-generation sequencing can produce results much faster than conventional phenotypic DST.
Indeed, advances in molecular diagnosis for TB over the past decade led to assays that are much more accurate and faster than conventional microbiological tests, and
emerging technologies promise to continue this trend. For example, NAAT lead to time reduction in diagnosing TB and in starting its treatment. Their use leads also to a continuously increased number of patients being examined and starting treatment for TB. Although they are still expensive nowadays, they will in fact help in saving money by providing an early diagnosis of the patients.
It should be emphasized here, that without the proper use of NAAT (strong health systems, achieving patient follow up, etc.) their clinical impact, which is the reduction of mortality or recurrence of TB will be less than expected. Thus, in order to improve it, it is necessary to introduce them into functional and strong organized health care systems (whether they involve a hospital facility, a peripheral center or a patient point of care) able to respond to outbreaks, wherever and whenever examination of many patients is required. It is now more than ever necessary to design high-quality health systems, everywhere, that allow NAATs reaching their full potential and becoming an integral part of a digitally connected, reimagined and patient-centered TB care
system.
8 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ
1. Ιστορική αναδρομή...12
2. Επιδημιολογικά δεδομένα...12
3. Γονιδίωμα, ταξινόμηση, δομή και μορφολογία του Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC)...17
4. Μετάδοση...21
5. Ανοσολογία της λοίμωξης...23
6. Μηχανισμοί αντοχής στα φάρμακα και γονίδια αντοχής...25
6.1. Μηχανικά έμφυτα χαρακτηριστικά της αντοχής στα φάρμακα...25
6.2. Μοριακοί μηχανισμοί...25
7. Κλινική εικόνα πνευμονικής ΤΒ...29
8. Μοριακή διάγνωση της φυματίωσης: Τρέχουσα κλινική εγκυρότητα και μελλοντικές προοπτικές...31
8.1. Αρχή της PCR...32
8.2. PCR για την εργαστηριακή διάγνωση της φυματίωσης...35
8.3. Διαφοροποίηση-Ταυτοποίηση-Γονοτύπηση...35
9. Εργαστηριακή διάγνωση...36
9.1. Ακτινογραφία θώρακος...36
9.2. Μικροσκόπηση επιχρίσματος πτυέλων...36
9.3. Μυκοβακτηριδιακή καλλιέργεια...39
9.3.1. Ομογενοποίηση, πέψη και απολύμανση των δειγμάτων...40
9.3.2. Μέσα καλλιέργειας...40
9.3.3. Φαινοτυπικό DST (Δοκιμασία ευαισθησίας στα φάρμακα πρώτης και δεύτερης γραμμής για το M. tuberculosis complex)...42
9.4. Μοριακές μέθοδοι...43
9.4.1. Μοριακές μέθοδοι ανίχνευσης του μυκοβακτηριδίου και της αντοχής του στα φάρμακα βασισμένες στην τεχνολογία PCR (ΝΑΑΤs)...43
9
Α) Μέθοδοι NAA για την ανίχνευση του MTBC χωρίς παράλληλη
ανίχνευση της αντοχής στα αντιφυματικά...45
i) PCR (IS6110, 16SrDNA, ITS)...45
ii) IS6110 SDA...46
iii) 16S rRNA TMA...46
iv) LAMP...46
v) NASBA...46
vi) LCR...46
vii) 23S rRNA Q-Beta...46
viii) bDNA...46
ix) TRC...47
Β) Μέθοδοι NAA για ανίχνευση του ΜΤΒC με παράλληλη ανίχνευση αντοχής στα αντιφυματικά...47
i) Υβριδισμός σε λωρίδες...47
ii) PCR σε πραγματικό χρόνο- Real-time...48
iii) Multiplex allele-specific PCR...51
9.4.2. Εμπορικές μέθοδοι για την ανίχνευση και/ή τον έλεγχο αντοχής...53
i) Amplified Mycobacterium Tuberculosis (MTB) Direct Test (MTD) (Gen-Probe Inc., San Diego, CA)...53
ii) Amplicor Mycobacterium Tuberculosis Test (Amplicor) (Roche Diagnostic Systems Inc., NJ)...55
iii) Real time MTB Abbott RealTime MTB-DR Abbott...56
iv) BD ProbeTec MTB Test (Becton Dickinson, Sparks, MD)...57
v) TRCRapid MTB Tosoh TRC-80 Tosoh...58
vi) COBAS TaqMan MTB Roche...59
vii) Loopamp MTBC Eiken Chemical Co...60
viii) EasyNat TB Ustar Biotechnologies...61
10
ix) Xpert MTB/RIF assay Cepheid Inc
Xpert Ultra MTB/RIF Cepheid Inc...62
x) FluoroType MTB Hain Lifescience FluoroType MTBDR Hain Lifescience...64
