και χαρακτηριστικών «υπογραφών» τους, με χρήση profile hidden Markov models

ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ

Μ.Δ.Ε ΒΙΟΠΛΗΡΟΦΟΡΙΚΗΣ

Δημιουργία βάσης δεδομένων των πρωτεϊνών του χορίου των λεπιδοπτέρων

και χαρακτηριστικών «υπογραφών» τους, με χρήση profile hidden Markov models

ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΝΙΚΟΛΑΟΣ Γ. ΓΙΑΝΝΟΠΟΥΛΟΣ

A.M.298009

ΑΘΗΝΑ 2011

1

Εξεταστική Επιτροπή:

1) Καθηγητής κ. Σταυρός Χαμόδρακας Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Αθηνών

2) Επίκουρος Καθηγητής κ. Παντελής Μπάγκος Τμήμα Πληροφορικής με Εφαρμογές στην Βιοιατρική 3) Δρ. Ιωάννης Μιχαλόπουλος

Ίδρυμα Ιατροβιολογικών Ερευνών της Ακαδημίας Αθηνών

2

3

4

Περίληψη

Τα αμυλοειδή είναι εξωκυτταρικές εναποθέσεις αδιαλύτων πρωτεϊνικών ινιδίων, προερχομένων από διαλυτές πρωτεΐνες ή πεπτίδια, όταν αυτά αυτοσυγκροτούνται κατά ανώμαλο τρόπο, προκαλώντας δυσλειτουργία κυττάρων και ιστών, με αποτέλεσμα την πρόκληση αμυλοειδώσεων, όπως η νόσος του Alzheimer, ο διαβήτης τύπου 2, οι σπογγώδεις εγκεφαλοπάθειες, κλπ. Ωστόσο, και υγιείς οργανισμοί φαίνεται να παράγουν δομές αμυλοειδών ινιδίων, οι οποίες συντελούν σε πλήθος διαφορετικών φυσιολογικών λειτουργιών και αναγκών των οργανισμών αυτών. Οι πρωτεΐνες του χορίου των λεπιδοπτέρων ανήκουν σε αυτά τα φυσικά προστατευτικά αμυλοειδή και για αυτό το λόγο μελετώνται η δομή και οι ιδιότητες αυτών των πρωτεϊνών στο εργαστήριο Βιοφυσικής και Βιοπληροφορικής του Πανεπιστημίου Αθηνών, με σκοπό να αποκαλυφθούν οι κανόνες οι οποίοι, διέπουν τη δημιουργία και λειτουργία τους.

Οι πρωτεΐνες του χορίου παρουσιάζουν στην αλληλουχία τους τριμερή δομή, αποτελούμενη από την κεντρική περιοχή και δύο βραχίονες εκατέρωθεν αυτής. Η κεντρική περιοχή παρουσιάζει υψηλή συντήρηση και βάσει αυτής, οι πρωτεΐνες του χορίου κατηγοριοποιούνται σε οικογένειες, εκ των οποίων οι συχνότερες είναι η οικογένεια Α και Β. Στη παρούσα εργασία, για την δημιουργία των προτύπων των κεντρικών περιοχών χρησιμοποιήθηκαν Κρυφά Μαρκοβιανά Πρότυπα, στα οποία και βασίστηκε η εξόρυξη όλων των πρωτεϊνών του χορίου μέσα από βάσεις δεδομένων.

Στόχος αυτής της διπλωματικής εργασίας ήταν να συγκεντρωθούν και να οργανωθούν στη σχεσιακή βάση δεδομένων ChorionDB, όλες οι πρωτεΐνες του χορίου ομαδοποιημένες στις οικογένειες Α και Β.

Λέξεις κλειδιά: Χόριο, Πρωτεΐνες, HMM, Λεπιδόπτερα, Σχεσιακή Βάση Δεδομένων.

5

Abstract

Amyloids are extracellular insoluble protein fibril deposits, derived from soluble proteins or peptides, when they self-assemble in an anomalous way, causing cell and tissue dysfunction, and resulting in amyloidoses, such as Alzheimer's Disease, Diabetes Type 2, Spongiform Encephalopathies, etc. However, even healthy organisms seem to produce amyloid fibril structures which contribute to many different physiological functions and needs of these organizations. Chorion proteins of Lepidoptera belong to these natural protective amyloids and for that reason, the structure and properties of these proteins are studied in the laboratory of Biophysics and Bioinformatics, University of Athens, in order to uncover the rules that govern their formation and function.

Chorion proteins show a tripartite sequence structure which consists of a central region and two flanking arms. The central region is highly conserved and based on this, chorion proteins are classified into families, mostly A and B. In this study, Hidden Markov Models were used to create central region profiles, on which the mining of all chorion proteins from databases, was based.

The aim of this dissertation was to gather and organize all chorion proteins of lepidoptera, grouped in A and B families, in ChorionDB relational database.

Keywords: Chorion, Proteins, HMM, Lepidoptera, Relational Database

6

Ευχαριστίες

Η δημιουργία της ChorionDB πραγματοποιήθηκε παράλληλα στον Τομέα Βιολογίας Κυττάρου και Βιοφυσικής του Πανεπιστημίου Αθηνών και στο Ίδρυμα Ιατροβιολογικών Ερευνών της Ακαδημίας Αθηνών (ΙΙΒΕΑΑ).

Ευχαριστώ πολύ τον Καθ. κ. Σ. Ι. Χαμόδρακα που μου έδειξε εμπιστοσύνη για την ανάθεση του θέματος, αλλά και για το χρόνο που αφιέρωσε για την καθοδήγησή μου στα πλαίσια του Μ.Δ.Ε Βιοπληροφορικής του Πανεπιστημίου Αθηνών. Επίσης ευχαριστώ θερμά τον Δρ. Ι. Μιχαλόπουλο από το ΙΙΒΕΑΑ, υπό του οποίου την επίβλεψη και διαρκή καθοδήγηση επετεύχθησαν οι στόχοι της διπλωματικής μου εργασίας, άλλα και γιατί κατάφερε να μου εμφυσήσει την μεθοδολογία της έρευνας πάνω στη Βιοπληροφορική με τον καλύτερο δυνατό τρόπο.

Κατά τη διεξαγωγή της διπλωματικής μου εργασίας, είχα την πολύτιμη βοήθεια της Δρ. Β. Α. Οικονομίδου και του Δρ. Ν. Παπανδρέου, τους οποίους ευχαριστώ, όπως και εξαιρετικής σημασίας ήταν η συνεργασία με όλους τους συναδέλφους μου από το ΜΔΕ Βιοπληροφορικής από τους οποίους αποκόμισα ένα πλήθος γνώσεων, ενώ παράλληλα δημιούργησα και καλές φιλίες.

Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω τους γονείς και την αδερφή μου που μου συμπαραστάθηκαν με αναντικατάστατο τρόπο κατά τη διάρκεια των σπουδών μου.

