0
ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΕΘΝΙΚΟ Ι∆ΡΥΜΑ
ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΕΡΕΥΝΩΝ
ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ∆ΙΠΛΩΜΑ ΕΙ∆ΙΚΕΥΣΗΣ
«ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ»
∆ΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ
ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΟΥ ΡΟΛΟΥ ΤΗΣ ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑΣ MIRNAS MIR-200 ΚΑΙ ΤΟΥ MIR-3069 ΣΤΟ ΠΟΛΥΣΤΑ∆ΙΑΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΚΑΡΚΙΝΟΓΕΝΕΣΗΣ ΤΗΣ ΕΠΙ∆ΕΡΜΙ∆ΑΣ ΤΟΥ
ΠΟΝΤΙΚΟΥ ΚΑΙ ΣΕ ΚΥΤΤΑΡΙΚΕΣ ΣΕΙΡΕΣ ΚΑΡΚΙΝΟΥ ΤΟΥ ΜΑΣΤΟΥ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ
ΕΛΕΝΗ ΣΚΟΥΡΤΗ, ΑΜ: 224204 Βιολόγος
ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ: ΙΩΑΝΝΗΣ Π. ΤΡΟΥΓΚΑΚΟΣ
Επίκουρος Καθηγητής, Τοµέας Βιολογίας Κυττάρου & Βιοφυσικής, Τµήµα Βιολογίας, ΕΚΠΑ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟΣ ΥΠΕΥΘΥΝΟΣ: ΒΑΣΙΛΕΙΟΣ ΖΟΥΜΠΟΥΡΛΗΣ Ερευνητής Α’-Καθηγητής Ερευνών, Μονάδα Βιοϊατρικών Εφαρµογών, Ινστιτούτο Βιολογίας,
Φαρµακευτικής Χηµείας και Βιοτεχνολογίας, ΕΙΕ
ΑΘΗΝΑ 2014
1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ
ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ
Μ∆Ε:«ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ»
∆ΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ: Ανάλυση του ρόλου της οικογένειας miRNAs miR-200 και του miR-3069 στο πολυσταδιακό σύστηµα καρκινογένεσης της επιδερµίδας του ποντικού και σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του µαστού του ανθρώπου
ΕΛΕΝΗ ΣΚΟΥΡΤΗ ΑΜ: 224204
Βιολόγος
ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ: ΙΩΑΝΝΗΣ Π. ΤΡΟΥΓΚΑΚΟΣ
Επίκουρος Καθηγητής, Τοµέας Βιολογίας Κυττάρου & Βιοφυσικής, Τµήµα Βιολογίας, ΕΚΠΑ
ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟΣ ΥΠΕΥΘΥΝΟΣ: ΒΑΣΙΛΕΙΟΣ ΖΟΥΜΠΟΥΡΛΗΣ
Ερευνητής Α’-Καθηγητής Ερευνών, Μονάδα Βιοϊατρικών Εφαρµογών, Ινστιτούτο Βιολογίας, Φαρµακευτικής Χηµείας και Βιοτεχνολογίας, ΕΙΕ
ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ:
Ιωάννης Π. Τρουγκάκος, Επίκουρος Καθηγητής Μαριάννα Αντωνέλου, Λέκτορας
Βασίλειος Ζουµπουρλής, Ερευνητής Α’ – Καθηγητής Ερευνών
ΤΟΠΟΣ ∆ΙΕΞΑΓΩΓΗΣ ΕΡΕΥΝΑΣ: Μονάδα Βιοϊατρικών Εφαρµογών, Ινστιτούτο Βιολογίας, Φαρµακευτικής Χηµείας και Βιοτεχνολογίας, ΕΙΕ, Αθήνα, 2014
2 ΠΡΟΛΟΓΟΣ-ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ
Θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Ερευνητή Α’ και ∆ιευθυντή Ερευνών στο Εθνικό Ίδρυµα Ερευνών κύριο Βασίλειο Ζουµπουρλή, επιστηµονικό υπεύθυνο της διπλωµατικής µου εργασίας για την καθοδήγηση και τις πλούσιες γνώσεις που µου προσέφερε καθ’όλη τη διάρκεια της διεξαγωγής της στο εργαστήριό του. Επίσης, ιδιαίτερες ευχαριστίες θα ήθελα να απευθύνω στον Επίκουρο Καθηγητή του τοµέα Βιολογίας Κυττάρου και Βιοφυσικής κύριο Ιωάννη Τρουγκάκο, επιβλέποντα της µεταπτυχιακής µου εργασίας, για την αµέριστη στήριξη και βοήθεια που µου προσέφερε κατά τη δηµιουργία της µελέτης αυτής αλλά και για τη πολύτιµη συµβολή του στην ολοκλήρωσή της. Ακόµη, ευχαριστώ πολύ τον Καθηγητή του Τοµέα Βιολογίας Κυττάρου και Βιοφυσικής κύριο Σταύρο Χαµόδρακα ως διευθυντή του Μ∆Ε στα πλαίσια του οποίου ολοκληρώθηκε η παρούσα εργασία αλλά και την λέκτορα του Τοµέα Βιολογίας Κυττάρου και Βιοφυσικής κυρία Μαριάννα Αντωνέλου ως µέλος της τριµελούς εξεταστικής µου επιτροπής. Επιπρόσθετα, επιθυµώ να εκφράσω τις ευχαριστίες µου στους επιστηµονικούς συνεργάτες του Ινστιτούτου Βιολογίας, Φαρµακευτικής Χηµείας και Βιοτεχνολογίας του Εθνικού Ιδρύµατος Ερευνών κύριο Σπυρίδωνα Βλαχόπουλο και κυρία Στυλιανή Λογοθέτη, το µεταδιδακτορικό ερευνητή κύριο Ιωάννη Χριστοδούλου, τον υποψήφιο διδάκτορα κύριο Σωτήριο Γαλτσίδη, τους µεταπτυχιακούς φοιτητές Ανδρέα Κρητικό και Νικόλα Χούρι καθώς επίσης και την προπτυχιακή φοιτήτρια Μαρία-Ελένη Ξυπολιτά για τη βοήθεια και τη συµπαράστασή τους. Τέλος, θα ήθελα να εκφράσω την ευγνωµοσύνη µου στην οικογένειά µου που µου συµπαραστέκεται τόσο ηθικά όσο και οικονοµικά και µε υποστηρίζει σε κάθε βήµα µου.
Αθήνα, 1 Ιουλίου 2014
3 ΣΥΝΤΟΜΟ ΒΙΟΓΡΑΦΙΚΟ ΣΗΜΕΙΩΜΑ
ΠΡΟΣΩΠΙΚΑ ΣΤΟΙΧΕΙΑ
• Ονοµατεπώνυµο: Ελένη Σκούρτη
• Ηµεροµηνία γέννησης: 19-6-1990
• Τόπος Γέννησης: Χολαργός Αττικής ΕΚΠΑΙ∆ΕΥΣΗ
• 2008 – 2012: Πτυχίο του Τµήµατος Βιολογίας, Σχολή Θετικών Επιστηµών, ΕΚΠΑ, βαθµός πτυχίου: 8,07 (Λίαν Καλώς).
• 2005 – 2008: Ενιαίο Λύκειο Μεταµόρφωσης, Βαθµός απολυτηρίου Γ΄ τάξης:
19 και 5/10.
ΞΕΝΕΣ ΓΛΩΣΣΕΣ
• Αγγλικά: Άριστο επίπεδο, πτυχίο: Certificate of Proficiency in English, University of Michigan.
• Γαλλικά: Μέτρια γνώση, πτυχίο: Β1.
ΣΥΜΜΕΤΟΧΗ ΣΕ ΣΥΝΕ∆ΡΙΑ:
• 34ο Ετήσιο Επιστηµονικό Συνέδριο της EEBE, Τρίκαλα, Μάιος 2012.
