ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΙΓΑΙΟΥ
ΤΜΗΜΑ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ
ΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ
«Εκτίμηση της τοξικής δράσης του φυτοφαρμάκου diuron με τη χρήση του φωτοσυνθετικού οργανισμού Lemna
minor»
Μήτα Ευσταθία Α.Μ. 141/2004033
Σκυριανού Αθηνά Α.Μ. 141/2004056
Επιβλέπων καθηγητής: Στασινάκης Αθανάσιος
Μυτιλήνη
Φεβρουάριος 2009
«Είναι μια περίεργη κατάσταση το γεγονός ότι η θάλασσα, από την οποία προέκυψε η ζωή αρχικά, απειλείται από τις δραστηριότητες μιας μορφής εκείνης της ζωής.
Αλλά η θάλασσα, αν και άλλαξε με ένα απαίσιο τρόπο, θα συνεχίσει να υπάρχει˙
η απειλή είναι μάλλον στη ζωή την ίδια»
Rachel Carson
“The Sea around us” (1951)
Ευχαριστίες
Ολοκληρώνοντας την πτυχιακή μας εργασία, θα θέλαμε να εκφράσουμε τις ευχαριστίες μας σε όσους μας παρείχαν γνώσεις και σε όσους μας στήριξαν ηθικά όλα αυτά τα χρόνια.
Ιδιαίτερα θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε τον επιβλέποντα καθηγητή μας, κ.
Στασινάκη Αθανάσιο αφενός για την ανάθεση του πρωτότυπου θέματος, την παροχή υλικοτεχνικής υποδομής και την επίβλεψη του κατά την εκπόνηση της πτυχιακής μας εργασίας, αφετέρου για την πολύτιμη βοήθεια και στήριξη που μας προσέφερε.
Ευχαριστούμε τη κ. Γατίδου Γεωργία και τη κ. Καλαντζή Όλγα – Ιωάννα που δέχτηκαν να συμμετέχουν στην τριμελή επιτροπή εξέτασης της πτυχιακής μας εργασίας.
Ιδιαιτέρως ευχαριστούμε την κ. Γατίδου Γεωργία για την πολύτιμη βοήθεια που μας παρείχε κατά τη διάρκεια των πειραμάτων και για τις συμβουλές της.
Ακόμη θέλουμε να ευχαριστήσουμε τις κυρίες Νίκη Γεωργή και Εριφύλη Ζαφειρίου και τους κυρίους Καραντανέλλη Γεώργιο και Ατσικμπάση Σπύρο για τη παροχή υλικών για τη διεξαγωγή των πειραμάτων.
Από τα βάθη της καρδιάς μας θέλουμε να ευχαριστήσουμε τους γονείς μας για την αμέριστη υποστήριξη τους, ηθική και οικονομική, όλα αυτά τα χρόνια που βρισκόμασταν τόσο μακριά τους. Επίσης τα αδέρφια μας για την υπομονή τους, ιδιαίτερα τους τελευταίους μήνες και τη στήριξη τους στις δύσκολες στιγμές. Αυτοί αποτελούσαν τη δύναμη μας να συνεχίσουμε.
Τέλος, ευχαριστούμε τους φίλους μας που όλα αυτά τα χρόνια μας αγκάλιασαν με αγάπη και μας στάθηκαν σαν δεύτερη οικογένεια.
Περιεχόμενα
ΠΕΡΙΕΧΌΜΕΝΑΔΙΑΓΡΑΜΜΆΤΩΝ...7
ΠΕΡΙΕΧΌΜΕΝΑΕΙΚΌΝΩΝ...7
ΠΕΡΙΕΧΌΜΕΝΑΠΙΝΆΚΩΝ...7
ΠΕΡΊΛΗΨΗ...9
ΚΕΦΆΛΑΙΟ 1 : ΖΙΖΑΝΙΟΚΤΌΝΑ ΣΤΗΝ ΚΑΤΗΓΟΡΊΑ ΤΩΝ ΥΠΟΚΑΤΕΣΤΗΜΈΝΩΝ ΟΥΡΙΏΝ: Η ΟΥΣΊΑ DIURON...10
1.1 ΦΥΤΟΦΆΡΜΑΚΑ...11
1.2 ΥΠΟΚΑΤΕΣΤΗΜΈΝΕΣ ΟΥΡΊΕΣ...13
1.3 DIURON...13
1.3.1 Φυσικοχημικές ιδιότητες...14
1.3.2 Τοξικότητα...15
ΚΕΦΆΛΑΙΟ 2 : ΤΟΞΙΚΟΛΟΓΙΚΆ ΠΕΙΡΆΜΑΤΑ ΚΑΙ ΈΡΕΥΝΕΣ ΜΕ ΧΡΉΣΗ ΤΗΣ LEMNA MINOR...16
2.1 ΕΙΣΑΓΩΓΉ...17
2.2 ΕΠΙΛΟΓΉΚΑΤΆΛΛΗΛΟΥ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΎ...17
2.3 ΠΕΙΡΆΜΑΤΑΤΟΞΙΚΌΤΗΤΑΣ...18
2.3.1 Πειράματα οξείας τοξικότητας (acute toxicity tests)...21
2.3.2 Πειράματα υποχρόνιας τοξικότητας (sub - chronic or early life stage toxicity tests)...22
2.3.3 Πειράματα χρόνιας τοξικότητας (chronic toxicity tests)...22
2.4 ΣΥΣΤΉΜΑΤΑ ΈΚΘΕΣΗΣ...23
2.5 ΔΟΚΙΜΑΣΊΕΣ ΤΟΞΙΚΌΤΗΤΑΣ. ΣΧΈΣΗ ΔΌΣΗΣ - ΑΠΟΤΕΛΈΣΜΑΤΟΣ...24
2.6 ΚΑΤΗΓΟΡΊΕΣΤΟΞΙΚΌΤΗΤΑΣΚΑΙ ΤΟΞΙΚΟΛΟΓΙΚΟΊΌΡΟΙ (ΣΥΝΤΜΉΣΕΙΣ)...26
2.7 ΣΗΜΕΊΑΛΉΞΗΣ ΠΕΙΡΑΜΆΤΩΝ (ENDPOINTS)...28
2.8 ΠΡΌΤΥΠΕΣΜΈΘΟΔΟΙ ΠΕΙΡΑΜΆΤΩΝ...29
2.9 ΠΑΡΆΓΟΝΤΕΣΠΟΥΕΠΗΡΕΆΖΟΥΝΤΗΝΤΟΞΙΚΌΤΗΤΑ...31
2.9.1 Παράγοντες που σχετίζονται με την ουσία...31
2.9.2 Παράγοντες που σχετίζονται με τον εκτιθέμενο οργανισμό...32
2.9.3 Παράγοντες που σχετίζονται με το χρόνο έκθεσης...32
2.9.4 Παράγοντες που σχετίζονται με το εξωτερικό περιβάλλον...34
2.9.4.1 Θερμοκρασία...34
2.9.4.2 Διαλυμένο οξυγόνο (DO)...34
2.9.4.3 pH...35
2.9.4.4 Αλατότητα...35
2.10 ΠΕΙΡΆΜΑΤΑΤΟΞΙΚΌΤΗΤΑΣ ΜΕΤΗΝ LEMNAMINOR...35
2.10.1 Lemna minor...35
2.10.2 Τοξικολογικά πειράματα και Lemna minor...37
ΚΕΦΆΛΑΙΟ 3: ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΊΑ...38
3.1 ΕΙΣΑΓΩΓΉ...39
3.2 ΠΕΡΙΓΡΑΦΉΠΡΩΤΟΚΌΛΛΟΥ...39
3.2.1 Εξοπλισμός...39
3.2.2 Συλλογή και καλλιέργεια Lemna minor...40
3.2.3 Θρεπτικό μέσο (medium)...41
3.2.4 Διαλύματα...42
3.2.5 Έκθεση και μετρήσεις...43
3.2.6 Χρόνος διπλασιασμού...44
3.2.7 Μέσος ρυθμός ανάπτυξης...44
3.2.8 Ποσοστιαία αναχαίτιση...45
3.2.9 Ποσοστιαία αναχαίτιση του συντελεστή απόδοσης βιομάζας (Yield) ...45
3.3 ΠΕΡΙΓΡΑΦΉΠΕΙΡΑΜΆΤΩΝ...46