xi) GenoType MTBC Hain Lifescience GenoType MTBDRplusv2.0 Hain Lifescience GenoType MTBDRslv1.0 Hain Lifescience GenoType MTBDRslv2.0 Hain Lifescience...66
xii) GeneXpert® Omni Cepheid Inc...71
xiii) Q-POC ™ QuantuMDx (UK)...72
xiv) TrueNAT ™ MTB Molbio Diagnostics...74
9.4.3. Γονοτύπηση του μυκοβακτηριδίου...75
A) Μέθοδοι γονοτύπησης χωρίς πολλαπλασιασμό του DNA...76
i) REA-PFGE typing...76
ii) RFLP (REA με υβριδισμό)...76
Β) Μέθοδοι γονοτύπησης με PCR-REA...78
i) IS6110-based methods...78
ii) ITS-based methods...78
iii) 16S rDNA gene based methods...78
Γ) Μέθοδοι γονοτύπησης με PCR...79
i) DR region based methods...79
ii) DRE-PCR...79
iii) DRlocus spoligotyping...79
iv) VNTR typing...79
v) MIRU-VNTR...80
vi) RAPD analysis...80
vii) AFLP analysis...80
Δ) Μέθοδοι γονοτύπησης με αλληλούχιση...81
i) MLST...81
11
ii) SNP typing...81
iii) NGS...81
10. DRlocus spoligotyping...82
11. MIRU-VNTR...84
12. NGS...87
12.1. Τεχνολογία αλληλούχησης δεύτερης γενιάς (SGS)...87
12.1.1. Προετοιμασία του προτύπου...87
12.1.2. Διαδικασία αλληλούχησης...88
i) Αλληλούχηση με σύνθεση (SBS)...88
α. PYROSEQUENCING...88
β. Sequencing by reversible termination...89
γ. Sequencing by detection of hydrogen ions...89
ii) Αλληλούχηση με υβριδισμό και σύνδεση (SBL)...89
12.2. Προσεγγίσεις στην αλληλούχηση τρίτης γενιάς...90
13. Πρόληψη και εμβόλιο...91
13.1 Μέτρα για την πρόληψη της μετάδοσης...91
13.2. Εμβόλιο...91
14. Θεραπεία...92
14.1. LTBI...92
14.2. Ενεργός ευαίσθητη στα φάρμακα ΤΒ...92
14.3. Ενεργός ανθεκτική στα φάρμακα TB...92
12 1. Ιστορική αναδρομή
Η φυματίωση (TB) είναι μια λοίμωξη από το Mycobacterium tuberculosis (MTB) η οποία μπορεί να εμφανιστεί σε οποιοδήποτε όργανο του σώματος αλλά είναι πιο ευρέως διαδεδομένη και συχνή στους πνεύμονες. Αποτελούσε μια μάστιγα σε όλη τη γνωστή ως τώρα ιστορία και μπορεί να έχει σκοτώσει περισσότερα άτομα από οποιοδήποτε άλλο μικροβιακό παθογόνο. 1 Η ανακάλυψη από τον Koch το 1882 του βακίλου που προκαλούσε τη φυματίωση παρείχε περισσότερες αποδείξεις ότι η ασθένεια ήταν μολυσματική. Ωστόσο, μέχρι τα μέσα του 20ού αιώνα διαπιστώθηκε οριστικά ότι η φυματίωση μεταδίδεται από την εισπνοή μολυσμένων σταγονιδίων του αέρα. 2
2. Επιδημιολογικά δεδομένα
Σε παγκόσμιο επίπεδο το 2018, περίπου 10 εκατομμύρια άνθρωποι νόσησαν εκ νέου ή/και από υποτροπή φυματίωσης, 3 που ισοδυναμεί με 132 περιπτώσεις ανά 100 000 άτομα στον πληθυσμό . Οι εκτιμήσεις των απόλυτων αριθμών παρουσιάζονται στον πίνακα 1 και οι εκτιμήσεις των ποσοστών ανά κατοίκους παρουσιάζονται στον πίνακα 2. Υπήρξαν κάτω από 10 περιστατικά ανά 100.000 άτομα στις περισσότερες χώρες υψηλού εισοδήματος, 150-400 στις περισσότερες από τις 30 χώρες υψηλού φορτίου φυματίωσης και πάνω από 500 στην Κεντροαφρικανική Δημοκρατία, τη Λαϊκή Δημοκρατία της Κορέας, το Λεσότο, τη Μοζαμβίκη, τη Ναμίμπια, τις Φιλιππίνες και τη Νότια Αφρική (εικόνα 1, πίνακας 2). Σύμφωνα με εκτιμήσεις, 8.600 ανά 100.000 άτομα (8.6%) δηλαδή περίπου 860.000 στα 10 εκατομμύρια των νέων περιστατικών ΤΒ και των υποτροπών τους το 2018 ήταν μεταξύ των ατόμων που ζουν με τον ιό HIV (πίνακας 1, πίνακας 2). Το υψηλότερο ποσοστό των
περιπτώσεων φυματίωσης που είχαν συνλοίμωξη με τον ιό HIV ήταν στις χώρες της περιοχής της Αφρικής σύμφωνα με τον ΠΟΥ, οι οποίες περιπτώσεις συνλοίμωξης υπερέβαιναν το 50% σε περιοχές της νότιας Αφρικής (εικόνα 2). Εκτιμάται ότι 143.000 νέες περιπτώσεις ζωονοτικής φυματίωσης (που προκαλούνται από Mycobacterium bovis) εμφανίστηκαν σε παγκόσμιο επίπεδο το 2018 στα 10
εκατομμύρια άτομα που νόσησαν από ΤΒ εκ νέου ή ως υποτροπή (πίνακας 3). Ειδικά στην Ελλάδα το 2018 είχαμε έναν συνολικό αριθμό 467 περιπτώσεων φυματίωσης δηλαδή 4.3 περιπτώσεις ανά 100.000 πληθυσμό (επιπολασμός). Από αυτές οι νέες περιπτώσεις μαζί με τις υποτροπές έφταναν τις 434 σε αριθμό. Οι νέες ήταν 414 (πίνακας 4).
