ΕΛΛΗΝΙΚΟ ΑΝΟΙΚΤΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ
ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΚΑΙ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ
ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ
ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ ΚΑΘΗΓΗΤΩΝ ΦΥΣΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ
ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ
ΚΥΣΤΙΚΗ ΙΝΩΣΗ: Παθογένεια, μοριακοί μηχανισμοί, νέα γνώση για θεραπευτικές προσεγγίσεις. Διδακτικά σενάρια σε μαθητές
λυκείου.
ΟΝΟΜΑ ΦΟΙΤΗΤΗ ΠΕΤΡΙΔΗΣ ΣΤΕΦΑΝΟΣ
(Α.Μ. 91168)
ΟΝΟΜΑ ΕΠΙΒΛΕΠΟΝΤΑ ΚΑΘΗΓΗΤΗ ΣΤΑΘΟΠΟΥΛΟΣ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ
ΠΑΤΡΑ ΙΟΥΛΙΟΣ 2018
1
© ΕΑΠ, 2018
Η παρούσα διατριβή, η οποία εκπονήθηκε στα πλαίσια της ΘΕ ΚΦΕ53, και τα λοιπά αποτελέσματα της αντίστοιχης Διπλωματικής Εργασίας (ΔΕ) αποτελούν συνιδιοκτησία του ΕΑΠ και του φοιτητή, ο καθένας από τους οποίους έχει το δικαίωμα ανεξάρτητης χρήσης και αναπαραγωγής τους (στο σύνολο ή τμηματικά) για διδακτικούς και ερευνητικούς σκοπούς, σε κάθε περίπτωση αναφέροντας τον τίτλο και το συγγραφέα και το ΕΑΠ όπου εκπονήθηκε η ΔΕ καθώς και τον επιβλέποντα και την επιτροπή κρίσης.
2 Τίτλος Διπλωματικής Εργασίας
«ΚΥΣΤΙΚΗ ΙΝΩΣΗ: Παθογένεια, μοριακοί μηχανισμοί, νέα γνώση για θεραπευτικές προσεγγίσεις. Διδακτικά σενάρια σε μαθητές
λυκείου.»
Συγγραφέας Πετρίδης Στέφανος
Επιβλέπων καθηγητής Μέλος Σταθόπουλος Κωνσταντίνος Σκορίλας Ανδρέας
3
“CYSTIC FIBROSIS: Pathogenicity, molecular mechanisms, new knowledge for therapeutical approaches. Lesson plans for senior high school pupils.”
Author Petridis Stefanos
Supervisor Member
Constantinos Stathopoulos Andreas Scorilas
4
Λέξεις-κλειδιά
• Κυστική ίνωση
• Δίαυλος ιόντων
• Επιθήλια
• Ενυδάτωση αεραγωγών
• Διορθωτές-ενισχυτές της CFTR
• CRISPR/Cas9
5
Περιεχόμενα
ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΕΙΚΟΝΩΝ ... 8
ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΠΙΝΑΚΩΝ ... 10
ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ ... 11
ΜΕΡΟΣ Α - ΕΙΣΑΓΩΓΗ ... 19
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1. ΚΛΙΝΙΚΑ ΣΥΜΠΤΩΜΑΤΑ ΚΑΙ ΠΑΘΟΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ ΚΥΣΤΙΚΗΣ ΙΝΩΣΗΣ ... 21
1.1 Γενικά χαρακτηριστικά της νόσου ... 21
1.2 Εξηγώντας την γεωγραφική κατανομή της κυστικής ίνωσης ... 24
1.3 Κλινικά συμπτώματα στη γαστρεντερική οδό ... 27
1.3.1 Διαταραχές του παγκρέατος ... 28
1.3.2 Διαταραχές του εντέρου ... 30
1.3.3 Διαταραχές του οισοφάγου ... 31
1.3.4 Διαταραχές του ήπατος ... 32
1.3.5 Διαταραχές της χοληδόχου κύστης ... 32
1.4 Κλινικά συμπτώματα του αναπνευστικού συστήματος ... 33
1.5 Διαταραχές του αναπαραγωγικού συστήματος ... 41
1.6 Διαταραχές στη λειτουργία των ιδρωτοποιών αδένων... 43
1.7 Η άτυπη μορφή της κυστικής ίνωσης ... 45
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2. ΑΠΟ ΤΟ ΓΟΝΙΔΙΟ ΣΤΗΝ ΠΡΩΤΕΪΝΗ-ΔΙΑΥΛΟ ΙΟΝΤΩΝ ... 46
2.1 Το γονίδιο και η πρωτεΐνη CFTR ... 46
2.2 Η ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου CFTR ... 51
2.3 Μη συμβατική διακίνηση της CFTR ... 62
2.4 Δομή και λειτουργία της πρωτεΐνης CFTR ... 64
2.4.1 Η CFTR ως δίαυλος ιόντων ... 64
2.4.2 Η ρυθμιστική περιοχή της CFTR ... 65
2.4.3 Οι διαμεμβρανικές περιοχές της CFTR ... 67
2.4.4 Οι επικράτειες δέσμευσης νουκλεοτιδίων ... 69
2.4.5 Το ανοιγοκλείσιμο του διαύλου ... 71
2.4.6 Βιοφυσικές ιδιότητες του διαύλου Cl- της F508del-CFTR ... 73
2.4.7 Η πρωτεΐνη CFTR είναι περισσότερο από ένας απλός δίαυλος ιόντων χλωρίου ... 75
2.5 Ο ρόλος της πρωτεΐνης CFTR στα επιθήλια ... 76
6 2.5.1 Το βασικό εργαλείο για την απορρόφηση ηλεκτρολυτών και υγρών στα
επιθήλια ... 76
2.5.2 Ο ρόλος της CFTR στο αναπνευστικό σύστημα ... 80
2.5.3 Ο ρόλος της CFTR στο εξωκρινές πάγκρεας ... 83
2.5.4 Ο ρόλος της CFTR στη φυσιολογία των ιδρωτοποιών αδένων ... 87
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3. Η ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΑΙΤΙΑ ΤΗΣ ΚΥΣΤΙΚΗΣ ΙΝΩΣΗΣ ... 92
3.1 Μεταλλάξεις του γονιδίου CFTR ... 93
3.1.1 Ταξινόμηση των μεταλλάξεων CFTR βάσει κλινικών συνεπειών ... 95
3.1.2 Ταξινόμηση των μεταλλάξεων του CFTR σύμφωνα με τις επιπτώσεις στη δομή και στη λειτουργικότητα της πρωτεΐνης CFTR ... 98
3.2 Ετερογένεια συμπτωμάτων στην κυστική ίνωση-Τροποποιητικά γονίδια ... 110
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4. Η ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΤΗΣ ΚΥΣΤΙΚΗΣ ΙΝΩΣΗΣ ... 116
4.1 Η στρατηγική για τη διάγνωση της κυστικής ίνωσης ... 116
4.2 Διαγνωστικές δοκιμασίες ... 118
4.2.2 Εντοπισμός των μεταλλάξεων στο γονίδιο CFTR... 121
4.2.3 Μέτρηση διαφοράς δυναμικού του ρινικού επιθηλίου ... 122
4.2.4 Μέτρηση του ρεύματος διαμέσου του εντερικού επιθηλίου ... 124
4.2.5 Καινοτόμες μέθοδοι για την αξιολόγηση της λειτουργίας της CFTR ... 125
4.3 Προγεννητικός έλεγχος ... 128
4.4 Πρόγραμμα ανίχνευσης νεογνών για την κυστική ίνωση (CF newborn screening) ... 132
4.5 Έλεγχος νεογνών στην Ελλάδα ... 134
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5. ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗ ΤΩΝ ΣΥΜΠΤΩΜΑΤΩΝ ΤΗΣ ΚΥΣΤΙΚΗΣ ΙΝΩΣΗΣ ... 138
5.1 Στόχοι των θεραπευτικών προσεγγίσεων ... 138
5.2 Θεραπεία των συμπτωμάτων του αναπνευστικού συστήματος ... 140