3.3.1. Προσαρμογή οργανισμών...46
3.3.2. Πειράματα ακετόνης...49
3.3.3. Πείραμα με φυτοφάρμακο diuron (range-finding test)...50
3.3.4. Πείραμα με φυτοφάρμακο diuron (EC50)...50
ΚΕΦΆΛΑΙΟ 4: ΑΠΟΤΕΛΈΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΉΤΗΣΗ...51
4.1 ΕΠΊΔΡΑΣΗΤΗΣΑΚΕΤΌΝΗΣ ΣΤΗ LEMNAMINOR...52
4.2 ΕΚΤΊΜΗΣΗΤΗΣΤΟΞΙΚΌΤΗΤΑΣΤΟΥDIURONΣΤΗ LEMNAMINOR...54
4.2.1 Προσδιορισμός του εύρους των αποτελεσματικών συγκεντρώσεων επίδρασης του diuron στη Lemna minor...54
4.2.2 Πείραμα εκτίμησης της τοξικότητας του diuron (EC50)...57
4.3 ΣΎΓΚΡΙΣΗΜΕΆΛΛΟΥΣΟΡΓΑΝΙΣΜΟΎΣ...62
4.4. ΣΥΜΠΕΡΆΣΜΑΤΑ...65
ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΊΑ...66
Βιβλία...66
Πανεπιστημιακές Μελέτες...67
Επιστημονικά άρθρα...67
Πρωτόκολλα – Εκθέσεις...69
Νομοθεσία...70
Περιεχόμενα διαγραμμάτων
Διάγραμμα 1: Επίδραση της ακετόνης στη Lemna minor...53
Διάγραμμα 2: Επίδραση της ακετόνης στο ξηρό βάρος της Lemna minor...54
Διάγραμμα 3: Τοξική επίδραση του diuron στην ανάπτυξη της Lemna minor 55 Διάγραμμα 4: Επι % αναχαίτιση του συντελεστή απόδοσης βιομάζας του οργανισμού...56
Διάγραμμα 5: Ρυθμός ανάπτυξης της Lemna minor με τη προσθήκη diuron. 57 Διάγραμμα 6: Η % αναχαίτιση του ρυθμού ανάπτυξης της Lemna minor συγκριτικά με τη συγκέντρωση του diuron...58
Διάγραμμα 7: Επίδραση του diuron (EC50) στο ξηρό βάρος της Lemna minor ...59
Διάγραμμα 8: Ρυθμός ανάπτυξης της Lemna minor μετά την προσθήκη diuron ...60
Διάγραμμα 9: Η % αναχαίτιση του ρυθμού ανάπτυξης της Lemna minor...61
Διάγραμμα 10: Επίδραση του diuron στο ξηρό βάρος της Lemna minor (επανάληψη)...62
Περιεχόμενα εικόνων
Εικόνα 1: Συντακτικός τύπος του diuron...14Εικόνα 2: Lemna minor...36
Εικόνα 3: Εργαστηριακή καλλιέργεια Lemna minor...40
Εικόνα 4: Συσκευή καθαρού νερού...42
Εικόνα 5: Ζυγός ακριβείας...44
Εικόνα 6: Κλίβανος αποστείρωσης...48
Εικόνα 7: Επωαστικός θάλαμος...49
Περιεχόμενα πινάκων
Πίνακας 1. Φυσικοχημικές ιδιότητες του diuron...14Πίνακας 2. Τοξικότητα του diuron σε διάφορους οργανισμούς...15
Πίνακας 3: Σουηδικό πρότυπο (SIS) θρεπτικού medium για την Lemna...41
Πίνακας 4: Συγκεντρώσεις διαλυμάτων...46
Πίνακας 5: Ρυθμός ανάπτυξης και % αναχαίτιση της Lemna minor...52
Πίνακας 6 : Ξηρό βάρος με την επίδραση της ακετόνης...53
Πίνακας 7: Ρυθμός ανάπτυξης και % αναχαίτιση της Lemna minor...54
Πίνακας 8: Ξηρό βάρος Lemna minor και % αναχαίτιση του συντελεστή απόδοσης βιομάζας...55
Πίνακας 9: Ρυθμός ανάπτυξης και % αναχαίτιση του ρυθμού ανάπτυξης της Lemna minor με τη προσθήκη diuron...57
Πίνακας 10: Ξηρό βάρος και % αναχαίτιση του συντελεστή απόδοσης βιομάζας με την επίδραση του diuron...58
Πίνακας 11: Ρυθμός ανάπτυξης και % αναχαίτιση του ρυθμού ανάπτυξης της Lemna minor...60
Πίνακας 12: Ξηρό βάρος με την επίδραση του diuron (επανάληψη)...61
Πίνακας 13: Τιμές EC50 για διάφορους δοκιμαστικούς οργανισμούς...63
Περίληψη
Στόχος της παρούσας πτυχιακής εργασίας είναι η διερεύνηση της τοξικής επίδρασης του diuron στο φυτικό οργανισμό Lemna minor.
Το diuron είναι ζιζανιοκτόνο, το οποίο ανήκει στην κατηγορία των υποκατεστημένων ουριών. Χρησιμοποιείται για τον έλεγχο των ζιζανίων σε αγροτικές εφαρμογές ή μη καθώς και ως ενισχυτική βιοκτόνος ουσία στα υφαλοχρώματα νέας γενιάς.
Κατά την εκπόνηση αυτής της εργασίας, εκτιμήθηκε αρχικά η επίδραση της ακετόνης ως διαλύτη στη Lemna minor και βρέθηκε ότι η παρουσία της έχει θετικό αντίκτυπο στην ανάπτυξη της. Στη συνέχεια εκτιμήθηκε η EC50 του diuron στον οργανισμό. Συγκεκριμένα η τιμή της EC50 του diuron κυμαίνεται από 29 έως 46 ppb.
Λέξεις κλειδιά: Lemna minor, Diuron, τοξικότητα, υποκατεστημένες ουρίες, ζιζανιοκτόνα
Κεφάλαιο 1 : Ζιζανιοκτόνα στην κατηγορία των
υποκατεστημένων ουριών: Η ουσία diuron
1.1 Φυτοφάρμακα
Ως φυτοφάρμακο ορίζεται κάθε ουσία ή μίγμα ουσιών με στόχο την πρόληψη, την καταστροφή ή τον έλεγχο κάθε ζιζανίου, συμπεριλαμβανομένου φορέων ανθρωπίνων και ζωικών ασθενειών, ανεπιθύμητων ειδών φυτών ή ζώων που προκαλούν βλάβες, ή εμπλέκονται με την παραγωγή, διαδικασία, αποθήκευση, μεταφορά ή εμπόριο των τροφίμων, γεωργικών εμπορευμάτων, ξύλου και προϊόντων ξυλείας, ή ζωικών τροφών, ή που μπορεί να απευθύνεται στα ζώα για τον έλεγχο των εντόμων, αραχνιδίων, ή άλλων ζιζανίων μέσα ή πάνω στα σώματα τους (WHO, 1990).