7

Π

1 . ΕΙΣΑΓΩΓΉ ... 9

1.1 ΛΕΠΙΔΌΠΤΕΡΑ _ 9

1.2 ΑΥΓΆ ΛΕΠΙΔΟΠΤΈΡΩΝ _14

1.3 ΧΌΡΙΟ ΛΕΠΙΔΟΠΤΈΡΩΝ _16

1.4 ΕΛΙΚΟΕΙΔΉΣ ΑΡΧΙΤΕΚΤΟΝΙΚΉ ΧΟΡΊΟΥ _17 1.5 ΤΟ ΧΌΡΙΟ ΩΣ ΒΙΟΛΟΓΙΚΌ ΑΝΆΛΟΓΟ ΤΩΝ ΧΟΛΗΣΤΕΡΙΚΏΝ ΥΓΡΏΝ ΚΡΥΣΤΆΛΛΩΝ

____________________________________________________________19

1.6 ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΤΟΥ ΧΟΡΊΟΥ _22

1.7 ΑΜΥΛΟΕΙΔΉ -ΑΜΥΛΟΕΙΔΏΣΕΙΣ _25

1.8 ΦΥΣΙΚΆ ΠΡΟΣΤΑΤΕΥΤΙΚΆ ΑΜΥΛΟΕΙΔΉ _27 2 . ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΊΑ ... 31

2.1 ΣΥΛΛΟΓΉ ΑΜΙΝΟΞΙΚΏΝ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΏΝ ΑΠΌ ΔΙΑΔΙΚΤΥΑΚΈΣ ΒΆΣΕΙΣ

ΔΕΔΟΜΈΝΩΝ _31

2.2 ΚΡΥΦΆ ΜΑΡΚΟΒΙΑΝΆ ΠΡΌΤΥΠΑ _34

2.2.1 ΑΝΑΓΝΏΡΙΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΏΝ ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΏΝ ΜΕ ΚΡΥΦΆ

ΜΑΡΚΟΒΙΑΝΆ ΠΡΌΤΥΠΑ ... 34 2.2.2 ΠΡΌΓΡΑΜΜΑ ΑΝΆΛΥΣΗΣ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΏΝ HMMER ... 38 2.2.3 ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΉ ΣΗΜΑΝΤΙΚΌΤΗΤΑ ΚΑΙ ΔΙΌΡΘΩΣΗ BONFERRONI ... 44 2.3 ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΌΣ ΦΥΣΙΚΟΧΗΜΙΚΏΝ ΙΔΙΟΤΉΤΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΏΝ _46

2.3.1 ΜΟΡΙΑΚΌ ΒΆΡΟΣ ΠΡΩΤΕΪΝΏΝ ... 46 2.3.2 ΙΣΟΗΛΕΚΤΡΙΚΌ ΣΗΜΕΊΟ ΠΡΩΤΕΪΝΏΝ ... 46 2.4 ΤΕΧΝΟΛΟΓΊΑ ΑΝΆΠΤΥΞΗΣ ΤΩΝ ΔΙΑΔΙΚΤΥΑΚΏΝ ΕΡΓΑΛΕΊΩΝ _50 2.5 ΜΈΘΟΔΟΙ ΚΑΙ ΕΡΓΑΛΕΊΑ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΊΑΣ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΏΝ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΏΝ ΚΑΙ

ΔΟΜΏΝ _52

2.5.1 ΠΟΛΛΑΠΛΉ ΣΤΟΊΧΙΣΗ ΤΩΝ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΏΝ ... 52 2.5.2 ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΊΑ ΠΟΛΛΑΠΛΏΝ ΣΤΟΙΧΊΣΕΩΝ ... 52 2.5.3 ΔΕΝΔΡΟΕΙΔΉΣ ΜΟΡΦΟΠΟΊΗΣΗ NEWICK ... 53

8

2.5.4 ΠΡΌΓΡΑΜΜΑ ΟΠΤΙΚΟΠΟΊΗΣΗΣ PΗΜΜ ΚΑΙ ΠΟΛΛΑΠΛΏΝ

ΣΤΟΙΧΊΣΕΩΝ ... 54

2.5.5 ΑΠΕΙΚΌΝΙΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΏΝ ΔΟΜΏΝ ... 54

3 . ΑΝΆΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΠΑΡΟΥΣΊΑΣΗ ΕΡΓΑΛΕΊΩΝ ... 55

3.1 HMMWEB TOOL _55 3.1.1 ΕΎΡΕΣΗ ΟΜΌΛΟΓΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΏΝ ... 55

3.1.2 ΕΎΡΕΣΗ ΟΜΌΛΟΓΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΏΝ ΣΤΟ HMMWEBTOOL ... 56

3.1.3 ΜΟΡΦΉ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΆΤΩΝ ΑΝΑΖΉΤΗΣΗΣ ΟΜΌΛΟΓΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΏΝ ΤΟΥ HMMWEB TOOL ... 60

3.1.4 ΕΦΑΡΜΟΓΉ ΑΝΆΛΥΣΗΣ ΠΡΩΤΕΩΜΆΤΩΝ «FILTER» ... 63

3.2 CHORIONDB _69 3.2.1 ΔΗΜΙΟΥΡΓΊΑ ΠΟΛΛΑΠΛΏΝ ΣΤΟΙΧΊΣΕΩΝ ΚΑΙ PHMMS ΓΙΑ ΤΙΣ ΟΙΚΟΓΈΝΕΙΕΣ Α ΚΑΙ Β ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΏΝ ΤΟΥ ΧΟΡΊΟΥ ΛΕΠΙΔΟΠΤΈΡΩΝ. ... 69

3.2.2 ΑΡΧΙΤΕΚΤΟΝΙΚΉ ΤΗΣ CHORIONDB ... 76

3.2.3 ΠΑΡΟΥΣΊΑΣΗ ΤΗΣ CHORIONDB ... 79

4 . ΑΠΟΤΕΛΈΣΜΑΤΑ ... 89

4.1 ΠΕΡΙΠΤΩΣΙΟΛΟΓΙΚΉ ΜΕΛΈΤΗ NFAT ΚΑΙ NF-ΚB 89 4.2 ΑΠΟΤΕΛΈΣΜΑΤΑ ΑΝΑΖΉΤΗΣΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΏΝ ΤΟΥ ΧΟΡΊΟΥ ΤΩΝ ΛΕΠΙΔΟΠΤΈΡΩΝ _______________________________________________________93 4.2.1 ΠΛΉΡΩΣΗ ΒΆΣΗΣ ΔΕΔΟΜΈΝΩΝ ... 93

4.2.2 ΑΠΟΤΕΛΈΣΜΑΤΑ ΑΝΑΖΉΤΗΣΗΣ ΣΤΗΝ UNIPROTKB ... 95

4.2.3 ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΤΙΚΆ ΑΠΟΤΕΛΈΣΜΑΤΑ ... 101

5 . ΣΥΖΉΤΗΣΗ ... 108

5.1 HMMWEB TOOL 108 5.2 NFAT ΚΑΙ NF-ΚB 109 5.3 ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΤΟΥ ΧΟΡΊΟΥ ΤΗΣ CHORIONDB 112 6 . ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΊΑ ... 123

9

1 Εισαγωγή

1.1 Λεπιδόπτερα

Η τάξη των λεπιδοπτέρων ανήκει στην ομοταξία των εντόμων του φύλου των αρθροπόδων. Η μοναδική προσαρμοστικότητα των εντόμων σε κάθε περιβάλλον και τα πλεονεκτήματα που τους προσφέρει, τόσο η κατασκευή τους, όσο και ο κύκλος ζωής τους, τα οδήγησε στο να έχουν την απόλυτη κυριαρχία σε ποσοτική αναλογία συγκριτικά με άλλα taxa (Εικόνα 1-1), ενώ η ποικιλία των ειδών τους είναι ασύγκριτη. Η παρουσία των λεπιδοπτέρων στη Γη είναι αδιάλειπτη, τουλάχιστον τα τελευταία 200 εκατομμύρια χρόνια, αφού οι έρευνες προσδιορίζουν τα πρώτα απολιθώματά τους να έρχονται από την Ιουρασική περίοδο (Resh and Cardé, 2003).

Εικόνα 1-1: Αναπαράσταση της ποσοτικής αναλογίας ανάμεσα σε διάφορες ομάδες οργανισμών. Το μέγεθος των οργανισμών αντικατοπτρίζει το πλήθος των ειδών της κάθε ομάδας. Παρατηρούμαι ότι τα έντομα αντιστοιχούν στο άθροισμα όλων των υπόλοιπων ομάδων μαζί.

