• Nenhum resultado encontrado

ΘΕΜΑΤΙΚΗ ΠΕΡΙΟΧΗ: Φαρµακευτική ανάλυση ΛΕΞΕΙΣ ΚΛΕΙΔΙΑ: ρανελικό στρόντιο, HPLC, αντιδραστήρια ζεύγους ιόντων, οστεοπόρωση, επικύρωση, εξαναγκασµένες µελέτες αποικοδόµησης (6)ABSTRACT In the present Τhesis we describe the development of a new reversed-phase ion pair high-performance liquid chromatographic method for the determination of strontium ranelate

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2023

Share "ΘΕΜΑΤΙΚΗ ΠΕΡΙΟΧΗ: Φαρµακευτική ανάλυση ΛΕΞΕΙΣ ΚΛΕΙΔΙΑ: ρανελικό στρόντιο, HPLC, αντιδραστήρια ζεύγους ιόντων, οστεοπόρωση, επικύρωση, εξαναγκασµένες µελέτες αποικοδόµησης (6)ABSTRACT In the present Τhesis we describe the development of a new reversed-phase ion pair high-performance liquid chromatographic method for the determination of strontium ranelate"

Copied!
141
0
0

Texto

(1)

ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ

ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ

ΔΙΑΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΟ ΔΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ

«ΧΗΜΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ – ΕΛΕΓΧΟΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ»

ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΔΙΠΛΩΜΑΤΟΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ

Ανάπτυξη και επικύρωση µεθόδου αντίστροφης φάσης ιοντικών ζευγών υγροχρωµατογραφίας

υψηλής απόδοσης για τον προσδιορισµό του ρανελικού στροντίου

ΕΥΦΡΟΣΥΝΗ ΦΩΤΙΑΔΗ ΧΗΜΙΚΟΣ

ΑΘΗΝΑ

ΣΕΠΤΕΜΒΡΙΟΣ 2012

(2)
(3)

ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΔΙΠΛΩΜΑΤΟΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ

Ανάπτυξη και επικύρωση µεθόδου αντίστροφης φάσης ιοντικών ζευγών υγροχρωµατογραφίας υψηλής απόδοσης για τον προσδιορισµό του

ρανελικού στροντίου

ΕΥΦΡΟΣΥΝΗ ΦΩΤΙΑΔΗ

Α.Μ.: 101311

ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ:

Μιχαήλ Κουππάρης, Καθηγητής ΕΚΠΑ

ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Μιχαήλ Κουππάρης, Καθηγητής ΕΚΠΑ

Ελένη Αρχοντάκη, Επίκουρος Καθηγήτρια ΕΚΠΑ

Νικόλαος Θωµαΐδης, Επίκουρος Καθηγητής ΕΚΠΑ

ΑΘΗΝΑ

ΣΕΠΤΕΜΒΡΙΟΣ 2012

(4)
(5)

ΠΕΡΙΛΗΨΗ

Στην παρούσα ερευνητική εργασία παρουσιάζεται η ανάπτυξη µιας µεθόδου υγροχρωµατογραφίας υψηλής απόδοσης αντίστροφης φάσης ιοντικών ζευγών για τον προσδιορισµό του ρανελικού στροντίου. Το ρανελικό στρόντιο, 5-[(2-οξειδο-2-οξοαιθυλ)αµινο]-4-κυανο-3-(2-οξειδο-2-οξοαιθυλ)θειοφαιν-2- καρβοξυλικό διστρόντιο), είναι το οργανικό άλας του στροντίου µε το ρανελικό οξύ, αποτελούµενο από δύο άτοµα σταθερού στροντίου και θεωρείται ότι είναι το πρώτο από µία νέα κατηγορία φαρµάκων που έχει αποδείξει την ικανότητά του στη µείωση του κινδύνου κατάγµατος σε µετεµµηνοπαυσιακές γυναίκες, οστεοπενικές ή οστεοπορωτικές. Το ρανελικό στρόντιο αυξάνει, τόσο το σχηµατισµό των οστών, όσο και µειώνει την οστική επαναρρόφηση, µε αποτέλεσµα την εξισορρόπηση του µεταβολισµού των οστών, ευνοώντας το σχηµατισµό των οστών. Η αντιοστεοπορωτική του δράση αποδείχθηκε µε ένα εκτεταµένο πρόγραµµα προκλινικών και κλινικών µελετών για τη θεραπεία της οστεοπόρωσης. Μία νέα µέθοδος υγροχρωµατογραφίας, χρησιµοποιώντας αντιδραστήρια ζεύγους ιόντων αναπτύχθηκε και επικυρώθηκε. Μελετήθηκε ένας αριθµός αντιδραστηρίων ζεύγους ιόντων, η συγκέντρωσή τους, το pH της κινητής φάσης, η ταχύτητα ροής και η παρουσία οργανικών τροποποιητών για τη βελτιστοποίηση της µεθόδου. Επιπλέον, περιγράφεται η διεξαγωγή εξαναγκασµένων µελετών αποικοδόµησης, σύµφωνα µε το πρωτόκολλο επικύρωσης.

ΘΕΜΑΤΙΚΗ ΠΕΡΙΟΧΗ: Φαρµακευτική ανάλυση

ΛΕΞΕΙΣ ΚΛΕΙΔΙΑ: ρανελικό στρόντιο, HPLC, αντιδραστήρια ζεύγους ιόντων, οστεοπόρωση, επικύρωση, εξαναγκασµένες µελέτες αποικοδόµησης

(6)

ABSTRACT

In the present Τhesis we describe the development of a new reversed-phase ion pair high-performance liquid chromatographic method for the determination of strontium ranelate. Strontium ranelate, (distrontium 5-[bis(2- oxido-2-oxoethyl)amino]-4-cyano-3-(2-oxido-2-oxoethyl)thiophene-2-

carboxylate), is the organic salt of ranelic acid with two atoms of stable strontium and is regarded to be the first of a new class of drugs which has demonstrated its ability to reduce fracture risk in postmenopausal women, osteopenic or osteoporotic. Strontium ranelate, both increases bone formation and reduces bone resorption, resulting in a rebalance of bone turnover in favor of bone formation. Its antiosteoporotic action was demonstrated by an extensive program of preclinical and clinical studies for the treatment of osteoporosis. A new liquid chromatographic method, using ion-pairing reagents has been developed and validated. A number of ion-pair reagents, their concentration, the pH of the mobile phase, flow-rate and the presence of organic modifiers have been studied for the optimization of the method. In addition, the conduction of forced degradation studies is reported, in accordance with the validation protocol.

SUBJECT AREA: Pharmaceutical analysis

KEYWORDS: strontium ranelate, HPLC, ion-pair reagents, osteoporosis, validation, forced degradation studies

(7)

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ

Για τη διεκπεραίωση της παρούσας ερευνητικής εργασίας, ήθελα να ευχαριστήσω τον επιβλέποντα καθηγητή Μιχαήλ Κουππάρη, καθώς και τις υποψήφιες διδάκτορες, Αικατερίνη Γκρεµιλογιάννη και Θεοδώρα Παπακονδύλη, για τη συνεργασία και την πολύτιµη συµβολή τους στην ολοκλήρωσή της.