Οι πρώτες χημικές ουσίες που χρησιμοποιήθηκαν στην φυτοπροστασία ως ζιζανιοκτόνα, ήταν ανόργανες: Ο ένυδρος θειικός χαλκός (CuSO4∙5H2O), ο ένυδρος θειικός σίδηρος (FeSO4∙7H2O), και αραιά διαλύματα θειικού οξέος (H2SO4, 5%) (Κοτρίκλα,2002). Επίσης χρησιμοποιήθηκαν βαρέα μέταλλα όπως: μόλυβδος, αρσενικό και υδράργυρος (Wright, 2005).
Τα πρώτα συνθετικά οργανικά ζιζανιοκτόνα συντέθηκαν τον 19ο αιώνα (Wright, 2005), αλλά η χρήση τους ξεκίνησε στη διάρκεια του δεύτερου παγκόσμιου πολέμου. Η αρχή έγινε με τα φαινοξυαλκανοϊκά οξέα (π.χ. 2, 4- D), ακολούθησαν τα καρβαμιδικά (π.χ. diallate), ενώ στη δεκαετία του ’50 χρησιμοποιήθηκαν οι πρώτες υποκατεστημένες ουρίες (π.χ. diuron, linuron), οι πρώτες τριαζίνες (π.χ. atrazine), και τα διπυριδίλια (π.χ. diquat). Σημαντικές κατηγορίες φυτοφαρμάκων αποτελούν επίσης οι φαινόλες (π.χ. DNOC), τα βενζονιτρίλια (π.χ. Dichlobenil), οι ενώσεις φαινοξυπροπιονικού οξέος (π.χ.
Mecoprop), οι ενώσεις φαινοξυβουτιρικού οξέος (π.χ. 2, 4-DB), τα αμίδια (π.χ.
Propanil), οι διαζίνες (π.χ. Lenacil) και οι δινιτροαλίνες (π.χ. Triflluralin) (Καλτσίδης, 1997).
Η παγκόσμια παραγωγή φυτοφαρμάκων για τη γεωργία είχε αλματώδη ανάπτυξη στην περίοδο των τελευταίων 50 χρόνων. Η κατανάλωση φυτοφαρμάκων αυξήθηκε κατά 15 φορές στην περίοδο αυτή με περίπου 8 - 10% αύξηση κάθε χρόνο. Συγκεκριμένα οι εταιρείες παραγωγής ζιζανιοκτόνων, που υπάγονται στην κατηγορία των υποκατεστημένων ουριών, το 1984 σημείωσαν κέρδη 550 εκατομμυρίων δολαρίων (Cremlyn, 1991). Την δεκαετία του 1990 η αύξηση σταμάτησε και άρχισε να υποχωρεί. Οι
καλλιέργειες των σιτηρών, ρυζιού, αραβοσίτου, βάμβακος, σόγιας και καπνού καταναλώνουν το 50% των αγροτικών φυτοφαρμάκων. Το 2000 το σύνολο των πωλήσεων των φυτοφαρμάκων ξεπέρασαν τα 35 δισεκατομμύρια δολάρια (Βαλαβανίδης, 2007). Σήμερα η ετήσια παραγωγή φυτοφαρμάκων υπολογίζεται σε 3 εκατ. τόνους, εκ των οποίων το 30 % χρησιμοποιείται από τις χώρες της ΕΕ.
Πολλά από τα προϊόντα διάσπασης των φυτοφαρμάκων μπορεί να είναι φυτοτοξικά αλλά σε μικρότερο βαθμό από τις μητρικές ενώσεις. Εξαιτίας της εκτεταμένης χρήσης και της σχετικής υψηλής τους σταθερότητας, κάποια από αυτά ανιχνεύονται στα επιφανειακά και τα υπόγεια νερά με αυξημένη συχνότητα.
Το νερό αποτελεί ένα πολύτιμο φυσικό πόρο ο οποίος τις τελευταίες δεκαετίες βρίσκεται σε έλλειψη, λόγω του αυξανόμενου πληθυσμού της γης, της αναντιστοιχίας μεταξύ ζήτησης και προσφοράς υδατικών πόρων, των πιθανών κλιματολογικών αλλαγών καθώς και της υποβάθμισης της ποιότητάς του εξαιτίας των εισροών χημικών ουσιών ανθρωπογενούς προέλευσης (Κοτρίκλα, 2002, Λέκκας, 2005).
Κατά τις τελευταίες δεκαετίες, υπήρξε μια δραματική ανάπτυξη της περιβαλλοντικής νομοθεσίας στις ΗΠΑ και την Ευρωπαϊκή Ένωση αναφορικά με επικίνδυνες χημικές ουσίες ανθρωπογενούς προέλευσης στα επιφανειακά, υπόγεια και πόσιμα νερά. Τα γεωργικά φάρμακα συμπεριλαμβάνονται σε τέτοιες κανονιστικές διατάξεις (Κοτρίκλα, 2002).
Οι τριαζίνες simazine και atrazine, οι φαινυλουρίες linuron και monolinuron και η πυριδαζινόνη chloridazon, συμπεριλαμβάνονται στον κατάλογο ΙΙ της Οδηγίας 76/464/ΕΟΚ (1976) μεταξύ 39 φυτοφαρμάκων, δηλαδή πρόκειται για ουσίες σχετικά επιβλαβείς που οι εισροές τους στο υδάτινο περιβάλλον θα πρέπει να ελαχιστοποιηθούν ή να περιοριστούν (Κοτρίκλα, 2002).
Το όριο που θέτει η Ευρωπαϊκή Ένωση για τις συγκεντρώσεις των φυτοφαρμάκων στα πόσιμα νερά είναι 0,1 μg/l για κάθε ουσία ξεχωριστά και 0,5 μg/l για το σύνολο των ουσιών (Συμβούλιο της Ευρώπης, 1980, 1998, ΚΥΑ 2001).
Το εξεταζόμενο ζιζανιοκτόνο (diuron) ανήκει στην ευρύτερη κατηγορία των υποκατεστημένων ουριών, η οποία θα αναπτυχθεί αναλυτικότερα στις επόμενες παραγράφους.
1.2 Υποκατεστημένες ουρίες
Τα ζιζανιοκτόνα της ομάδας αυτής προέρχονται από υποκατάσταση των υδρογόνων της ουρίας από διάφορες χημικές ομάδες.
Τα πρώτα ζιζανιοκτόνα παράγωγα της ουρίας, συντέθηκαν την δεκαετία του ’50 και ήταν αλειφατικά παράγωγα τα οποία δεν χρησιμοποιήθηκαν εκτεταμένα. Σήμερα σχεδόν σε όλα τα παράγωγα της ουρίας, με καλή ζιζανιοκτόνο δράση, περιέχουν τρεις υποκαταστάτες των αμινομάδων και ένα υδρογόνο, το οποίο σχηματίζει δεσμούς υδρογόνου και ενισχύει την ζιζανιοκτόνο δράση των ουσιών. Οι πιο σημαντικοί και ενεργοί αντιπρόσωποι αυτής της κατηγορίας των ζιζανιοκτόνων είναι τα Ν-αρυλο-Ν΄, Ν΄-διαλκυλο παράγωγα.
Τα ζιζανιοκτόνα αυτά επιδρούν στο μηχανισμό της φωτοσύνθεσης.
Συγκεκριμένα επεμβαίνουν με την συμμετοχή του νερού στη μη κυκλική φωτοσυνθετική ροή των ηλεκτρονίων. Η βασική μέθοδος της εφαρμογής είναι η αναστολή του Φωτοσυστήματος ΙΙ στους χλωροπλάστες, από τους οποίους μετακινούνται τα ηλεκτρόνια κατά την διάρκεια της οξείδωσης του νερού σε μοριακό οξυγόνο (αντίδραση Hill). Αυτό αποτρέπει την σύνθεση ΑΤΡ και, τελικά, NADH, με επακόλουθο την ανάπτυξη χλώρωσης και συνέπεια την κατάπτωση αρχικά των κατώτερων φύλλων. Το φαινόμενο γίνεται εντονότερο μετά από βροχόπτωση ή άρδευση και όταν επικρατούν ιδανικές συνθήκες για φωτοσύνθεση (έντονη ηλιακή ακτινοβολία) (Connell et al., 1984, Matolcsy et al, 1988, Ελευθεροχωρινός, 2002).