• 8ο Πανελλήνιο Συνέδριο Βιοεπιστηµόνων, Πάτρα, Οκτώβριος 2012.
• 35ο Ετήσιο Επιστηµονικό Συνέδριο της EEBE, Ναύπλιο, Μάιος 2013.
• International workshop on: Ageing and cancer cell biology: Convergent and divergent molecular mechanisms, Ιούνιος, 2013, Αθήνα.
• Proc Int Symp Mol Med: Οκτώβριος 2013, Κρήτη.
• 8th conference of HSCBB13, Νοέµβριος 2013, Λαµία.
• 64ο Συνέδριο Ελληνικής Εταιρίας Βιοχηµείας και Μοριακής Βιολογίας, Ίδρυµα Ευγενίδου, ∆εκέµβριος 2013, Αθήνα.
• XIX International Taurine Meeting: Taurine – a "very essential" amino acid, Μάιος 2014, Κρακοβία, Πολωνία.
∆ΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ:
• Ε. Σκούρτη, Σ Λογοθέτη, Σ Βλαχόπουλος, Ι. Τρουγκάκος, Ι. Χριστοδούλου και Β. Ζουµπουρλής, MicroRAs, καρκίνος και καρκινικά βλαστοκύτταρα:
Από την έρευνα στην θεραπεία, Αρχεία Ελληνικής Ιατρικής, 2013, 30(4):391- 405.
• Ξυπολιτά Μ.Ε., Σκούρτη Ε., Κρητικός Α., Βλαχόπουλος Σ., Ζουµπουρλής Β., Η δοµή κι η λειτουργία των GTPασών και ο ρόλος τους στον καρκίνο του πνεύµονα, Αρχεία Ελληνικής Ιατρικής, 2014, 31(2):150-164.
• Skourti E., LogothetiS, Kontos C, Dimoragka PT, Sideridou M, Trougakos IP, Gorgoulis V, Scorilas A, Michalopoulos I, Zoumpourlis V, miR-200 family and miR-205 miRNAs are downregulated as mouse skin carcinogenesis progresses as well as in aggressive human breast cancer cell lines, PlosOne, 2014, Under submission.
ΥΠΟΤΡΟΦΙΕΣ
• Μεταπτυχιακή υποτροφία από το Ίδρυµα Κρατικών Υποτροφιών (ΙΚΥ), Οκτώβριος 2013.
4 Περιεχόµενα
Α. Εισαγωγή... 6
1 MiRNAs ...7
1.1 Ιστορική αναδροµή στην ανακάλυψη των miRNAs ...7
1.2 Η βιογένεση των miRNAs ...8
1.3 Τρόπος λειτουργίας των miRNAs ...11
1.5 Θέσεις του γονιδιώµατος όπου βρίσκονται miRNAs ...12
1.6 MiRNAs και επιγενετική ...14
1.7 Σύµπλοκο σίγησης µέσω παρεµβολής RNA ...15
1.8 RNAi παρεµβολή (RNAi) ...16
1.9 Τύποι ασθενειών µε συχνή υπερ- ή υπο- έκφραση µορίων miRNAs ...18
2 Καρκίνος ...19
2.1 Τα ορόσηµα του καρκίνου ...19
2.2 Στόχευση των ορόσηµων του καρκίνου ...29
2.3 Τύποι καρκίνου ...30
2.4 Μετάσταση ...31
2.5 Το πολυσταδιακό σύστηµα ογκοογένεσης του δέρµατος του ποντικού ...32
2.6 Καρκίνος του µαστού ...36
2.7 Καρκινικές κυτταρικές σειρές του µαστού του ανθρώπου ...37
3 miRNAs και καρκίνος ...40
3.1 Βιολογικές λειτουργίες που επηρεάζει η έκφραση των miRNAs ...40
3.2 Τα miRNAs ως βιοδείκτες του καρκίνου ...40
3.3 Εµπλοκή των miRNAs στον καρκίνο ...41
3.4 Εµπλοκή των miRNAs στη ρύθµιση του πολλαπλασιασµού ...43
3.5 Τα miRNAs στη θεραπεία του καρκίνου (miRNA targeted therapies) ...44
Σκοπός της παρούσας διπλωµατικής εργασίας ...49
Β. Υλικά και µέθοδοι ... 50
5
1 Καλλιέργειες κυτταρικών σειρών ...52
1.1 Καλλιέργεια σε φλάσκα (ή τρυβλίο Petri) ...52
1.2 Αλλαγή θρεπτικού υλικού ...53
1.3 Θρυψινοποίηση κυττάρων ...53
1.4 Πάγωµα κυττάρων ...53
1.5 Προετοιµασία υλικών καλλιέργειας ...54
2 Αποµόνωση RNA...55
3 Μικροσυστοιχίες - Ανάλυση των δεδοµένων των µικροσυστοιχιών ...59
4 Ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης πραγµατικού χρόνου (quantitative Real Time PCR) ...61
4.1 Πολυαδενυλίωση και παραγωγή cDNA από το αποµονωµένο ολικό RNA ...62
4.2 Ποσοτική PCR (qPCR) ...63
Γ. Αποτελέσµατα ... 66
∆. Συζήτηση ... 84
Ε. Μελλοντικές προοπτικές ... 91
ΣΤ. Βιβλιογραφία ... 93
6
Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ
7 1 MiRNAs
Τα miRNAs (µικροRNAs) είναι µία οµάδα µικρών, µονόκλωνων στην ώριµη µορφή τους, µορίων RNAs που αποτελούνται από 19-25 νουκλεοτίδια (µε µέσο µήκος τα 22 νουκλεοτίδια) και συµµετέχουν στην αρνητική ρύθµιση πολλών γονιδίων. Τα µόρια αυτά δεν κωδικοποιούν κάποιο πρωτεϊνικό προϊόν, αλλά ρυθµίζουν τη διαδικασία της µετάφρασης µορίων mRNAs [1].
1.1 Ιστορική αναδροµή στην ανακάλυψη των miRNAs
Η ανακάλυψη των miRNAs έγινε µόλις το 1993 από τους Victor Ambros, Rosalind Lee και Rhonda Feinbaum. Οι συγκεκριµένοι ερευνητές µελετούσαν το ρόλο του γονιδίου lin-14 στην ανάπτυξη του Caenorabditis elegans και βρήκαν ότι η ποσότητα της πρωτεΐνης Lin-14 ρυθµιζόταν από ένα µικρού µήκους RNA που κωδικοποιούνταν από το γονίδιο lin-4. Στη συνέχεια ασχολήθηκαν µε την έκφραση αυτού του γονιδίου κι έτσι είδαν πως αρχικά σχηµατίζεται ένα πρόδροµο µόριο RNA που αποτελείται από 61 νουκλεοτίδια και ωριµάζει σε ένα τελικό RNA 22 νουκλεοτιδίων. Αυτό το τελικό µόριο περιείχε αλληλουχίες εν µέρει συµπληρωµατικές προς τη 3’UTR του mRNA του lin-14. Η συµπληρωµατικότητα αυτή ήταν αναγκαία και επαρκής για την αναστολή της µετάφρασης του mRNA στην πρωτεΐνη Lin-14.
Σύµφωνα µε τα παραπάνω, το lin-4 ήταν το πρώτο miRNA που αναγνωρίστηκε. Έπειτα από µελέτη του µορίου, ανακαλύφθηκε πως όταν είναι ανενεργό, προωθείται ο πολλαπλασιασµός κι όχι η διαφοροποίηση κάποιων συγκεκριµένων επιθηλιακών κυττάρων του ζώου.
Αρχικά, θεωρήθηκε πως η µορφή αυτή της γονιδιακής ρύθµισης ήταν παρούσα αποκλειστικά και µόνο στο συγκεκριµένο σκώληκα και µάλιστα µε µοναδική αντιπροσώπευση το lin-4.