13 Εικόνα 1
Εκτιμώμενο ποσοστό επίπτωσης της ΤΒ (ανά 100.000 άτομα) το 2018 (Global Tuberculosis report 2019 WHO)
Εικόνα 2
Εκτιμώμενος επιπολασμός ατόμων με HIV σε νέες περιπτώσεις και υποτροπές της ΤΒ το 2018
(Global Tuberculosis report 2019 WHO)
14
POPULATION
TOTAL TB INCIDENCE HIV-POSITIVE TB INCIDENCE HIV-NEGATIVE TB MORTALITY HIV-POSITIVE TB MORTALITYb BEST
ESTIMAT E
UNCERTAINTY INTERVAL
BEST ESTIMATE
UNCERTAINTY INTERVAL
BEST ESTIMAT
E
UNCERTAINTY INTERVAL
BEST ESTIMAT
E
UNCERTAINTY INTERVAL
Angola 31 000 109 71–156 11 6.8–15 19 11–28 3.7 2.4–5.3
Bangladesh 161 000 357 260–469 0.73 0.36–1.2 47 30–67 0.19 0.094–0.32
Brazil 209 000 95 81–110 11 9.3–13 4.8 4.6–5.0 1.9 1.4–2.4
Cambodia 16 000 49 27–77 1.1 0.59–1.7 3.0 1.9–4.3 0.38 0.21–0.60
Central African Republic 5 000 25 16–36 6.6 4.2–9.4 4.8 2.8–7.3 3.1 2.0–4.5
China 1 430 000 866 740–1 000 18 9.8–28 37 34–41 2.4 1.2–4.0
Congo 5 000 20 12–28 5.7 2.9–9.4 3.0 1.7–4.6 2.3 1.2–3.8
DPR Korea 26 000 131 114–149 0.22 0.12–0.36 20 14–27 0.068 0.035–0.11
DR Congo 84 000 270 175–385 31 9.4–65 43 25–65 10 3.2–22
Ethiopia 109 000 165 116–223 7.6 5.3–10 24 15–36 2.2 1.5–3.0
Indiac 1 350 000 2 690 1 840–3 700 92 63–126 440 408–472 9.7 5.7–15
Indonesia 268 000 845 770–923 21 8.9–38 93 87–99 5.3 2.1–9.8
Kenya 51 000 150 92–222 40 25–60 19 11–30 13 8.1–20
Lesothod 2 000 13 8.3–18 8.4 5.4–12 0.95 0.56–1.4 3.3 2.1–4.7
Liberia 5 000 15 9.6–21 2.6 1.7–3.7 2.7 1.6–4.1 1.0 0.67–1.5
Mozambiqued 29 000 162 105–232 58 38–83 21 13–32 22 14–31
Myanmar 54 000 181 119–256 15 10–22 21 12–31 3.7 2.5–5.2
Namibia 2 000 13 9.2–17 4.5 3.2–5.9 1.6 1.0–2.3 1.5 1.1–2.1
Nigeria 196 000 429 280–609 53 34–75 125 73–192 32 20–47
Pakistan 212 000 562 399–754 3.8 2.5–5.4 43 35–52 1.3 0.83–1.8
Papua New Guinea 9 000 37 30–45 2.7 2.2–3.3 4.5 3.0–6.2 0.25 0.10–0.45
Philippines 107 000 591 332–924 10 4.1–19 26 22–30 0.60 <0.01–4.2
Russian Federation 146 000 79 51–112 16 10–22 9.2 8.3–10 1.3 0.57–2.2
Sierra Leone 8 000 23 15–33 2.9 1.9–4.2 2.6 1.5–3.9 0.70 0.44–1.0
South Africad 58 000 301 215–400 177 127–235 21 20–23 42 30–57
Thailand 69 000 106 81–136 11 8.2–14 9.2 6.9–12 2.3 1.7–3.0
UR Tanzania 56 000 142 67–245 40 19–69 22 10–40 16 7.8–27
Viet Nam 96 000 174 111–251 6.0 3.8–8.6 11 6.7–15 2.2 1.4–3.2
Zambia 17 000 60 39–86 36 23–51 4.8 2.9–7.3 13 8.3–19
Zimbabwe 14 000 30 22–39 19 14–24 1.1 0.69–1.7 3.5 2.4–4.8
High TB burden countries 4 830 000 8 690 7 670–9 770 709 626–797 1 080 1 010–1 170
201 175–229
Africa 1 060 000 2 450 2 190–2 730 615 539–697 397 331–468 211 184–239
The Americas 1 000 000 289 268–310 29 27–31 17 16–19 5.9 5.2–6.6
Eastern Mediterranean 704 000 810 639–1 000 6.9 5.3–8.8 77 66–89 2.2 1.6–2.8
Europe 927 000 259 225–296 30 23–37 23 22–24 4.4 3.3–5.6
South-East Asia 1 980 000 4 370 3 480–5 370 140 107–178 637 598–677 21 16–28
Western Pacific 1 920 000 1 840 1 520–2 180 41 30–54 90 83–98 6.5 4.9–8.4
GLOBAL 7 600 000 10 000 8 990–11 100 862 776–952 1 240 1 160–1 320
251 224–280
Πίνακας 1
Εκτιμώμενο επιδημιολογικό φορτίο της φυματίωσης το 2018 για 30 χώρες υψηλού φορτίου, σύμφωνα με τον ΠΟΥ τοπικά και σε παγκόσμιο επίπεδο. Αριθμός σε χιλιάδες.