(8)

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ

ΠΡΟΛΟΓΟΣ ... 12

ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΥΓΡΟΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΨΗΛΗΣ ΑΠΟΔΟΣΗΣ (HPLC) .... 14

Η χρωµατογραφία στο φαρµακευτικό κόσµο ... 14

1.1 Εισαγωγή στην HPLC ... 15

1.2 Αρχή της τεχνικής ... 15

1.3 Οργανολογία ενός συστήµατος HPLC ... 16

1.4 Βασικές χρωµατογραφικές παράµετροι ... 17

1.5 Είδη υγροχρωµατογραφίας ... 19

1.6 1.6.1 Χρωµατογραφία κατανοµής κανονικής φάσης (Normal Phase, NP) 21 1.6.2 Χρωµατογραφία κατανοµής αντίστροφης φάσης (Reversed Phase, RP) 22 1.6.3 Χρωµατογραφία ιοντικών ζευγών (Ion Pair) ... 22

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ΡΑΝΕΛΙΚΟ ΣΤΡΟΝΤΙΟ (STRONTIUM RANELATE) ... 26

2.1 Γνωριµία µε το ρανελικό στρόντιο ... 26

2.2 Οστεοπόρωση ... 27

2.3 Οστική ρύθµιση – οστική ανακατασκευή ... 30

2.3.1 Δίκτυο οστεοκλαστικής ρύθµισης RANKL - OPG ... 30

2.4 Θεραπεία οστεοπόρωσης ... 31

2.5 Μηχανισµός δράσης ρανελικού στροντίου ... 32

2.6 Αποτελεσµατικότητα του ρανελικού στροντίου ... 34

2.6.1 Χορήγηση και ασφάλεια του ρανελικού στροντίου ... 35

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ΕΞΑΝΑΓΚΑΣΜΕΝΕΣ ΜΕΛΕΤΕΣ ΑΠΟΙΚΟΔΟΜΗΣΗΣ (FORCED DEGRADATION STUDIES) ... 37

Εισαγωγή ... 37 3.1

(9)

Ορισµοί ... 38

3.2 Φύση των µελετών – Προβλεπτικές ή Καθοριστικές; ... 39

3.3 Πειραµατικός σχεδιασµός ... 41

3.4 Εξαναγκασµένες µελέτες αποικοδόµησης στο ρανελικό στρόντιο 3.5 43 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΚΑΙ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΑΝΑΛΥΤΙΚΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ 44 Αξιολόγηση ... 44

4.1 4.1.1 Ακρίβεια (Accuracy) ... 45

4.1.2 Πιστότητα (Precision) ... 46

4.1.3 Ευαισθησία (Sensitivity) ... 47

4.1.4 Εκλεκτικότητα (Selectivity) / Ειδικότητα (Specificity) ... 48

4.1.5 Αντοχή (Ruggedness) και Ανθεκτικότητα (Robustness) ... 48

4.1.6 Άλλες παράµετροι ... 49

Επικύρωση Μεθόδου ... 49

4.2 4.2.1 Ειδικότητα (Specificity) / Εκλεκτικότητα (Selectivity) ... 51

4.2.2 Γραµµικότητα (Linearity) ... 53

4.2.3 Περιοχή Συγκεντρώσεων (Range) ... 55

4.2.4 Όριο Ανίχνευσης / Όριο Ποσοτικοποίησης (LOD / LOQ) ... 56

4.2.5 Ακρίβεια (Accuracy) ... 57

4.2.6 Πιστότητα (Precision) ... 59

4.2.7 Αντοχή Μεθόδου (Ruggedness) ... 61

4.2.8 Ανθεκτικότητα Μεθόδου (Robustness) ... 61

4.2.9 Έλεγχος Καταλληλότητας Συστήµατος (System Suitability Test) . 62 4.2.10 Έλεγχος Χρωµατογραφικών Μεθόδων ... 62

ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟΣ ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ - ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ ... 65

(10)

Χρωµατογραφικό σύστηµα ... 65 5.1

Αναλυτική στήλη ... 65 5.2

Συσκευή παραγωγής νερού υψηλής καθαρότητας ... 65 5.3

Αναλυτικός ζυγός ... 65 5.4

Συσκευή υπερήχων ... 66 5.5

Πεχάµετρο ... 66 5.6

Συσκευή διήθησης κινητής φάσης ... 66 5.7

Υλικά αναφοράς ... 66 5.8

Διαλύτες – Αντιδραστήρια ... 67 5.9

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6 ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΤΗΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ... 68 Κατεργασία δείγµατος ... 68 6.1

6.1.1 Έλεγχος διαλυτότητας ... 68 6.1.2 Επιλογή µέσου διάλυσης ... 69 Κινητή φάση ... 69 6.2

6.2.1 Πειράµατα κινητής φάσης ... 69 6.2.2 Επίδραση αντιδραστηρίου ζεύγους ιόντων στο χρόνο ανάσχεσης ...

72

6.2.3 Επίδραση pH στο χρόνο ανάσχεσης ... 73 6.2.4 Επίδραση της σύστασης της κινητής φάσης στο χρόνο ανάσχεσης

74

6.2.5 Επιλογή κινητής φάσης ... 75 Επιλογή χρωµατογραφικών παραµέτρων για την προς

6.3

επικύρωση µέθοδο ... 75

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7 ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΜΕΘΟΔΟΥ ΠΟΣΟΤΙΚΟΥ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΡΑΝΕΛΙΚΟΥ ΣΤΡΟΝΤΙΟΥ (STRONTIUM RANELATE) ... 77

Επιλογή χρωµατογραφικών παραµέτρων ... 77 7.1

Παρασκευή διαλυµάτων ... 77 7.2

(11)

7.2.1 Πρότυπο διάλυµα ρανελικού στροντίου (Standard solution) ... 77

7.2.2 Διάλυµα ελέγχου (Test solution) ... 78

7.2.3 Πρότυπο διάλυµα παρακαταθήκης (Standard stock solution) ... 78

7.2.4 Διάλυµα εικονικού φαρµάκου (Placebo) ... 78

Ποσοτικός προσδιορισµός ... 79

7.3 Επικύρωση ... 79

7.4 7.4.1 Ειδικότητα ... 79

7.4.2 Γραµµικότητα ... 80

7.4.3 Εύρος ... 81

7.4.4 Πιστότητα ... 81

7.4.5 Ακρίβεια ... 83

7.4.6 Ανθεκτικότητα ... 84

7.4.7 Έλεγχος καταλληλότητας συστήµατος ... 84

Αποτελέσµατα ... 85

7.5 7.5.1 Ειδικότητα ... 85

7.5.2 Γραµµικότητα / Εύρος / Πιστότητα συστήµατος ... 85

7.5.3 Πιστότητα ... 88

7.5.4 Ακρίβεια ... 89

7.5.5 Ανθεκτικότητα ... 91

7.5.6 Έλεγχος καταλληλότητας συστήµατος ... 93

Συµπέρασµα ... 94

7.6 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 8 ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΜΕΘΟΔΟΥ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΣΥΓΓΕΝΩΝ ΟΥΣΙΩΝ ΚΑΙ ΠΑΡΑΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΤΟΥ ΡΑΝΕΛΙΚΟΥ ΣΤΡΟΝΤΙΟΥ ... 95

Επιλογή χρωµατογραφικών παραµέτρων ... 95

8.1 Παρασκευή διαλυµάτων ... 96

8.2 8.2.1 Διάλυµα ελέγχου (Test solution) ... 96

(12)

8.2.2 Διάλυµα αναφοράς 0.2% (Reference solution) ... 96

8.2.3 Πρότυπο διάλυµα παρακαταθήκης των προσµίξεων Α και Β (Standard stock solution of impurity A and impurity B) ... 96