Αυτό το δεδοµένο άλλαξε το 2000, όταν και ανακαλύφθηκε ένα δεύτερο RNA µε παρόµοια λειτουργία, πάλι στον C. elegans. Πρόκειται για το let-7 το οποίο καταστέλλει την έκφραση των γονιδίων lin-41, lin-14, lin-28, lin-42 και daf-12 σε διάφορα αναπτυξιακά στάδια του ζώου και όπως και το lin-4 αυξάνεται κατά τη διαφοροποίηση και ελαττώνεται όταν έπεται κυτταρικός πολλαπλασιασµός. Το let-7 βρέθηκε στη συνέχεια να είναι εξαιρετικά συντηρηµένο σε αρκετά είδη.
8 Ακολούθησε η ανακάλυψη πάρα πολλών άλλων µορίων miRNA, τα οποία αριθµώνται σε περισσότερα από 4000 µόρια, σε πολλούς οργανισµούς ανάµεσα στους οποίους και ο άνθρωπος. Έτσι, έγινε γνωστή η παρουσία των miRNAs στα ευκαρυωτικά γονιδιώµατα ως ένα καθολικό φαινόµενο. Συγκεκριµένα, στο ανθρώπινο γονιδίωµα έχουν ταυτοποιηθεί περισσότερα από 800 τέτοια µόρια και προβλέπεται ότι υπάρχουν πάνω από 700 ακόµη.
Γενικά, εκτός από τα µετάζωα, miRNAs έχουν βρεθεί σε ιούς, πρώτιστα, µυξοµύκητες και φυτά.
1.2 Η βιογένεση των miRNAs
Η βιογένεση των miRNAs περιλαµβάνει τα ακόλουθα στάδια:
i. Μεταγραφή των miRNAs
Η µεταγραφή των miRNAs γίνεται από την RNA πολυµεράση ΙΙ, χωρίς να αποκλείεται ορισµένα miRNAs να µεταγράφονται από άλλες RNA πολυµεράσες (πολυµεράση ΙΙΙ). Αρχικά µάλιστα θεωρήθηκε ότι η RNA πολυµεράση ΙΙΙ είναι υπεύθυνη για τη µεταγραφή των miRNAs, καθώς µεταγράφει τα περισσότερα µικρά RNAs (tRNAs, U6 snRNA). Η πρώτη άµεση ένδειξη ότι η πλειοψηφία των miRNAs µεταγράφεται από την RNA πολυµεράση ΙΙ είναι το γεγονός πως κατά κανόνα το αρχικό µετάγραφο έχει κάλυµµα στο 5’ άκρο αλλά και ουρά πολυαδενίνης (πολύ-Α ουρά). Αυτά αποτελούν προϊόντα αποκλειστικά της RNA πολυµεράσης ΙΙ. Επίσης, χορήγηση α-αµανιτίνης σε συγκέντρωση τέτοια που να αναστέλλει επιλεκτικά την ενεργότητα της RNA πολυµεράσης ΙΙ έχει διαπιστωθεί ότι µειώνει σηµαντικά τα επίπεδα των pri-miRNA. Επιπρόσθετα σε όλα αυτά, µε ανοσοκατακρήµνιση χρωµατίνης (CHIP assay) βρέθηκε πως η RNA πολυµεράση ΙΙ συνδέεται σε υποκινητή κάποιου miRNA που εξετάστηκε.
Υπάρχουν επιπλέον ενδείξεις πως η µεταγραφή των miRNAs δε συµβαίνει από την pol III. Αυτές περιλαµβάνουν το ότι πολλά αρχικά µετάγραφα miRNAs έχουν µήκος αρκετών χιλιάδων βάσεων αλλά και το γεγονός ότι αρκετά περιέχουν τµήµατα µε περισσότερες από 4 διαδοχικές ουρακίλες, κάτι που θα οδηγούσε σε λήξη της µεταγραφής από την πολυµεράση ΙΙΙ [2,3].
9 ii. Επεξεργασία από τη Drosha
Το αποτέλεσµα της µεταγραφής είναι να προκύψει το pri-miRNA που έχει µήκος αρκετές χιλιάδες βάσεις και αναδιπλώνεται δηµιουργώντας τοπική δοµή φουρκέτας.
Έτσι, προκύπτει δοµή της µορφής µίσχος-θηλιά, η οποία υφίσταται πέψη από την πυρηνική RNάση ΙΙΙ Drosha ώστε τελικά να απελευθερωθεί η αµέσως επόµενη πρόδροµη µορφή του miRNA, το pre-miRNA. Αυτό αποτελείται µόνο από τη δοµή της µορφής λούπα-µίσχος, ενώ τα υπολείµµατα του pri-miRNA αποικοδοµούνται στον πυρήνα. Παρόλα αυτά υπάρχουν ενδείξεις πως σε ορισµένες περιπτώσεις διαθέτουν διακριτές λειτουργίες.
Η Drosha είναι µία µεγάλη πρωτεΐνη περίπου 160 kDa και είναι συντηρηµένη στα µετάζωα. Έχει δύο επικράτειες RNάσης ΙΙΙ (RIIIDs) και µία επικράτεια σύνδεσης στο δίκλωνο RNA (dsRBD). ∆ηµιουργεί ένα µεγάλο σύµπλοκo 500 kDa στη Drosophila melanogaster και 600 kDa στον άνθρωπο. Αυτό ονοµάζεται σύµπλοκο µικροεπεξεργασίας (microprocessor complex). Η Drosha αλληλεπιδρά µε το συµπαράγοντά της (120 kDa), την κρίσιµη περιοχή για το σύνδροµο DiGeorge του γονιδίου 8 στον άνθρωπο (αντίστοιχα στη Drosophila melanogaster έχουµε την Pasha). Αυτός ο συµπαράγοντας περιλαµβάνει δύο επικράτειες πρόσδεσης δίκλωνου RNA, ενώ έχει υποτεθεί πως έχει κι µία επικράτεια αλληλεπίδρασης µε πλούσιες σε προλίνη περιοχές. Μία τέτοια περιοχή υπάρχει στη Drosha κι έτσι έχει θεωρηθεί πως ίσως αυτός να είναι ο τρόπος αλληλεπίδρασης µεταξύ των δύο µορίων.
Αυτό που φαίνεται περίεργο είναι το πώς η Drosha αναγνωρίζει τα πολλά διαφορετικά microRNAs που αποτελούν υποστρώµατά της ανάµεσα στα τόσα µόρια RNA που συναντά. Φαίνεται πως, αν και δεν είναι πλήρως ξεκαθαρισµένο το πώς αυτό συµβαίνει, µάλλον σχετίζεται µε αναγνώριση του δίκλωνου µίσχου και της µεγάλης τελικής θηλιάς των microRNAs. Η Drosha κόβει «µετρώντας» περίπου 2 στροφές (22 νουκλεοτίδια) από την τελική θηλιά [2,3].
iii. Έξοδος στο κυτταρόπλασµα
Την τροποποίηση από τη Drosha ακολουθεί η εξαγωγή του pre-miRNA από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασµα µε τη διέλευση διαµέσου των πυρηνικών πόρων.
Συγκεκριµένα, η µεταφορά των pre-miRNAs από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασµα υποβοηθάται σε σηµαντικό βαθµό από την εξπορτίνη 5 (exportin-5) µε κατανάλωση
10 ενέργειας σε µορφή GTP. Στη διαδικασία εξαγωγής στο κυτταρόπλασµα συµµετέχει και η Ran-GTPάση. Αυτή ενεργοποιείται µε πρόσδεση GTP το οποίο και υδρολύει έπειτα από ενεργοποίηση από µία πρωτεΐνη-ενεργοποιητή της ενεργότητας GTPάσης (GTPase Activation Protein, GAP). Στη συνέχεια, το GDP που φέρει συνδεδεµένο επάνω της αποµακρύνεται και ανταλλάσσεται µε GTP από έναν παράγοντα ανταλλαγής GTP (GTP Exchange Factor, GEF) [2,3].
iv. Επεξεργασία από την Dicer
Μετά το στάδιο που µόλις περιγράφηκε έπεται η τροποποίηση από την κυτταροπλασµατική RNάση ΙΙΙ Dicer η οποία µετατρέπει το pre-miRNA των 70 νουκλεοτιδίων σε δίκλωνο µόριο RNA των 22 νουκλεοτιδίων.