(Global Tuberculosis report 2019 WHO)
15 Πίνακας 2
Εκτιμώμενο επιδημιολογικό φορτίο της φυματίωσης το 2018 για 30 χώρες υψηλού φορτίου, σύμφωνα με τον ΠΟΥ τοπικά και σε παγκόσμιο επίπεδο. Τιμές ανά 100 000 κατοίκους.
(Global Tuberculosis report 2019 WHO)
16 Πίνακας 3
Εκτιμώμενη συχνότητα εμφάνισης νέων κρουσμάτων και υποτροπών και θνησιμότητα οφειλόμενη σε M. bovis TB, 2018
(Global Tuberculosis Report 2019 WHO)
ΕΛΛΑΔΑ-ΚΑΤΑΓΡΑΦΗ ΚΡΟΥΣΜΑΤΩΝ ΤΒ
Συνολικός αριθμός κρουσμάτων στον πληθυσμό (επιπολασμός) 467
Επιπολασμός ανά 100.000 άτομα 4.3
Συνολικός αριθμός νέων κρουσμάτων και υποτροπών στον πληθυσμό (επίπτωση)
434
Επίπτωση ανά 100.000 άτομα 4.0
Περιπτώσεις ΤΒ επιβεβαιωμένες εργαστηριακά στο σύνολο των κρουσμάτων
265 (56.7%)
Μέση ηλικία νέων γηγενών κρουσμάτων 62.8 έτη
Μέση ηλικία νέων κρουσμάτων αλλοδαπών 34.7 έτη Περιπτώσεις αλλοδαπών στο σύνολο των κρουσμάτων 197 (42.2%) Νέες περιπτώσεις στο σύνολο των κρουσμάτων (χωρίς τις
υποτροπές από θεραπεία)
414 (88.7%) Πίνακας 4
Καταγραφή κρουσμάτων ΤΒ στην Ελλάδα το 2017
(Tuberculosis surveillance and monitoring in Europe 2019 WHO)
17
3. Γονιδίωμα, ταξινόμηση, δομή και μορφολογία του Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC)
Ένα από τα στελέχη του MTB που έχει αλληλουχηθεί, το H37Rv, έχει αποδειχθεί ότι σχετίζεται με σαπρόφυτα που ζουν ελεύθερα στο έδαφος, το οποίο ίσως υποδεικνύει ότι ο πρόγονος του MTB ήταν ένα μυκοβακτηρίδιο του εδάφους 4. Το γονιδίωμα του στελέχους H37Rv δημοσιεύθηκε το 1998. 5,6 Το μέγεθός του είναι 4 εκατομμύρια ζεύγη βάσεων, με 3.959 γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες. Το 40% αυτών των γονιδίων έχει διευκρινισμένη λειτουργία, με την πιθανή υπόθεση της λειτουργίας για το άλλο 44%. Μέσα στο γονιδίωμα υπάρχουν επίσης έξι ψευδογονίδια. Έχει πολύ πυκνά τοποθετημένες κωδικοποιητικές περιοχές και έχει πολύ υψηλή περιεκτικότητα σε γουανίνη και κυτοσίνη που αντανακλάται στην ήδη υπάρχουσα περιεκτικότητα αμινοξέων των πρωτεϊνών του 7.
Το MTBC αποτελεί μια αξιοσημείωτα γενετικά ομοιογενή ομάδα. Εντός του ριβοσωμικού DΝΑ (rDNA) ενός οπερονίου δεν κωδικοποιούν μόνο τα γονίδια διάφορους τύπους ριβοσωμικού RNA (rRNA) αλλά και περιοχές μεταξύ αυτών των γονιδίων, όπως εσωτερικές μεταγραφόμενες διαχωριζόμενες περιοχές (internal transcribed spacer regions- ITS), (οι οποίες σε πολλά βακτήρια και μύκητες είναι έντονα πολυμορφικές και επομένως είναι χρήσιμες για την ταυτοποίηση και την γονοτύπηση σε υποείδος ή επίπεδο στελέχους), δείχνουν δε πλήρη διατήρηση (ομοιότητα) μεταξύ των μελών του MTBC 8. Ομοίως, πολλά δομικά γονίδια του MTBC παρουσιάζουν σημαντική διατήρηση των αλληλουχιών τους, με εκτιμώμενο ποσοστό συνώνυμων (σιωπηλών, που δεν τροποποιούν την παραγόμενη αλληλουχία αμινοξέων) μεταλλάξεων 0,01-0,03% 9-11 είναι δηλαδή πολύ λίγες και χωρίς νόημα.
Επιπλέον, η έλλειψη σημαντικών αποδείξεων για οριζόντια μεταφορά γονιδίων μεταξύ των μυκοβακτηριδιακών γονιδιωμάτων υποστηρίζει την κλωνική εξέλιξη στο MTBC 9-12 κι αυτό με τη σειρά του καθιστά δύσκολη ακόμη και τη διάκριση σε επίπεδο στελέχους του MTB μέσω προσεγγίσεων με μοριακή γονοτύπηση. Ωστόσο, πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η γενετική ποικιλομορφία (η ποικιλία στη γενετική σύνθεση ενός είδους από ένα άλλο) του MTBC είναι πολύ μεγαλύτερη από ό, τι είχε ήδη υποτεθεί και ότι αυτή η διακύμανση στα γονιδιώματα αποδίδεται στους μονονουκλεοτιδικούς πολυμορφισμούς (SNPs), με πιθανή επίδραση στον
παθοβιολογικό φαινότυπό τους (συνώνυμες ή μη συνώνυμες) 13,14.