Ποσοτικός προσδιορισµός ... 96

8.3 Επικύρωση ... 97

8.4 8.4.1 Ειδικότητα ... 97

8.4.2 Γραµµικότητα ... 98

8.4.3 Εύρος ... 99

8.4.4 Παράγοντας σχετικής απόκρισης (Relative response factor) ... 99

8.4.5 Πιστότητα ... 99

8.4.6 Ακρίβεια ... 101

8.4.7 Όριο ανίχνευσης ... 102

8.4.8 Όριο ποσοτικοποίησης ... 102

8.4.9 Ανθεκτικότητα ... 102

8.4.10 Έλεγχος καταλληλότητας συστήµατος ... 103

Αποτελέσµατα ... 103

8.5 8.5.1 Ειδικότητα ... 103

8.5.2 Γραµµικότητα / Εύρος / Πιστότητα συστήµατος ... 105

8.5.3 Παράγοντας σχετικής απόκρισης (RRF) ... 110

8.5.4 Πιστότητα ... 110

8.5.5 Ακρίβεια ... 112

8.5.6 Όριο ανίχνευσης (DL) ... 114

8.5.7 Όριο ποσοτικοποίησης (QL) ... 115

8.5.8 Ανθεκτικότητα ... 116

8.5.9 Έλεγχος καταλληλότητας συστήµατος ... 121

Συµπέρασµα ... 121 8.6

(13)

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9 ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ ΚΑΙ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΕΞΑΝΑΓΚΑΣΜΕΝΩΝ

ΜΕΛΕΤΩΝ ΑΠΟΙΚΟΔΟΜΗΣΗΣ ... 122

Παρασκευή διαλυµάτων ... 122

9.1 Εφαρµογή ακραίων συνθηκών ... 123

9.2 Αποτελέσµατα εξαναγκασµένων µελετών αποικοδόµησης ... 123

9.3 9.3.1 Υδρολυτική αποικοδόµηση ... 123

9.3.2 Οξειδωτική αποικοδόµηση ... 124

9.3.3 Θερµική αποικοδόµηση ... 124

Συµπεράσµατα ... 124

9.4 ΠΙΝΑΚΑΣ ΟΡΟΛΟΓΙΑΣ ... 127

Συντµήσεις – Αρκτικόλεξα – Ακρωνύµια ... 130

ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Ι ... 132

ΑΝΑΦΟΡΕΣ ... 133

(14)

ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΣΧΗΜΑΤΩΝ

Σχήµα 2.1: Η χηµική δοµή του ρανελικού στροντίου ... 27  

Σχήµα 2.2: Συχνότητα εµφάνισης σπονδυλικών και καταγµάτων ισχύου και καρπού σε γυναίκες άνω των 50 ετών ... 30  

Σχήµα 2.3: Μηχανισµός δράσης του ρανελικού στροντίου ... 33  

Σχήµα 7.4: Γραφική παράσταση της καµπύλης βαθµονόµησης για το ρανελικό ανιόν ... 87

Σχήµα 7.5: Γραφική παράσταση υπολοίπων για το ρανελικό ανιόν ... 87  

Σχήµα 8.1: Πρόσµιξη Α ... 95

Σχήµα 8.2: Πρόσµιξη Β ... 95

Σχήµα 8.3: Γραφική παράσταση της καµπύλης βαθµονόµησης για την πρόσµιξη Α ... 106

Σχήµα 8.4: Γραφική παράσταση υπολοίπων για την πρόσµιξη Α ... 107

Σχήµα 8.5: Γραφική παράσταση της καµπύλης βαθµονόµησης για την πρόσµιξη Β ... 109  

Σχήµα 8.6: Γραφική παράσταση υπολοίπων για την πρόσµιξη Β ... 109

(15)

ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΠΙΝΑΚΩΝ

Πίνακας 1.1: Σηµαντικές χρωµατογραφικές πειραµατικές ποσότητες...18  

Πίνακας 1.2: Σηµαντικές παράγωγες ποσότητες και σχέσεις τους...19  

Πίνακας 1.3: Τύποι διαχωρισµού και µηχανισµοί κατακράτησης...20  

Πίνακας 1.4: Αντιδραστήρια ζεύγους ιόντων και χρωµατογραφικές παράµετροι που χρησιµοποιήθηκαν για το ρανελικό στρόντιο...25  

Πίνακας 3.1: Συνθήκες που χρησιµοποιούνται συνήθως στην εξαναγκασµένη αποικοδόµηση ... 42  

Πίνακας 6.1: Επίδραση αντιδραστηρίου ζεύγους ιόντων στον παράγοντα και στο χρόνο ανάσχεσης και στη διαχωριστότητα………...73

Πίνακας 6.2: Επίδραση του οργανικού τροποποιητή στον παράγοντα και στο χρόνο κατακράτησης………....74

Πίνακας 7.1: Αποτελέσµατα γραµµικότητας για το ρανελικό ανιόν…………...85

Πίνακας 7.2: Αποτελέσµατα πιστότητας για το ρανελικό ανιόν……….88

Πίνακας 7.3: Αποτελέσµατα ακρίβειας για το ρανελικό ανιόν………....89

Πίνακας 7.4: Παράγοντες ανθεκτικότητας……….91

Πίνακας 7.5: Συνθήκες και πειράµατα ανθεκτικότητας………...91

Πίνακας 7.6: Αποτελέσµατα ανθεκτικότητας για το ρανελικό ανιόν…………..92

Πίνακας 7.7: Σταθερότητα διαλυµάτων (1 ηµέρα στους 25 °C) για το ρανελικό ανιόν………....93

Πίνακας 8.1: Χρόνοι ανάσχεσης………...104

Πίνακας 8.2: Αποτελέσµατα γραµµικότητας για την πρόσµιξη Α…………....105

Πίνακας 8.3: Αποτελέσµατα γραµµικότητας για την πρόσµιξη Β…………....107

Πίνακας 8.4: Παράγοντας σχετικής απόκρισης………..110

Πίνακας 8.5: Αποτελέσµατα πιστότητας για την πρόσµιξη Α…...…………...110

Πίνακας 8.6: Αποτελέσµατα πιστότητας για την πρόσµιξη Β...111

Πίνακας 8.7: Αποτελέσµατα ακρίβειας για την πρόσµιξη A...113

Πίνακας 8.8: Αποτελέσµατα ακρίβειας για την πρόσµιξη Β...114

Πίνακας 8.9: Παράγοντες ανθεκτικότητας...116

(16)

Πίνακας 8.10: Συνθήκες και πειράµατα ανθεκτικότητας ...116 Πίνακας 8.11: Αποτελέσµατα ανθεκτικότητας για την πρόσµιξη Α...117 Πίνακας 8.12: Αποτελέσµατα ανθεκτικότητας για την πρόσµιξη Β...118

Πίνακας 8.13: Σταθερότητα διαλυµάτων (1 ηµέρα στους 25 °C) για την

πρόσµιξη Α...120

Πίνακας 8.14: Σταθερότητα διαλυµάτων (1 ηµέρα στους 25 °C) για την

πρόσµιξη Β...120

Πίνακας 9.1: Συνθήκες και αποτελέσµατα εξαναγκασµένων µελετών

αποικοδόµησης...125

Πίνακας 1: Πίνακας ορολογίας µε τις αντιστοιχίσεις των ελληνικών και

ξενόγλωσσων όρων ...127 Πίνακας 2: Ακρωνύµια και ανάπτυξή τους...130

(17)

ΠΡΟΛΟΓΟΣ

Η παρούσα ερευνητική εργασία διενεργήθηκε στα πλαίσια του µεταπτυχιακού προγράµµατος «Χηµική Ανάλυση – Έλεγχος Ποιότητας» στο Διαπιστευµένο κατά ISO/IEC 17025, Εργαστήριο Αναλυτικής Χηµείας «Χηµική Ανάλυση – Έλεγχος Ποιότητας» στο Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήµιο Αθηνών, υπό την καθοδήγηση του καθηγητή Μιχαήλ Κουππάρη.