Παράλληλα, και τα Καρκινοειδή εκπροσωπούνται από πολλά είδη. Τα

10 Αρθρόποδα αποτελούν πάνω από το 80% όλων των καταγεγραμμένων ζωντανών ειδών σήμερα, με το εύρος των μεγεθών τους να ποικίλει από τους πλαγκτονικούς οργανισμούς έως τα γιγάντια καβούρια της Ιαπωνίας M. kaempferi, των οποίων η έκταση των ποδιών φτάνει τα 3.8 μέτρα

Τα λεπιδόπτερα είναι μια από τις μεγαλύτερες τάξεις των εντόμων με 174,250 καταγεγραμμένα είδη, τα οποία ανήκουν σε 126 διαφορετικές οικογένειες, ενώ οι εκτιμήσεις που συμπεριλαμβάνουν και τα μη καταγεγραμμένα είδη από περιοχές που δεν έχουν εξαντληθεί οι έρευνες, όπως ο Αμαζόνιος στην Νότια Αμερική, φτάνει τις 350,000. Θεωρείται ότι η σχέση εξάρτησης που έχουν τα λεπιδόπτερα με τα επίσης πλούσια σε αριθμό και ποικιλία ανθοφόρα φυτά, όπως τα αγγειόσπερμα, έχει παίξει βασικό ρόλο στην εξάπλωση και ποικιλομορφία τους. Οι σκώροι και οι πεταλούδες που ανήκουν στα πιο οικεία και εύκολα αναγνωρίσιμα έντομα στον άνθρωπο, συνιστούν την τάξη των λεπιδοπτέρων. Τα λεπιδόπτερα διαθέτουν μεγάλη ικανότητα προσαρμογής σε ποικίλα περιβάλλοντα, γεγονός που έχει οδηγήσει στην εξάπλωσή τους σε όλους σχεδόν τους γνωστούς βιότοπους. Το πεδίο δράσης τους είναι ευρύ και ο ρόλος τους πολύπλευρος, καθώς συμμετέχουν σε ζητήματα που σχετίζονται με την οικολογία (επικονίαση των φυτών), την οικονομία (παραγωγή μεταξιού, φθορές στη γεωργική παραγωγή) και την υγεία (μετάδοση μολυσματικών ασθενειών) (Resh and Cardé, 2003).

Τα λεπιδόπτερα ξεχωρίζουν από μια σειρά είκοσι και πλέον χαρακτηριστικών, εκ των οποίων ένα από τα πιο προφανή και αυτό το οποίο ενέπνευσε τον C. Linnaeus, το 1775, να τους προσδώσει το όνομα τους (λεπίς + πτερόν), είναι τα μικροσκοπικά λέπια (λέπυρα) που επικαλύπτουν τα φτερά τους. Τα αλληλεπικαλυπτόμενα λεπιδόμορφα λέπια, με την γκάμα των χρωμάτων που μπορούν να φέρουν, περιβάλλουν το σώμα και τα φτερά των λεπιδοπτέρων με εξαιρετικά μεγάλη ποικιλία χρωματικών συνδυασμών και σχεδίων (Εικόνα 1-2).

11 Εικόνα 1-2: Στα λέπια (αριστερά), οφείλονται το όνομα και η τεράστια γκάμα χρωματικών συνδυασμών που καλύπτουν το σώμα και τα φτερά των λεπιδοπτέρων, όπως του P. pavonia (δεξιά).

Όπως και τα άλλα ολομετάβολα έντομα, τα λεπιδόπτερα αναπαράγονται εγγενώς και είναι ωοτόκα, ενώ ο κύκλος ζωής τους περιλαμβάνει μια σειρά μορφολογικά διακριτών αναπτυξιακών σταδίων.

Συγκεκριμένα, διακρίνουμε τα ακόλουθα αναπτυξιακά στάδια: Αυγό

Προνύμφη Νύμφη Ενήλικο (Εικόνα 1-3). Μερικά είδη γεννάνε τα αυγά τους εν πτήση (Wiklund, 1984), ενώ τα περισσότερα λεπιδόπτερα φροντίζουν να γεννήσουν τα αυγά κοντά ή πάνω σε ένα φυτό ξενιστή, από το οποίο οι προνύμφες θα τρέφονται. Έχουν βρεθεί κάποια είδη να γεννούν τα αυγά τους στα ρούχα ή την γούνα (π.χ., οι κοινοί οικιακοί σκώροι Tineola bisselliella και Trichophaga tapetzella). Ο αριθμός των αυγών μπορεί να ποικίλλει από λίγα μόνο, μέχρι αρκετές χιλιάδες. Τα θηλυκά επιλέγουν το φυτό ξενιστή ενστικτωδώς, κατά κύριο λόγο από τα χημικά μηνύματα που λαμβάνουν από αυτά. Το αυγό καλύπτεται από ένα σκληρό προστατευτικό εξωτερικό στρώμα του κελύφους, που ονομάζεται χόριο. Η προνύμφη ή κάμπια είναι το πρώτο στάδιο στον κύκλο ζωής των λεπιδοπτέρων, μετά την εκκόλαψη τους. Τα βασικά μορφολογικά χαρακτηριστικά της προνύμφης είναι το κυλινδρικό σώμα, τα κοντά πόδια στην θωρακική περιοχή και τα ψευδοπόδια στην κοιλιακή περιοχή. Το σώμα αποτελείται από δεκατρία τμήματα, εκ των οποίων τα τρία είναι του θώρακα και δέκα είναι της κοιλιάς (Gullan and Cranston, 2010). Οι περισσότερες προνύμφες είναι φυτοφάγες, αλλά λίγες είναι σαρκοφάγες, οι οποίες τρέφονται με μυρμήγκια ή άλλες κάμπιες (Dugdale, 1996). Οι

12 προνύμφες, συνήθως, αναπτύσσονται ταχύτατα, ώστε αρκετές γενιές να αναπτύσσονται κατά τη διάρκεια του έτους. Η αύξηση τους είναι ασυνεχής, τουλάχιστον για τα σκληροποιημένα τμήματα του σώματος. Η αύξηση του μεγέθους επιτυγχάνεται με την έκδυση, μια περιοδική δημιουργία νέας επιδερμίδας μεγαλύτερης επιφάνειας και αποβολής της παλαιότερης. Κατά συνέπεια, η αύξηση της διάστασης του σώματος περιορίζεται λίγο πριν την επόμενη, αμέσως μετά την προηγούμενη έκδυση, προτού προλάβει να σκληροποιηθεί η επιδερμίδα και κατά συνέπεια να παρεμποδιστεί μηχανικά η αύξηση από τον σκληροποιημένο ιστό (Gullan and Cranston, 2010). Συχνά παρουσιάζουν μιμητισμούς, ώστε να αποτρέπουν τους πιθανούς θηρευτές και να ενισχύουν την άμυνα τους: Μερικές κάμπιες έχουν τη δυνατότητα να διογκώνουν μέρη του κεφαλιού τους και προβάλλοντας κάποιες χαρακτηριστικές βούλες στο σώμα τους μιμούνται τα μάτια και το κεφάλι φιδιών ή συχνά παράγουν δύσοσμες χημικές ουσίες καθιστώντας τα ανεπιθύμητα για πτηνά και άλλα αρπακτικά. Η προνύμφη εκδύεται από 5 έως 7 φορές, ώσπου στην τελευταία έκδυση με την βοήθεια κάποιων ορμονών που παράγει, αναπτύσσει ένα σκληρό εξωτερικό δερµάτιο περνώντας με αυτό το τρόπο στο τρίτο στάδιο, αυτό της νύμφης (χρυσαλλίδας). Ανάλογα με το είδος, αυτό το στάδιο θα το διανύσει στο εσωτερικό ενός βομβυκίου από μετάξι (κουκούλι) ή μπορεί να μην καλυφθεί καθόλου. Όλα τα εμφανή χαρακτηριστικά ενός ενήλικου, όπως οι κεραίες και τα φτερά βρίσκονται τυλιγμένα γύρω από το κεφάλι και τον θώρακα τους, εντός του δερματιού. Η χρονική διάρκεια της πλήρους ανάπτυξης από νύμφη σε ενήλικο διαφέρει από είδος σε είδος, από μερικές εβδομάδες έως και 10 μήνες. Τα περισσότερα είδη λεπιδοπτέρων δεν ζουν πολύ μετά την έκδυση, αφού χρειάζονται μερικές μόνο ημέρες για να ζευγαρώσουν και στη συνέχεια να γεννήσουν τα αυγά τους. Άλλες μπορεί να διαχειμάσουν και να περιμένουν να μπουν στην αναπαραγωγική διαδικασία, στις αρχές της άνοιξης. Ενώ τα περισσότερα λεπιδόπτερα είναι χερσαία, πολλά είδη είναι ημι-υδρόβια με όλες τις φάσεις εκτός από την ενήλικη να εμφανίζονται στο νερό (Resh and Cardé, 2003).