Τα ζιζανιοκτόνα αυτά χρησιμοποιούνται εκτεταμένα για την προστασία μεγάλων ποσοτήτων σοδειών, όπως λαχανικά, φρούτα και δημητριακά, από ετήσιες πόες και πλατύφυλλα ζιζάνια (Hulsen et al, 2002; Teisseire et al, 2000).
1.3 Diuron
Το diuron (3-(3,4-διχλωροφαινύλ)-1,1-διμεθυλουρία) είναι ένα ζιζανιοκτόνο το οποίο παρασκευάστηκε το 1950 από την E. I. du Pont de Nemours Co και η χρήση του σχετίζεται κυρίως με τον έλεγχο των ζιζανίων σε αγροτικές
εφαρμογές ή μη, καθώς και ως ενισχυτική βιοκτόνος ουσία στα υφαλοχρώματα νέας γενιάς. Βρίσκει ευρεία εφαρμογή σε καλλιέργειες ελιάς, εσπεριδοειδών, βαμβακιού, κτηνοτροφικών ψυχανθών και οσπρίων.
Κυκλοφορεί πλέον και από άλλες εταιρείες όπως: Bayer, Griffin, Nufarm Ltd, Sagrochem με τις εμπορικές ονομασίες Karmex, Direx, Diurex, Sanuron και Seduron.
Εικόνα 1: Συντακτικός τύπος του diuron
1.3.1 Φυσικοχημικές ιδιότητες
Οι φυσικοχημικές ιδιότητες του diuron παρουσιάζονται στον παρακάτω πίνακα.
Πίνακας 1. Φυσικοχημικές ιδιότητες του diuron
ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΤΙΜΗ
Μοριακός τύπος C9H10N2OCl2
Μοριακό βάρος 233,10
CAS Registry No 330 - 54 – 1
EEC No 006 – 015 – 00
CIPAC No 100
Φάση (25οC) Λευκοί κρύσταλλοι
Σημείο τήξης 158 – 159 οC
Τάση ατμών (50οC) 3,1*10-6 mmHg
LogKow (25οC) 2,85 ± 0,03
Koc 480
Διαλυτότητα στο νερό (25οC) 42 mg/l
Διαλυτότητα στην ακετόνη (27οC) 5,3% ή 53 gr/Kg Χρόνος ημίσειας ζωής (μέρες) 90
Υπολειμματική διάρκεια (μήνες) 9 – 14
Βαθμός έκπλυσης 2
Ελάχιστη καθαρότητα 930 g/kg
1.3.2 Τοξικότητα
Το diuron δεν προκαλεί ερεθισμό στα μάτια αλλά προκαλεί ελαφρύ ερεθισμό στο δέρμα. Επειδή αναστέλλει τη φωτοσύνθεση είναι πιο τοξικό στους φυτικούς από ότι στους ζωικούς οργανισμούς. Είναι ελαφρά τοξικό στα πουλιά και στα θηλαστικά, μέτρια τοξικό στα ψάρια και υψηλά τοξικό στα ασπόνδυλα. Έχει βρεθεί EC50 για το μικροφύκος Selenastrum capricornotum ίση με 0,045 ± 0,0079 mg/l και για τη Daphnia magna ίση με 8,6 ± 1,3 mg/l (Αθανασάκη, 2004).
Πίνακας 2. Τοξικότητα του diuron σε διάφορους οργανισμούς
ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΣ ΔΕΙΚΤΗΣ
ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑΣ ΕΚΘΕΣΗ (hr) ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ
Αρουραίοι Oral LD50 - 3400 mg/Kg
Αρουραίοι Dermal LD50 - > 2000 mg/Kg
Πουλιά LC50 - 1730 - >5000 mg/Kg
Ψάρια LC50 96 5.6 – 25 mg/l
Ασπόνδυλα LC50 48 1 – 2.5 mg/l
Πηγή: Αθανασάκη, 2004, Tomlin, 1997
Από τον Οκτώβριο του 2008 βάση της οδηγίας 2008/91/EK η Ευρωπαϊκή Ένωση αποφάσισε να εντάξει το diuron ως δραστική ουσία στη λίστα της οδηγίας 91/414/ΕΟΚ που επιτρέπει τη χρήση της αποκλειστικά ως ζιζανιοκτόνο σε ποσότητες που δεν υπερβαίνουν τα 0,5 Kg/ha.
Κεφάλαιο 2 : Τοξικολογικά πειράματα και έρευνες με
χρήση της Lemna minor
2.1 Εισαγωγή
Περιβαλλοντική Τοξικολογία είναι η επιστήμη που μελετά την έκθεση, τις τοξικοκινητικές και τοξικοδυναμικές μεταβολές, και τις αρνητικές επιπτώσεις των συνθετικών και επικίνδυνων χημικών παραγόντων σε ζωντανούς οργανισμούς και περιβαλλοντικά διαμερίσματα (Βαλαβανίδης, 2007).
Υδατική τοξικολογία καλείται η ποιοτική και ποσοτική μελέτη των δυσμενών επιπτώσεων των χημικών ουσιών, αλλά και άλλων ανθρωπογενών υλικών, πάνω στους υδρόβιους οργανισμούς, ενώ παράλληλα προβλέπει και τις συγκεντρώσεις των ρύπων που αναμένονται στο υδατικό περιβάλλον (νερό, ίζημα, οργανισμοί). Επομένως περιλαμβάνει και τη μελέτη της τύχης και συμπεριφοράς των ουσιών στο περιβάλλον (Γατίδου, 2005).
Η τοξική επίδραση μιας ουσίας πάνω σε έναν οργανισμό μπορεί να είναι θανατηφόρα ή σχεδόν θανατηφόρα που σημαίνει ότι στον εκτιθέμενο οργανισμό συμβαίνουν αλλαγές που επηρεάζουν την ανάπτυξη, την αναπαραγωγή, τη φυσιολογία, τη βιοχημεία και τη συμπεριφορά του γενικότερα. Η μελέτη τοξικότητας μπορεί να πραγματοποιηθεί σε επίπεδο κυττάρου ενός οργανισμού, μεμονωμένου οργανισμού, πληθυσμού ακόμα και ολόκληρης κοινωνίας οργανισμών (Γατίδου, 2005).
2.2 Επιλογή κατάλληλου οργανισμού
Η επιλογή του κατάλληλου οργανισμού για τη διεξαγωγή ενός πειράματος τοξικότητας αποτελεί τη βασικότερη παράμετρο του πειράματος. Η επιλογή θα πρέπει να γίνεται με γνώμονα την οικολογική σημασία και την αφθονία του οργανισμού καθώς και την ευκολία και την ταχύτητα ανάπτυξης του στο εργαστήριο.