Η πρωτεΐνη Dicer παρουσιάζει υψηλή συντηρητικότητα και συναντάται σχεδόν σε όλους τους ευκαρυωτικούς οργανισµούς (φυτά, ζώα και Schizosaccharomyces pombe). Έχει δύο domains RNάσης και ένα σύνδεσης RNA όπως και η Drosha.
Επιπρόσθετα, η Dicer διαθέτει ένα µακρύ Ν-τελικό άκρο που περιλαµβάνει τις εξής τρεις λειτουργικές περιοχές (επικράτειες, domains):
1) επικράτεια RNA ελικάσης Dead-box 2) επικράτεια DUF283
3) επικράτεια PAZ
Η Dicer συνδέεται µε µία σειρά από άλλες πρωτεΐνες, όπως η Rde-4 στο C.
elegans, οι R2d2 και Fmr1 στην D. melanogaster και η οικογένεια των πρωτεϊνών αργοναυτών (Argonautes, Agos) σε διάφορους οργανισµούς. Έχει όµως δειχτεί ότι η κατάλυση συµβαίνει και απουσία των πρωτεϊνών αυτών. Θεωρείται πως σταθεροποιούν τα miRNAs.
Στη φάση αυτή, το ώριµο miRNA ενσωµατώνεται στο λειτουργικό σύµπλοκο που ονοµάζεται miRNP, από το miRNA-containing ribonucleoprotein complex. Άλλες ονοµασίες του συµπλόκου είναι: ‘mirgonaute’ ή ‘miRISC’. Τα ώριµα miRNAs δεν έχουν µεγάλο χρόνο ζωής στο κυτταρόπλασµα [2,3].
11 Εικόνα 1.1: Βιογένεση των miRNAs. Η βιογένεση ενός miRNA ξεκινά από τη μεταγραφή του αντίστοιχου γονιδίου στο αρχικό μετάγραφο (pri-miRNA), ακολουθεί η επεξεργασία του pri- miRNA προς pre-miRNA από την RNAάση Drosha , η έξοδος από τον πυρήνα και η ωρίμανσή του με τη δράση της RNAάσης Dicer. Στο κατώτερο τμήμα της εικόνας φαίνονται οι δύο κύριοι τρόποι δράσης του ώριμου miRNA που έχει συνδεθεί στο RISC: καταστολή της μετάφρασης και αποδόμηση του mRNA.
1.3 Τρόπος λειτουργίας των miRNAs
Υπάρχουν δύο διακριτοί τρόποι δράσης των miRNAs, όπως παρουσιάζεται στο σχήµα που ακολουθεί. Και οι δύο περιλαµβάνουν υβριδοποίηση βάσει της συµπληρωµατικότητας των νουκλεοτιδίων µε το mRNA-στόχο. Στην πρώτη περίπτωση η συµπληρωµατικότητα είναι πλήρης, εκτείνεται δηλαδή σε όλο το µήκος του miRNA. Όταν αυτό συµβαίνει, γίνεται αποικοδόµηση του µορίου mRNA, αφού έχουµε δηµιουργία θέσης στόχου για µία ενδονουκλεάση (slicer). Πρόκειται για το RNAi (RNA interference), διαδικασία που όµοια µε εκείνη που προκαλούν τα
12 siRNAs. Αυτός ο τρόπος δράσης είναι πολύ κοινός στα φυτά. Στη δεύτερη, όπου η συµπληρωµατικότητα είναι µερική, δε γίνεται αποικοδόµηση του mRNA αλλά αναστολή της µετάφρασης. Συνηθέστερα το miRNA και στις δύο περιπτώσεις συνδέεται σε αµετάφραστη περιοχή και πιο συγκεκριµένα στην 3’ αµετάφραστη περιοχή του mRNA-στόχου. Μάλιστα, στις περισσότερες περιπτώσεις η συµπληρωµατική αλληλουχία του miRNA επαναλαµβάνεται αρκετές φορές στο mRNA-στόχο.
Αξίζει να αναφερθεί ότι η πλήρης συµπληρωµατικότητα µε την περιοχή από το δεύτερο µέχρι το όγδοο νουκλεοτίδιο είναι απαραίτητη για όλα τα miRNAs. Η περιοχή αυτή καλείται περιοχή εκβλάστησης (seed region, SR). Αποτέλεσµα της δράσης των miRNAs είναι ένα από τα τρία ακόλουθα: (α) καταστολή της µετάφρασης του mRNA-στόχου (β) αποικοδόµηση του mRNA-στόχου (γ) τροποποιήσεις της χρωµατίνης.
Εικόνα 1.2: Τρόπος δράσης των miRNAs. Όταν η συμπληρωματικότητα προς το τμήμα της 3’
αμετάφραστης περιοχής όπου προσδένεται το miRNA είναι πλήρης, συμβαίνει αποδόμηση του mRNA ενώ όταν είναι μερική, είτε γίνεται αποδόμηση είτε καταστέλλεται η μετάφραση του mRNA.
1.4 Θέσεις γονιδιώµατος όπου βρίσκονται miRNAs
Τα miRNAs εµφανίζουν µεγάλη εξελικτική συντηρητικότητα. Έρευνες έχουν δείξει πως τα περισσότερα miRNAs εντοπίζονται σε διαγονιδιακές περιοχές (70%,
13 έχουν δικό τους υποκινητή), ενώ υπάρχει και ένα µικρότερο ποσοστό αυτών που εντοπίζεται µέσα σε εσώνια γνωστών γονιδίων, είτε στην κωδική είτε στη µη κωδική αλυσίδα. Αυτά µαζί µε εκείνα που εντοπίζονται σε εξώνια αποτελούν το υπόλοιπο 30%.
Αυτά τα δεδοµένα οδηγούν στο συµπέρασµα πως τα miRNAs αποτελούν ανεξάρτητες µεταγραφικές µονάδες.
Ένα ακόµη ενδιαφέρον στοιχείο είναι πως το 50% των γνωστών miRNAs βρίσκονται κοντά σε άλλα miRNAs (πιθανά πρόκειται για polycistronic transcription units).
Εικόνα 1.3: Απεικόνιση των τύπων οργάνωσης στο γονιδίωμα που έχουν βρεθεί για τα miRNAs. Τα πρωτογενή μετάγραφα που κωδικοποιούν miRNAs, τα pri-miRNAs, περιέχουν κάλυμμα στο 5' άκρο τους καθώς επίσης 3’ πολύ-(A) ουρές. Τα miRNAs μπορούν να κατηγοριοποιηθούν σε τρεις ομάδες με βάση την εντόπισή τους στο γονιδίωμα και σχετικά με το αν βρίσκονται μέσα σε εξώνια ή εσώνια. (a) Εξωνικά miRNAs σε μη-κωδικοποιητικά μετάγραφα όπως η ομάδα των miR-23~27~24-2, το miR-21 και το miR-155. Το miR-155 βρέθηκε σε μία περιοχή που είχε προηγουμένως χαρακτηριστεί ως γονίδιο μη-
14 κωδικοποιητικoύ RNA, την bic17. (b) Εσωνικά miRNAs σε μη-κωδικοποιητικά μετάγραφα Για παράδειγμα, η ομάδα των miR-15~16-1 βρέθηκε στο τέταρτο εσώνιο ενός γονιδίου που είχε χαρακτηριστεί ως μη κωδικοποιητικού RNA, του DLEU2. (c) Εσωνικά miRNAs σε γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες. Για παράδειγμα, η ομάδα miR-106~93~25 εντοπίζεται στο δέκατο τρίτο εσώνιο του γονιδίου του παράγοντα ενεργοποίησης της αντιγραφής του DNA MCM7. Το ομόλογο του miR-106~93~25 στον ποντικό εντοπίζεται στο δέκατο τρίτο εσώνιο του ομόλογου γονιδίου του MCM7 του ποντικού.