13 Το ενδιαφέρον αυτής της εργασίας εστιάζεται στις πρωτεΐνες που περιέχονται στο χόριο του αυγού των λεπιδοπτέρων.

Εικόνα 1-3: Σχηματική αναπαράσταση κύκλου αναπτυξιακών σταδίων λεπιδοπτέρων Αρχίζοντας από αυγό, περνάνε στην φάση της προνύμφης και στη συνεχεία της νύμφης, μέχρι τελικά να ενηλικιωθούν.

14

1.2 Αυγά λεπιδοπτέρων

Τα λεπιδόπτερα γεννούν συνήθως από 200 έως χιλιάδες αυγά, τα οποία αποθέτουν στο περιβάλλον τους (Εικόνα 1-4), αφού προηγηθεί η διαδικασία γονιμοποίησης τους. Η εμβρυϊκή ανάπτυξη των λεπιδοπτέρων σχετίζεται με τη θερμοκρασία (ταχύτερη σε υψηλότερες θερμοκρασίες), και ελέγχεται ορμονικά, καθ’ όλη την διάρκεια ανάπτυξης που διαρκεί συνήθως 7-14 ημέρες. Ωστόσο, μπορεί να αναβληθεί και για πολλές εβδομάδες ή μήνες σε είδη, που περνούν αυτό το αναπτυξιακό στάδιο σε ακραίες θερμοκρασίες χειμερινής περιόδου, ή έρχονται αντιμέτωπα με μηχανικές πιέσεις, βακτήρια και επιθέσεις ιών (Resh and Cardé, 2003). Η ισχυρή θωράκιση του αυγού αντιμετωπίζει όλες αυτές τις απειλές, αποκαλύπτοντας έτσι τις μοναδικές δυνατότητες που μπορεί να προσφέρει η δομή των αυγών, στην προστασία της ζωής των λεπιδοπτέρων.

Εικόνα 1-4: Αποτεθειμένα αυγά του λεπιδόπτερου O. cinnamomea σε στήμονες φυτών (σε λεπτομέρεια δεξιά).

Το σχήμα των αυγών των λεπιδοπτέρων είναι ελλειψοειδές και πλευρικά συμπιεσμένο. Η εξωτερική διάμετρος τους κυμαίνεται από 0.9 mm για το S. nonagrioides, 1.5 mm για το B. mori, 2.1 mm για το M. sexta μέχρι και 3 mm για το A. polyphemus. Το ξηρό βάρος τους κυμαίνεται από 40 mg για το B. mori έως και 460 mg για το A. polyphemus (Kafatos et al., 1977). Το επιφανειακό ανάγλυφο μπορεί να είναι λείο, με εγκάρσιες ή διαμήκεις αυλακώσεις ή συνδυασμό αυτών, και αποτελεί συχνά τρόπο για να χαρακτηριστούν διαφορετικές οικογένειες λεπιδοπτέρων (Hamodrakas, 1992).

15 Η δομή του αυγού των λεπιδοπτέρων αποτελείται από μια σειρά λειτουργικών στρωμάτων, υπευθύνων για ξεχωριστές ανάγκες του εμβρύου (Εικόνα 1-5). Το εξώτατο στρώμα ονομάζεται χόριο και καταλαμβάνει το μεγαλύτερο μέρος του κελύφους του αυγού. Το χόριο είναι ένα πρωτεϊνικό περίβλημα, το οποίο δημιουργεί το όριο του αυγού με το εξωτερικό περιβάλλον. Σημαντική είναι η ύπαρξη των αεροπυλών, οι οποίες διαπερνούν το χόριο και λειτουργούν ως αεραγωγοί ανταλλαγής αεριών μεταξύ του εμβρύου και του εξωτερικού περιβάλλοντος. Οι αεροπύλες καταλήγουν στην βάση του χορίου, όπου βρίσκεται η στυλοειδής στοιβάδα, η οποία διακρίνεται από μια σειρά από συγκοινωνούσες κοιλότητες γεμάτες αέρα. Τα δύο αυτά στρώματα αποτίθενται από τα μητρικά θυλακοκύτταρα. Εσωτερικά τους υπάρχει η βιτελλινική μεμβράνη, η οποία περιβάλλει το ωοκύτταρο.

Εικόνα 1-5: Σχηματική αναπαράσταση διαστρωμάτωσης κελύφους αυγού λεπιδόπτερου. Τα χαρακτηριστικά δεν είναι υπό κλίμακα. Από το εξωτερικό περιβάλλον προς το εσωτερικό του αυγού, τα στρώματα είναι:

Χόριο, Στυλοειδής Στοιβάδα (ΣΣ), Βιτελλινική Μεμβράνη (ΒΜ) και Ωοκύτταρο. Στο στρώμα του χορίου διακρίνονται και οι αεροπύλες, οι οποίες το διαπερνούν.

16

1.3 Χόριο Λεπιδοπτέρων

Βασικό συστατικό του αυγού των λεπιδοπτέρων είναι το χόριο, του οποίου το 95% της ξηρής μάζας είναι πρωτεΐνες. Αυτό το πρωτεϊνικό περίβλημα αποτελεί την εξωτερική θωράκιση του κελύφους του αυγού και σε αυτό οφείλονται οι εξαιρετικές μηχανικές, φυσικές και βιολογικές ιδιότητες που προστατεύουν το ωάριο και το αναπτυσσόμενο έμβρυο, ενώ παράλληλα του παρέχουν το κατάλληλο εσωτερικό περιβάλλον για να αναπτυχθεί (Hamodrakas, 1992).

Το χόριο, ενώ αρχικά είναι μαλακό, μετά την απόθεση των αυγών σκληραίνει ραγδαία. Σε κάποια είδη, όπως αυτό του B. mori, αξιοπρόσεκτο είναι το πολυγωνικό δίκτυο «οροσειρών» στην επιφάνεια του χορίου, το οποίο είναι αποτέλεσμα υπερέκκρισης των πρωτεϊνών του χορίου από τις μεσοκυττάριες περιοχές (Kafatos et al., 1977). Εστιάζοντας με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης στα σημεία συνένωσης των «οροσειρών», διακρίνονται οι αεροπύλες, οι οποίες λειτουργούν ως δίαυλοι μεταφοράς αερίων, απαραίτητοι για την αναπνοή και την διατήρηση κατάλληλων συνθηκών στο εσωτερικό (Εικόνα 1-6Α). Επίσης ζωτικής σημασίας είναι η ύπαρξη της μικροπύλης, μιας σχισμής διαμέσου της οποίας το σπέρμα εισέρχεται στο εσωτερικό του αυγού. Η εξωτερική πλευρά της σχισμής ξεχωρίζει διότι είναι ακτινικά και συμμετρικά περικυκλωμένη από αυλακώσεις, ενώ στη περιοχή αυτή οι αεροπύλες απουσιάζουν (Εικόνα 1-6Β). Η υπερδομή του χορίου συνίσταται σε ινώδη στρώματα παράλληλα στη επιφάνεια του χορίου (Papanicolaou et al., 1986; Smith et al., 1971).

17 Εικόνα 1-6: Φωτογραφίες χορίου. Α. Εικόνα ηλεκτρονικού μικροσκοπίου αυγού M. sexta, όπου φαίνεται η πυκνότητα των αεροπυλών στην κατατετμημένη σε πολύγωνα επιφάνεια του (Orfanidou et al., 1992). Τα λευκά βέλη στα σημεία τομής των πολυγώνων δείχνουν 2 από τις 13 αεροπύλες που περιλαμβάνονται στη φωτογραφία. Β. Εικόνα ηλεκτρονικού μικροσκοπίου σάρωσης γονιμοποιημένου αυγού A.

polyphemus. Στον άνω πόλο διακρίνεται η περιοχή της μικροπύλης (Μ) (Hamodrakas, 1992).