5.2.1 Βελτίωση της κάθαρσης του κροσσωτού επιθηλίου από τη βλέννα ... 140
5.2.2 Αντιμετώπιση της φλεγμονής ... 146
5.2.3 Αντιμετώπιση της λοίμωξης ... 150
5.3 Αντιμετώπιση συμπτωμάτων του πεπτικού συστήματος ... 153
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6. ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΕΣ ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΕΙΣ ΠΟΥ ΣΤΟΧΕΥΟΥΝ ΣΤΗ ΔΙΟΡΘΩΣΗ ΤΗΣ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΛΑΒΗΣ ... 156
6.1 Φαρμακευτικά μόρια-διορθωτές της πρωτεΐνης CFTR ... 156
6.2 Θεραπεία καταστολής του πρώιμου κωδικονίου λήξης ... 162
7
6.2.1 Τερματισμός της μετάφρασης στα ευκαρυωτικά κύτταρα ... 164
6.2.2 Τρέχουσα κατάσταση της θεραπείας μέσω καταστολής πρώιμου κωδικονίου λήξης ... 165
6.3 Γονιδιακή θεραπεία (Gene therapy) ... 168
6.3.1 Η γονιδιακή θεραπεία ως θεραπευτική προσέγγιση ... 168
6.3.2 Ιικοί φορείς ... 170
6.3.3 Μη ιικοί φορείς ... 173
6.4 Επιδιόρθωση γονιδίων (Gene editing) ... 176
6.5 Θεραπεία με τη χρήση βλαστοκυττάρων ... 182
6.6 Θεραπευτικά συστήματα νουκλεϊκών οξέων ... 186
6.6.1 Χαρακτηριστικά των θεραπευτικών συστημάτων νουκλεϊκών οξέων ... 186
6.6.2 Αντινοηματικά ολιγονουκλεοτίδια (Antisense oligonucleotides-ASOs) .. 186
6.6.3 Προγράμματα αντικατάστασης mRNA ... 189
6.7 Νέοι πιθανοί φαρμακευτικοί στόχοι... 190
ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ-ΠΡΟΠΤΙΚΕΣ ... 193
ΠΕΡΙΛΗΨΗ ... 195
ABSTRACT ... 196
ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ... 197
ΜΕΡΟΣ Β - Η ΚΥΣΤΙΚΗ ΙΝΩΣΗ ΩΣ ΘΕΜΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΣΤΗ ΔΕΥΤΕΡΟΒΑΘΜΙΑ ΕΚΠΑΙΔΕΥΣΗ ... 215
ΦΥΛΛΟ ΕΡΓΑΣΙΑΣ 1ης ΔΙΔΑΚΤΙΚΗΣ ΩΡΑΣ - Η κυστική ίνωση ... 217
ΦΥΛΛΟ ΕΡΓΑΣΙΑΣ 2ης ΔΙΔΑΚΤΙΚΗΣ ΩΡΑΣ - Η πρωτεΐνη CFTR ... 219
ΦΥΛΛΟ ΕΡΓΑΣΙΑΣ 3ης ΔΙΔΑΚΤΙΚΗΣ ΩΡΑΣ - Βιολογικός ρόλος της πρωτεΐνης CFTR στα ανθρώπινα επιθήλια ... 223
ΦΥΛΛΟ ΕΡΓΑΣΙΑΣ 4ης ΔΙΔΑΚΤΙΚΗΣ ΩΡΑΣ - Η γενετική αιτία της κυστικής ίνωσης ... 226
8
ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΕΙΚΟΝΩΝ
Εικόνα 1: Βασικά χαρακτηριστικά της κυστικής ίνωσης ………...23
Εικόνα 2: Πληθυσμιακή κατανομή της μετάλλαξης F508del στην Ευρώπη ………..25
Εικόνα 3: Απεικόνιση των επιπτώσεων της CF στους πνεύμονες …………...……...34
Εικόνα 4: Τελικό στάδιο βρογχιέκτασης ……….……..………..35
Εικόνα 5: Ιδιότητες της βλέννας στους πνεύμονες της CF …………...………..39
Εικόνα 6: Σχηματική απεικόνιση του γονιδίου CFTR ………...……….47
Εικόνα 7: Δισδιάστατο μοντέλο των δομικών περιοχών της CFTR……...………….48
Εικόνα 8: Τρισδιάστατο μοντέλο της πρωτεΐνης CFTR ………...………..49
Εικόνα 9: Μοντέλο του πόρου της CFTR ………...………49
Εικόνα 10: Κατανομή των θετικών υπολειμμάτων στον πόρο της CFTR …………..50
Εικόνα 11: Το πρώτο σημείο ελέγχου της βιοσύνθεσης της CFTR …………...…….55
Εικόνα 12: Σημεία ποιοτικού ελέγχου στο ER για τη CFTR. ……...………..58
Εικόνα 13: Ρύθμιση της διακίνησης της CFTR ………...………...60
Εικόνα 14: Θέσεις φωσφορυλίωσης της RD της CFTR ………...………..65
Εικόνα 15: Η τρισδιάστατη δομή του πόρου της CFTR σε ανοιχτή και κλειστή διαμόρφωση……….……….68
Εικόνα 16: Απεικόνιση των δύο θυλάκων δέσμευσης ATP της CFTR ………..70
Εικόνα 17: Η θέση του τομέα R όταν ο δίαυλος είναι κλειστός ……….71
Εικόνα 18: Το ανοιγοκλείσιμο του διαύλου της CFTR ………...………...73
Εικόνα 19: Ο διμερισμός των NBDs της CFTR ………..………...74
Εικόνα 20: Βασικά χαρακτηριστικά μιας στιβάδας επιθηλιακών κυττάρων ………..78
Εικόνα 21: Το επιθήλιο της αναπνευστικής οδού ………...80
Εικόνα 22: Μεταφορά ιόντων στους αεραγωγούς ………...………...82
Εικόνα 23: Απλοποιημένη δομή παγκρέατος ………...………..84
Εικόνα 24: Μετακίνηση ιόντων και υγρού από τα παγκρεατικά κύτταρα ………….85
Εικόνα 25: Αναπαράσταση ιδρωτοποιού αδένα ………..………...88
Εικόνα 26: Μεταφορά ιόντων στους ιδρωτοποιούς αδένες ………...………....90
Εικόνα 27: Σχηματική απεικόνιση του γονιδίου CFTR και της κατανομής των μεταλλάξεων σ’ αυτό ………..94
Εικόνα 28: Οι μεταλλάξεις CF διαταράσσουν την έκφραση και τη λειτουργία της CFTR ……….…..98
9 Εικόνα 29: Η συνεργατική αναδίπλωση του WT-CFTR και η κακή συναρμολόγηση
της F508del-CFTR ………102
Εικόνα 30: Ταξινόμηση των μεταλλάξεων της CF που αντιπροσωπεύουν σύνθετους φαινοτύπους ………..110
Εικόνα 31: Παράγοντες που αλληλεπιδρούν για τον καθορισμό του τελικού φαινοτύπου στην κυστική ίνωση ………...111
Εικόνα 32: Απλοποιημένος αλγόριθμος για την διάγνωση της CF …………..……117
Εικόνα 33: Δοκιμή ιδρώτα ………...……….120
Εικόνα 34: Η μέτρηση του NPD ………...………123
Εικόνα 35: Οργανοειδή ………...………..127
Εικόνα 36: Δοκιμασία FIS ………...……….128
Εικόνα 37: Απλοποιημένος αλγόριθμος για CF-NBS ………...………133
Εικόνα 38: Σχηματική αναπαράσταση των αντιμικροβιακών, ανοσορρυθμιστικών και βλεννολυτικών ιδιοτήτων του HTS ………...143
Εικόνα 39: Μεταλλάξεις του CFTR για στοχευμένες θεραπείες ………..157
Εικόνα 40: Θεραπεία τριπλού συνδυασμού για την CF ………...161
Εικόνα 41: Η δομή της αγγελιοφόρου ριβονουκλεοπρωτεΐνης (mRNP) σε a) κανονικά και (b) πρόωρα κωδικόνια τερματισμού ………...165
Εικόνα 42: Γονιδιακή θεραπεία της CF με τη χρήση λιποσωμάτων ……….168
Εικόνα 43: Επεξεργασία γονιδιώματος με μεσολάβηση CRISPR/Cas9 …………...177
Εικόνα 44: In vivo και ex vivo στρατηγικές για επιδιόρθωση μεταλλάξεων μέσω του συστήματος CRISPR/Cas9……….179
Εικόνα 45: Θεραπευτική προσέγγιση της μετάλλαξης F508del σε iPSCs …………183