Πολλές από τις μεταλλάξεις έχουν ως αποτέλεσμα την αντοχή στα φάρμακα 15. Επίσης φαίνεται ότι συχνά ένα αίτιο μεταλλάξεων αποτελεί ο ανασυνδυασμός μέσω διαφορετικών τρανσποζονίων. Τα απλούστερα τρανσποζόνια είναι αλληλουχίες εισαγωγής (IS) 16 και πάνω από 14 διαφορετικά είδη αλληλουχιών εισαγωγής έχουν αναγνωριστεί στο γονιδίωμα. Η ακολουθία εισαγωγής που χρησιμοποιείται
περισσότερο σε επιδημιολογικές μελέτες είναι η 1S6110.
Η ανάλυση της γενετικής παραλλαγής (μετάλλαξης) ή η γονοτύπηση (genotyping) χρησιμοποιείται για την ανίχνευση διαφορετικών στελεχών του MTB, τόσο σε εθνικό
18
όσο και σε διεθνές επίπεδο, προκειμένου να ληφθούν πληροφορίες σχετικά με τα μοτίβα των στελεχών εξάπλωσης, λοιμογονικότητας και παθογένειας.
Συνολικά, οι στρατηγικές δημιουργίας των γενετικών παραλλαγών (μεταλλάξεων) στα βακτήρια μπορούν να χωριστούν σε τρεις κατηγορίες 17:
(i) μικρές τοπικές αλλαγές στην αλληλουχία των νουκλεοτιδίων του γονιδιώματος, π.χ., πολυμορφισμοί ενός νουκλεοτιδίου (SNPs).
(ii) ενδο-γονιδιωματικές αναδιατάξεις τμημάτων αλληλουχίας του γονιδιώματος, π.χ.
ανασυνδυασμός μεταξύ επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών και διαγραφών.
(iii) απόκτηση αλληλουχιών DNA από άλλους μικροοργανισμούς. Στο MTB, η οριζόντια ανταλλαγή πιστεύεται ότι συμβαίνει σπάνια, αν όχι καθόλου 18,19, όπως αποδεικνύεται από την ανάλυση spoligotyping με αποτέλεσμα την απώλεια μιας σημαντικής οδού μεταλλάξεων.
Το MTB που προκαλεί τη φυματίωση είναι ένα μικρό, αργά αναπτυσσόμενο
βακτήριο που μπορεί να ζήσει μόνο στους ανθρώπους. Δεν απαντάται σε άλλα ζώα, έντομα, χώμα ή άλλα άψυχα αντικείμενα. Το MTB είναι αερόβιο βακτήριο, που σημαίνει ότι χρειάζεται οξυγόνο για να επιβιώσει. Για τον λόγο αυτό, κατά τη διάρκεια της ενεργού φυματιώδους νόσου, τo MTB εντοπίζεται πάντοτε στους άνω λοβούς των πνευμόνων. Το βακτήριο είναι ένας προαιρετικά ενδοκυττάριος
μικροοργανισμός, συνήθως των μακροφάγων, και έχει έναν αργό ρυθμό αναπαραγωγής, 15-20 ώρες, ένα φυσιολογικό χαρακτηριστικό που μπορεί να συνεισφέρει στη λοιμογονικότητά του. Τα βακτήρια συνήθως προσβάλλουν τους πνεύμονες, αλλά το MTB μπορεί να προσβάλλει οποιοδήποτε μέρος του σώματος, όπως ο νεφρός, η σπονδυλική στήλη και ο εγκέφαλος. Εάν δεν θεραπευθεί σωστά, η ασθένεια μπορεί να είναι θανατηφόρα.
Το διακριτό χαρακτηριστικό όλων των ειδών του γένους είναι ότι το κυτταρικό τοίχωμα είναι παχύτερο από ό,τι σε άλλα βακτήρια, και είναι υδρόφοβο, κηρώδες και πλούσιο σε μυκολικά οξέα. Το κυτταρικό τοίχωμα αποτελείται από μια υδρόφοβη μυκολική στιβάδα και μια στιβάδα πεπτιδογλυκάνης που συγκρατούνται μαζί, με έναν πολυσακχαρίτη, την αραβινογαλακτάνη. Το κυτταρικό τοίχωμα συμβάλλει ουσιαστικά στην ανθεκτικότητα αυτού του γένους. Οι βιοσυνθετικές οδοί των συστατικών του κυτταρικού τοιχώματος είναι δυνητικοί στόχοι για νέα φάρμακα για τη φυματίωση. (εικόνα 3)
19 Εικόνα 3.
Μυκοβακτηριδιακό κυτταρικό τοίχωμα:
1-εξωτερικά λιπίδια, 2-μυκολικό οξύ, 3 πολυσακχαρίτες (αραβινογαλακτάνη), 4- πεπτιδογλυκάνη, 5-πλασματική μεμβράνη, 6-λιποαραβινομαννάνη (LAM), 7- μαννοσίδη της φωσφατιδυλινοσιτόλης, 8- σκελετός κυτταρικού τοιχώματος ("Mycobacterial outer membranes: in search of proteins". Trends in Microbiology 18 (3): 109–16)
Για μεγαλύτερη ακρίβεια, με βάση τα τοπογραφικά χαρακτηριστικά, το MTBC μπορεί να κατηγοριοποιηθεί σε έξι είδη, συμπεριλαμβανομένων των Μycobacterium tuberculosis, Μycobacterium africanum, Μycobacterium bovis, Μycobacterium microti και Μycobacterium canettii. Τέλος το Μycobacterium bovis Bacillus Calmette Guérin (BCG) αποτελεί κι αυτό μέλος του MTBC. Άλλα μυκοβακτηρίδια μολύνουν θαλάσσια λιοντάρια (Μycobacterium pinnipedi), ή αιγοπρόβατα
(Μycobacterium caprae).