1.4 Ελικοειδής Αρχιτεκτονική Χορίου

Μείζονος σημασίας για τις ιδιότητες της δομής, είναι η ελικοειδής αρχιτεκτονική, όπου, όπως σε πολλές εξωκυτταρικές ινώδεις δομές στη φύση, συναντάται και στη δομή του χορίου. Σε αυτές συγκαταλέγονται το χόριο του αυγού των εντόμων και των ψαριών, το κυτταρικό τοίχωµα των φυτικών κυττάρων, οι τένοντες των σπονδυλωτών και το δερµάτιο των αρθροπόδων (Hamodrakas, 1992).

Η βασική δομή της ελικοειδούς αρχιτεκτονικής του χορίου, αποτελείται από στρώσεις παράλληλων φύλλων πρωτεϊνικών ινιδίων. Τα φύλλα αποτελούνται από ινίδια, τα οποία είναι σχεδόν παράλληλα μεταξύ τους σχηματίζοντας έτσι ένα επίπεδο. Μεταξύ διαδοχικών φύλλων, η διεύθυνση των ινιδίων στρέφεται σταδιακά κατά σταθερή γωνία περιστροφής, με αποτέλεσμα να δημιουργείται μια ελικοειδής δομή (Bouligand, 1972) (Εικόνα 1-7Α). Αξιοπερίεργο είναι το γεγονός ότι η δημιουργούμενη έλικα είναι, σε όλα τα μελετημένα συστήματα ελικοειδούς

0.4mm

18 αρχιτεκτονικής, αριστερόστροφη. Ως βήμα της έλικας ορίζεται η απόσταση ανάμεσα στα επίπεδα, όπου τα ινίδια έχουν στραφεί κατά 360°. Επομένως ανά 180° στροφής των ινιδίων η έλικα διανύει μισό βήμα, δηλαδή τα ινίδια του ανώτερου και του κατώτερου επιπέδου βρίσκονται σε αντιπαράλληλη διεύθυνση. Ένα έλασμα (lamella) αντιστοιχεί στην συνολική περιστροφή των ινιδίων κατά 180°, δηλαδή αποτελεί τη διαστρωματωμένη δομή, η οποία περιλαμβάνεται στο μισό του βήματος της έλικας (Εικόνα 1-7Β).

(Hamodrakas, 1992).

Εικόνα 1-7: Α. Σχηματική αναπαράσταση παράλληλων φύλλων ινιδίων, τα οποία στρέφονται υπό σταθερή γωνία. Β. Λοξή τομή ελικοειδούς δομής (αντιστοιχεί στη σκιασμένη επιφάνεια της εικόνας Α). Παρατηρούνται τοξοειδή επαναλαμβανόμενα πρότυπα ανά 180° περιστροφής των ινιδίων, επισημαίνοντας παράλληλα τα επίπεδα τα οποία συναποτελούν ένα έλασμα. Γ. Τρισδιάστατη απεικόνιση τομής ελικοειδούς δομής στρωμάτων ινιδίων. Τα παραβολοειδή τόξα, τα οποία σχηματίζονται, αποτελούν και βασικό χαρακτηριστικό αναγνώρισης αυτού του είδους της δομής για τους ερευνητές.

Τέμνοντας το χόριο πλαγίως ως προς την επιφάνειά του, το χόριο, παρατηρούνται ελασματοειδείς δομές (Εικόνα 1-8Β). Κάθε έλασμα φαίνεται να αποτελείται από συνεχόμενα παραβολοειδή τόξα. Ωστόσο και τα ελάσματα και τα τόξα αυτά είναι οφθαλμαπάτη. Το φαινόμενο αυτό δημιουργείται εξαιτίας της αλλαγής στη διεύθυνση των ινιδίων, από επίπεδο σε επίπεδο. Απόδειξη για την πλαστή υπόσταση των ελασμάτων

19 αποτελεί το γεγονός ότι αυξάνοντας τη γωνία µε την οποία κόβονται οι τομές, προκύπτουν ελάσματα μικρότερου πάχους, δηλαδή ελάσματα µε μικρότερη περιοδικότητα εμφάνισης.

Εικόνα 1-8: Α. Εικόνα Ηλεκτρονικού Μικροσκοπίου Σάρωσης (SEM) αυγού B. mori. B. Εικόνα Ηλεκτρονικού Μικροσκοπίου Διέλευσης (TEM) τομής χορίου B. mori. Σε αυτή τη φωτογραφία παρατηρούνται τα χαρακτηριστικά παραβολοειδή τόξα που σχηματίζονται και τα οποία υποδηλώνουν την ύπαρξη ελικοειδούς δομής στη κατασκευή του χορίου (Hamodrakas, 1992; Papanicolaou et al., 1986).Το κάθε έλασμα αποτελείται από συστοιχίες πρωτεϊνικών ινιδίων.

1.5 Το χόριο ως βιολογικό ανάλογο των χοληστερικών υγρών κρυστάλλων

Το πρωτεϊνικό χόριο είναι ένα βιολογικό ανάλογο των χοληστερικών υγρών κρυστάλλων (Mazur et al., 1982). Η υγροκρυσταλλική κατάσταση της ύλης είναι μια ενδιάμεση κατάσταση μεταξύ της στερεάς και της υγρής (ισοτροπικής) φάσης. Οι υγροί κρύσταλλοι «ρέουν» όπως το νερό, αλλά έχουν ανισοτροπικές ιδιότητες, όπως οι στερεοί κρύσταλλοι. Όταν η συγκέντρωση ενός διαλύματος επιμηκών μορίων αυξάνει, το διάλυμα περνάει από την ισότροπη υγρή φάση, σ’ ένα μείγμα ισορροπίας μεταξύ μιας ισοτροπικής και μιας υγροκρυσταλλικής φάσης και τελικά μεταπίπτει σε μια καθαρά υγροκρυσταλλική φάση. Οι υγροί κρύσταλλοι λέγονται αλλιώς και μεσοφάσεις ή μεσομορφικές καταστάσεις ή ανισότροπα υγρά ή παρακρύσταλλοι. Πολλές βιολογικές δομές απαντούν σε υγροκρυσταλλική κατάσταση με αποτέλεσμα αυτή η φάση της ύλης να είναι εξαιρετικής

400 μm 450 nm

Έλασμα

20 σημασίας για την ίδια τη ζωή. Οι υγροί κρύσταλλοι έχουν υποδιαιρεθεί σε τέσσερεις τύπους: Σμητικούς, Νηματικούς, Δισκοτικούς και Χοληστερικούς (Εικόνα 1-9).

Ο τύπος που συναντάται στη δομή του χορίου των λεπιδοπτέρων είναι αυτός των χοληστερικών υγρών κρύσταλλων. Εναλλακτικά, χαρακτηρίζεται και ως τύπος εστραμμένων νηματικών, διότι μπορεί να θεωρηθεί σαν ένα είδος νηματικής φάσης, η οποία μπορεί να περιγραφεί ως μια στραμμένη νηματική δομή, της οποίας τα κέντρα βάρους των μορίων σχηματίζουν ισαπέχοντα επίπεδα και τα μόρια διευθετούνται με τους μεγάλους άξονες παράλληλους μ’ αυτά τα επίπεδα. Αναλυτικότερα, στη δομή αυτή, σε κάθε επίπεδο τα μόρια είναι παράλληλα μεταξύ τους και σε μια κοινή διεύθυνση, αλλά από επίπεδο σε επίπεδο, η διεύθυνση των μορίων μεταβάλλεται προοδευτικά και σταθερά, ώστε τελικά να δημιουργούνται ελικοειδείς διευθετήσεις μορίων, με τους άξονες των ελίκων κάθετους στα επίπεδα. Στους χοληστερικούς υγρούς κρυστάλλους, η στροφή από επίπεδο σε επίπεδο, μπορεί να είναι πολύ μικρή, αλλά η συνολική μακροσκοπική περιστροφή είναι μεγάλη. Αυτή η χοληστερική υπερδομή εμφανίζεται σαν εναλλαγή φωτεινών και σκοτεινών γραμμών, που απέχουν το μισό του βήματος της υπερέλικας, όταν το δείγμα παρατηρείται κάθετα στον άξονα της έλικας μεταξύ διασταυρωμένων, πολωτή και αναλυτή, στο πολωτικό μικροσκόπιο. Το βήμα, είναι επίσης δυνατό να μετρηθεί, μετρώντας τη γωνία στροφής γραμμικά πολωμένου φωτός, όταν το φως πέφτει παράλληλα με τον άξονα της έλικας.