Εικόνα 46: Μηχανισμοί δράσης των ASOs ………..187
Εικόνα 47: Επιδιόρθωση του λάθους εναλλακτικού ματίσματος του εξωνίου 10 με χρήση ASO ………189
Εικόνα 48: Επιλεγμένοι ρυθμιστές πρωτεόστασης αντιπροσωπεύουν στόχους για την ανάπτυξη φαρμάκων για την CF ………...191
10
ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΠΙΝΑΚΩΝ
Πίνακας 1: Συμπτώματα στην κυστική ίνωση ………22
Πίνακας 2: Κλινικές εκδηλώσεις της κυστικής ίνωσης στις διάφορες ηλικίες………24
Πίνακας 3: Παθολογικές εκδηλώσεις του γαστρεντερικού.………28
Πίνακας 4: Μεταλλάξεις του γονιδίου CFTR..………....93
Πίνακας 5: Ταξινόμηση των μεταλλάξεων του γονιδίου CFTR σύμφωνα με τις κλινικές επιπτώσεις τους. ………96
Πίνακας 6: Οι 23 κλασικές μεταλλάξεις που συνιστά το ACMG για τη διάγνωση της CF ………97
Πίνακας 7: Τροποποιητικά γονίδια στην CF ……….112
Πίνακας 8: Ευρήματα του NBS στην Ελλάδα ………...135
Πίνακας 9: Μεταλλάξεις του CFTR στην Ελλάδα ………136
Πίνακας 10: Θεραπευτική αντιμετώπιση συμπτωμάτων της κυστικής ίνωσης ……139
11
ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ
ΣΥΜΒΟΛΟ ΠΛΗΡΗΣ ΟΝΟΜΑΣΙΑ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ
AAV adeno-associated virus Αδενο-συσχετιζόμενοι
ιοί
ΑΑΤ A1 antitrypsin Α1 αντιθρυψίνη
AV Adenovirus Αδενοϊοί
ABC transporter ATP-binding cassette transporter Πρωτεΐνες μεταφοράς με θύλακα δέσμευσης για
το ATP
AC Acinar cells Παγκρεατοκυψελιδικά
κύτταρα ACTs Airway clearance techniques Τεχνικές εκκαθάρισης
των αεραγωγών AMPK AMP-activated protein kinase Πρωτεϊνική κινάση που
ενεργοποιείται από AMP
ANO1 Anoctamin-1 Δίαυλος ιόντων χλωρίου
που ενεργοποιείται από ασβέστιο
ΑΡ-1 Activator protein 1 Μεταγραφικός
παράγοντας που εμπλέκεται στον
κυτταρικό πολλαπλασιασμό, στην
κυτταρική
διαφοροποίηση και στην απόπτωση
AP2 Adaptor protein-2 Πρωτεΐνη προσαρμογέας
ASL airway surface liquid Υγρό επιφανείας
αεραγωγών
ASOs Antisense oligonucleotides Αντινοηματικά
ολιγονουκλεοτίδια
BC basal cells Βασικά κύτταρα
Cas protein CRISPR associated protein Πρωτεΐνη που συνδέεται με CRISPR CaCC Ca2+ activated chloride channel Δίαυλος χλωρίου που
ενεργοποιείται από ασβέστιο CBAVD congenital bilateral absence of the
vas deferens
Συγγενής αμφίπλευρη απουσία σπερματικών
πόρων
CC Ciliated cells Βλεφαριδοφόρα
12 κύτταρα
CHIP Carboxy terminus of Hsc70
interacting protein
Πρωτεΐνη που αλληλεπιδρά με το C-
άκρο της Hsp70 COP I, COP II Coated vesicles Ι,ΙΙ Επικαλυμμένα κυστίδια
με κλαθρίνη CREB cAMP response element-binding
protein
Μεταγραφικός παράγοντας που ανταποκρίνεται στο
cAMP
CF Cystic fibrosis Κυστική ίνωση
CFALD Cystic fibrosis-associated liver disease
Ασθένεια του ήπατος που συνδέεται με την
κυστική ίνωση CFBE CF bronchial epithelial cells Επιθηλιακά κύτταρα
βρόγχων ασθενών με CF
CFRD CF-related diabetes Διαβήτης που συνδέεται
με την κυστική ίνωση
cffDNA cell-free fetal DNA Ελεύθερο εμβρυικό
DNA CFSPID CF screen positive inconclusive
diagnosis
Θετική ασαφή διάγνωση της CF
CFTR Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator
Πρωτεΐνη ρυθμιστής διαμεμβρανικής αγωγιμότητας ιόντων
της κυστικής ίνωσης
CFTR-RD CFTR related diseases Ασθένειες που
σχετίζονται με την κυστική ίνωση CRISPR Clustered regularly interspaced
short palindromic repeats
Σύμπλεγμα μικρών παλινδρομικών αλληλουχιών τακτικής
χωροκατανομής CRMS CF related metabolic syndrome Μεταβολικό σύνδρομο
που σχετίζεται με την CF
CSP Cysteine string protein Πρωτείνη με κυκλικό
δάκτυλο κυστεΐνης που δρα ως μοριακή συνοδός CTCF protein Transcriptional repressor CTCF Πρωτεΐνη CTCF
καταστολέας μεταγραφής, που
δεσμεύεται στην
13 αλληλουχία CCCTC DIOS Distal intestinal obstruction
syndrome
Σύνδρομο απόφραξης περιφερικού εντέρου DHS DNase I hypersensitive site Θέση υπερευαισθησίας
στη νουκλεάση DNase I DNAJB12 DNAJB12 heat shock protein
family (Hsp40) member B12
Πρωτεΐνη μοριακή συνοδός ENaC Epithelial Sodium Channel Επιθηλιακός δίαυλος
νατρίου
EDNRA Endothelin receptor type A Υποδοχέας ενδοθηλίνης τύπου Α
ECL Extracellular loop Εξωκυτταρικός βρόχος
EEF1A1 Eukaryotic transcription
elongation factor 1 alpha 1
Ευκαρυωτικός παράγοντας επιμήκυνσης της
μεταγραφής eEF1 Eukaryotic elongation factor 1 Παράγοντας επιμήκυνσης μετάφρασης ευκαρυωτικών
ER Endoplasmic Reticulum Ενδοπλασματικό δίκτυο
eRF Eukaryotic translation termination factor (release factor)
Παράγοντας τερματισμού της
μετάφρασης ERAD Endoplasmic-reticulum-associated
protein degradation
Ενδοκυτταρική οδός που σημαδεύει λανθασμένα
αναδιπλωμένες πρωτεΐνες για αποικοδόμηση
ERGIC ER-Golgi intermediate
compartment
Μεμβρανικό διαμέρισμα που μεσολαβεί στην μεταφορά πρωτεϊνών από το ΑΕΔ στο Golgi
ERQC ER quality control Μηχανισμός ποιοτικού
ελέγχου πρωτεϊνών του ΑΕΔ
ESCs Embryonic stem cells Εμβρυικά
βλαστοκύτταρα FDA Food and Drug Administration Υπηρεσία Τροφίμων και
Φαρμάκων
FEV1 Forced one-second capacity Αναγκαστικά
εκπνεόμενος όγκος σε 1sec
14 FIS Forskolin induced swelling assay Προσδιορισμός
διόγκωσης που προκαλείται από
φορσκολίνη
GAGs Glycosaminoglycans Γλυκοζαμινογλυκάνες
GC Goblet cells Κυπελλοειδή κύτταρα
GERD Gastroesophageal reflux disease Ασθένεια
γαστροοισοφαγικής παλινδρόμησης GM1 Monosialotetrahexosylganglioside Γαγγλιοσίδιο της
πλασματικής μεμβράνης με ένα υπόλειμμα