(18)

ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

(19)

1 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1

ΥΓΡΟΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΨΗΛΗΣ ΑΠΟΔΟΣΗΣ (HPLC) Η χρωµατογραφία στο φαρµακευτικό κόσµο [1]

1.1

Στη σύγχρονη φαρµακευτική βιοµηχανία, η υγροχρωµατογραφία υψηλής απόδοσης (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) είναι το κυριότερο και το πιο αναπόσπαστο αναλυτικό εργαλείο που εφαρµόζεται σε όλα τα στάδια της φαρµακευτικής ανακάλυψης, ανάπτυξης και παραγωγής. Η ανάπτυξη νέων χηµικών ενώσεων περιλαµβάνει δύο κύριες δραστηριότητες:

την ανακάλυψη και την ανάπτυξη φαρµάκων. Ο στόχος του προγράµµατος ανακάλυψης νέων φαρµάκων είναι να διερευνήσει µία πληθώρα ενώσεων, χρησιµοποιώντας γρήγορες µεθόδους ελέγχου, που οδηγεί σε µία γενιά πρόδροµων ενώσεων (lead compounds) και στη συνέχεια, περιορίζει την επιλογή µέσω στοχευµένης σύνθεσης και επιλεκτικής βελτιστοποίησης. Αυτό οδηγεί στην τελική επιλογή των πιο δυνητικά βιώσιµων θεραπευτικών υποψήφιων ενώσεων, που οδηγούνται κατόπιν στην ανάπτυξη των φαρµάκων. Η κύρια δραστηριότητα της ανάπτυξης φαρµάκων είναι ο πλήρης χαρακτηρισµός των υποψήφιων ενώσεων, µέσω της µελέτης του µεταβολισµού των φαρµάκων, του προκλινικού και κλινικού ελέγχου, καθώς και των κλινικών δοκιµών. Ταυτόχρονα µε τη διαδικασία ανάπτυξης του φαρµάκου, εκτελείται και η διαδικασία βελτιστοποίησης της σύνθεσης του φαρµάκου, η οποία τελικά οδηγεί σε µία αξιόπιστη και ανθεκτική παραγωγική διαδικασία για τη δραστική φαρµακευτική ουσία και το φαρµακευτικό προϊόν.

Καθ΄όλη τη διάρκεια της ανακάλυψης και ανάπτυξης φαρµάκων, αναπτύσσονται ανθεκτικές, αναλυτικές µέθοδοι διαχωρισµού HPLC, οι οποίες προσαρµόζονται από κάθε οµάδα ανάπτυξης (πρώιµη ανακάλυψη φαρµάκων, µεταβολισµός φαρµάκων, φαρµακοκινητική, έρευνα διαδικασίας, σύνθεση και παρασκευή). Σε κάθε φάση της ανάπτυξης, πραγµατοποιούνται αναλύσεις ενός µεγάλου αριθµού δειγµάτων για τον έλεγχο και την παρακαλούθηση της ποιότητας των µελλοντικών υποψήφιων φαρµάκων, εκδόχων και τελικών προϊόντων. Η αποτελεσµατική και γρήγορη ανάπτυξη της µεθόδου είνα ύψιστης σηµασίας σε όλο αυτό τον κύκλο ζωής ανάπτυξης του φαρµάκου, γεγονός που απαιτεί κατανόηση σε βάθος των αρχών και της

(20)

θεωρίας της HPLC για τη δηµιουργία ενός γερού θεµελίου για την εκτίµηση των διαφόρων µεταβλητών, οι οποίες βελτιστοποιούνται κατά τη διάρκεια γρήγορης και αποτελεσµατικής ανάπτυξης µεθόδου HPLC και βελτιστοποίησης.

Εισαγωγή στην HPLC [2-5]

1.2

Η υγροχρωµατογραφία υψηλής απόδοσης είναι µία αναλυτική τεχνική διαχωρισµού µε θεµελιώδη σηµασία για το σύγχρονο επιστήµονα που απαιτεί αναλύσεις µε ακρίβεια, ταχύτητα και λογικό κόστος. Χρησιµοποιείται για να διαχωριστούν ουσίες µε παραπλήσιες χηµικές ιδιότητες, από σύνθετα µίγµατα.

Η HPLC αποτελεί προέκταση της κλασικής υγροχρωµατογραφίας και χαρακτηρίζεται από την αυξηµένη πίεση µε την οποία διαβιβάζεται η κινητή φάση µέσα από τη στατική φάση, η οποία περιέχει σωµατίδια πλήρωσης υψηλού µερισµού. Αποτέλεσµα αυτού αποτελεί το γεγονός ότι οι διαχωρισµοί αυτοί είναι ταχύτεροι, αποτελεσµατικότεροι και µπορούν να χρησιµοποιηθούν για την ποσοτικοποίηση διαφόρων ουσιών.

Αρχή της τεχνικής [2-5]

1.3

Ένα δείγµα που περιέχει περισσότερα του ενός συστατικά, διαχωρίζεται όταν εξαναγκάζεται να διέλθει από ένα σύστηµα δύο φάσεων εκ των οποίων η µία κινείται σε σχέση µε την άλλη. Για το σκοπό αυτό, το δείγµα διαλύεται σε έναν κινούµενο διαλύτη, τη λεγόµενη κινητή φάση, ο οποίος εξαναγκάζεται να διέλθει µέσω ενός ακινητοποιηµένου υλικού, τη λεγόµενη στατική φάση.

Οι δύο φάσεις επιλέγονται έτσι, ώστε τα συστατικά του δείγµατος να κατανέµονται σε διαφορετικό βαθµό µεταξύ της κινητής και της στατικής φάσης. Η κατανοµή αυτή εξαρτάται από τη σύνθεση και τις ιδιότητες της κινητής φάσης, το είδος και τις ιδιότητες της στατικής φάσης, τις διαµοριακές δυνάµεις που αναπτύσσονται µεταξύ των δύο φάσεων, καθώς και από τη θερµοκρασία.

Τα συστατικά τα οποία κατακρατούνται ισχυρότερα από τη στατική φάση κινούνται αργά κατά τη ροή της κινητής φάσης. Αντίθετα, τα συστατικά τα οποία κατακρατούνται ασθενέστερα από τη στατική φάση, κινούνται ταχύτερα.

(21)

Δηλαδή, η ταχύτητα µε την οποία θα µεταφερθεί η κάθε ουσία κατά µήκος της κινητής φάσης, είναι ανάλογη της σχετικής συγγένειας της ουσίας ως προς τις δύο φάσεις.