Οι χοληστερικοί υγροί κρύσταλλοι ονομάστηκαν έτσι από τη χοληστερόλη, της οποίας πολλοί εστέρες σχηματίζουν υγρούς κρυστάλλους αυτού του τύπου, αν και η ίδια η χοληστερόλη δεν εμφανίζει μεσόμορφη φάση.

21 Εικόνα 1-9: Διάταξη μορίων των κατηγόριων των υγρών κρυστάλλων. Οι Νηματικοί είναι η συνηθέστερη και η λιγότερο οργανωμένη υγρή κρυσταλλική κατάσταση, όπου τα μόρια διευθετούνται σχεδόν παράλληλα ως προς τον μεγάλο τους άξονα. Στους Σμηκτικούς, τα μόρια έχουν κανονικότητα κατά δύο διαστάσεις και διατάσσονται κατά στρώματα. Το πάχος του στρώματος είναι περίπου ίσο με το μήκος του μορίου. Στους Χοληστερικούς, τα μόρια είναι παράλληλα διατεταγμένα ως προς μία διεύθυνση σε στρώματα, τα οποία στρέφονται υπό σταθερά γωνία, με αποτέλεσμα να δημιουργείται ελικοειδής δομή. Στους Δισκοτικούς υγρούς κρυστάλλους, τα μόρια έχουν δισκοειδές σχήμα αντί για επίμηκες και στοιβάζονται σε επίπεδα αντίστοιχα με τους νηματικούς.

Παραδείγματα μορίων που δημιουργούν χοληστερικές μεσοφάσεις είναι τα πολυαμινοξέα, το DNA, ο ιός της μωσαϊκής του καπνού, οι νηματοειδής φάγοι, συμπλέγματα χιτίνης-πρωτεϊνών, η κυτταρίνη και διαφορές δομικές πρωτεΐνες, όπως αυτές που συναντώνται στο χόριο των λεπιδοπτέρων. Οι τελευταίες αποτελούν το βασικό σημείο ενδιαφέροντος της παρούσας εργασίας.

Συνεπώς, το χόριο χαρακτηρίζεται ως φυσικό ανάλογο χοληστερικών υγρών κρυστάλλων, διότι η ελικοειδής αρχιτεκτονική του µε την περιστροφή των ινιδίων κατά σταθερή γωνία παρουσιάζει έντονη αναλογία µε τους χοληστερικούς υγρούς κρυστάλλους (Mazur et al., 1982). Κρίσιμο στοιχείο αυτής της διαμόρφωσης είναι ότι η ενέργεια που απαιτείται για το σχηματισμό της ελικοειδούς δομής είναι πολύ μικρή, σε σχέση με την ενέργεια που απαιτείται για άλλες διατάξεις των μορίων, ισχυροποιώντας με αυτό τον τρόπο την άποψη ότι το χόριο είναι ένα σύστημα αυτοσυγκροτούµενο, που οργανώνεται χωρίς τη βοήθεια ενζύµων ή την κατανάλωση ενέργειας, αλλά μέσα από τη δημιουργία υγρών κρυστάλλων. Αυτό καταδεικνύει και τη σημασία των υγρών

Σμηκτικοί

Νηματικοί Χοληστερικοί Δισκοτικοί

22 κρυστάλλων στην οργάνωση εξωκυτταρικών συστημάτων, όπου η διαθέσιμη ενέργεια είναι μειωμένη και η ανάγκη για αυτοσυγκρότηση είναι πολύ έντονη.

1.6 Πρωτεΐνες του χορίου

Η δομή του χορίου είναι σύνθετη και βιοχημικά πολύπλοκη διότι πρέπει να εξυπηρετεί παράλληλα πλήθος ξεχωριστών λειτουργιών και αναγκών (Kafatos et al., 1977). Αυτός είναι ο λόγος που περιέχει εκατοντάδες διαφορετικές πρωτεΐνες, αρκετές από τις οποίες έχουν απομονωθεί από το χόριο διαφόρων ειδών λεπιδοπτέρων, όπως B. mori (Rodakis et al., 1982), A. polyphemus ή A. pernyi (Moschonas et al., 1988), και έχουν αναλυθεί.

Σύμφωνα με το βαθμό συντήρησης που παρουσιάζουν οι πρωτεΐνες του χορίου των λεπιδοπτέρων στη κεντρική τους περιοχή (Εικόνα 1-10) έχουν κατηγοριοποιηθεί σε οικογένειες εκ των οποίων οι συνηθέστερες είναι οι Α, Β και C . Διαφορετικά μέλη της ίδιας οικογενείας εκφράζονται σε διάφορα στάδια κατά τη διάρκεια της χρονικής περιόδου της χοριογένεσης (πρώιμο, μέσο, προχωρημένο και πολύ προχωρημένο στάδιο) (Rodakis et al., 1982). Οι κυρίαρχες οικογένειες είναι οι Α, Β και λιγότερο η C, οι οποίες συγκεντρώνουν περίπου το 97% της μάζας του χορίου, πχ στο λεπιδόπτερο A. polyphemus, οι Α, Β και C πρωτεΐνες αντιπροσωπεύουν το 38%, 50% και 9% αντίστοιχα της ξηρής μάζας του χορίου (Kafatos et al., 1977). Το φάσμα των μοριακών βαρών των πρωτεϊνών A και B, κυμαίνονται από 9-12 kDa και 12-14 kDa, αντίστοιχα (Hamodrakas, 1992).

Η αμινοξική αλληλουχία αρκετών πρωτεϊνών από τις παραπάνω οικογένειες, έχει καθοριστεί. Η ομοιότητα των αμινοξικών αλληλουχιών και η πρόβλεψη της δευτεροταγούς δομής τους φανερώνουν ότι οι πρωτεΐνες του χορίου έχουν τριμερή δομή, η οποία αποτελείται από μία κεντρική περιοχή και δυο πλευρικά άκρα (Hamodrakas et al., 1982; Regier et al., 1983) (Εικόνα 1-11).

23 Εικόνα 1-10: Στις παραπάνω πολλαπλές στοιχίσεις, οι πρωτεΐνες των οποίων το όνομα καταλήγει σε «BOMMO» προέρχονται από το Β. mori, αυτές που καταλήγουν σε «LYMDI» προέρχονται από το L. dispar, σε «ANTPO» προέρχονται από το Α.

polyphemus και σε «HYACE» από το H. cecropia. Οι διακεκομμένες γραμμές οριοθετούν την κεντρική περιοχή για την κάθε οικογένεια. Στην κεντρική περιοχή και των δύο οικογενειών παρατηρείται μια σταθερή περιοδική επανάληψη της γλυκίνης ανά 6 αμινοξικά κατάλοιπα. Ο χρωματισμός των αμινοξέων και των δύο οικογενειών είναι σύμφωνα με το πρότυπο ClustalΧ (Thompson et al., 1997). A. Πολλαπλή στοίχιση αλληλουχιών τυπικών πρωτεϊνών της οικογένειας Α. B. Πολλαπλή στοίχιση αλληλουχιών τυπικών πρωτεϊνών της οικογένειας Β.