σιαλικού οξέος GRASP55 Golgi reassembly stacking protein Πρωτεΐνη της
μεμβράνης του Golgi Gre Transcription elongation factor Παράγοντας
επιμήκυνσης κατά την μεταγραφή
gRNA Guide RNA Οδηγός RNA
HBECs Human Bronchial Epithelial Cells Ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα βρόγχων HD-Ad Helper-dependent adenoviral Υποβοηθούμενοι
αδενοϊοί
HGF Hepatocyte growth factor Παράγοντας αύξησης
επιθηλιακών, ενδοθηλιακών και αιμοποιητικών κυττάρων
HDR Homology directed repair Επιδιόρθωση που
κατευθύνεται από ομολογία
HIF-1 Hypoxia-Inducible Factor Μεταγραφικός
παράγοντας που ρυθμίζει την μεταγραφή γονιδίων σε καταστάσεις
υποξίας
HLA Human leukocyte antigen Αντιγόνο ανθρώπινων
λευκών αιμοσφαιρίων HNF1α Hepatocyte nuclear factor 1
homeobox A
Μεταγραφικός παράγοντας που ρυθμίζει την έκφραση
γονιδίων κυρίως στο ήπαρ
HRE Hypoxia response element Αλληλουχία σε
15 υποκινητές γονιδίων
στην οποία προσδένονται μεταγραφικοί παράγοντες σε καταστάσεις υποξίας
Hsp Heat shock proteins Πρωτείνες θερμικού
σοκ. Λειτουργούν ως μοριακοί συνοδοί κατά
την διακίνηση πρωτεϊνών στο κύτταρο
HTS Hypertonic saline Υπερτονικό αλατόνερο
ICL Intracellular loop Ενδοκυτταρικός βρόχος
ICM intestinal current measurement Μέτρηση του ρεύματος διαμέσου του εντερικού
επιθηλίου
IL-8 Interleukin 8 Ιντερλευκίνη-8,
πρωτεΐνη με σημαντικό ρόλο στην φλεγμονή iPSCs Induced pluripotent stem cells Eπαγόμενα πολυδύναμα
αρχέγονα κύτταρα
IRT Immunoreactive trypsinogen Ανοσοαντιδραστικό
θρυψινογόνο LES Lower esophageal sphincter Σφικτήρας στο κάτω
μέρος του οισοφάγου
lncRNAs Long non-coding RNAs Μεγάλα μη
κωδικοποιητικά mRNAs
MCC mucociliary clearance Βλεννοκροσσωτή
κάθαρση αεραγωγών
ΜΙ Meconium ileus Ειλεός μηκωνίου
MSCs Mesenchymal stem (stromal) cells Μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα
MSD Μembrane-spanning domain Διαμεμβρανική
επικράτεια mRNP Messenger ribonucleoprotein Σύμπλοκο mRNA με
συνδεδεμένες πρωτεΐνες
MUCs Mucins Βλεννίνες
NAC N-acetylcysteine Άμινο-ακέτυλο κυστείνη
NBD Νucleotide-binding domain Τομέας δέσμευσης
νουκλεοτιδίου
NBS newborn screening Ανίχνευση νεογνών
NF-kB Nuclear factor kappa- B cells, Σύμπλεγμα πρωτεϊνών
16 που λειτουργεί ως
μεταγραφικός παράγοντας NGS next-generation sequencing Αλληλούχιση επόμενης
γενιάς
NHEJ Non-homologous end joining
repair
Επιδιόρθωση DNA που δεν κατευθύνεται από
ομολογία NHERF1 Na+/H+ Exchanger Regulatory
Factor
Παράγοντας ρύθμισης του εναλλάκτη ιόντων
Na+/H+
NIPD Non-invasive prenatal diagnosis Μη επεμβατικός προγεννητικός έλεγχος NKCC1 Cotransporter Na+- K+- 2Cl- Συν-μεταφορέας ιόντων
Na+- K+- 2Cl-
NMD Νonsence mediated decay Καταστροφή των
mRNA που έχουν πρώιμο κωδικόνιο λήξης
NPD Nasal potential difference Διαφορά δυναμικού
ρινικού επιθηλίου ORCC Outwardly rectifying chloride
channel
Δίαυλος χλωρίου που επιτρέπει την έξοδο ιόντων χλωρίου από το
κύτταρο
PA Pseudomonas aeruginosa Ψευδομονάδα η
αεριογόνος ΡΑΒΡ poly-A binding protein Πρωτεΐνη που συνδέεται
στην πολυαδενυλιωμένη ουρά του mRNA
PCL Periciliary liquid Στρώμα υγρού που
περιβάλλει τις βλεφαρίδες του αναπνευστικού PCR Polymerase Chain Reaction Αλυσιδωτή αντίδραση
πολυμεράσης
PDC pancreatic ductal cells Κεντροκυψελιδικά
κύτταρα παγκρέατος
PEI Polyethylenimine Πολυαιθυλενιμίνη
PERT Pancreatic enzyme replacement therapy
Θεραπεία αναπλήρωσης των παγκρεατικών
ενζύμων
PIP2 Phosphatidylinositol 4,5-
bisphosphate
Ένα από τα κύρια φωσφολιπίδια της
17 πλασματικής μεμβράνης
ΡΚΑ Protein kinase A Πρωτεϊνική κινάση Α
PKC Protein kinase-C Πρωτεϊνική κινάση C
PKG GMP-dependent protein kinases Πρωτεϊνικές κινάσες που εξαρτώνται από το
κυκλικό GMP
PM Plasma membrane Πλασματική μεμβράνη
PN Proteostasis network Δίκτυο πρωτεόστασης
PMO Phosphorodiamidate morpholino oligomer
Φωσφοροδιαμιδικό μορφολίνο ολιγομερές PTC Premature termination codon- Πρώιμο κωδικόνιο
λήξης
PS Phosphorothioate bond Φωσφοροθειώδης
δεσμός
QPIT Quantitative Pilocarpine
Iontophoresis Test
Ποσοτική δοκιμή ιοντοφόρησης
πιλοκαρπίνης
Rab family Ras-related protein Οικογένεια
μικρών GTPασών Rac1 Rac family small GTPase 1 Σηματοδοτική πρωτεΐνη
της υπεροικογένειας RAS
RD Regulatory Domain Ρυθμιστικός τομέας
rDNase a Recombinant DNase a Ανασυνδυασμένη
ανθρώπινη δεοξυριβονουκλεάση Ι
RMA1 RING membrane-anchor 1 Πρωτείνη με κυκλικό
δάκτυλο με δράση λιγάσης
SBBO Small bowel bacterial overgrowth Υπεραύξηση βακτηρίων λεπτού εντέρου SLC family Solute carrier proteins Οικογένεια πρωτεϊνών
μεταφορέων της πλασματικής μεμβράνης SPD Sweat gland potential difference
assay
Μέθοδος διαφοράς δυναμικού ιδρωτοποιού
αδένα
SP1 Specificity protein 1 Μεταγραφικός
παράγοντας που προσδένεται σε επαναλαμβανόμενα
μοτίβα GC
SQSTM1/p62 Sequestosome-1/p62 Πρωτεΐνη που
18 στοχοποιεί άλλες πρωτεϊνες για αυτοφαγία SSOs Splice-switching oligonucleotides Ολιγονουκλεοτίδια
εναλλακτικού ματίσματος TALEN Transcription activator-like
effector nucleases
Νουκλεάσες που μοιάζουν με μεταγραφικούς
ενεργοποιητές
TMDs Transmembrane domains Διαμεμβρανικοί τομείς
ΤΝF-a Tumor necrosis factor a Παράγοντας νέκρωσης όγκων Α
Tr2GFB1 Transforming growth factor Αυξητικός παράγοντας μετασχηματισμού UPP Ubiquitin-proteasome pathway Οδός ουβικιτίνης-
πρωτεασώματος.