Αποτέλεσµα αυτών των διαφορών στην ευκινησία, είναι ότι τα συστατικά του δείγµατος διαχωρίζονται καταλαµβάνοντας το καθένα ξεχωριστές ζώνες. Το µέγεθος της αρχικής ζώνης, η οποία περιέχει π.χ. δύο αναλύτες, είναι σηµαντικά µικρότερο από το µέγεθος και των δύο ζωνών κατά τη στιγµή της έκλουσης, επειδή ο διαχωρισµός των ουσιών συνοδεύεται πάντα και από την αραίωσή τους. Αποµόνωση των ουσιών επιτυγχάνεται µε το πέρασµα αρκετής ποσότητας κινητής φάσης µέσω της στήλης, ώστε να βγει η κάθε ζώνη από την έξοδο της στήλης. Είναι προφανές, ότι οι ουσίες που κατακρατούνται ασθενέστερα εκλούονται νωρίτερα, ενώ οι ουσίες που κατακρατούνται ισχυρότερα εκλούονται αργότερα.

Οργανολογία ενός συστήµατος HPLC [1]

1.4

Ως συνέπεια των υψηλών πιέσεων που δηµιουργούνται, η οργανολογία της HPLC είναι πολυπλοκότερη και δαπανηρότερη από την οργανολογία άλλων ειδών χρωµατογραφίας. Τα κύρια τµήµατα ενός υγροχρωµατογράφου υψηλής απόδοσης είναι τα παρακάτω:

Φιάλες διαλυτών. Αποθήκευση επαρκούς ποσότητας διαλυτών HPLC για τη συνεχή λειτουργία του συστήµατος. Μπορούν να είναι απευθείας συνδεδεµένες µε σύστηµα απαέρωσης και ειδικά φίλτρα που αποµονώνουν το διαλύτη από την επίδραση του περιβάλλοντος.

Αντλία. Είναι το µέσο που εξασφαλίζει τη σταθερή και συνεχή ροή της κινητής φάσης µέσω του συστήµατος. Οι περισσότερες σύγχρονες αντλίες επιτρέπουν την ελεγχόµενη ανάµιξη διαφορετικών διαλυτών από διαφορετικές φιάλες.

Σύστηµα εισαγωγής δείγµατος. Γίνεται η εισαγωγή (injection) του µίγµατος αναλυτών στη ροή της κινητής φάσης πριν µπει στη στήλη. Τα περισσότερα συστήµατα εισαγωγής δείγµατος είναι αυτόµατοι δειγµατολήπτες, οι οποίοι επιτρέπουν προγραµµατισµένες εισαγωγές διαφορετικών όγκων δείγµατος, που εγχύονται από τα φιαλίδια (vials) που βρίσκονται στο δίσκο του αυτόµατου δειγµατολήπτη.

(22)

Αναλυτική στήλη. Είναι η καρδιά του συστήµατος HPLC. Στην πραγµατικότητα προκαλεί το διαχωρισµό των αναλυτών στο µίγµα. Η στήλη είναι το σηµείο όπου η κινητή φάση έρχεται σε επαφή µε τη στατική, σχηµατίζοντας µία διεπιφάνεια µε πολύ µεγάλο εµβαδό. Το µεγαλύτερο µέρος της εξέλιξης της χρωµατογραφίας τα τελευταία χρόνια, είχε ως αντικείµενο το σχεδιασµό πολλών διαφορετικών τρόπων για την ενίσχυση αυτής της διεπιφανειακής επαφής.

Ανιχνευτής. Είναι µία συσκευή για τη συνεχή καταγραφή συγκεκριµένων φυσικών (µερικές φορές και χηµικών) ιδιοτήτων των αναλυτών. Ο πιο κοινός ανιχνευτής που χρησιµοποιείται στη φαρµακευτική ανάλυση είναι ο ανιχνευτής απορρόφησης υπεριώδους (UV), ο οποίος επιτρέπει τον έλεγχο και τη συνεχή καταγραφή της απορρόφησης της υπεριώδους ακτινοβολίας σε ένα επιλεγµένο µήκος κύµατος ή σε µία περιοχή µηκών κύµατος (πολυδιαυλική ανίχνευση, ανιχνευτές σειράς φωτοδιόδων, DAD). Η εµφάνιση του αναλύτη στην κυψελίδα του ανιχνευτή προκαλεί αλλαγή στην απορρόφηση. Αν ο αναλύτης απορροφά περισσότερο από το υπόβαθρο (κινητή φάση), λαµβάνεται θετικό σήµα.

Καταγραφέας – σύστηµα ελέγχου και επεξεργασίας αποτελεσµάτων. Είναι ένα ηλεκτρονικό σύστηµα που βασίζεται σε ηλεκτρονικό υπολογιστή, ελέγχει όλες τις παραµέτρους του υγροχρωµατογράφου υψηλής απόδοσης (ανάµιξη διαφορετικών διαλυτών, θερµοκρασία, πίεση, συχνότητα ενέσεων κ.ά.), λαµβάνει δεδοµένα από τον ανιχνευτή και ελέγχει και παρακολουθεί την απόδοση του συστήµατος (συνεχής παρακολούθηση της σύνθεσης της κινητής φάσης, της πίεσης, της θερµοκρασίας κ.ά.).

Βασικές χρωµατογραφικές παράµετροι [6]

1.5

Αν θεωρήσουµε πως έχουµε µια προσδιοριζόµενη ουσία Α, µετά την εισαγωγή του δείγµατος στη στήλη, η ουσία Α θα µερισθεί µεταξύ της κινητής και της στατικής φάσης σύµφωνα µε την ισορροπία που ακολουθεί:

𝐴! ⇌ 𝐴! (1.1)

όπου ΑΜ είναι η ουσία στην κινητή φάση και ΑS είναι η ουσία στη στατική φάση. Η διαδικασία αυτή χαρακτηρίζεται από την αντίστοιχη σταθερά ισορροπίας Κ για την οποία είναι γνωστό ότι ισχύει:

(23)

𝐾=!!!

! (1.2)

όπου CS είναι η γραµµοµοριακή συγκέντρωση της ουσίας Α στη στατική φάση και CΜ η γραµµοµοριακή συγκέντρωση της ουσίας Α στην κινητή φάση. Η σταθερά Κ ονοµάζεται σταθερά κατανοµής της ουσίας Α.

Πίνακας 1.1: Σηµαντικές χρωµατογραφικές πειραµατικές ποσότητες

Ποσότητα Σύµβολο της πειραµατικής ποσότητας

Χρόνος µετανάστευσης µη κατακρατούµενης

ουσίας tM

Χρόνοι κατακράτησης ουσιών Α και Β (tR)A, (tR)B

Εύρη κορυφών Α και Β WA, WB

Μήκος πληρωµένης στήλης L

Ταχύτητα ροής F

Όγκος στατικής φάσης VS

Συγκεντρώσεις αναλύτη στην κινητή και στη

στατική φάση CM, CS

(24)

Πίνακας 1.2: Σηµαντικές παράγωγες ποσότητες και σχέσεις τους

Ποσότητα Υπολογισµός της παράγωγης

ποσότητας Σχέση µε άλλες ποσότητες

Γραµµική ταχύτητα

κινητής φάσης 𝑢=𝐿/𝑡!

Όγκος κινητής φάσης 𝑉!=𝑡!  𝐹

Παράγοντας

κατακράτησης 𝑘′=(𝑡!𝑡!)/𝑡! 𝑘′=𝐾𝑉!/𝑉! Σταθερά κατανοµής 𝐾=𝑘!𝑉!/𝑉! 𝐾=𝐶!/𝐶!

Παράγοντας

εκλεκτικότητας 𝛼=(𝑡!)!𝑡!