1.5 MiRNAs και επιγενετική
Με τον όρο επιγενετική χαρακτηρίζονται οι κληρονοµήσιµες µεταβολές στο πρότυπο της γονιδιακής έκφρασης που δεν περιλαµβάνουν αλλαγές στη νουκλεοτιδική αλληλουχία του DNA αυτή καθαυτή. Οι δύο κύριοι µηχανισµοί µέσω των οποίων εκδηλώνεται η επιγενετική είναι η µεθυλίωση του DNA σε κυτοσίνες και η τροποποίηση των ιστονών. Η τροποποίηση των ιστονών εµφανίζεται µε δύο διακριτούς τρόπους.
Ο πρώτος αφορά τη µεθυλίωση των ιστονών, η οποία σχετίζεται µε την
«κλειστή» δοµή της χρωµατίνης κι αυτό έχει ως συνέπεια τη χαµηλή µεταγραφική ενεργότητα στην περιοχή. Αντίθετα, η δεύτερη µορφή τροποποίησης των ιστονών, η ακετυλίωσή τους οδηγεί σε «ανοιχτή» δοµή χρωµατίνης κι ενεργοποίηση της µεταγραφής στην εκάστοτε χρωµοσωµική περιοχή. Η µεθυλίωση του DNA, όπως και η µεθυλίωση των ιστονών, οδηγεί σε καταστολή της µεταγραφής. Στο σηµείο αυτό, αξίζει να γίνει µία αναφορά στη σχέση µεταξύ του επιγενετικού ελέγχου και των miRNAs.
Από τη µία µεριά, φαίνεται πως ορισµένα miRNAs εµπλέκονται στη διαδικασία της µεθυλίωσης του DNA. Παραδείγµατος χάριν, βρέθηκε ότι τα miR-165 και miR-166 απαιτούνται για τη µεθυλίωση του γονιδίου phabulosa (phb) στο φυτό Arabidopsis. Πιο συγκεκριµένα, τα δύο αυτά miRNAs αλληλεπιδρούν µε το νεοσυντιθέµενο mRNA που προκύπτει από τη µεταγραφή του γονιδίου για να αλλάξουν τη δοµή της χρωµατίνης του συµπληρωµατικού προς το mRNA κλώνου του DNA (µεταγραφόµενη αλυσίδα). Αυτό υποδεικνύει πως υπάρχει ένας ακόµη µηχανισµός µέσω του οποίου τα miRNAs ελέγχουν τη γονιδιακή έκφραση πέραν της καταστολής της µετάφρασης και της αποικοδόµησης του mRNA που στοχεύουν.
Παρόµοια αποτελέσµατα έχουν δώσει αντίστοιχες έρευνες στα θηλαστικά, όπου τα
15 ένζυµα µεθυλίωσης του DNA Dnmt1, 3a, και 3b προβλέπονται ως πιθανοί στόχοι κάποιων miRNAs. Ωστόσο, δεν έχει ακόµη αποδειχθεί πειραµατικά ότι οι Dnmts όντως υφίστανται ρύθµιση από miRNAs. Επιπρόσθετα, τα miRNAs ενδέχεται να ρυθµίζουν τη δοµή της χρωµατίνης µέσω στόχευσης των κύριων τροποποιητών των ιστονών. Ως παράδειγµα εδώ αναφέρεται η περίπτωση του miR-140, το οποίο εκφράζεται ειδικά στους χόνδρους και στοχεύει την αποακετυλάση 4 της ιστόνης (histone deacetylase 4) στο ποντίκι. Έρευνες δείχνουν ότι είναι πιθανό τα miRNAs να εµπλέκονται στη σίγηση της χρωµατίνης που δεν έχει υποστεί σύναψη κατά τη µείωση στο ποντίκι. Με βάση όλα τα παραπάνω, τα miRNAs φαίνεται να παίζουν σηµαντικό ρόλο στον επιγενετικό έλεγχο της γονιδιακής έκφρασης.
Από την άλλη πλευρά, φαίνεται πως και η έκφραση των miRNAs βρίσκεται κάτω από επιγενετικό έλεγχο. Οι Saito και συνεργάτες επισηµαίνουν ότι ο έλεγχος αυτός εκδηλώνεται τόσο µέσω µεθυλίωσης του DNA όσο και τροποποίησης των ιστονών.
Ειδικότερα, έπειτα από χορήγηση του 5-Aza-CdR, ενός αναστολέα της µεθυλίωσης του DNA και του 4-φαινυλοβουτυρικού οξέος (4-phenylbutyric acid, PBA), ενός αναστολέα της αποακετυλίωσης των ιστονών παρατηρήθηκαν τα εξής: Η δράση αυτών των ουσιών οδηγεί σε περισσότερο ανοιχτές δοµές της χρωµατίνης, εποµένως και σε αυξηµένη γονιδιακή ρύθµιση. Το ενδιαφέρον εδώ είναι ότι παρατηρήθηκε υπερέκφραση του miR-127, κάτι που υποδεικνύει πως υπάρχει επιγενετική ρύθµιση για το miRNA αυτό, και πιθανότατα και για άλλα τέτοια µόρια.
Πολλά miRNAs εντοπίζονται σε εσώνια. Θεωρείται, λοιπόν, πως τα miRNAs αυτά υπόκεινται σε κοινή ρύθµιση της έκφρασης µε τα γονίδια-ξενιστές τους, όπως ονοµάζονται τα γονίδια που τα περιλαµβάνουν. Ωστόσο, δεν είναι απίθανο τα miRNAs αυτά να έχουν δικό τους υποκινητή. Μάλιστα, η εύρεση νησίδων CpG (CpG islands) στις αλληλουχίες αυτών των εσωνίων καθιστά πιθανό το ενδεχόµενο τα miRNAs που περιέχονται να υφίστανται επιγενετικό έλεγχο µέσω µεθυλίωσης του DNA [4].
1.6 Σύµπλοκο σίγησης µέσω παρεµβολής RNA
Το σύµπλοκο σίγησης µέσω παρεµβολής RNA (RISC) αποτελείται από µία πρωτεΐνη που προσδένεται στο RNA και είναι ευαίσθητη σε trans ενεργοποίηση
(transactivation-responsive 2. Ακόµη, στο σχηµατισµό του
Πρόσφατες έρευνες δείχνουν πως αρχικά η νουκλεοτίδια του pre-miRNA
διαµόρφωση του τελικού δίκλωνου µορίου των 22 νουκλεοτιδίων. Από αυτό, η ενεργός ή ώριµη αλυσίδα παραµ
(passenger strand) αποσυν Στα σπονδυλόζωα το
αυτό είναι που εµφανίζει συµπληρωµατικότητα προς το µόριο αναγνωρίζει ειδικά [5].
Εικόνα 1.4: Σύνδεση του ώριμου μορίου
και ωριμάσει, το miRNA προσδένεται στο σύμπλεγμα
Η RNA παρεµβολή
διαδικασίες τις οποίες µπορεί να πυροδοτήσει η δράση του ώριµου
διαδικασία γονιδιακής σίγησης κατά τη διάρκεια της οποίας ένα µόριο responsive RNA-binding protein, TRBP) και από την πρωτεΐνη 2. Ακόµη, στο σχηµατισµό του RISC φαίνεται να λαµβάνει µέρος η Gw
Πρόσφατες έρευνες δείχνουν πως αρχικά η ago-2 πέπτει τα 12 πρώ miRNA από το 3’ άκρο του και στη συνέχεια δρα η
διαµόρφωση του τελικού δίκλωνου µορίου των 22 νουκλεοτιδίων. Από αυτό, η ενεργός ή ώριµη αλυσίδα παραµένει στο σύµπλοκο, ενώ η συµπληρωµατική της
) αποσυντίθεται.