Μηχανισμός αποικοδόμησης
πρωτεϊνών
UTR Untranslated region Αμετάφραστη περιοχή
VX-661 Tezacaftor Μόριο-διορθωτής της
CFTR
VX-770 Ivacaftor, trade name Kalydeco Μόριο-ενισχυτής της CFTR
VX-809 Lumacaftor Μόριο-διορθωτής της
CFTR VRT-532 4-methyl-2-(5-phenyl-1H-pyrazol-
3-yl)-phenol
Μόριο-ενισχυτής της CFTR
YBX Y box binding protein Μεταγραφικός
παράγοντας με πολλαπλούς ρόλους
ZFNs Zinc finger nucleases Νουκλεάσες με
δάκτυλους ψευδαργύρου
19
ΜΕΡΟΣ Α - ΕΙΣΑΓΩΓΗ
Η κυστική ίνωση (Cystic Fibrosis-CF) είναι μια πλειοτροπική νόσος που αν και επηρεάζει όλα τα εξωκρινή επιθήλια του ανθρώπινου οργανισμού η νοσηρότητα και η θνησιμότητά της οφείλονται, σε μεγάλο βαθμό, στη χρόνια βακτηριακή μόλυνση και στη φλεγμονή των πνευμόνων. Η πάθηση εμφανίζεται συχνότερα στην Ευρωπαϊκή ήπειρο, παρόλο που έχει αναφερθεί σε όλες τις φυλές και τις εθνότητες Υπολογίζεται ότι 70.000 άνθρωποι νοσούν παγκοσμίως ενώ η συχνότητα γέννησης παιδιών με CF ποικίλει ανάλογα με την εθνική προέλευση.(1) Η συχνότητα γέννησης ατόμων με CF κυμαίνεται 1 στις 3.500 γεννήσεις στους Καυκάσιους, 1 στις 17.000 γεννήσεις στους Αφροαμερικανούς, 1 στις 40.000 γεννήσεις σε πληθυσμούς Ινδών ενώ είναι πολύ μικρή σε πληθυσμούς της Ανατολικής Ασίας.
Θεωρείται ότι η αρχική αιτία όλων των εκδηλώσεων της CF είναι η μειωμένη μεταφορά ανιόντων μέσω της κορυφαίας μεμβράνης των επιθηλιακών κυττάρων.
Εμφανίζει αυτοσωμικό υπολειπόμενο τύπο κληρονομικότητας, δηλαδή από ένα ζευγάρι φορέων του παθολογικού γονιδίου (που είναι υγιείς) υπάρχει πιθανότητα 25% να γεννηθεί παιδί με την ασθένεια.. Επίσης η βαρύτητα των συμπτωμάτων όπως και ο χρόνος εκδήλωσης αυτών εμφανίζει μεγάλη ετερογένεια.(2)
Η γενετική αιτία της CF είναι οι μεταλλάξεις στο γονίδιο του ρυθμιστή διαμεμβρανικής διακίνησης ιόντων (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator-CFTR). Η πρωτεΐνη CFTR που παράγεται από την έκφραση αυτού του γονιδίου λειτουργεί κυρίως ως δίαυλος ιόντων χλωρίου στην κορυφαία μεμβράνη των επιθηλιακών κυττάρων σε πολλά όργανα του σώματος. Έχουν καταγραφεί περίπου 2000 διαφορετικές μεταλλάξεις του γονιδίου αυτού, οι οποίες ταξινομούνται σε έξι τάξεις και έχουν ως αποτέλεσμα έλλειψη της έκφρασης του γονιδίου, την κακή λειτουργία ή αστάθεια της πρωτεΐνης στην πλασματική μεμβράνη. (3)
Λόγω της μεγάλης ετερογένειας συμπτωμάτων της CF αλλά και λόγω των πολλών μεταλλάξεων που έχουν εντοπιστεί στο γονίδιο CFTR το να γίνει σχετικά νωρίς η διάγνωση της CF με απόλυτη βεβαιότητα συνεχίζει να αποτελεί μία πρόκληση για την επιστημονική κοινότητα. Τα τελευταία χρόνια έχει σημειωθεί σημαντική αύξηση των πληροφοριών σχετικά με την ποικιλία φαινοτύπων και γονοτύπων της CF οι οποίες μπορούν να βοηθήσουν στην ερμηνεία της κατάστασης της νόσου σε αρκετούς ασθενείς. Παρόλα αυτά ακόμη και σήμερα η πιο αξιόπιστη και ευρέως διαθέσιμη διαγνωστική εξέταση για την CF είναι η μέτρηση της
20 συγκέντρωσης ιόντων χλωρίου στον ιδρώτα η οποία ήταν και η πρώτη διαγνωστική τεχνική που χρησιμοποιήθηκε. Αυτό αποτελεί κύριο χαρακτηριστικό της ασθένειας και εντοπίστηκε κατά τη διάρκεια καύσωνα το καλοκαίρι του 1948 όταν ο Δρ Paul de Sant'Agnese εξετάζοντας βρέφη που παρουσίαζαν αφυδάτωση στη Νέα Υόρκη ανακάλυψε ότι ο ιδρώτας των παιδιών με ΚΙ είχε ασυνήθιστα υψηλές συγκεντρώσεις αλάτων.(4)
Κατά τη διάρκεια των τελευταίων τεσσάρων δεκαετιών η επιβίωση των ασθενών με CF προοδευτικά βελτιώθηκε. H μέση προβλεπόμενη ηλικία επιβίωσης των ασθενών αυξήθηκε από 25 χρόνια το 1985 σε 37 έτη το 2008 ενώ οι ασθενείς που γεννήθηκαν σήμερα αναμένεται να ζήσουν έως και εξήντα χρόνια. Η παρατηρούμενη αύξηση στο προσδόκιμο επιβίωσης των ασθενών με CF οφείλεται στην καλύτερη κατανόηση της φυσικής εξέλιξης της νόσου η οποία οδηγεί σε θεραπείες που στοχεύουν στις λοιμώξεις του αναπνευστικού συστήματος, στη φλεγμονή, στην κάθαρση των βλεννογόνων και στη διατροφική επάρκεια. Παρά το γεγονός ότι ακόμη δεν υπάρχει αποτελεσματική θεραπεία για την CF, η προγεννητική διάγνωση η οποία εφαρμόζεται σε ζευγάρια που είναι γνωστό ότι και οι δύο γονείς είναι φορείς μετάλλαξης προσφέρει πολλά οφέλη στους υποψήφιους γονείς. (5)
Εκτός από τις θεραπείες που στοχεύουν στα συμπτώματα της ασθένειας έχουν αναπτυχθεί και θεραπείες που έχουν ως στόχο την γενετική βλάβη (γονιδιακή θεραπεία, γονιδιακή επιδιόρθωση) αλλά και θεραπείες που στοχεύουν στην διόρθωση της πρωτεΐνης CFTR (θεραπεία μέσω διορθωτών). Το πιο πρόσφατο εργαλείο, που χρησιμοποιείται δοκιμαστικά προς το παρόν, είναι το σύστημα μιας νουκλεάσης που εντοπίστηκε σε βακτήρια και σε αρχαία και μπορεί να προκαλεί θραύσεις και στη συνέχεια επιδιόρθωση του DNA σε επιλεγμένες αλληλουχίες. Το σύστημα αυτό ονομάζεται CRISPR/Cas9 και παρά τις προκλήσεις που παρουσιάζονται, η τεχνολογία αυτή δίνει πολλές υποσχέσεις για την εισαγωγή της γονιδιακής θεραπείας στην κλινική πρακτική. (6)
Ο στόχος της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι η ανασκόπηση των πρόσφατων ευρημάτων σχετικά με την κυστική ίνωση. Ιδιαίτερη έμφαση δίνεται στα ευρήματα που αφορούν στους μοριακούς μηχανισμούς και στις νέες τεχνικές έγκαιρης διάγνωσης και αποτελεσματικής θεραπείας της ασθένειας.
21
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1. ΚΛΙΝΙΚΑ ΣΥΜΠΤΩΜΑΤΑ ΚΑΙ ΠΑΘΟΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ ΚΥΣΤΙΚΗΣ ΙΝΩΣΗΣ
1.1 Γενικά χαρακτηριστικά της νόσου
Αν και η κυστική ίνωση επηρεάζει όλα τα εξωκρινή επιθήλια του ανθρώπινου οργανισμού, η νοσηρότητα και η θνησιμότητα που προκαλεί οφείλονται, σε μεγάλο βαθμό, στη χρόνια βακτηριακή μόλυνση και στη φλεγμονή των πνευμόνων. Θεωρείται ότι η αρχική αιτία όλων των εκδηλώσεων της CF είναι η μειωμένη μεταφορά ανιόντων μέσω της κορυφαίας μεμβράνης των επιθηλιακών κυττάρων. Επηρεάζει τους αεραγωγούς των πνευμόνων, το πάγκρεας, το αρσενικό αναπαραγωγικό σύστημα, το έντερο, το συκώτι, τα οστά και τους νεφρούς. Η πάθηση εμφανίζεται συχνότερα στην Ευρωπαϊκή ήπειρο ενώ έχει αναφερθεί σε όλες τις φυλές και τις εθνότητες. Επίσης η βαρύτητα των συμπτωμάτων όπως και ο χρόνος εκδήλωσης αυτών εμφανίζει μεγάλη ετερογένεια.