Γενικότερα ένας οργανισμός για να χρησιμοποιηθεί σε πείραμα τοξικότητας θα πρέπει να πληρεί όσο το δυνατόν περισσότερα από τα παρακάτω κριτήρια (Γατίδου, 2005; Βαλαβανίδης, 2007):
Ευρεία γεωγραφική κατανομή και ευρύ φάσμα ευαισθησίας στους διάφορους ρύπους
Να βρίσκεται σε αφθονία
Να είναι εύκολο να βρεθεί στο συγκεκριμένο οικοσύστημα και να συλλεγεί
Να υπάρχει σε αρκετές ποσότητες ώστε να διευκολύνει τις αναλύσεις και τις τοξικολογικές παρατηρήσεις
Οι θρεπτικές απαιτήσεις για τη σωστή ανάπτυξη του να είναι πλήρως γνωστές
Να είναι γνωστή η ταξινομική του ταυτότητα και η γενετική του σύνθεση
Να παρουσιάζει μικρή γενετική και φαινοτυπική ποικιλομορφία Να αναπτύσσεται γρήγορα αλλά και να γηράσκει εύκολα ώστε να γίνονται παρατηρήσεις και σε σχέση με την ηλικία του μέσα στα πλαίσια των τοξικολογικών ερευνών
Να περιέχει τέτοιες συγκεντρώσεις του χημικού ρύπου ή ρύπων ώστε να διευκολύνεται η ανάλυση, αλλά και σε ποσότητες που να μην προκαλούν διαταραχές ή να σκοτώνουν τα άτομα του πληθυσμού
Να είναι εύκολος στους χειρισμούς και κατάλληλος για εργαστηριακές μελέτες
Αν είναι δυνατόν να είναι ενδογενής και να χαρακτηρίζει το οικοσύστημα της περιοχής που δέχεται την επίδραση της τοξικής ουσίας
Να είναι σημαντικός από οικολογική, οικονομική ή άλλη άποψη
Σε διάφορα πειραματικά πρωτόκολλα προτείνονται διαφορετικά είδη οργανισμών είτε του γλυκού είτε του θαλασσινού νερού τα οποία μπορούν να χρησιμοποιηθούν στα πειράματα τοξικότητας (Γατίδου, 2005).
2.3 Πειράματα τοξικότητας
Η θεμελιώδης αρχή πάνω στην οποία βασίζονται όλα τα πειράματα τοξικότητας είναι η διαπίστωση ότι καμία χημική ουσία δεν είναι απολύτως επικίνδυνη και καμία χημική ουσία δεν είναι απολύτως ασφαλής. Αν μια ουσία
είναι επιβλαβής ή ασφαλής για έναν οργανισμό, αυτό εξαρτάται από τη συγκέντρωση της ουσίας στην οποία εκτίθεται ο οργανισμός και από τη διάρκεια της έκθεσης σε αυτή (Γατίδου, 2005; Hoffman et al., 2003).
Ένα πείραμα τοξικότητας για να θεωρηθεί κατάλληλο και να γίνει αποδεκτό ευρύτερα θα πρέπει να πληρεί τα εξής κριτήρια (Γατίδου, 2005;Βαλαβανίδης, 2007):
Ευρεία αποδοχή από την επιστημονική κοινότητα Μικρό κόστος και ευκολία χειρισμών
Μεγάλη ευαισθησία και απήχηση σε όσο το δυνατόν πραγματικές συνθήκες
Ρεαλιστικό σχεδιασμό σεναρίων έκθεσης οργανισμών σε τοξικές ουσίες
Ικανότητα πρόβλεψης και σύγκρισης των επιπτώσεων ευρέου φάσματος ουσιών σε διαφορετικούς οργανισμούς
Περιγραφή επιπτώσεων ευρέου φάσματος συγκεντρώσεων για ρεαλιστικούς χρόνους
Δυνατότητα επανάληψης σε διαφορετικά εργαστήρια με παρόμοια αποτελέσματα
Σχεδιασμός στατιστικών - παραμέτρων για τα πειραματικά δεδομένα
Παροχή αποτελεσμάτων τα οποία μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την εκτίμηση της επικινδυνότητας (risk assessment)
Η διεξαγωγή των πειραμάτων τοξικότητας μπορεί να πραγματοποιηθεί είτε στο εργαστήριο, κάτω από ελεγχόμενες συνθήκες, είτε στο πεδίο (in situ).
Στο εργαστήριο η διεξαγωγή των πειραμάτων πραγματοποιείται συνήθως με τη χρήση ενός μόνο είδους. Τα πειράματα αυτά προσφέρουν σημαντική πληροφορία για τις συγκεντρώσεις και τους χρόνους έκθεσης που προκαλούν θνησιμότητα, μεταβολές στην ανάπτυξη, την αναπαραγωγή, τη συμπεριφορά, τη φυσιολογία και τη βιοχημεία των οργανισμών. Είναι εύκολο να εδραιωθούν σχέσεις αιτίας - αποτελέσματος, επειδή οι συνθήκες είναι ελεγχόμενες και επιπλέον τα πειράματα πραγματοποιούνται εύκολα και δίνουν επαναλήψιμα αποτελέσματα. Το σημαντικότερο μειονέκτημά τους είναι ότι οι τοξικές δράσεις που παρατηρούνται στο εργαστήριο, μπορεί να μην συμβαίνουν κατά τον ίδιο
τρόπο και στον ίδιο βαθμό στο φυσικό περιβάλλον διότι δεν λαμβάνονται υπόψη οι πολύπλοκες αλληλεπιδράσεις βιοτικών και αβιοτικών παραγόντων των φυσικών οικοσυστημάτων (Γατίδου, 2005).
Όταν για τη μελέτη της επίδρασης μιας χημικής ουσίας χρησιμοποιούνται ταυτόχρονα πολλά διαφορετικά είδη τότε τα συστήματα ονομάζονται εργαστηριακοί μικρόκοσμοι. Για τη δημιουργία τους μεταφέρεται μέσα σε περίκλειστα γυάλινα ή πλαστικά δοχεία μέρος ενός φυσικού οικοσυστήματος (νερό, ίζημα, ασπόνδυλα ή/ και ψάρια) και εκεί αναπτύσσεται. Το πλεονέκτημα της χρήσης εργαστηριακών μικρόκοσμων είναι ότι παρέχουν πληροφορία που μπορεί να συνδεθεί με τις οικολογικές επιδράσεις μιας χημικής ουσίας. Αν οι συνθήκες είναι ομογενείς, μπορεί να πιστοποιηθούν και να επαναληφθούν. Οι σχέσεις αιτίας - αποτελέσματος είναι σχετικά εύκολο να αναλυθούν διότι οι περιβαλλοντικές επιδράσεις ελέγχονται. Το μειονέκτημά τους είναι ότι δεν λαμβάνουν υπόψη τις μεταβαλλόμενες συνθήκες του φυσικού περιβάλλοντος, ενώ δεν περιλαμβάνουν σημαντικά βιοτικά στοιχεία του φυσικού περιβάλλοντος, όπως οι εισβολείς (Γατίδου, 2005).
Τέλος υπάρχουν οι μελέτες πεδίου, οι οποίες είναι οι πλέον σημαντικές τοξικολογικές έρευνες που πλησιάζουν σε μεγάλο βαθμό τις φυσικές και οικολογικές συνθήκες που επικρατούν σε διάφορες περιοχές. Οι μελέτες πεδίου απαιτούν καλό σχεδιασμό και κατάλληλες συνθήκες για να εκπροσωπούν ένα οικοσύστημα ή τμήμα βιοκοινότητας, πάνω στην οποία θα μελετηθεί η επίδραση της τοξικής ουσίας ή μίγματος ή κάποιου τοξικού αποβλήτου. Στις μελέτες αυτές χρησιμοποιείται τμήμα εδάφους που είναι περιφραγμένο, με όλες τις παραμέτρους του οικοσυστήματος και περιλαμβάνει την πλειοψηφία των ειδών του. Η αναπαράσταση του οικοσυστήματος κάτω από φυσιολογικές συνθήκες με το είδος αυτό έρευνας αποτελεί δείγμα χερσαίων ή υδρόβιων μικρόκοσμων ή μεσόκοσμων, ανάλογα με το μέγεθος. Οι μελέτες πεδίου διαφέρουν σε μέγεθος ανάλογα με το οικοσύστημα που εκπροσωπούν, συνήθως περιέχουν φυτά ή προσομοιώσεις οικοσυστημάτων, και είναι περιφραγμένα για να εμποδίζουν την είσοδο άλλων οργανισμών ή την διαφυγή των σπονδυλωτών που μελετούνται. Τα οικοσυστήματα που μελετούνται είναι κυρίως τμήμα χέρσου κοντά σε λίμνες ή ποτάμια, αγροοικοσυστήματα με ποικιλία φυτών, μικροοργανισμών και γαιοσκωλήκων εδάφους, υγρότοποι, θαλάσσιες παράκτιες περιοχές, λιμάνια ή
ποτάμια οικοσυστήματα. Επειδή όμως οι συνθήκες στο πεδίο δεν ελέγχονται είναι δύσκολο να αποδοθούν σχέσεις αιτίας - αποτελέσματος και να υπάρξουν επαναλήψεις των πειραμάτων (Γατίδου, 2005; Βαλαβανίδης, 2007).