Τα μέλη του MTBC έχουν μεταξύ τους κοινό το 99,95% των γενωμικών
αλληλουχιών τους και μια αυστηρά κλωνική πληθυσμιακή δομή 20. Λαμβάνοντας υπόψη ότι όλα τα είδη προέρχονται από έναν κοινό πρόγονο, είναι ενδιαφέρον ότι μερικά είναι παθογόνα για τον άνθρωπο ή τα τρωκτικά, ενώ άλλα έχουν ένα ευρύ φάσμα ξενιστών 21. Οπότε τα διαφορετικά βιολογικά, οικολογικά και κλινικά χαρακτηριστικά τους υποδηλώνουν διαφορετικές εξελικτικές πορείες.
Φυλογενετικές μελέτες ανέδειξαν κάποια στοιχεία για το πώς αναπτύχθηκε το MTBC. 22 Έχει εξηγηθεί λεπτομερώς ο τρόπος με τον οποίο έχουν οριστεί οι φυλογενετικές σειρές του MTBC.
Εν συντομία, στο MTB έχουν περιγραφεί πέντε μεγάλες γενεές που συνδέονται με διαφορετικές περιοχές του κόσμου:
1) Γενεά 1 (Ανατολική Αφρική, Φιλιππίνες, στην περιοχή του Ινδικού Ωκεανού) 2) Γενεά 2 (Ανατολική Ασία)
3) Γενεά 3 (Ανατολική Αφρική , Κεντρική Ασία)
4) Γενεά 4 (Ευρώπη, Αμερική, Αφρική) και, πολύ πρόσφατα 5) γενεά 7 στην Αιθιοπία 23
20
Το Μycobacterium africanum έχει χωριστεί σε δύο φυλογενετικά διαφορετικές γενεές:
1) Γενεά 5 (Δυτική Αφρική 1) και 2) γενεά 6 (Δυτική Αφρική 2)
Τα ζωικά είδη αντιπροσωπεύουν επίσης εξατομικευμένες μονοφυλογενετικές γενεές.
Τέλος, το Μycobacterium canettii έχει μια προγονική θέση στο MTBC (εικόνα 4) 24-
26.
Εικόνα 4
Φυλογένεση του ΜΤΒC με βάση τις μελέτες σε επίπεδο γονιδιώματος (που προέρχονται από τον Comas et al., 2013). Εμφανίζονται οι πέντε γενεαλογικές γραμμές του MTB (γενεές 1, 2, 3, 4 και 7). Το σχήμα υπογραμμίζει τις δύο εξατομικευμένες γενεαλογικές γραμμές του Μycobacterium africanum (γενεαλογίες 5 και 6) και την προγονική θέση του Μycobacterium canettii. Οι σειρές των ζωικών ειδών αντιπροσωπεύουν ένα μονοφυλογενετικό κλάδο στο complex. Οι γενεές του γκρίζου οβάλ είναι οι λεγόμενες «σύγχρονες» γενεές, σε αντίθεση με όλες τις άλλες γενεές, που ονομάζονται «προγονικές».
(M. tuberculosis: ecology and evolution, Journal of Medical Microbiology 64)
Επειδή το MTB φαίνεται να εξελίσσεται κλωνικά (διασπορά συγκεκριμένων κλώνων με κοινή προέλευση), ουσιαστικά με αντικαταστάσεις, διαγραφές και αντιγραφές (μεταλλάξεις που τους δίνουν πλεονέκτημα επιβίωσης), είναι πιθανό ότι ορισμένες γενεές θα μπορούσαν να έχουν αποκτήσει στην πορεία συγκεκριμένα χαρακτηριστικά λοιμογονικότητας και / ή αντοχής πριν εξαπλωθούν στους πληθυσμούς (ανάδυση κλώνων) 27. Με βάση επιδημιολογικά και πειραματικά δεδομένα, φαίνεται σαφές ότι το MTB έχει εξελιχθεί στο να αποκτήσει αυξημένο δυναμικό μετάδοσης και
λοιμογονικότητα. Από την άλλη πλευρά, η αντοχή στα αντιβιοτικά δεν φαίνεται να επηρεάζει το δυναμικό μετάδοσής του ή τη λοιμογόνο δράση του, διαφορετικά απ' ότι αναμενόταν 28.
21 4. Μετάδοση
Το MTB μεταδίδεται ουσιαστικά μέσω του αέρα και των μικροσταγονιδίων του βήχα, του πταρμού ή της ομιλίας με αποτέλεσμα οι φυματιώδεις βάκιλοι να εισέρχονται στο ανθρώπινο σώμα κυρίως μέσω της αναπνευστικής οδού μετά από την εισπνοή αυτών των μικροσκοπικών σταγονιδίων (εικόνα 5). Αυτά τα σωματίδια είναι αρκετά μικρά ώστε να μπορούν να φτάσουν στους κατώτερους αεραγωγούς 29.