Στα σπονδυλόζωα το RISC οδηγείται στο στόχο του από το αυτό είναι που εµφανίζει συµπληρωµατικότητα προς το µόριο mRNA
Εικόνα 1.4: Σύνδεση του ώριμου μορίου miRNA στο σύμπλεγμα RISC. Αφού μεταγραφεί προσδένεται στο σύμπλεγμα RISC και εκδηλώνει τη δράση του.
1.7 RNA παρεµβολή (RNAi)
παρεµβολή (RNA interference, RNAi) είναι µία από τις δύο διαδικασίες τις οποίες µπορεί να πυροδοτήσει η δράση του ώριµου miRNA
διαδικασία γονιδιακής σίγησης κατά τη διάρκεια της οποίας ένα µόριο
16 και από την πρωτεΐνη Αgo-
w182.
2 πέπτει τα 12 πρώτα από το 3’ άκρο του και στη συνέχεια δρα η dicer για τη διαµόρφωση του τελικού δίκλωνου µορίου των 22 νουκλεοτιδίων. Από αυτό, η ένει στο σύµπλοκο, ενώ η συµπληρωµατική της
οδηγείται στο στόχο του από το miRNA καθώς mRNA-στόχο και το
Αφού μεταγραφεί και εκδηλώνει τη δράση του.
είναι µία από τις δύο miRNA. Είναι µία διαδικασία γονιδιακής σίγησης κατά τη διάρκεια της οποίας ένα µόριο
17 αντινοηµατικού (antisense) RNA (miRNA) υβριδοποιείται πλήρως µε ένα µόριο mRNA προκαλώντας µε τον τρόπο αυτό την αποδόµηση του τελευταίου µέσω προσέλκυσης του συµπλόκου RISC.
Στη λογική του RNAi βασίζεται ένα σύνολο µεθόδων (τεχνολογία RNAi) και χρησιµοποιούν τα siRNAs, µόρια µε ρόλο ανάλογο αυτού των miRNAs που υπάρχουν φυσιολογικά στο κύτταρο. Σήµερα χρησιµοποιείται ευρέως προκειµένου να γίνει αποσιώπηση της έκφρασης (knockdown) συγκεκριµένων γονιδίων. Ένας πολύ σηµαντικός λόγος για τον οποίο προτιµούνται τα siRNAs είναι η εξειδίκευση τους στη ρύθµιση των γονιδίων.
Η διαµόλυνση κυττάρων µε δίκλωνα siRNA µπορεί να συµβεί µε δύο τρόπους, άµεσα και έµµεσα:
1. µε επιµόλυνση των κυττάρων µε δίκλωνα µόρια siRNA, που έχουν παραχθεί είτε χηµικά είτε ενζυµικά.
2. µε την επιµόλυνση των κυττάρων µε φορείς οι οποίοι µπορούν να εκφράσουν µία πρόδροµη µορφή του siRNA (shRNA – short hairpin RNA) που έπειτα από επεξεργασία από την Dicer καταλήγει σε µορφή siRNA.
Η κωδική αλυσίδα, αυτή δηλαδή που συνδέεται στο RISC και αναστέλλει τη µετάφραση του mRNA καλείται αλυσίδα-οδηγός (guide strand) ενώ η συµπληρωµατική της λέγεται αλυσίδα-επιβάτης (passenger strand).
Η µελέτη κρυσταλλικών δοµών siRNAs έδειξαν πως η αναγνώριση των siRNAs απαιτεί να υπάρχει φωσφορυλίωση του 5’ άκρου της αλυσίδας-οδηγού. Φαίνεται πως το τελευταίο νουκλεοτίδιο του 5’ άκρου δεν βρίσκεται συνδεδεµένο συµπληρωµατικά µε το απέναντί του στο mRNA αλλά αλληλεπιδρά µε το RISC. Κάτι ακόµη που έδειξαν αυτές οι δοµικές µελέτες είναι πως η πέψη ανάµεσα στην οδηγό και τη συµπληρωµατική αλυσίδα συµβαίνει στην περιοχή µεταξύ 10ου και 11ου νουκλεοτιδίου της οδηγού αλυσίδας. Τέλος, τα νουκλεοτίδια του 3’ άκρου είναι πιο χαλαρά συνδεδεµένα στο RISC και είναι, προφανώς, λιγότερο σηµαντικά προκειµένου να γίνει η αλληλεπίδραση.
Είναι, εποµένως, αναγκαίο να υπάρχει µία µοναδική ακολουθία µεταξύ των νουκλεοτιδίων 2 και 11 προκειµένου να ελαχιστοποιηθεί ο θόρυβος και να έχουµε τη µέγιστη δυνατή – ει δυνατόν και απόλυτη – συµπληρωµατικότητα.
Ακόµη, γίνεται εµφανής η ανάγκη για ύπαρξη νουκλεοτιδίου χαµηλής ενέργειας ζευγαρώµατος στο 5’ άκρο αφού αυτό δε θα ζευγαρώσει αλλά συµµετέχει µόνο στην αλληλεπίδραση µε το RISC. Έτσι, κατά το σχεδιασµό µορίων siRNAs θα πρέπει να
18 υπάρχει µία ασυµµετρία ως προς την κατανοµή της ενέργειας ζευγαρώµατος (binding energy) και αυτή να είναι µεγαλύτερη στο 3’ άκρο.
Ένα σηµαντικό πρόβληµα που πρέπει να λυθεί για να λειτουργήσει η τεχνολογία του siRNA είναι η είσοδος των µορίων στο κύτταρο. Τα siRNAs είναι νουκλεϊκά οξέα τα οποία είναι πολυανιόντα. Άρα, δεν µπορούν να διαπεράσουν τη λιπιδική διπλοστιβάδα. Οι µέθοδοι για να γίνει αυτό δυνατό είναι:
Υπερµοριακή νανοµεταφορά
Χρήση πεπτιδίου µε υψηλή διαπερατότητα ως προς τη µεµβράνη Μεταφορά βασιζόµενη σε χρήση λιπιδικών µεµβρανών
Ηλεκτροδιάτρηση
Για να γίνει έλεγχος του βαθµού αποτελεσµατικότητας του siRNA ή του shRNA που εισήχθη στο εκάστοτε κύτταρο ακολουθείται µία από τις ακόλουθες διαδικασίες:
Μέτρηση του ενδογενούς mRNA-στόχου.
Μέτρηση των επιπέδων της αντίστοιχης πρωτεΐνης.
Χρήση ενός πλασµιδίου αναφοράς που περιέχει την αλληλουχία-στόχο συγχωνευµένη µε ένα γονίδιο αναφοράς.
1.8 Τύποι ασθενειών µε συχνή υπερ- ή υπο- έκφραση µορίων miRNAs
Χαρακτηριστικές κατηγορίες ασθενειών στις οποίες συχνά παρατηρείται υπερέκφραση ή υποέκφραση κάποιου ή κάποιων mRNAs αναφέρονται παρακάτω:
I. Ασθένειες σχετικές µε τη γήρανση II. Καρδιακές παθήσεις
III. Νευρολογικές ασθένειες
IV. ∆ιαταραχές του ανοσοποιητικού συστήµατος V. Ογκογένεση – καρκίνος
19 2. Καρκίνος
2.1 Τα ορόσηµα του καρκίνου
Ο όρος «καρκίνος» δεν αποδίδεται σε µία και µόνη ασθένεια, αλλά σε µία οµάδα ασθενειών που χαρακτηρίζονται από τον ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασµό των κυττάρων. Σε αντίθεση µε τα φυσιολογικά κύτταρα στο ανθρώπινο σώµα, τα οποία αυξάνονται, διαιρούνται και πεθαίνουν µε έναν αυστηρά ελεγχόµενο τρόπο, τα καρκινικά κύτταρα διαφέρουν διότι συνεχίζουν να διαιρούνται ανεξέλεγκτα. Αυτό έχει ως αποτέλεσµα την ανάπτυξη µιας µάζας κυττάρων, που ονοµάζεται όγκος. Οι όγκοι µπορεί να είναι καλοήθεις ή κακοήθεις. Οι κακοήθεις όγκοι αναφέρονται ως καρκίνοι.