(𝑡!)!𝑡! 𝛼=𝑘!!

𝑘!! =𝐾! 𝐾!

Διαχωριστική ικανότητα (Διαχωριστικότητα)

𝑅! =2[(𝑡!)!(𝑡!)!]

𝑊!+𝑊! 𝑅! = 𝑁 4

𝛼1 𝛼

𝑘!! 1+𝑘!!

Αριθµός θεωρητικών

πλακών 𝑁 =16(𝑡! 𝑊)! 𝑁=16𝑅!! 1

𝛼1

! 1+𝑘!! 𝑘!!

!

Ύψος ισοδύναµο προς

θεωρητική πλάκα 𝐻 =𝐿/𝑁

Χρόνος κατακράτησης (𝑡!)!=16𝑅!!𝐻 𝑢

𝛼 𝛼1

!(1+𝑘!!)! (𝑘!!)!

Είδη υγροχρωµατογραφίας 1.6

Το είδος και η ονοµασία της εφαρµοζόµενης χρωµατογραφίας, καθορίζεται κυρίως από τη φύση του πληρωτικού υλικού. Οι βασικές τεχνικές και οι αντίστοιχοι µηχανισµοί κατακράτησης αναφέρονται στον πίνακα 1.3. Το κύριο χαρακτηριστικό που καθορίζει την ταυτότητα κάθε τεχνικής, είναι ο τύπος των µοριακών αλληλεπιδράσεων που χρησιµοποιούνται. Υπάρχουν τρεις βασικοί τύποι µοριακών δυνάµεων: ιοντικές δυνάµεις (χρωµατογραφία

(25)

ιονανταλλαγής), πολικές δυνάµεις (χρωµατογραφία κατανοµής κανονικής φάσης) και δυνάµεις διασποράς (χρωµατογραφία κατανοµής αντίστροφης φάσης).

Πίνακας 1.3: Τύποι διαχωρισµού και µηχανισµοί κατακράτησης Τύπος Διαχωρισµού Μηχανισµός Κατακράτησης

Υγρο-στερεοχρωµατογραφία προσρόφησης

(Liquid-solid adsorption chromatography)

Επιφανειακή προσρόφηση µε βάση την πολικότητα

Υγρο-υγροχρωµατογραφία

(Liquid- liquid

chromatography)

Κατανοµή µεταξύ των φάσεων ή αλληλεπιδράσεις προσρόφησης µεταξύ ουσίας και πολικής-δεσµευµένης φάσης

Ιοντοανταλλαγή (Ion exchange)

Αλληλεπιδράσεις µεταξύ των ιόντων της ουσίας και ιονοφόρων οµάδων δεσµευµένων στη στήλη

Ιοντικών ζευγών (Ion pair)

Κατανοµή ουδέτερων ζευγών ιόντων µεταξύ των φάσεων

Αποκλεισµός µεγέθους (Size exclusion)

Διαχωρισµός µε βάση τον υδροδυναµικό όγκο

Χειροµορφία (Chiral)

Διαστερεοϊσοµερικές αλληλεπιδράσεις µεταξύ εναντιοµερών της κινητής φάσης και χειραλικών θέσεων της στήλης

(26)

Συγγένεια (Affinity)

Εξειδικευµένη σύνδεση µε ακινητοποιηµένο υποκαταστάτη

1.6.1 Χρωµατογραφία κατανοµής κανονικής φάσης (Normal Phase, NP)

[1]

Η HPLC κανονικής φάσης διερευνά τις διαφορές στη δύναµη των πολικών αλληλεπιδράσεων των αναλυτών στο µίγµα µε τη στατική φάση. Όσο πιο ισχυρή είναι η αλληλεπίδραση του αναλύτη µε τη στατική φάση, τόσο περισσότερο κατακρατείται ο αναλύτης. Όπως συµβαίνει µε κάθε υγροχρωµατοφραγική τεχνική, η NP HPLC είναι µία ανταγωνιστική διαδικασία. Τα µόρια του αναλύτη αναταγωνίζονται τα µόρια της κινητής φάσης ως προς τα σηµεία προσρόφησης στην επιφάνεια της στατικής φάσης.

Όσο ιχυρότερες είναι οι αλληλεπιδράσεις της κινητής φάσης µε τη στατική, τόσο ασθενέστερες είναι οι αλληλεπιδράσεις της στατικής φάσης µε τον αναλύτη και, εποµένως, τόσο µικρότερη η κατακράτηση του αναλύτη.

Οι κινητές φάσεις στην NP HPLC είναι µη πολικοί διαλύτες (εξάνιο, επτάνιο κ.ά.) µε µία µικρή προσθήκη πολικού τροποποιητή (µεθανόλη, αιθανόλη κ.ά.).

Μεταβολή της συγκέντρωσης του πολικού τροποποιητή στην κινητή φάση επιτρέπει τον έλεγχο της κατακράτησης του αναλύτη στη στήλη. Τυπικά πολικά πρόσθετα είναι οι αλκοόλες (µεθανόλη, αιθανόλη ή ισοπροπανόλη), οι οποίες προστίθενται στην κινητή φάση σε σχετικά µικρές ποσότητες. Εφόσον οι δυνάµεις που επικρατούν είναι κυρίως πολικές και αυτές οι δυνάµεις είναι σχετικά ισχυρές, συνήθως αρκεί µεταβολή του πολικού τροποποιητή σε ποσοστό 1% v/v, για να οδηγήσει σε σηµαντική αλλαγή στο χρόνο κατακράτησης του αναλύτη.

Η επιλογή του κατάλληλου τύπου HPLC εξαρτάται από τη διαλυτότητα του αναλύτη σε συγκεκριµένες κινητές φάσεις. Εφόσον στην HPLC κανονικής φάσης χρησιµοποιούνται κυρίως µη πολικοί διαλύτες, επιλέγεται ως χρωµατογραφική τεχνική για τον προσδιορισµό εξαιρετικά υδρόφοβων ενώσεων, οι οποίες είναι αδιάλυτες σε πολικούς ή υδατικούς διαλύτες.

(27)

1.6.2 Χρωµατογραφία κατανοµής αντίστροφης φάσης (Reversed Phase, RP) [1]

Σε αντίθεση µε την HPLC κανονικής φάσης, στη χρωµατογραφία αντίστροφης φάσης, επικρατούν κυρίως δυνάµεις διασποράς (υδροφοβικές ή αλληλεπιδράσεις Van der Waals). Οι πολικότητες της κινητής και στατικής φάσης αντιστρέφονται έτσι, ώστε η επιφάνεια της στατικής φάσης στην RP HPLC να είναι υδρόφοβη και η κινητή φάση πολική, για την οποία χρησιµοποιούνται κυρίως υδατικά διαλύµατα.

Η HPLC αντίστροφης φάσης είναι µακράν το πιο δηµοφιλές είδος χρωµατογραφίας. Σχεδόν το 90% των αναλύσεων δειγµάτων µικρού µοριακού βάρους, πραγµατοποιούνται µε την RP HPLC. Ένας από τους βασικούς µοχλούς για την τεράστια δηµοτικότητά της, είναι η ικανότητά της να διαχωρίζει ενώσεις που σχετίζονται άµεσα και η ευκολία της διακύµανσης στην κατακράτηση και στην εκλεκτικότητα.