Ανάλογα με το χρόνο έκθεσης τα πειράματα τοξικότητας ταξινομούνται σε δοκιμές βραχυπρόθεσμες ή οξείες και μακροπρόθεσμες ή χρόνιες δοκιμές.
Στην πρώτη περίπτωση γίνεται προσπάθεια εκτίμησης της βιωσιμότητας ενός οργανισμού ανάλογα με τη συγκέντρωση της ουσίας στην οποία εκτίθεται και το χρόνο έκθεσης, ενώ στη δεύτερη μελετώνται οι επιπτώσεις της ουσίας πάνω στην ανάπτυξη του οργανισμού, την αναπαραγωγή του, τα βιοχημικά του αποτελέσματα και τη συμπεριφορά του γενικότερα (Γατίδου, 2005;
Hoffman et al., 2003).
2.3.1 Πειράματα οξείας τοξικότητας (acute toxicity tests)
Τα πειράματα οξείας τοξικότητας είναι βραχυπρόθεσμες δοκιμές που στοχεύουν στη μέτρηση των αποτελεσμάτων μιας ουσίας σε υδατικούς οργανισμούς μετά από μικρή έκθεσή τους στην ουσία αυτή κατά τη διάρκεια της ζωής τους (Hoffman et al.,2003).
Το κριτήριο ώστε να θεωρηθεί η επίπτωση της εξεταζόμενης ουσίας πάνω στον εκτιθέμενο οργανισμό επιβλαβής εξαρτάται από τον ίδιο τον οργανισμό και μπορεί να είναι στην περίπτωση των ψαριών η πρόκληση θανάτου, στην περίπτωση των ασπόνδυλων η πρόκληση ακινησίας ή η απώλεια ισορροπίας και στην περίπτωση των φυκών η μείωση της ανάπτυξής τους (Γατίδου, 2005).
Τα πειράματα οξείας τοξικότητας μπορεί να διεξαχθούν για συγκεκριμένο χρονικό διάστημα ώστε να εκτιμηθούν τα αποτελέσματα μετά από μια περίοδο 24 έως 96 ωρών (LC50) ή μετά από 48 ώρες (EC50). Στην περίπτωση αυτή το πείραμα είναι χρονοεξαρτώμενο. Όταν όμως το πείραμα συνεχίζεται έως ότου οικονομικοί ή άλλοι παράγοντες επιβάλλουν τη διακοπή του τότε ονομάζεται χρονοανεξάρτητο και διαρκεί συνήθως 7 με 14 μέρες (Γατίδου, 2005; Hoffman et al., 2003).
2.3.2 Πειράματα υποχρόνιας τοξικότητας (sub - chronic or early life stage toxicity tests)
Η διάρκεια των πειραμάτων αυτών είναι συνήθως μερικοί μήνες και εξετάζουν τις δυσμενείς επιπτώσεις μιας χημικής ουσίας πάνω σε έναν οργανισμό όταν αυτός βρίσκεται στα πρώτα στάδια της ανάπτυξής του. Στα υποχρόνια πειράματα ο εκτιθέμενος οργανισμός ποτέ δεν συμπληρώνει έναν πλήρη αναπαραγωγικό κύκλο ζωής (Γατίδου, 2005).
2.3.3 Πειράματα χρόνιας τοξικότητας (chronic toxicity tests)
Τα πειράματα χρόνιας τοξικότητας είναι σχεδιασμένα για να μετράνε τις επιπτώσεις των τοξικών ουσιών σε υδατικούς οργανισμούς κατά τη διάρκεια ενός σημαντικού σταδίου του κύκλου ζωής τους, που συνήθως κυμαίνεται στο ένα δέκατο (1/10) της ζωής του οργανισμού. Στα πειράματα αυτά εκτιμώνται οι επιπτώσεις των ουσιών στην αναπαραγωγή, την ανάπτυξη και τη συμπεριφορά εξαιτίας των ψυχολογικών και βιοχημικών διαταραχών (Hoffman et al., 2003).
Η διάρκεια των πειραμάτων χρόνιας τοξικότητας είναι τόση όση χρειάζεται ο οργανισμός αναφοράς, δηλαδή ο οργανισμός ο οποίος δεν εκτίθεται στην εξεταζόμενη ουσία και χρησιμοποιείται ως μέτρο σύγκρισης, να μεγαλώσει, να αναπτυχθεί, να ωριμάσει και να δώσει απογόνους για πρώτη φορά (First filial generation, F1) (Γατίδου, 2005).
Το κριτήριο για την εξαγωγή συμπερασμάτων αναφορικά με τη χρόνια τοξικότητα μιας ουσίας εξαρτάται και εδώ από το είδος του εκτιθέμενου οργανισμού και μπορεί να περιλαμβάνει τον αριθμό των εμβρύων που φυσιολογικά και πλήρως αναπτύσσονται, τον αριθμό των προνυμφών (larvae) και των ανήλικων ατόμων (juveniles) που επιβιώνουν και αναπτύσσονται φυσιολογικά, τον αριθμό των αυγών που επιβιώνουν και κατά συνέπεια τον αριθμό των ατόμων πρώτης γενιάς (F1) που παράγονται, επιβιώνουν και αναπτύσσονται για καθορισμένο χρονικό διάστημα (Γατίδου,2005).
2.4 Συστήματα έκθεσης
Κατά τη διάρκεια των πειραμάτων τοξικότητας η έκθεση στην ουσία μπορεί να γίνει με τέσσερις διαφορετικούς τρόπους (Γατίδου, 2005; Hoffman et al., 2003):
Στατικό πείραμα τοξικότητας, όπου το νερό στο θάλαμο δοκιμής φορτίζεται με την επιθυμητή συγκέντρωση της ουσίας και στη συνέχεια τοποθετούνται οι οργανισμοί. Κατά τη διάρκεια του πειράματος ούτε το νερό αλλά ούτε και η εξεταζόμενη ουσία ανανεώνονται.
Ανανεώσιμο πείραμα τοξικότητας. Είναι παρόμοιο με το στατικό πείραμα τοξικότητας, με μόνη διαφορά πως γίνεται ανανέωση του νερού ή της ουσίας κατά περιόδους (συνήθως καθημερινά ή κάθε δύο μέρες).
Πείραμα ανακυκλοφορίας. Και το πείραμα αυτό είναι παρόμοιο με το πείραμα στατικής τοξικότητας με μόνη διαφορά πως το νερό αντλείται από το θάλαμο, διηθείται και επιστρέφεται σε αυτόν χωρίς να μεταβληθεί η συγκέντρωση της εξεταζόμενης ουσίας.