Η διαμεμβρανική πρωτεΐνη που ευθύνεται γι’ αυτή τη μεταφορά ιόντων και εκφράζεται στη μεμβράνη των επιθηλιακών κυττάρων ονομάζεται ρυθμιστής διαμεμβρανικής αγωγιμότητας κυστικής ίνωσης ((cystic fibrosis transmembrane conductance regulator-CFTR). Η CFTR λειτουργεί κυρίως ως αγωγός ιόντων χλωρίου ρυθμιζόμενος από το cAMP αλλά ρυθμίζει επίσης και τη δράση άλλων πρωτεϊνών-μεταφορέων της μεμβράνης διαδραματίζοντας βασικό ρόλο στην κίνηση ιόντων και νερού στους επιθηλιακούς ιστούς. (1,5)
Η απόφραξη των αγωγών του παγκρέατος με πυκνές εκκρίσεις προκαλεί την αυτόλυση του παγκρεατικού ιστού με αντικατάσταση του σώματος του παγκρέατος από λιπώδη ιστό, οδηγώντας στην παγκρεατική ανεπάρκεια με επακόλουθο τον υποσιτισμό. Στους πνεύμονες, η δυσλειτουργία της CFTR οδηγεί στην εξάντληση του υγρού της επιφάνειας των αεραγωγών (airway surface liquid-ASL) και στον σχηματισμό παχύρρευστης και κολλώδους βλέννας η οποία προσκολλάται στις επιφάνειες των αεραγωγών. Το αποτέλεσμα είναι η μειωμένη κάθαρση των βλεννογόνων (mucociliary clearance-MCC), o εποικισμός μικροβίων και η εξασθένιση της άμυνας του ξενιστή. Η ενδοβρογχική μόλυνση με περιορισμένο φάσμα διακριτών βακτηρίων και η υπερβολική φλεγμονώδη απόκριση οδηγεί στην
22 ανάπτυξη βρογχιεκτασίας και προοδευτικής αποφρακτικής ασθένειας των αεραγωγών. Η πνευμονική ανεπάρκεια είναι υπεύθυνη για τους περισσότερους θανάτους που σχετίζονται με την κυστική ίνωση.(5)
Όργανο Συμπτώματα Συχνότητα
Πνεύμονες Χρόνια πνευμονία, ίνωση 99%
Ανώτερο αναπνευστικό Χρόνια ρινοκολπίτιδα 61%
Πολύποδες στην μύτη και στους κόλπους
46%
Συκώτι στεάτωση 25-60%
κίρρωση 10%
χολοκυστολιθίαση 15%
Πάγκρεας Ανεπάρκεια εξωκρινούς
μοίρας
87%
παγκρεατίτιδα 2%
Σακχαρώδης διαβήτης 32%
Έντερο Ειλεός μηκωνίου 20%
Σύνδρομο εντερικής απόφραξης
6%
Αναπαραγωγική οδός Αποφρακτική αζωοσπερμία
97%
Πίνακας 1: Συμπτώματα στην κυστική ίνωση από Naehrig et al (2017)
Συμπτώματα που επίσης παρατηρούνται είναι η αύξηση της συγκέντρωσης χλωρίου στον ιδρώτα και η ανδρική υπογονιμότητα. (7) Η πρωτεΐνη CFTR παίζει άμεσο ρόλο και σε άλλα όργανα, όπως ο υποθάλαμος και τα οστά, όπου η δυσλειτουργία του CFTR μπορεί να οδηγήσει σε καθυστέρηση της γραμμικής ανάπτυξης, σε καθυστερημένη έναρξη της εφηβείας, σε διαμόρφωση της οστικής πυκνότητας και σε ευαισθησία σε νεφρολιθιάσεις, οι οποίες μπορεί να υπάρχουν σε άτομα με CF και για πολλά χρόνια να θεωρούνται δευτερεύοντα σε σχέση με τα συμπτώματα του αναπνευστικού και του γαστρεντερικού. Εκτός αυτού, η CFTR εμπλέκεται σε αρκετούς φυσιολογικούς μηχανισμούς που αφορούν την φυσική ανοσία ή την ανοσοαπόκριση, η οποία με τη σειρά της παίζει ρόλο στην ανάπτυξη της ασθένειας στους πνεύμονες.(8)
Επειδή τα τελευταία χρόνια οι ασθενείς με κυστική ίνωση ζουν περισσότερο έχει καταστεί σαφές ότι η κυστική ίνωση σχετίζεται και με την υψηλότερη συχνότητα
23 εμφάνισης εντερικών καρκίνων οι οποίοι εμφανίζονται σε νεαρότερη ηλικία από ότι στον γενικό πληθυσμό. Ωστόσο, οι λόγοι γι’ αυτό είναι ασαφείς αυτή τη στιγμή.(9)
Εικόνα 1: Βασικά χαρακτηριστικά της κυστικής ίνωσης και σχετική συμβολή των μεταλλάξεων του γονιδίου CFTR σε επιλεγμένα χαρακτηριστικά της κυστικής ίνωσης.
(Από Cutting Garry R, 2015)
Στο άλλο άκρο του φάσματος των συμπτωμάτων βρίσκονται διάφορες διαταραχές που σχετίζονται με την CF. Αυτές έχουν ως βασική αιτιολογία τις μεταλλάξεις στο γονίδιο CFTR αλλά δεν προκαλούν τη συνηθισμένη εικόνα της CF.
Αυτές οι κλινικές εκδηλώσεις περιορίζονται σε ένα σύστημα οργάνων και περιλαμβάνουν επεισόδια επαναλαμβανόμενης παγκρεατίτιδας ή απομονωμένη αμφοτερόπλευρη βρογχιεκτασία. Τα αρσενικά άτομα μπορεί να εκδηλώσουν συγγενή αμφίπλευρη έλλειψη σπερματικού πόρου (congenital bilateral absence of the vas deferens-CBAVD) χωρίς εμπλοκές στο πεπτικό ή στο αναπνευστικό σύστημα.
24 Τέλος, η μεγάλη μεταβλητότητα της κλινικής εικόνας, ιδιαίτερα στην ασθένεια των πνευμόνων, υποδηλώνει ότι παράγοντες ανεξάρτητοι από την CFTR παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη της κλινικής εμφάνισης μεμονωμένων ασθενών.