1.6.3 Χρωµατογραφία ιοντικών ζευγών (Ion Pair) [1,7-10]

Στην HPLC αντίστροφης φάσης µε υδατικά/οργανικά υγρά έκλουσης, οι ιοντικές αλληλεπιδράσες παίζουν πάντα ένα σηµαντικό ρόλο όσον αφορά στην κατακράτηση του αναλύτη, στην ενυδάτωση, στην ιοντική ισορροπία και σε άλλες διαδικασίες.

Η κινητή φάση αποτελείται από ένα υδατικό διάλυµα (συν ένα πρόσθετο οργανικό διαλύτη, όπως είναι η µεθανόλη ή το ακετονιτρίλιο) και ένα πρόσθετο αντισταθµιστικό ιόν (counter-ion), αντίθετου φορτίου από αυτό του αναλύτη. Για παράδειγµα, για το διαχωρισµό µιας οµάδας καρβοξυλικών οξέων, χρησιµοποιώντας µία κινητή φάση ρυθµισµένη σε pH 7.0 έτσι, ώστε όλες οι ενώσεις του δείγµατος να βρίσκονται στη µορφή RCOO-, το αντισταθµιστικό ιόν που µπορεί να χρησιµοποιηθεί είναι το ιόν του τετραβουτυλοαµµωνίου (tetrabutyl ammonium ion, Bu4N+ ή TBA+). Η εισαγωγή αµφίφιλων και λυόφιλων ιόντων στην κινητή φάση προκαλεί την προσρόφησή τους στην υδρόφοβη επιφάνεια του πληρωτικού υλικού, µε αποτέλεσµα τη µετατροπή της σε µία ψευδοϊονανταλλακτική επιφάνεια. Έτσι, δηµιουργούνται ιοντικές αλληλεπιδράσεις µε τους φορτισµένους αναλύτες

(28)

στην κινητή φάση και µε τα αντισταθµιστικά ιόντα, που µπορεί να απορροφηθούν στην επιφάνεια της στατικής φάσης.

Τα αµφίφιλα ιόντα είναι συνήθως µόρια µε σχετικά µεγάλη αλκυλική αλυσίδα και µία φορτισµένη οµάδα στη µία άκρη. Οι ουσίες αυτές είναι επιφανειοδραστικές και διαθέτουν πλήρως εντοπισµένο φορτίο. Στο χρωµατογραφικό σύστηµα, αυτά τα µόρια συσσωρεύονται στη διεπιφάνεια µεταξύ της υδρόφοβης στατικής φάσης και του υδατικού/οργανικού υγρού έκλουσης. Προσανατολίζονται στη διεπιφάνεια έτσι, ώστε το φορτισµένο µέρος του µορίου να παραµένει στο υγρό έκλουσης και το υδρόφοβο µέρος (αλκυλική αλυσίδα) να προσροφάται στην επιφάνεια της στατικής φάσης.

Έτσι, σχηµατίζεται µία φορτισµένη επιφάνεια και το περίσσειο φορτίο της επιφάνειας πρέπει να αντισταθµίζεται από τα συσσωρευµένα στην κινητή φάση αντισταθµιστικά ιόντα, στο πλησιέστερο σηµείο της επιφάνειας, σχηµατίζοντας την αντίστοιχη ηλεκτρική διπλή στιβάδα.

Για την περιγραφή της επίδρασης των ιοντικών προσθέτων της κινητής φάσης στην κατακράτηση των φορτισµένων αναλυτών, φαινοµενικά δύο διαφορετικοί µηχανισµοί µπορούν να αποδωθούν. Πρώτον, ο σχηµατισµός του ζεύγους ιόντων ανάµεσα στον αναλύτη και στο αµφίφιλο αντισταθµιστικό ιόν, µε επακόλουθη προσρόφηση αυτού του σύνθετου µορίου στη στατική φάση, και δεύτερον, η προσρόφηση του ίδιου του αµφίφιλου αντισταθµιστικού ιόντος στην επιφάνεια της στατικής φάσης και επακόλουθη κατακράτηση του φορτισµένου αναλύτη, ουσιαστικά, µε ιονανταλλαγή. Στην πραγµατικότητα, κατά πάσα πιθανότητα, και οι δύο µηχανισµοί συνυπάρχουν στο χρωµατογραφικό σύστηµα. Ο σχηµατισµός του ζεύγους ιόντων οφείλεται µόνο σε αλληλεπιδράσεις εξωτερικής σφαίρας και δε σχηµατίζεται κανένας χηµικός δεσµός.

Στην πράξη, η χρήση των αντιδραστηρίων ζεύγους ιόντων (ion pair reagents), συνιστάται συνήθως ως ύστατη λύση για το διαχωρισµό εξαιρετικά υδρόφιλων ιόντων, που δεν µπορούν να µετατοπιστούν από το νεκρό όγκο µε κανένα άλλο µέσο (αλλαγή του pH της κινητής φάσης, του τύπου της στήλης, της συγκέντρωσης του οργανικού τροποποιητή). Ο λόγος για την προσεκτική χρήση µιας τόσο ισχυρής µεθόδου ειδικής εκλεκτικότητας και ρύθµισης κατακράτησης, είναι η επακόλουθη, µη αναστρέψιµη προσρόφηση των

(29)

αντιδραστηρίων ζεύγους ιόντων στην επιφάνεια του υλικού αντίστροφης φάσης. Ο βαθµός της κατακράτησης των ιοντισµένων διαλυµένων ουσιών είναι ευθέως ανάλογος της πυκνότητας του επιφανειακού φορτίου, που παράγεται από την προσρόφηση του αντισταθµιστικού ιόντος. Η ποσότητα του αντιδραστηρίου ζεύγους ιόντων, συγκεκριµένης συγκέντρωσης στην κινητή φάση, που προσροφάται στην επιφάνεια, εξαρτάται από την υδροφοβικότητα του αλκυλικού τµήµατος του αντιδραστηρίου ζεύγους ιόντων.

Είναι λογικό να αναµένεται ότι µε την αύξηση της συγκέντρωσης του αντιδραστηρίου ζεύγους ιόντων η κατακράτηση των αντίθετα φορτισµένων αναλυτών αυξάνεται, ενώ όµοια φορτισµένοι αναλύτες µε το αντιδραστήριο ζεύγους ιόντων εκλούονται γρηγορότερα.

Υπάρχει µία πληθώρα αντιδραστηρίων ζεύγους ιόντων: άλατα του αµµωνίου, όπως τετραµεθυλο-, τετρααιθυλο-, τετραπροπυλο-, τετραβουτυλο-αµµωνίου (αυτά πρέπει να είναι σε µορφή υδροξειδίου για να καταστέλλεται η ανίχνευση της αγωγιµότητας), υδροχλωρικά, υπερχλωρικά και υπερφθοριωµένα καρβοξυλικά οξέα, πεντανο-, εξανο-, επτανο-, και οκτανο-σουλφονικά οξέα, διαιθυλαµίνη, τριαιθυλαµίνη, τρι-βουτυλαµίνη, πεντυλαµίνη, εξυλαµίνη κ.ά.

Στον πίνακα 1.4 φαίνεται η επίδραση των αντιδραστηρίων ζεύγους ιόντων (διαιθυλαµίνη, εξυλαµίνη, υδροξείδιο του τετραβουτυλοαµµωνίου, υδροξείδιο του τετραµεθυλαµµωνίου, βρωµιούχο τετραβουτυλοαµµώνιο) σε σχέση µε το χρόνο κατακράτησης και τον παράγοντα κατακράτησης για τον αναλύτη ρανελικό στρόντιο, που µελετήθηκε στην παρούσα εργασία. Στο πειραµατικό µέρος υπάρχει αναλυτική περιγραφή για τις συγκεντρώσεις των αντιδραστηρίων ζεύγους ιόντων και τη σύσταση της κινητής φάσης.