Πείραμα τοξικότητας συνεχούς ροής. Στο πείραμα αυτό οι οργανισμοί παραμένουν στον θάλαμο δοκιμής ενώ το νερό ανανεώνεται διαρκώς με την εισαγωγή φρέσκου και την απομάκρυνση του παλιού. Η ανανέωση μπορεί να είναι είτε διακοπτόμενη, είτε συνεχής.
Οι περισσότερο χρησιμοποιούμενες δοκιμές είναι η στατική και η συνεχούς ροής και κυρίως η στατική η οποία όμως παρόλο το χαμηλό κόστος και τους εύκολους χειρισμούς της μειονεκτεί διότι (Γατίδου,2005):
Η εξεταζόμενη ουσία μπορεί να είναι πτητική, να αποδομείται ή να προσροφάται στα τοιχώματα του θαλάμου δοκιμής με αποτέλεσμα οι οργανισμοί με την πάροδο του χρόνου να εκτίθενται σε χαμηλότερη συγκέντρωση της ουσίας από την επιθυμητή,
Η εξεταζόμενη ουσία μπορεί να έχει υψηλή βιοχημική απαίτηση σε οξυγόνο (BOD). Αυτό συνεπάγεται μείωση του διαλυμένου
οξυγόνου στο νερό γεγονός που από μόνο του επηρεάζει τους οργανισμούς. Στην περίπτωση αυτή δεν μπορούν να εξαχθούν σαφή συμπεράσματα για την τοξικότητα της ουσίας,
Τυχόν μεταβολισμός της εξεταζόμενης ουσίας από τους ίδιους τους οργανισμούς επίσης είναι δυνατόν να αλλοιώσει τα αποτελέσματα καθώς μπορεί να παραχθούν ουσίες οι οποίες σε συνδυασμό με την αρχική να έχουν εντελώς διαφορετική δράση από ότι θα είχε η εξεταζόμενη ουσία από μόνη της.
2.5 Δοκιμασίες τοξικότητας. Σχέση Δόσης - Αποτελέσματος
Οι τοξικολογικές έρευνες για χρόνια και οξεία τοξικολογική δράση χημικών ουσιών απαιτούν ποσοτική μελέτη. Μετά από πολυάριθμες έρευνες και πειραματικά δεδομένα σε διάφορα πειραματόζωα καθιερώθηκε η μεθοδολογία σύγκρισης της σχέσης των τοξικολογικών δόσεων και αποτελέσματος σε πειραματική καμπύλη [καμπύλη δόσης - αποτελέσματος (dose - response curve)] ανά μονάδα βάρους του πειραματόζωου. Η τοξικότητα εκφράζεται συνήθως σε χιλιοστά του γραμμαρίου ανά χιλιόγραμμο βάρους, δηλαδή mg Kg-1 ή mg/kg. Όταν περιλαμβάνεται και η διάρκεια της έκθεσης σε δόσεις ανά ημέρα, τότε εκφράζεται ως mg kg-1 day-1 ή mg/kg/day.
Για κάποιο εύρος συγκεντρώσεων, όσο η συγκέντρωση της χημικής ουσίας αυξάνει, τόσο αυξάνει η τοξική της δράσης. Η καμπύλη (Σχήμα 2.1) που περιγράφει τη σχέση δόσης - αποτελέσματος είναι γενικά ασυμπτωτική στον άξονα των δόσεων (σιγμοειδής), καθώς κάτω από κάποιο κατώφλι συγκέντρωσης η ουσία δεν εμφανίζει μετρήσιμη τοξική δράση, ενώ πάνω από κάποια τιμή, οι περισσότεροι ή όλοι οι οργανισμοί έχουν υποστεί την δυσμενή επίδραση της ουσίας. Το μεσαίο τμήμα της καμπύλης, στην περιοχή μεταξύ 16% και 84%, είναι γραμμικό. Όσο μεγαλύτερη είναι η κλίση του κεντρικού τμήματος της καμπύλης τόσο εντονότερη είναι η απόκριση για το ίδιο εύρος συγκεντρώσεων.
Σχήμα 2.1: Γραφική παράσταση της αθροιστικής καμπύλης δόσης - αποτελέσματος. Το αποτέλεσμα είναι το αθροιστικό ποσοστό % των πειραματόζωων που πέθαναν.
Σε χαμηλής τοξικότητας πειράματα η τοξική ουσία προστίθεται κυρίως στην τροφή του πειραματόζωου, όπου η συγκέντρωση εκφράζεται σε μέρη ανά εκατομμύριο (ppm, parts per million). Η ποσοτική εκτίμηση γίνεται με προσεκτική παρακολούθηση της ποσότητας της τροφής που καταναλώνεται.
Τα πειραματικά δεδομένα δείχνουν ότι το βάρος του σώματος του πειραματόζωου παίζει σημαντικό ρόλο στο κατά πόσο τοξική είναι μία ουσία.
Οι φυσιολογικές λειτουργίες του οργανισμού παίζουν σημαντικό ρόλο στην τοξικότητα. Άλλοι τρόποι πρόσληψης της τοξικής ουσίας είναι δια του στόματος, μέσω του δέρματος, με υποδερμικές ενέσεις και μέσω της εισπνοής με συγκεντρώσεις της τοξικής ουσίας (αέριο ή ατμός) στον αέρα του αεροστεγούς κλουβιού.
Στα τοξικολογικά πειράματα χρησιμοποιούνται συνήθως ομάδες των 50 πειραματόζωων που λαμβάνουν διαφορετικές δόσεις και ομάδα αναφοράς. Η διάρκεια των πειραμάτων κανονίζονται από πρωτόκολλο δοκιμασίας και ανάλογα με το είδος των πειραματόζωων. Κατά τη διάρκεια του πειράματος καταγράφονται οι θάνατοι και στο τέλος θανατώνονται όλα τα πειραματόζωα για να γίνουν τοξικολογικές αναλύσεις οργάνων, εξέταση όγκων σε διάφορα τμήματα οργάνων και μελέτη παθολογικών αλλοιώσεων. Η δόση στην οποία το 50% των πειραματόζωων πεθαίνει καλείται LD50 (Lethal Dose 50%).
Εκτός από την LD50 χρησιμοποιείται και η (median) Lethal Concentration 50% (LC50) για τοξικολογικά πειράματα όπου τα πειραματόζωα εκτίθενται σε συγκεντρώσεις (που εκφράζονται σε ppm ή ppb, mg/m3, μg/m3, ng/m3). Με
την τοξικολογική έρευνα διερευνώνται και άλλες τοξικολογικές παράμετροι, όπως η Lowest Observed Effect (LOEL), No Observed Effect Level (NOEL), δηλαδή επίπεδα με τη χαμηλότερη παρατηρούμενη επίδραση ή μη παρατηρούμενη επίδραση.