0-2 ετών αποβιώνουν στεατόρροια
επαναλαμβανόμενες λοιμώξεις αναπνευστικού συμπεριλαμβανομένης της βρογχιολίτιδας / βρογχίτιδας ειλεός μηκωνίου
πρόπτωση ορθού
Οίδημα / υποπρωτεϊναιμία / "kwashiorkor" μεταβολές του δέρματος
σοβαρή πνευμονία / εμπύημα
θερμοπληξία λόγω εξάντλησης άλατος παρατεταμένος νεογνικός ίκτερος
ανεπάρκεια βιταμίνης Κ με αιμορραγική διάθεση
3–16 ετών επαναλαμβανόμενες λοιμώξεις αναπνευστικού και άσθμα ιδιοπαθείς βρογχεκτασίες
στεατόρροια
ρινικοί πολύποδες και ιγμορίτιδα
χρόνια απόφραξη του εντέρου, ενοχλήσεις Θερμοπληξία με υπονατριαιμία
Ενήλικη ζωή (συχνά άτυπη κυστική ίνωση)
Αζωοσπερμία/ συγγενής απουσία σπερματικών πόρων βρογχεκτασία
χρόνια ιγμορίτιδα
οξεία ή χρόνια παγκρεατίτιδα
αλλεργική βρογχοπνευμονική ασπεργίλλωση κίρρωση της χολής του εστιακού μέρους μη φυσιολογική ανοχή στην γλυκόζη πυλαία υπέρταση
χολοκυστίτιδα/ χολολιθίαση
Πίνακας 2: Κλινικές εκδηλώσεις της κυστικής ίνωσης στις διάφορες ηλικίες που χρησιμοποιούνται στην διάγνωση (Από Hodson and Geddes, 2016)
1.2 Εξηγώντας την γεωγραφική κατανομή της κυστικής ίνωσης
Η συχνότητα γέννησης ατόμων με CF κυμαίνεται 1 στις 3.500 γεννήσεις στους Καυκάσιους, 1 στις 17.000 γεννήσεις στους Αφροαμερικανούς, 1 στις 40.000
25 γεννήσεις σε πληθυσμούς Ινδών ενώ είναι πολύ μικρή σε πληθυσμούς της Ανατολικής Ασίας.(2) Η ηλικία της πιο συχνής μετάλλαξης, της F508del, εκτιμάται ότι είναι περίπου 600 γενιές. Πολλές υποθέσεις προτάθηκαν αρχικά για να εξηγήσουν την υψηλή συχνότητα της CF στην Ευρώπη, όπως οι συνδυασμοί μεταλλάξεων με υψηλό ποσοστό, η αρχή του ιδρυτή, η γενετική παρέκκλιση και το πλεονέκτημα του ετεροζυγώτη. Όμως οι υποθέσεις που δεν λαμβάνουν υπόψην το πλεονέκτημα του ετεροζυγώτη έχουν βρεθεί ασύμβατες με τα δεδομένα των μικροδορυφορικών αλληλουχιών DNA και δεδομένα απλοτύπων όπως και την εμφάνιση της CF σε πολλές χώρες της Ευρώπης, τον πληθυσμό και την ιστορία της Ευρώπης και τη σχετική απουσία της CF εκτός Ευρώπης.
Η αρχικά επικρατούσα άποψη για τις υποψήφιες ασθένειες που θα μπορούσαν να προσδώσουν επιλεκτικό πλεονέκτημα στους ετερόζυγους της CF η οποία υποστηρίζεται από τη μοριακή έρευνα αφορούσε εντερικές ασθένειες όπως ο τυφοειδής πυρετός και η εκκριτική διάρροια της χολέρας.
Εικόνα 2: Πληθυσμιακή κατανομή της κοινής μετάλλαξης F508del στην Ευρώπη (Από Καναβάκης, Τζέτη 2006)(10)
Οι Poolman et al (2007) χρησιμοποιώντας ιστορικά δημογραφικά και επιδημιολογικά δεδομένα, πρότειναν ότι ούτε η χολέρα ούτε ο τυφοειδής πυρετός αποτελούν την προϋπόθεση επαρκούς επιλεκτικής πίεσης για την σύγχρονη εμφάνιση της κυστικής ίνωσης. Οι επιστήμονες κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι μόνο η αντίσταση στη φυματίωση θα ήταν επαρκής πηγή επιλεκτικής πίεσης για να οδηγήσει
26 στις σημερινές συχνότητες της CF. Η ανακάλυψη ότι η τοξίνη του βακτηρίου Escherichia coli δρα μέσω της πρωτεΐνης CFTR αύξησε το ενδιαφέρον για την ιδέα ότι η εκκριτική διάρροια έπαιξε ρόλο στην εμφάνιση της CF. Μια παρόμοια τοξίνη παράγεται στη χολέρα, που επίσης προκαλεί εκκριτική διάρροια. Οι κλινικές ενδείξεις για την αντίσταση στην εκκριτική διάρροια είναι στην καλύτερη περίπτωση ασαφείς ενώ δεν υπάρχει απόδειξη αντοχής στη διάρροια χωρίς εκκριτική τοξίνη.
Ο αιτιολογικός παράγοντας του τυφοειδούς πυρετού, Salmonella enterica serovar Typhi, απαιτεί την άγριου τύπου CFTR για να εισέλθει στην γαστρεντερική οδό ποντικιών. Το ποσοστό λειτουργικής CFTR μειώνεται σημαντικά σε ετερόζυγα ποντίκια για την μετάλλαξη F508del, υποδηλώνοντας ένα ρόλο για τις μεταλλάξεις της CF στην πρόληψη του τυφοειδούς πυρετού. Ωστόσο, μια κλινική μελέτη στην Ινδονησία, μια περιοχή με ιδιαίτερα ενδημικό τον τυφοειδή πυρετό, δεν βρήκε μεταλλάξεις F508del σε δείγματα από 775 άτομα. Έτσι, λείπουν τα κλινικά στοιχεία τα οποία να υποστηρίζουν ένα ρόλο για τις μεταλλάξεις της CFTR στην αντίσταση έναντι του τυφοειδούς πυρετού.
Πρόσφατα θεωρήθηκε ότι η αντίσταση στη φυματίωση ασθενών με CF προκύπτει από τη μειωμένη δραστηριότητα του ενζύμου αρυλοσουλφατάση Β. Το Mycobacterium tuberculosis στερείται εσωτερικής δραστικότητας της αρυλοσουλφατάσης, αλλά το βακτήριο έχει μια αρυλοσουλφοτρανσφεράση η οποία μπορεί να απαιτεί θειικό άλας που απελευθερώνεται από την αρυλοσουλφατάση του ξενιστή για την κατασκευή του κυτταρικού του τοιχώματος. Το περιεχόμενο του κυτταρικού τοιχώματος σε θειικό συσχετίζεται με την λοιμογόνο δράση. Έτσι, η δυσλειτουργία της αρυλοσουλφατάσης κατά την CF υποτίθεται ότι προστατεύει από τη φυματίωση με τη στέρηση από τα βακτήρια μιας απαραίτητης θρεπτικής ουσίας.
Επίσης, υπάρχουν κλινικές ενδείξεις σύνδεσης μεταξύ της CF και της αντοχής στη φυματίωση. Έχει παρατηρηθεί μεταξύ ετεροζυγωτών ένα χαμηλότερο ποσοστό θνησιμότητας λόγω φυματίωσης ενώ έχει σημειωθεί από αρκετούς ερευνητές η χαμηλή επίπτωση της φυματίωσης στους ασθενείς με CF, ιδιαίτερα σε σχέση με μη φυματιώδη μυκοβακτηρίδια. Έτσι, η φυματίωση υποστηρίζεται και από μοριακά και από κλινικά στοιχεία.
Η γεωγραφική κατανομή της CF βρίσκεται σε έντονη αντίθεση με τη γεωγραφική εξάπλωση του τυφοειδή πυρετού και της χολέρας, οι οποίες είναι συχνότερες στις τροπικές περιοχές. Η ιστορική-γεωγραφική κατανομή της φυματίωσης ταιριάζει πιο στενά με εκείνη της CF, επειδή ενώ η φυματίωση υπήρξε
27 ενδημική παγκοσμίως για τουλάχιστον 15.000 χρόνια, μια επιδημία φυματίωσης με θνησιμότητα ρεκόρ ξέσπασε στην Ευρώπη στις αρχές του δέκατου έβδομου αιώνα. Η επιδημία δεν εξαπλώθηκε στην Ινδία, την Αφρική και την Αφρική και σε άλλα μέρη του κόσμου παρά στα τα τέλη του 19ου αιώνα.(11)
Οι Miguel A. et al (2010) προτείνουν μία άλλη υπόθεση για να εξηγήσουν την σημερινή κατανομή της CF στην Ευρώπη. Προτείνουν ότι η υψηλή συχνότητα της CF και ειδικότερα της πιο κοινής μετάλλαξη F508del στους τρέχοντες πληθυσμούς που προέρχονται από την Ευρώπη μπορεί να είναι συνέπεια της επίπτωσης των επιλεκτικών πιέσεων που προκαλούνται από τη μετάδοση παθογόνων παραγόντων από τα κατοικίδια ζώα, κυρίως βοοειδή, στον άνθρωπο. Οι εντερικές μολυσματικές ασθένειες ήταν πιθανώς ένα σημαντικό πρόβλημα υγείας για τους νεολιθικούς λαούς.