(30)

Πίνακας 1.4: Αντιδραστήρια ζεύγους ιόντων

και χρωµατογραφικές παράµετροι που χρησιµοποιήθηκαν για το ρανελικό στρόντιο

Αντιδραστήριο ζεύγους ιόντων tR

(min) k’

Διαιθυλαµίνη 2,5 0,28

Εξυλαµίνη 7,9 2,59

Υδροξείδιο του τετραβουτυλοαµµωνίου 11,6 3,96 Υδροξείδιο του τετραµεθυλοαµµωνίου 2,8 2,12 Βρωµιούχο τετραβουτυλοαµµώνιο 9,4 3,02

(31)

2 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

ΡΑΝΕΛΙΚΟ ΣΤΡΟΝΤΙΟ (STRONTIUM RANELATE)

2.1 Γνωριµία µε το ρανελικό στρόντιο [11-13]

Το ρανελικό στρόντιο αποτελεί µία νέα επιλογή για τη θεραπεία και πρόληψη της οστεοπόρωσης. Ανήκει σε µία καινούρια θεραπευτική κατηγορία, αφού είναι ο µόνος αντιοστεοπορωτικός παράγοντας που δρα και στις δύο φάσεις της οστικής ανακατασκευής ταυτόχρονα. Αποδείχθηκε ότι επιδρά, τόσο στους οστεοκλάστες, αναστέλλοντας την οστική επαναρρόφηση, όσο και στους οστεοβλάστες, προάγοντας την οστική παραγωγή.

Η χηµική ονοµασία του ρανελικού στροντίου είναι 5-[(2-οξειδο-2- οξοαιθυλ)αµινο]-4-κυανο-3-(2-οξειδο-2-οξοαιθυλ)θειοφαιν-2-καρβοξυλικό διστρόντιο. Το ενεργό στοιχείο του ρανελικού στροντίου, είναι το χηµικό στοιχείο στρόντιο, Sr, του περιοδικού πίνακα, µε ατοµικό αριθµό 38 και ατοµικό βάρος 87, το οποίο ανήκει µαζί µε το µαγνήσιο, το ασβέστιο, το βάριο και το ράδιο στις αλκαλικές γαίες. Η ονοµασία του προέρχεται από το όνοµα της πόλης Strontian της Σκωτίας, όπου ανακαλύφθηκε στα ορυχεία και αναγνωρίστηκε ως νέο στοιχείο από τον A. Crawford το 1790. Αποµονώθηκε ως µέταλλο από τον Sir Humphry Davy (Αγγλία, 1808) µε ηλεκτρολυτική µέθοδο. Μία συνηθισµένη δίαιτα περιέχει 1-3 mg στροντίου/ηµερησίως.

Τροφές που υπερτερούν σε περιεκτικότητα στροντίου είναι: τα σιτηρά, τα όσπρια, τα λαχανικά και τα µπαχαρικά. Λόγω των ιδιοτήτων του να συγκεντρώνεται στα οστά, χρησιµοποιήθηκε τη δεκαετία του 1950 στη θεραπεία της οστεοπόρωσης και πιο πρόσφατα το ραδιενεργό στρόντιο-89 για οστικές κακοήθειες. Γρήγορα όµως εγκαταλήφθηκε για τη θεραπεία τη οστεοπόρωσης, καθώς παρατηρήθηκαν οστικά ελλείµµατα και οστεοµαλακία σε άτοµα που λάµβαναν στρόντιο. Αυτό ήταν αποτέλεσµα της µεγάλης δόσης και ελαττωµένης διατροφικής πρόσληψης ασβεστίου και βιταµίνης D.

Το ρανελικό στρόντιο αποτελείται από 2 άτοµα σταθερού στροντίου και 1 µόριο ρανελικού οξέος (οργανικό µόριο-φορέας) (Σχήµα 2.1). Το στοιχειακό στρόντιο αποτελεί το 34% του βάρους όλου του µορίου, µε αποτέλεσµα κάθε δόση 2 g ρανελικού στροντίου να παρέχει 680 mg στοιχειακού στροντίου. Το ρανελικό στρόντιο κατά τη διάλυσή του στο νερό (διαλύονται 800 mg/L 25 °C)

(32)

διίσταται πλήρως. Οι τιµές του pKa είναι: 4,8 (pKa1), 3,6 (pKa2), 2,9 (pKa3), 2,0 (pKa4) και 1,5 (pKa5). Επιτρέπει ποσοστό γαστρεντερικής απορρόφησης του στροντίου κατά 27%.

Λόγω της ικανότητάς του να δρα ως φορέας 2 ατόµων στροντίου, της καλής βιοδιαθεσιµότητάς του, της υψηλής διαλυτότητάς του και της χαµηλής τοξικότητάς του, το άλας αυτό επιλέχθηκε και, στη συνέχεια, αξιολογήθηκε από ένα εκτεταµένο πρόγραµµα προκλινικών και κλινικών µελετών, ανάµεσα από πολλά άλλα άλατα για τη θεραπεία της οστεοπόρωσης.

 

   

Σχήµα 2.1: Η χηµική δοµή του ρανελικού στροντίου

2.2 Οστεοπόρωση [11,14,15]

Η οστεοπόρωση είναι µία χρόνια πάθηση του µεταβολισµού των οστών, κατά την οποία παρατηρείται σταδιακή µείωση της πυκνότητας και ποιότητάς τους, µε αποτέλεσµα αυτά µε την πάροδο του χρόνου να γίνονται πιο εύθραυστα και λεπτά. Η οστεοπόρωση ορίζεται ως η κατάσταση όπου η οστική πυκνότητα (BMD) της σπονδυλικής στήλης ή του ισχίου είναι τουλάχιστον 2,5 SD χαµηλότερη από τη µέση τιµή ενός υγιούς νέου πληθυσµού. Με τη µετεµµηνοπαυσιακή οστεοπόρωση έχει συνδεθεί ένας αριθµός παραγόντων κινδύνου, συµπεριλαµβανοµένων της χαµηλής οστικής µάζας, της χαµηλής οστικής πυκνότητας σε µεταλλικά στοιχεία, της πρόωρης εµµηνόπαυσης, του ιστορικού καπνίσµατος και του οικογενειακού ιστορικού οστεοπόρωσης. Η κλινική συνέπεια της οστεοπόρωσης είναι τα κατάγµατα. Ο κίνδυνος για κατάγµατα αυξάνεται όσο αυξάνεται ο αριθµός των παραγόντων κινδύνου. Η οστεοπόρωση είναι µία χρόνια νόσος του οστίτη ιστού, η οποία συνοδεύεται από ρήξη της µικροαρχιτεκτονικής δοµής των οστών.

Η αντοχή του οστού προσδιορίζεται από τη σύνθεση και τη δοµή του υλικού του. Παρά το γεγονός ότι η οστική πυκνότητα είναι ένας σηµαντικός

Referências

Documentos relacionados

Με δεδομένο ότι η Τοπική Αυτοδιοίκηση συνιστά φορέα τοπικής δημοκρατίας, και μάλιστα άμεσης, είναι εύλογο οι εκλογές για την ανάδειξη των αρχών της να έχουν σημασία για τις τοπικές