2.6 Κατηγορίες τοξικότητας και τοξικολογικοί όροι (συντμήσεις)
Με βάση την πολυετή εμπειρία των τοξικολόγων, οι τοξικές χημικές ουσίες χωρίζονται σε 4 κατηγορίες:
I. Πολύ τοξικές: < 50 mg/kg (LD50 oral), < 200 mg/kg (LD50 dermal, δέρμα).
II. Μετρίως τοξικές: 51-500 mg/kg (LD50 oral), 200-2000 mg/kg (LD50 dermal, για το δέρμα).
III. Ελαφρώς τοξικές: > 500 mg/kg (LD50 oral), > 2000 mg/kg (LD50 dermal).
IV. Μη τοξικές: για υψηλότερες συγκεντρώσεις του ενός γραμμαρίου ανά μονάδα βάρους (συνήθως 1 κιλό).
Τα τελευταία χρόνια έχουν επικρατήσει διάφοροι τοξικολογικοί όροι:
LD50 (mean lethal dose for 50% mortality), θανατηφόρος δόση 50%
LC50 (mean lethal concentration for 50% mortality), θανατηφόρος συγκέντρωση 50%
EC50 (Effect concentration 50%, concentration that causes an effect, not death, on 50% of tested organism), συγκέντρωση πρόκλησης αποτελέσματος σε 50% του οργανισμού-πειραματόζωου
LED10 (Effective dose corresponding to the lower 95% confidence limit on a dose associated with 10% response), αποτελεσματική δόση με 95% όρια αξιοπιστίας για δόση που ανταποκρίνεται σε 10% αποτέλεσμα (θνησιμότητα)
IC50 (inhibitory concentration that reduces the normal response, growth rates of algae, bacteria and other organisms by 50%), δόση αναστολής 50%, δοκιμασία για την ανάπτυξη βακτηρίων, φύκους και άλλων οργανισμών
NOEC (No observed effects concentration, determined by graphical or statistical methods), συγκέντρωση μη παρατηρούμενου αποτελέσματος
NOEL (No observed effects level, parameter as a dose), επίπεδο (mg/kg) μη παρατηρούμενου αποτελέσματος (βλάβη στην υγεία οργανισμού)
NOAEC (No observed adverse effects concentration, the effect is usually chosen for its impact upon the species tested), συγκέντρωση με μη παρατηρούμενη επίδραση σε συγκεκριμένο παράγοντα υγείας οργανισμού
NOAEL (No observed adverse effects level), επίπεδο με μη παρατηρούμενες αρνητικές συνέπειες
LOEC (Lowest observed effects concentration), χαμηλότερη συγκέντρωση όπου παρατηρείται αποτέλεσμα (βλάβη στον ζωντανό οργανισμό)
LOEL (Lowest observed effects level), χαμηλότερο επίπεδο όπου παρατηρείται αποτέλεσμα
MTC (Minimum Threshold conc.), ελάχιστη συγκέντρωση κατωφλίου (ουδός)
MTD (Maximum tolerated dose), ανώτατη ανεκτή δόση (για τοξικολογικά πειράματα σε καρκινογόνες ουσίες)
MATC (Minimum allowable toxicant concentration), ελάχιστη επιτρεπόμενη δόση τοξικής ουσίας
TLV (Threshold Limit Value), Οριακή Τιμή Κατωφλίου, για το εργασιακό περιβάλλον (American Conference Governmental Industrial Hygienists)
TLV-STEL (TLV-Short Term Exposure Limit), Μικρής Διάρκειας Έκθεση
Οι συγκεντρώσεις για τους παραπάνω όρους μεταβάλλονται (συνήθως προς τα κάτω) μετά από νεότερα πειράματα περιβαλλοντικής τοξικολογίας και οικοτοξικολογίας που έχουν αυστηρότερα κριτήρια τελικών αποτελεσμάτων ή βλαβών στα πειραματόζωα. Επιπλέον, υπάρχουν και άλλοι όροι
τοξικολογικών πειραμάτων που αφορούν εξειδικευμένα πειράματα οικοτοξικολογίας.
2.7 Σημεία λήξης πειραμάτων (End points)
Τα τοξικολογικά σημεία λήξης είναι τιμές οι οποίες προκύπτουν από τα πειράματα τοξικότητας και συγκεκριμένα από τις μετρήσεις που πραγματοποιούνται κατά τη διάρκεια του πειράματος ή στο τέλος του πειράματος (Hoffman et al, 2003). Γενικότερα υπάρχουν δύο ευρέως χρησιμοποιούμενες κατηγορίες σημείων λήξης: τα σημεία λήξης που σχετίζονται με την εκτίμηση της τοξικότητας μιας ουσίας (assessment endpoints) και τα σημεία λήξης που στηρίζονται στη μέτρηση της επίδρασης (measures of effect) της ουσίας. Τα σημεία λήξης που σχετίζονται με την εκτίμηση της τοξικότητας, αναφέρονται σε παραμέτρους που σχετίζονται με έναν ολόκληρο πληθυσμό, μια κοινωνία ή ολόκληρο το οικοσύστημα (π.χ.
ρυθμός ανάπτυξης του πληθυσμού), το οποίο επιθυμείται να προστατευτεί.
Αντίθετα η μέτρηση της επίδρασης της ουσίας αναφέρεται σε μέτρηση κάποιων μεταβλητών (επιβίωση, ανάπτυξη και αναπαραγωγή) ενός είδους, οι οποίες στη συνέχεια χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό των εκτίμησης σημείων λήξης. Στην περίπτωση που οι μετρήσεις είναι πολύ συγκεκριμένες επιτρέπεται η περιγραφή δυσμενών επιπτώσεων της ουσίας πάνω σε συγκεκριμένες βασικές λειτουργίες των οργανισμών όπως είναι η αναπνοή και η φωτοσύνθεση. Η θεμελιώδης υπόθεση στην χρήση μετρήσεων τοξικολογικών σημείων λήξης είναι ότι τα σημεία αυτά μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την εκτίμηση ή την πρόβλεψη των επιπτώσεων των τοξικολογικών παραγόντων στο φυσικό περιβάλλον (Γατίδου, 2005; Hoffman et al, 2003).
Τόσο στα πειράματα οξείας τοξικότητας όσο και στα πειράματα χρόνιας τοξικότητας τα σημεία λήξης περιλαμβάνουν τον προσδιορισμό της LC50 και της EC50. Οι LC50 και EC50 εκτιμώνται γραφικά από την καμπύλη δόσης - αποτελέσματος ή με τη χρήση στατιστικών μεθόδων για το κεντρικό τμήμα της ίδιας καμπύλης (Γατίδου, 2005; Hoffman et al, 2003).
Άλλα σημεία λήξης αναφέρονται στον προσδιορισμό της υψηλότερης συγκέντρωσης της χημικής ουσίας η οποία δεν είναι επιβλαβής σε σχέση με την καλλιέργεια αναφοράς (NOEC - No observed effects concentration) ή στον προσδιορισμό της χαμηλότερης συγκέντρωσης της χημικής ουσίας η οποία επιφέρει δυσμενή επίπτωση σε σχέση με την καλλιέργεια αναφοράς (LOEC - Lowest observed effects concentration) (Γατίδου, 2005; Hoffman et al, 2003).
Επίσης μπορεί να υπολογιστεί η φυκοστατική (algistatic) συγκέντρωση, η οποία προκαλεί στασιμότητα στους κυτταρικούς αριθμούς κατά τη διάρκεια της έκθεσης, αλλά επανέρχονται στην εκθετική φάση ανάπτυξης όταν μεταφερθούν σε μέσο ανάπτυξης χωρίς την τοξική ουσία ή η φυτοκτόνος (algicidal) συγκέντρωση η οποία σκοτώνει τα κύτταρα χωρίς να μπορούν να επανέλθουν στην προηγούμενη κατάσταση (Γατίδου, 2005).
2.8 Πρότυπες μέθοδοι πειραμάτων
Οι πρότυπες μέθοδοι πειραμάτων που χρησιμοποιούνται σήμερα έχουν αναπτυχθεί από διάφορους οργανισμούς όπως:
την Αμερικανική ένωση Δημόσιας Υγείας (American Public Association - APHA)
τη Διεύθυνση Περιβαλλοντικής Προστασίας των ΗΠΑ (U.S Environmental Protection Agency)
την Αμερικανική Εταιρεία Δοκιμών και Υλικών (American Society for Testing and Materials - ASTM)
τον Οργανισμό για Οικονομική Συνεργασία και Ανάπτυξη (Organization for Economic Cooperation and Development - OECD) Τον Διεθνή Οργανισμό για Πιστοποίηση (International Organization for Standardization - ISO)
το Πρόγραμμα για το Περιβάλλον των Ηνωμένων Εθνών (United Nations Environmental Program - UNEP)