Α

Β

Κεντρική περιοχή περιοχή

Κεντρική περιοχή περιοχή

Α

Β

24 Εικόνα 1-11: Σχηματική αναπαράσταση τριμερούς δομής πρωτεϊνών του χορίου. Αποτελούνται από μια κεντρική περιοχή η οποία είναι σε μεγάλο βαθμό συντηρημένη και τον καρβοξυτελικό και αμινοτελικό βραχίονα, οι οποίοι χαρακτηρίζονται από μικρότερη συντήρηση και υψηλότερη περιεκτικότητα σε γλυκίνη.

Η κεντρική περιοχή κάθε οικογένειας είναι συντηρημένη.

Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί η κεντρική περιοχή, των πρωτεϊνών του χορίου του A. polyphemus, η οποία καλύπτει το 42%-48% του συνολικού μήκους της αλληλουχίας, με πάνω από 77% ομοιότητα μεταξύ τους (Hamodrakas et al., 1982). Επίσης, σε σχέση με την υπόλοιπη αλληλουχία, παρατηρείται υψηλότερη περιεκτικότητα σε βαλίνη και αλανίνη. Επιπλέον, τόσο σε αυτό το είδος, όσο και σε άλλα, όπως το B.

mori, παρατηρείται μια σταθερή περιοδική επανάληψη της γλυκίνης, ανά 6 αμινοξικά κατάλοιπα (Iconomidou and Hamodrakas, 2008) (Εικόνα 1-10).

Τα πλευρικά αμινοτελικά και καρβοξυτελικά άκρα (βραχίονες) εμφανίζουν μεγαλύτερη μεταβλητότητα και ξεχωρίζουν από την παρουσία χαρακτηριστικών επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών από πεπτίδια όπου δεν συναντώνται στην κεντρική περιοχή. Επίσης, σε αυτές τις περιοχές παρατηρείται υψηλή περιεκτικότητα σε γλυκίνη, κυστεΐνη, λευκίνη και τυροσίνη. Πέρα από τις ομοιότητες μεταξύ των πρωτεϊνικών αλληλουχιών της κάθε οικογένειας, επίσης σημαντικές ομοιότητες και μακρινή εξελικτική σχέση παρουσιάζονται στους βραχίονες και την κεντρική περιοχή μεταξύ διαφορετικών οικογενειών, ισχυροποιώντας με αυτό τον τρόπο την ιδέα για την κοινή καταγωγή τους, από μια προγονική υπεροικογένεια γονιδίων (Lecanidou et al., 1986).

Κεντρική περιοχή Αμινοτελικός

βραχίονας

Καρβοξυτελικό βραχίονας

25

1.7 Αμυλοειδή - Αμυλοειδώσεις

Τα αμυλοειδή είναι εξωκυτταρικές εναποθέσεις αδιαλύτων πρωτεϊνικών ινιδίων, προερχομένων από διαλυτές πρωτεΐνες ή πεπτίδια, όταν αυτά αυτοσυγκροτούνται κατά ανώμαλο τρόπο (Εικόνα 1-12).

Αρνητική συνέπεια αυτών είναι η δυσλειτουργία των κυττάρων και των ιστών, με αποτέλεσμα την πρόκληση ασθενειών, όπως η νόσος του Alzheimer, ο διαβήτης τύπου 2, οι σπογγώδεις εγκεφαλοπάθειες, κλπ, οι οποίες οδήγησαν αρχικά τους ερευνητές στη μελέτη των αμυλοειδών.

Αμυλοείδωση είναι η κλινική διαταραχή που συσχετίζεται με την εξωκυτταρική εναπόθεση αδιάλυτων ινιδίων, που δημιουργούνται από τη συσσωμάτωση μη φυσιολογικά διαμορφωμένων πρωτεϊνών οι οποίες κανονικά θα ήταν διαλυτές (Altschul et al., 1990; Kelly, 1996; Tan and Pepys, 1994). Τουλάχιστον 25 πρωτεΐνες και πολυπεπτίδια έχουν αναγνωριστεί σε αμυλοειδείς εναποθέσεις (Guijarro et al., 1998; Sunde and Blake, 1998).

Εικόνα 1-12: Εσφαλμένη δίπλωμα πρωτεϊνών. Υπό συγκεκριμένες περιστάσεις, όπως η αλλαγή του pΗ ή της θερμοκρασίας, μηχανικές πιέσεις, γλυκοζυλίωση ή οξείδωση, η δομή των πρωτεϊνών λύνεται και μπαίνει σε μια διαδικασία επανασύστασης. Κατά τη διαδικασία αυτή μπορεί να εμπλουτιστεί με δομή cross-β, οδηγώντας σε άμορφα συσσωματώματα πρωτεϊνών ή στη δημιουργία πρωτοϊνιδίων, τα οποία στη συνέχεια συνδιαμορφώνουν ινίδια.

Αρχικά τα αμυλοειδή αντιμετωπίστηκαν ως μια πρωτεΐνη, αφού αποδείχτηκε η παρουσία πρωτεϊνών και η απουσία υδρογονανθράκων σε μια μάζα ‘αμυλοειδών’, με βάση την υψηλή αναλογία σε άζωτο (Friedreich

cross-β

26 and Kekulé, 1859). Τα αμυλοειδή αποτελούνται από αμυλοειδή ινίδια τα οποία εμφανίζουν κοινά χαρακτηριστικά ως προς τη δομή, τα μορφολογικά χαρακτηριστικά και την ιδιότητα δέσμευσης συγκεκριμένης χρωστικής.

Ειδικότερα αυτά είναι:

 Δέσμευση της χρωστικής Ερυθρό του Κονγκό και εμφάνιση κίτρινο- πράσινης διπλοθλαστικότητας κάτω από διασταυρωμένο πολωτή- αναλυτή πολωτικού μικροσκοπίου (Divry and Florkin, 1927). Η Εικόνα 1-13 απεικονίζει μια μικρογραφία από την εναπόθεση αμυλοειδών στην καρδία, τα οποία ξεχωρίζουν λόγο της χρώσης τους με εντονότερο κόκκινο χρώμα. Η ιδιότητα αυτή παραμένει μέχρι και σήμερα η κοινή πρακτική για την διάγνωση των αμυλοειδώσεων.

 Εμφανίζουν ομοιόμορφα αδιακλάδιστα ινίδια διαμέτρου ~100Å, ακαθορίστου μήκους, τα οποία μπορεί να είναι ευθύγραμμα ή ελαφρώς καμπυλόγραμμα.

 Οι εμπεριεχόμενες πρωτεΐνες των ινιδίων εμφανίζουν δομή cross-β με τους β-κλώνους κάθετους στον άξονα των ινιδίων (Sunde and Blake, 1998).

Το φαινόμενο του πολυμερισμού των πρωτεϊνών σε αμυλοειδή ινίδια και η κατανόηση των μηχανισμών δημιουργίας των αμυλοειδών μελετώνται διότι:

 Σχετίζονται με το πρόβλημα του διπλώματος των πρωτεϊνών.

 Συνδέονται άμεσα με τις ασθένειες που προκαλούνται από τα αμυλοειδή (αμυλοειδώσεις).

 Στοχεύεται η ανάπτυξη αναστολέων για θεραπευτικούς σκοπούς (Hamodrakas et al., 2004).

27 Εικόνα 1-13: Εικόνα φωτονικού μικροσκοπίου από ιστό ανθρώπινης καρδίας προσβεβλημένης από αμυλοείδωση (χρώση με Ερυθρό του Κονγκό). Η συσσώρευση των αμυλοειδών διακρίνεται στις νεφελώδεις περιοχές με ρόδινο χρώμα. Τέτοια φαινόμενα μπορούν να απειλήσουν την υγιή λειτουργία των οργάνων.