Παρά την περιπλοκότητα και την ποικιλοµορφία που εµφανίζεται µεταξύ των διαφόρων µορφών καρκίνου, οι Hanahan και Weinberg [6] έχουν καταφέρει να ορίσουν τα έξι χαρακτηριστικότερα στοιχεία που εµφανίζουν όλοι οι κακοήθεις όγκοι (Εικόνα 2.1).
Εικόνα 2.1: Τα χαρακτηριστικά του καρκίνου. Στην εικόνα φαίνονται τα έξι χαρακτηριστικά γνωρίσματα που συναντώνται σε όλους, σχεδόν, τους καρκινικούς όγκους, έτσι όπως ορίστηκαν από τους Hanahan και Weinberg τα χαρακτηριστικά γνωρίσματα των καρκινικών όγκων που αναφέρονται στην εικόνα, αποτελούν πιθανούς στόχους για θεραπεία της ασθένειας [6].
20 Συνοπτικά, αυτά τα γνωρίσµατα παρουσιάζονται παρακάτω:
1. ∆ιαρκώς ενεργά σηµατοδοτικά µονοπάτια κυτταρικού πολλαπλασιασµού.
Αδιαµφισβήτητα, το πιο χαρακτηριστικό γνώρισµα κάθε κακοήθους όγκου είναι το εξαιρετικά υψηλό πολλαπλασιαστικό δυναµικό του. Οι φυσιολογικοί ιστοί ελέγχουν µε εξαιρετική ακρίβεια την παραγωγή και την απέλευθέρωση σηµάτων που προωθούν τον κυτταρικό κύκλο κι επάγουν κυτταρικό πολλαπλασιασµό. Αυτός ο αυστηρός έλεγχος εξασφαλίζει την οµοιόσταση του αριθµού κυττάρων κι εποµένως τη διατήρηση της φυσιολογικής αρχιτεκτονικής και λειτουργίας του ιστού. Τα καρκινικά κύτταρα, απορρυθµίζοντας αυτά τα σήµατα καθορίζουν από µόνα τους τη δική τους πορεία: Η σηµατοδότηση που επιτρέπει τον πολλαπλασιασµό των κυττάρων προέρχεται σε µεγάλο βαθµό από αυξητικούς παράγοντες που προσδένονται σε υποδοχείς της κυτταρικής επιφάνειας που συνήθως φέρουν ενδοκυτταρικές λειτουργικές περιοχές µε ενεργότητα κινάσης τυροσίνης. Αυτή η ενεργότητα καθιστά δυνατή τη µετάδοση των εξωκυττάριων σηµάτων στο εσωτερικό των κυττάρων µε ενεργοποίηση ενδοκυττάριων σηµατοδοτικών µονοπατιών που ρυθµίζουν την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου και την κυτταρική αύξηση (δηλαδή την αύξηση του µεγέθους του κυττάρου). Κάποιες φορές, τα σήµατα αυτά µπορεί να επηρεάζουν άλλες κυτταρικές λειτουργίες, όπως η κυτταρική επιβίωση και ο µεταβολισµός του κυττάρου.
Τα καρκινικά κύτταρα µπορούν να αποκτήσουν την ικανότητα να διατηρούν τη σηµατοδότηση που επάγει τον πολλαπλασιασµό τους µε έναν αριθµό εναλλακτικών τρόπων: Μπορούν να παράγουν από µόνα τους αυξητικούς παράγοντες, µε τους οποίους µπορούν να ανταποκριθούν µέσω της έκφρασης των αντίστοιχων υποδοχέων, οδηγώντας σε αυτοκρινή διέγερση του κυτταρικού πολλαπλασιασµού. Εναλλακτικά, τα καρκινικά κύτταρα µπορεί να αποστέλλουν σήµατα σε φυσιολογικά κύτταρα εντός του υποστηρικτικού, σχετιζόµενου µε τον όγκο στρώµατος, το οποίο ανταποκρίνεται µε την παροχή διαφόρων αυξητικών παραγόντων στα καρκινικά κύτταρα [7,8]. Η σηµατοδότηση µέσω υποδοχέων µπορεί επίσης να απορρυθµιστεί µέσω της αύξησης των επιπέδων των πρωτεϊνικών υποδοχέων που εµφανίζονται στην επιφάνεια των καρκινικών κυττάρων. Αυτό προκαλεί στα καρκινικά κύτταρα υπερ-απόκριση σε αυξητικούς
21 παράγοντες που φυσιολογικά βρίσκονται σε χαµηλά επίπεδα. Το ίδιο αποτέλεσµα µπορεί να προκύψει από στερεοδοµικές αλλαγές στα µόρια του υποδοχέα (δηλαδή διαταραχές στη δοµή που αυτά λαµβάνουν στο χώρο) που διευκολύνουν τη σύνδεση του εκάστοτε αυξητικού παράγοντα µε τον υποδοχέα του. Ο ανεξάρτητος από τον αυξητικό παράγοντα πολλαπλασιασµός των καρκινικών κυττάρων µπορεί επίσης να προέρχεται από τη διαρκή ενεργοποίηση συστατικών των οδών σηµατοδότησης που λειτουργούν καταρροϊκά αυτών των υποδοχέων, αποφεύγοντας έτσι την ανάγκη να αυξηθεί σε αυτά η συγγένεια σύνδεσης του αυξητικού παράγοντα µε τον υποδοχέα του. ∆εδοµένου ότι συνήθως ένας σηµαντικός αριθµός διαφορετικών οδών σηµατοδότησης διεγείρεται από τη σύνδεση ενός ζεύγους συνδέτη-υποδοχέα, η διαρκώς ενεργή κατάσταση µίας από αυτές τις οδούς µπορεί να επιδρά µόνο σε ένα υποσύνολο των ρυθµιστικών οδηγιών που µεταδίδονται από έναν ενεργοποιηµένο υποδοχέα.
Επιπλέον, σωµατικές µεταλλάξεις που ενεργοποιούν επιπρόσθετα καταρροϊκά µονοπάτια καθώς επίσης και διαταραχές των µηχανισµών αρνητικής ανάδρασης που καταστέλλουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασµό µπορούν να ενισχύσουν το πολλαπλασιαστικό δυναµικό των καρκινικών κυττάρων.