Η επιτυχία της λοίμωξης και η ανάπτυξη της πνευμονικής μορφής της ΤΒ (οι πνεύμονες είναι ο κύριος στόχος αυτού του βακτηρίου) εξαρτώνται από τέσσερα διαδοχικά στάδια:
1) την φαγοκυττάρωση των βακίλων 2) τον ενδοκυττάριο πολλαπλασιασμό τους
3) τη διάρκεια της φάσης της λανθάνουσας λοίμωξης (LTBI) 4) και τελικά την ενεργό πνευμονική λοίμωξη
Αυτά τα βήματα μπορούν να προχωρήσουν σε διαφορετικά κλινικά σενάρια:
1) την αυτόματη θεραπεία
2) την αυτόματη ενεργό ασθένεια
3) την λανθάνουσα λοίμωξη και την αναζωπύρωσή της 4) ή την επαναλοίμωξη (βλέπε εικόνα 5) 30
Τα ανοσοκατεσταλμένα άτομα διατρέχουν μεγαλύτερο κίνδυνο να αναπτύξουν ενεργό φυματίωση μετά τη μόλυνση, ιδιαίτερα οι ασθενείς με AIDS. Ωστόσο, κανένας από τους κρίσιμους καθοριστικούς παράγοντες (που σχετίζονται με τον ξενιστή ή τον παθογόνο παράγοντα) που εμπλέκονται στην κλινική έκβαση της συνλοίμωξης με τον ιό της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας (HIV) και την ΤΒ είναι γνωστός λεπτομερώς 31-34.
22 Εικόνα 5
Ο κύκλος με βάση τους Kaufmann et al. (2006) και Godreuil et al. (2007b). Το MTB εισέρχεται στο ξενιστή με την εισπνοή των αερολυμάτων. Υπάρχουν
διάφορα σενάρια: (1) άμεση εξάλειψη του MTB από το πνευμονικό ανοσοποιητικό σύστημα, (2) η μόλυνση προχωρεί σε ενεργό φυματίωση, (3) η μόλυνση δεν
προχωρεί σε ενεργό νόσο και το MTB εισέρχεται σε φάση λανθάνουσας κατάστασης, (4) μετά τη φάση λανθάνουσας κατάστασης, το MTB μπορεί να ενεργοποιηθεί μετά από ενδογενή αναζωπύρωση ή νέα εξωγενή μόλυνση ή και τα δύο. (5) σε αυτό το στάδιο, υπάρχει διασπορά και μετάδοση του MTB.
(M. tuberculosis: ecology and evolution, Journal of Medical Microbiology 64)
23 5. Ανοσολογία της λοίμωξης
Η πύλη εισόδου του MTB είναι η αναπνευστικής οδός. Μετά την εισπνοή, το MTB μετακινείται στην κατώτερη αναπνευστική οδό, όπου συναντά τα κυψελιδικά μακροφάγα, τα οποία είναι ο κυρίαρχος κυτταρικός τύπος που αυτό προσβάλλει (εικόνα 6). Αυτά τα κύτταρα εγκολπώνουν τα βακτήρια με μεσολαβούμενη από υποδοχέα φαγοκυττάρωση, με πολλούς διαφορετικούς υποδοχείς να συμβάλλουν στη διαδικασία αυτή. Μόλις εγκολπωθεί, το MTB αναστέλλει ενεργά τη σύντηξη του φαγοσώματος με το λυσόσωμα, εξασφαλίζοντας την επιβίωσή του 35. Μετά τη μόλυνση των κυψελιδικών μακροφάγων στους αεραγωγούς, το MTB αποκτά πρόσβαση στον διάμεσο χώρο του πνεύμονα, όπου εξελίσσεται η διαδικασία μόλυνσης. Ωστόσο, η ακριβής αλληλουχία γεγονότων της εισόδου του MTB στο παρέγχυμα είναι υπό διερεύνηση. Υπάρχουν δύο πιθανοί μηχανισμοί:
- ο ένας περιλαμβάνει την άμεση μόλυνση των επιθηλιακών κυττάρων από το MTB και
- ο δεύτερος περιλαμβάνει τη μετανάστευση μολυσμένων με MTB μακροφάγων στο επιθήλιο (εικόνα 6).
Ανεξάρτητα από τη διαδρομή, το MTB εισέρχεται στο παρέγχυμα και στην συνέχεια ακολουθεί μια ανοσολογική αντίδραση που οδηγεί στην προσέλκυση ενός
αυξανόμενου αριθμού κυττάρων στη θέση του μικροοργανισμού, δημιουργώντας μια αντίδραση του ξενιστή που ονομάζεται κοκκίωμα. Καθώς εγκαθίσταται η πρωτογενής λοίμωξη, είτε τα προσβεβλημένα δενδριτικά κύτταρα 36 είτε τα φλεγμονώδη
μονοκύτταρα 37 μεταφέρουν το MTB στους λεμφαδένες των πνευμόνων για να δώσουν έναυσμα στα Τ κύτταρα. Το κοκκίωμα καταδεικνύει τη δυαδικότητα της μόλυνσης από το MTB. Από την πλευρά του ξενιστή, το κοκκίωμα είναι μια βακτηριακή «φυλακή» με την πιθανότητα να «απομονωθεί» ο λοιμογόνος
παράγοντας από το υπόλοιπο σώμα. Ωστόσο, από την βακτηριακή πλευρά, είναι μια αυξανόμενη συλλογή φαγοκυττάρων που μπορούν αυτά να μολύνουν και να
αναδιπλασιάζονται μέσα τους. Έχει επίσης προταθεί ότι το κοκκίωμα μπορεί να έχει ένα μέγιστο βακτηριακό φορτίο, πέρα από το οποίο η λοίμωξη θα συνεχίσει να προχωρεί 38. Αν το κοκκίωμα απομονώνει τη λοίμωξη χωρίς να προκαλεί σημαντική ανατομική διαφοροποίηση, τότε το άτομο έχει LTBI και μπορεί να είναι υποψήφιο για προληπτική θεραπεία. Στα περισσότερα άτομα με LTBI, ο συνδυασμός
μακροφάγων, δενδριτικών κυττάρων και Τ κυττάρων είναι επαρκής για να διατηρήσει μια ελεγχόμενη, ασυμπτωματική λοίμωξη. Ωστόσο, σε ένα υποσύνολο ξενιστών, για λόγους που δεν είναι απολύτως σαφείς, η λοίμωξη μπορεί να προχωρήσει σε κλινική νόσο, στις πρώτες εβδομάδες της μόλυνσης ή μετά από δεκαετίες.