1.8 Φυσικά Προστατευτικά Αμυλοειδή

Στην πορεία των ερευνών διαπιστώθηκε ότι και υγιείς ζώντες οργανισμοί φαίνεται να παράγουν δομές αμυλοειδών ινιδίων, οι οποίες συντελούν σε πλήθος διαφορετικών φυσιολογικών λειτουργιών και αναγκών των οργανισμών αυτών, όπως η προστασία και η θωράκιση.

Ισχυρά παραδείγματα φυσικών προστατευτικών αμυλοειδών συναντώνται και στο χόριο των λεπιδοπτέρων. Πρόκειται για μια δομή με αμυλοειδή χαρακτηριστικά, η οποία είναι ικανή να προστατεύει τα πρώτα βήματα της ζωής των λεπιδοπτέρων, χάρη στις εξαιρετικές φυσικές και μηχανικές ιδιότητες που προσφέρει (Iconomidou and Hamodrakas, 2008).

Ωστόσο η μελέτη των ιδιοτήτων και των δομικών χαρακτηριστικών πρωτεϊνών του χορίου παρεμποδίζεται από την δυσκολία απομόνωσης και διατήρησης αρκετά μεγάλων ποσοτήτων πρωτεϊνών του χορίου, ώστε να εξεταστούν σε λεπτομέρεια με μεθόδους κρυσταλλογραφίας και

28 φασματοσκοπίας NMR. Για αυτό το λόγο δημιουργήθηκαν συνθετικά πεπτίδια ανάλογα των πρωτεϊνών του χορίου της κάθε οικογένειας. Το cA το οποίο αποτελείται από 51 αμινοξέα είναι πεπτιδικό ανάλογο της κεντρικής περιοχής της οικογένειας Α, ενώ το πεπτίδιο Β αποτελείται από 18 αμινοξέα και αντιπροσωπεύει την οικογένεια Β (Iconomidou et al., 2001; Iconomidou et al., 2000). Αυτά τα πεπτίδια αυτοσυγκροτούνται σχηματίζοντας αμυλοειδή ινίδια in vitro, σε χρονικό διάστημα που εξαρτάται κυρίως από την θερμοκρασία, την συγκέντρωση και το τύπο του διαλύματος. Το πρώτο βήμα στο σχηματισμό των αμυλοειδών ινιδίων είναι η αυθόρμητη δημιουργία πυρήνων υγροκρυσταλλικής φύσης (σφαιρουλιτών) διαμέτρου κυμαινόμενης από 0.1 έως 200 μm. Εν συνεχεία αυτοί οι πυρήνες σταδιακά «καταρρέουν» και μετασχηματίζονται σε αμυλοειδή ινίδια (Εικόνα 1-14). Τα σχηματιζόμενα ινίδια που προήλθαν από το cA πεπτίδιο παρουσίασαν όλα τα χαρακτηριστικά γνωρίσματα των αμυλοειδών. Προβλέψεις της δευτεροταγούς δομής συμφωνούν με τα περιθλασιγράμματα ακτινών X που προέκυψαν από τα συνθετικά αμυλοειδή και δείχνουν ότι η κυρίαρχη δομή στις πρωτεΐνες του χορίου είναι η β-πτυχωτή επιφάνεια (Hamodrakas et al., 1982) (Εικόνα 1-15).

Σε ποσοτικές μετρήσεις που πραγματοποιήθηκαν για την δευτεροταγή δομή των πρωτεϊνών του χορίου του B. mori δείχτηκε ότι αποτελούνται από 60-70% από δομές αντιπαραλλήλων β-πτυχωτών επιφανειών και 30-40% από δομές β-στροφών (Hamodrakas et al., 1988).

29 Εικόνα 1-14: Στάδια μετασχηματισμού πεπτιδίων cA από σφαιρουλίτες σε αμυλοειδή ινίδια, κατά τη διάρκεια μιας εβδομάδας. Α. Μέρα 0.

Διακρίνονται μόνο οι σφαιρουλίτες (ράβδος κλίμακας 10 μm). Β. Μέρα 2.

Συνύπαρξη σφαιρουλιτών και ινιδίων (ράβδος κλίμακας 100 nm). Γ. Μέρα 5. Ο αριθμός των ινιδίων έχει αυξηθεί αρκετά ενώ των σφαιρουλιτών έχει μειωθεί (ράβδος κλίμακας 100 nm). Δ. Μέρα 6. Ολική εξαφάνιση των σφαιρουλιτών. Η περιοχή είναι γεμάτη από πρώιμα αμυλοειδή ινίδια (ράβδος κλίμακας 100 nm). Ε. Μέρα 7. Παρατηρούνται μόνο αμυλοειδή ινίδια (ράβδος κλίμακας 100 nm).

Η συντηρημένη κεντρική περιοχή του Β. mori εμφανίζει περιοδική επανάληψη ανά 6 θέσεις διάφορων αμινοξέων όπως των γλυκινών.

Συνδυάζοντας αυτού του είδους τις περιοδικότητες μαζί με την εξακριβωμένη επικράτηση β-πτυχωτών δομών και β-στροφών προτάθηκε ένα δομικό μοντέλο στο οποίο εμφανίζονται β-πτυχωτές επιφάνειες 4 κατάλοιπων να εναλλάσσονται με β-στροφές τύπου Ι’ και ΙΙ’

διαμορφώνοντας συνολικά αντιπαράλληλες β επιφάνειες, οι οποίες αποτελούν την βάση της μοριακής και υπερμοριακής συγκρότησης του χορίου (Hamodrakas et al., 1988).

30 Εικόνα 1-15: Τα αμυλοειδή αποτελούνται από ινίδια, όπως φαίνεται στην εικόνα ηλεκτρονικής μικρογραφίας αριστερά. Το περιθλασίγραμμα ακτινών X, στο μέσο, παρουσιάζει ανάκλαση μεσημβρινού στα 4.66 Å και ισημερινού στα 10.12 Å τα οποία υποδηλώνουν την ύπαρξη δομής cross- β, όπως αναπαρίσταται στην εικόνα δεξιά.

Περιθλασίγραμμα της cross-β-επιφάνειας

Μοντέλο cross-β-επιφάνειας Αμυλοειδή ινίδια

Άξονας ινιδίου

31

2 Μεθοδολογία

2.1 Συλλογή αμινοξικών αλληλουχιών από Διαδικτυακές βάσεις δεδομένων

Στη μελέτη των πρωτεϊνικών αλληλουχιών, όπως του χορίου, είναι κρίσιμο να συλλεχθεί επαρκής όγκος αλληλουχιών, ώστε το εύρος του πεδίου μελέτης να είναι το δυνατό μεγαλύτερο. Από όλες τις διαθέσιμες πηγές βιολογικών δεδομένων, οι πιο κατάλληλες σήμερα είναι οι Διαδικτυακές βάσεις δεδομένων, λόγω του εκθετικά αυξανόμενου μεγέθους τους (Εικόνα 2-1), αλλά και της ευκολίας ανάκτησης των δεδομένων τους, εξαιτίας του Διαδικτυακού τους χαρακτήρα.

Εικόνα 2-1: Αύξηση καταχωρήσεων βιολογικών ακολουθιών και δομών στις Διαδικτυακές βάσεις δεδομένων από το 1982 μέχρι σήμερα (http://www.genome.jp/en/db_growth.html).

32 Οι βάσεις δεδομένων που χρησιμοποιήθηκαν για την εξόρυξη αλληλουχιών, ώστε στη συνέχεια να εντοπιστούν μέσα από αυτές οι πρωτεΐνες του χορίου κάθε οικογένειας, είναι οι εξής:

 Η UniProtKB (Universal Protein Resource Knowledgebase) (Jain et al., 2009; UniProt Consortium, 2011) ανήκει στην κατηγορία των γνωσιακών βάσεων δεδομένων, οι οποίες παρέχουν τα μέσα για αυτοματοποιημένη συλλογή, οργάνωση και ανάκτηση γνώσης, μέσα από ένα σύστημα που χρησιμοποιεί τεχνητή νοημοσύνη για την διαδικασία επίλυσης προβλημάτων. Η UniProtKB είναι κομβικής σημασίας για τους ερ