2. Αποφυγή των σηµάτων καταστολής της ανάπτυξης
Εκτός από την ικανότητα να επάγουν και να διατηρούν θετικά σήµατα για τον πολλαπλασιασµό τους, τα καρκινικά κύτταρα πρέπει επίσης να παρακάµψουν ισχυρά προγράµµατα που ρυθµίζουν αρνητικά τον πολλαπλασιασµό των κυττάρων πολλά από τα οποία εξαρτώνται από τη δράση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων. ∆εκάδες γονίδια καταστολής όγκων που λειτουργούν µε διάφορους τρόπους για να περιορίσουν την ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασµό των κυττάρων έχουν ανακαλυφθεί µέσα από τη χαρακτηριστική τους αδρανοποίηση σε διάφορους τύπους καρκίνου του ανθρώπου ή των ζώων. Πολλά από αυτά τα γονίδια έχουν ταυτοποιηθεί ως ικανοί καταστολείς της ογκογένεσης µέσω ενίσχυσης ή απώλειας της λειτουργίας σε πειράµατα µε ποντίκια. Τα δύο βασικά ογκοκατασταλτικά γονίδια κωδικοποιούν την πρωτεΐνη του ρετινοβλαστώµατος (retinoblastoma protein, pRΒ) και την TP53. Αυτές οι πρωτεΐνες λειτουργούν ως κεντρικοί κόµβοι ελέγχου εντός των δύο βασικών συµπληρωµατικών κυτταρικών ρυθµιστικών κυκλωµάτων που ελέγχουν τις αποφάσεις των κυττάρων για
22 πολλαπλασιασµό ή, εναλλακτικά, την ενεργοποίηση των προγραµµάτων της γήρανσης ή της απόπτωσης. Η πρωτεΐνη RB ενσωµατώνει σήµατα από διαφορετικές εξωκυττάριες και ενδοκυττάριες πηγές και σε απάντηση αποφασίζει κατά πόσον ή όχι ένα κύτταρο θα πρέπει να προχωρήσει µέσα στον κυτταρικό κύκλο και να διαιρεθεί [9-11]. Τα καρκινικά κύτταρα µε ελαττωµατική λειτουργία του µονοπατιού της πρωτεΐνης RB στερούνται, εποµένως, τις υπηρεσίες ενός κρίσιµου φύλακα της προόδου του κυτταρικού κύκλου, του οποίου η απουσία επιτρέπει τον διαρκή κι ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασµό των κυττάρων. Ενώ η RB µεταδίδει σήµατα που αναστέλλουν την ανάπτυξη που προέρχονται σε µεγάλο βαθµό από παράγοντες εκτός του κυττάρου, η ΤΡ53 δέχεται σήµατα από αισθητήρες καταπόνησης (stress, στρες) και διαταραχών που λειτουργούν µέσα σε ενδοκυτταρικά λειτουργικά συστήµατα του κυττάρου: εάν ο βαθµός της βλάβης στο γονιδίωµα είναι υπερβολικός, ή εάν τα επίπεδα των νουκλεοτιδίων, τα σήµατα προαγωγής της ανάπτυξης, η γλυκόζη, ή οξυγόνωση είναι κατώτερα του ιδανικού, η TP53 µπορεί να θέσει τέλος στην περαιτέρω εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, έως ότου οι όροι αυτοί οµαλοποιηθούν. Εναλλακτικά, σε περίπτωση σηµάτων συναγερµού που υποδεικνύουν συντριπτική ή ανεπανόρθωτη βλάβη στα προαναφερθέντα κυτταρικά υποσυστήµατα, η ΤΡ53 µπορεί να προκαλέσει απόπτωση. Ειδικότερα, οι διάφορες επιδράσεις της ενεργοποιηµένης ΤΡ53 είναι πολύπλοκες και εξαιρετικά εξαρτώµενες από το περιβάλλον, ποικίλλουν ανά τύπο κυττάρου, καθώς και µε βάση τη σοβαρότητα και την επιµονή των συνθηκών κυτταρικής καταπόνησης και τη µ
βλάβη. Αν και οι δύο κύριοι καταστολείς του πολλαπλασιασµού- TP53 και RB- έχουν εξέχουσα σηµασία στη ρύθµιση του κυτταρικού πολλαπλασιασµού, φαίνεται ότι καθένα από αυτά λειτουργεί ως µέρος ενός µεγαλύτερου δικτύου που συνδέεται µέσω επιπρόσθετων, δευτερευόντων παραγόντων που παρέχουν δικλείδες ασφαλείας στο κύτταρο. Για παράδειγµα, είναι εντυπωσιακό ότι χιµαιρικά ποντίκια που φέρουν σε όλο το σώµα τους µεµονωµένα κύτταρα που στερούνται ένα λειτουργικό γονίδιο Rb δεν εµφανίζουν διαταραχές στον πολλαπλασιασµό, παρά αυτό που αναµένεται, ότι δηλαδή η απώλεια της λειτουργίας της RB θα επιτρέψει τη συνεχή πυροδότηση του κυτταρικού κύκλου σε αυτά τα κύτταρα και τους απογόνους τους. Μάλιστα, θα περίµενε κανείς µερικές από τις προκύπτουσες οµάδες κυττάρων που στερούνται Rb να συµβάλλουν σε εµφάνιση νεοπλασίας. Ωστόσο, τα κύτταρα που δεν έχουν Rb σε
23 τέτοια χιµαιρικά ποντίκια έχουν βρεθεί να συµµετάσχουν στη δηµιουργία σχετικά φυσιολογικού ιστού σε όλο το σώµα. Η µόνη νεοπλασία που παρατηρήθηκε ήταν η ανάπτυξη όγκων της υπόφυσης αργά στη ζωή [12]. Οµοίως, ποντικοί χωρίς ΤΡ53 αναπτύσσονται κανονικά, παρουσιάζουν µεγάλο βαθµό κυτταρικής και ιστικής οµοιόστασης και αναπτύσσουν ανωµαλίες αργότερα στη ζωή, µε τη µορφή λευχαιµιών και σαρκωµάτων [13]. Και τα δύο παραδείγµατα είναι χαρακτηριστικά της αφθονίας των διαθέσιµων εναλλακτικών µηχανισµών που χρησιµεύουν για να περιορίσουν την ακατάλληλη ανάπτυξη των κυττάρων που στερούνται αυτούς τους βασικούς καταστολείς του πολλαπλασιασµού.
Μεταξύ των µηχανισµών αποφυγής της καταστολής της αύξησης που επιστρατεύουν τα καρκινικά κύτταρα συγκαταλέγεται και η αναστολή της αύξησης λόγω επαφής. Σε έναν τρόπο για να επιτευχθεί αυτό εµπλέκεται το προϊόν του γονιδίου nf2 ενός γνωστού ογκοκατασταλτικού γονιδίου, έλλειψη του οποίου προκαλεί µία µορφή νευροϊνωµάτωσης του ανθρώπου. Το κυτταροπλασµατικό προϊόν του γονιδίου της νευροϊνωµάτωσης ρυθµίζει την αναστολή της αύξησης λόγω επαφής µέσω διασύνδεσης των µορίων προσκόλλησης της κυτταρικής επιφάνειας (για παράδειγµα, µε την Ε-καδερίνη, E- cadherin) σε διαµεµβρανικούς υποδοχείς κινάσης τυροσίνης (π.χ. υποδοχέας του επιδερµικού αυξητικού παράγοντα, epidermal growth factor receptor, EGFR).
Εκτός από το να ενδυναµώνει την προσκολλητική ικανότητα της Ε-καδερίνης σε σηµεία διακυτταρικών επαφών η Merlin έχει την ικανότητα να δεσµεύει αυξητικούς παράγοντες περιορίζοντας τη δυνατότητά τους να µετάγουν µιτογόνα σήµατα [14,15].
3. Αντίσταση στον κυτταρικό θάνατο
Η ιδέα ότι ο προγραµµατισµένος κυτταρικός θάνατος µε απόπτωση χρησιµεύει ως ένα φυσικό εµπόδιο για την ανάπτυξη του καρκίνου έχει καθιερωθεί από λειτουργικές µελέτες που πραγµατοποιήθηκαν κατά τις τελευταίες δύο δεκαετίες [16-18]. Η αποσαφήνιση του κυκλώµατος σηµατοδότησης που κατευθύνεται προς το αποπτωτικό πρόγραµµα αποκάλυψε πώς η απόπτωση ενεργοποιείται ως απόκριση σε διάφορες φυσιολογικές καταπονήσεις που υφίστανται τα καρκινικά κύτταρα κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης ή ως αποτέλεσµα της αντικαρκινικής θεραπείας. Αξιοσηµείωτες