24 Εικόνα 6
Μόλυνση από το MTB α | Η μόλυνση αρχίζει όταν το MTB εισέρχεται στους πνεύμονες με εισπνοή, φτάνει στον κυψελιδικό χώρο και συναντά τα μόνιμα υπάρχοντα εκεί κυψελιδικά μακροφάγα. Εάν αυτή η πρώτη γραμμή άμυνας αποτύχει να εξουδετερώσει τα βακτηρίδια, τότε το MTB εισβάλλει στον διάμεσο ιστό του πνεύμονα είτε με άμεση μόλυνση από τα βακτήρια του κυψελιδικού επιθηλίου είτε με μετανάστευση των μολυσμένων κυψελιδικών μακροφάγων στο πνευμονικό παρέγχυμα. Ακολούθως, είτε τα δενδριτικά κύτταρα είτε τα
φλεγμονώδη μονοκύτταρα μεταφέρουν το MTB στους πνευμονικούς λεμφαδένες για κινητοποίηση των Τ κυττάρων. Αυτό το γεγονός οδηγεί στην προσέλκυση ανοσοκυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των Τ και των Β κυττάρων, στο πνευμονικό παρέγχυμα για τον σχηματισμό κοκκιώματος.
b | Τα βακτήρια αναπαράγονται μέσα στο αναπτυσσόμενο κοκκίωμα. Εάν το βακτηριακό φορτίο γίνει πολύ μεγάλο, το κοκκίωμα θα αποτύχει να συγκρατήσει τη λοίμωξη75 και τα βακτήρια θα διαδοθούν τελικά σε άλλα όργανα,
συμπεριλαμβανομένου του εγκεφάλου. Σε αυτή τη φάση, τα βακτήρια μπορούν να εισέλθουν στην κυκλοφορία του αίματος ή να επανέλθουν στην αναπνευστική οδό απ' όπου και απελευθερώθηκαν- ο μολυσμένος ξενιστής είναι πλέον μολυσματικός, συμπτωματικός και λέγεται ότι έχει ενεργό νόσο της φυματίωσης.
(2 0 1 6 Macmillan Publishers Limited, part of Springer Nature)
25
6. Μηχανισμοί αντοχής στα φάρμακα και γονίδια αντοχής
Τις τελευταίες δεκαετίες έχουν εμφανιστεί στελέχη ανθεκτικά σε πολλά φάρμακα (MDR) 39 . Επιπλέον, οι εκθέσεις που έδωσε ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας για το 2010 αποκαλύπτουν δύο ακόμη κατηγορίες στελεχών, που είναι, στελέχη σε
εκτεταμένο βαθμό ανθεκτικά στα φάρμακα (XDR), που είναι ανθεκτικά σε τουλάχιστον 4 από τα βασικά φάρμακα κατά της φυματίωσης και στελέχη φυματίωσης που είναι πλήρως ανθεκτικά στα φάρμακα της ΤΒ (TDR).
Ένας τύπος αντοχής στη φυματίωση που εμφανίζεται σε άτομα που μολύνθηκαν αρχικά από το ανθεκτικό στα αντιβιοτικά στέλεχος αλλά δεν είχαν λάβει καμία θεραπεία κατά της φυματίωσης θεωρείται ως η πρωτογενής αντοχή, ενώ μια κατάσταση στην οποία η αντοχή αναπτύχθηκε λόγω ανεπαρκούς θεραπείας αναφέρεται ως επίκτητη αντοχή 40-41.
Η πολυπλοκότητα των μηχανισμών που χρησιμοποιεί το MTB για την αντοχή του στα φάρμακα οδήγησε τους επιστήμονες να μελετήσουν το MTB σε μοριακό επίπεδο.
Οι Both και Blair (2015), τόνισαν ότι η αντοχή στα φάρμακα στο MTB δεν είναι μία ομοιογενής, μεμονωμένη βιολογική μονάδα, υποδηλώνοντας έτσι ότι η
πολυπλοκότητα και η σοβαρότητα της αντοχής στο παθογόνο οφείλονται σε κάποιους άλλους εγγενείς παράγοντες.
6.1. Μηχανικά ενδογενή χαρακτηριστικά της αντοχής στα φάρμακα
Η μη διαπερατότητα του κυτταρικού τοιχώματος, ο αργός μεταβολισμός και πολλαπλασιασμός του κυττάρου και η ύπαρξη πολυάριθμων αντλιών εκροής στην επιφάνεια του κυτταρικού περιβλήματος καθιστά το κύτταρο ανθεκτικό σε πολλά αντιβιοτικά, ειδικά των ομάδων που βασίζονται σε βιολογικά ενεργό και
πολλαπλασιαζόμενο πληθυσμό κυττάρων. Οι συγκεκριμένοι μηχανισμοί είναι ενδογενείς και δεν μεταβιβάζονται.
6.2. Μοριακοί μηχ