Σε ένα τέτοιο πλαίσιο, μια γονιδιακή μετάλλαξη που προσδίδει αυξημένη αντίσταση στις ασθένειες που προκαλούνται από παθογόνα που μεταδίδονται από βοοειδή γαλακτοπαραγωγής θα αποτελούσε ένα σαφές επιλεκτικό πλεονέκτημα, ιδιαίτερα σε εκείνες τις ομάδες ανθρώπων όπου το αγελαδινό γάλα έγινε ουσιαστικό συστατικό της διατροφής. Αυτό το επιλεκτικό πλεονέκτημα οφείλεται στην αυξημένη αντίσταση στις διάρροιες με τις οποίες αποβάλλονται ιόντα Cl- εκείνων των ατόμων που έφεραν ένα μόνο αντίγραφο της F508del (αντίσταση ετεροζυγώτη).
Αυτή η υπόθεση υποστηρίζεται από την ισχυρή συσχέτιση μεταξύ της γεωγραφίας της διάχυσης του κτηνοτροφίας βοοειδών και τη γεωγραφική κατανομή της πιο κοινής μετάλλαξης που προκαλεί κυστική ίνωση (F508del). Η συστηματική αλληλεπίδραση των ανθρώπων με μολυσματικά παθογόνα θα είχε ξεκινήσει στη Βόρεια Ευρώπη, οι πρώτοι αγρότες των βορειοευρωπαϊκών πεδιάδων κινούνται προοδευτικά προς τα νότια με τη διάδοση των βοσκοτόπων. Αυτή η βαθμιαία έκθεση στην επιδημική θνησιμότητα μεταξύ των πληθυσμών που βρίσκονται περαιτέρω και πιο νότια στην Ευρώπη, καθώς επεκτάθηκε ο βοσκότοπος των βοοειδών, θα μπορούσε να προκαλέσει διαφορές στις συχνότητες των γονιδίων της CFTR, διαμορφώνοντας έτσι τις διαβαθμίσεις της συχνότητας των γεωγραφικών παραμέτρων που παρατηρούνται στους σημερινούς ευρωπαϊκούς πληθυσμούς.(12)
1.3 Κλινικά συμπτώματα στη γαστρεντερική οδό
Το γονίδιο CFTR εκφράζεται κατά μήκος της γαστρεντερικής οδού και τα προβλήματα λόγω απώλειας της λειτουργίας της CFTR στο πάγκρεας και στο έντερο
28 αρχίζουν ήδη από την εμβρυϊκή ζωή. Τα προβλήματα από την δυσλειτουργία του γαστρεντερικού συστήματος στους ασθενείς με CF είναι ουσιώδη όπως φαίνεται στον πίνακα 3.
Γαστρεντερικές εκδηλώσεις στην κυστική ίνωση
Ποσοστό εμφάνισης
Παγκρεατική ανεπάρκεια 85%
Υπερανάπτυξη βακτηρίων στο λεπτό έντερο 30-55%
Γαστροοισοφαγική παλινδρόμηση 20-80%
Δυσκοιλιότητα 26-47%
Σύνδρομο απόφραξης εντέρου 16%
Ειλεός μηκωνίου 6-20%
Φορείς του βακτηρίου Clostridium difficile 22-32%
Helicobacter pylori 10%–60%
Πρόπτωση ορθού 10%–20%
Εγκολεασμός 1%
Σκωληκοειδίτιδα 1-2%
Πίνακας 3: Παθολογικές εκδηλώσεις του γαστρεντερικού σε ασθενείς με κυστική ίνωση (Από Hodson and Geddes, 2016)
1.3.1 Διαταραχές του παγκρέατος
Η μη φυσιολογική λειτουργία του γονιδίου CFTR σε επιθηλιακά κύτταρα των αγωγών του παγκρέατος. έχει ως αποτέλεσμα οι παγκρεατικές εκκρίσεις να έχουν μειωμένη ποσότητα νερού και χαμηλό pH (όξινο). Το αυξημένο ιξώδες του περιεχομένου του αυλού και η παρουσία παγκρεατικών ενζύμων προκαλούν απόφραξη και προοδευτική καταστροφή των λοβών, φλεγμονή, σχηματισμό κύστεων και ίνωση (επιδιόρθωση και αντικατάσταση ερεθισμένων ιστών ή οργάνων με συνδετικό ιστό η οποία έχει ως αποτέλεσμα την αντικατάσταση των φυσιολογικών κυττάρων με ινοβλάστες και τελικά, την αντικατάσταση του φυσιολογικού ιστού των οργάνων με ουλώδη ιστό). Εξ ου και η πλήρης ονομασία της νόσου: κυστική ίνωση του παγκρέατος.(13)
Το ανθρώπινο μητρικό γάλα περιέχει σε χαμηλά επίπεδα αμυλάση και λιπάση, κάτι που μπορεί να καθυστερήσει την εμφάνιση συμπτωμάτων μέχρι τον απογαλακτισμό. Ένδειξη για την παρουσία παγκρεατικής ανεπάρκειας στην παιδική ηλικία μπορεί να αποτελεί το γεγονός ότι εμφανίζονται και άλλες εκδηλώσεις της CF.
Οι περισσότεροι ασθενείς έχουν σοβαρή δυσλειτουργία (παγκρεατική ανεπάρκεια)
29 που οδηγεί σε στεατόρροια και δυσαπορρόφηση θρεπτικών συστατικών που εκδηλώνεται κατά το πρώτο έτος της ζωής.
Οι ενήλικοι ασθενείς με CF που αναπτύσσουν παγκρεατική ανεπάρκεια επιδεικνύουν χαρακτηριστικά που εμφανίζονται και σε άτομα που δεν πάσχουν από CF, όπως κοιλιακή διάταση και δυσφορία, στεατόρροια (λιπαρές, δύσοσμες, μεγάλες σε όγκο και αριθμό, πολτώδεις κενώσεις), επιπλέοντα κόπρανα, αέρια και απώλεια βάρους. Η ανεπαρκής εξωκρινής λειτουργία του παγκρέατος έχει ως αποτέλεσμα την αδυναμία πέψης των πολύπλοκων υδατανθράκων, των πρωτεϊνών και του λίπους λόγω ανεπάρκειας αμυλάσης, πρωτεάσης και λιπάσης, αντίστοιχα. Η δυσαπορρόφηση του λίπους είναι εξέχουσα, καθώς η δράση της λιπάσης μειώνεται περαιτέρω εξαιτίας της μειωμένης έκκρισης διττανθρακικού από το πάγκρεας, κάτι που ευνοεί τη μετουσίωση αυτών των ενζύμων λόγω του όξινου περιβάλλοντος.(8)
Ο γονότυπος του ασθενούς με CF συσχετίζεται άμεσα με την εξωκρινή λειτουργία του παγκρέατος ενώ η ύπαρξη ασθενών που εμφανίζουν καθυστερημένα την παγκρεατική ανεπάρκεια υποδεικνύει την πιθανή συμμετοχή γενετικών τροποποιητών. Το ανοσοαντιδραστικό θρυψινογόνο (Immunoreactive trypsinogen- IRT), που είναι ένας πρόδρομος του παγκρεατικού θρυψινογόνου, εντοπίζεται στον ορό σε μεγαλύτερες συγκεντρώσεις στα νεογνά με CF και χρησιμεύει ως δείκτης για τον εντοπισμό νεογνών με CF. Σε νέους ασθενείς με CF που αναπτύσσουν ανεπάρκεια της εξωκρινούς παγκρεατικής λειτουργίας τα επίπεδα IRT μειώνονται ραγδαία.(14) Για τη διάγνωση της ανεπάρκειας της εξωκρινούς μοίρας του παγκρέατος χρησιμοποιείται επίσης η μέτρηση των παγκρεατικών ενζύμων στα κόπρανα. Συνήθως μετράται η συγκέντρωση της ελαστάσης-1. Η απόφραξη των αγωγών σε ασθενείς με μερική παγκρεατική λειτουργία μπορεί να προκαλέσει υποτροπιάζοντα επεισόδια παγκρεατίτιδας και, μακροπρόθεσμα, τη συνολική απώλεια της ικανότητας έκκρισης ενζύμων.(13)
Η κακή απορρόφηση των λιπών, των πρωτεϊνών και των λιποδιαλυτών βιταμινών είναι αποτέλεσμα της ανεπαρκούς παρα