ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΚΡΗΤΗΣ
ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ
ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΙΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ – ΔΙΑΧΕΙΡΙΣΗ ΧΕΡΣΑΙΩΝ ΚΑΙ ΘΑΛΑΣΣΙΩΝ ΒΙΟΛΟΓΙΚΩΝ ΠΟΡΩΝ
Μεταπτυχιακή διατριβή
Μελέτη της παρασιτικής πανίδας εκτρεφόμενου μαγιάτικου. Βιολογία, κύκλος ζωής και ποικιλότητα παρασίτων
Σεϊμένης Νίκος
Ηράκλειο 2016
2
UNIVERSITY OF CRETE
POST GRADUATE STUDIES PROGRAM
ENVIRONMENTAL BIOLOGY AND MANAGEMENT OF TERRESTRIAL AND MARINE RESOURCES
Master of Science Thesis
Study of parasitic fauna of farmed greater amberjack. Biology, life cycle and diversity of parasites
Seimenis Nikos
Heraklion 2016
3 Η διπλωματική αυτή διατριβή πραγματοποιήθηκε στο:
Ινστιτούτο Θαλάσσιας Βιολογίας, Βιοτεχνολογίας & Υδατοκαλλιεργειών Ελληνικό Κέντρο Θαλασσίων Ερευνών, Ηράκλειο Κρήτης
Εξεταστική επιτροπή Επιβλέπων καθηγητής
Μιχάλης Παυλίδης (Καθηγητής, Πανεπιστήμιο Κρήτης) Μέλη εξεταστικής επιτροπής
Παντελής Καθάριος (Ερευνητής, Ινστιτούτου Θαλάσσιας Βιολογίας, Βιοτεχνολογίας και Υδατοκαλλιεργειών, ΕΛΚΕΘΕ)
Νικόλαος Πουλακάκης (Αναπληρωτής Καθηγητής, Πανεπιστήμιο Κρήτης)
4 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ
Σε αυτή τη στήλη θα ήθελα να εκφράσω την ειλικρινή ευγνωμοσύνη μου σε όλους αυτούς που βοήθησαν να ολοκληρωθεί αυτή η εργασία.
Ένα πολύ μεγάλο ευχαριστώ στον καθηγητή μου από το Πανεπιστήμιο Κρήτης, τον κύριο Μιχάλη Παυλίδη που δέχτηκε να επιβλέψει την εργασία μου και κυρίως για την συνολική βοήθεια, τις συμβουλές του και την ηθική στήριξη καθ’ όλη τη διάρκεια του μεταπτυχιακού. Επίσης τον κύριο Νικόλαο Πουλακάκη που δέχτηκε να συμμετάσχει στην εξεταστική επιτροπή.
Στη Ντίντα Κοκκάρη και τα υπόλοιπα παιδιά του εργαστηρίου ένα τεράστιο ευχαριστώ που έλυσαν την κάθε απορία μου και βοήθησαν σε κάθε δύσκολη στιγμή.
Παναγιώτη, Μαριάννα και Μαρία σας οφείλω πραγματικά πάρα πολλά.
Ιδιαίτερη σημασία έχουν επίσης όλοι οι άνθρωποι που γνώρισα στο ΕΛ.ΚΕ.Θ.Ε. και βοήθησαν με κάθε δυνατό τρόπο για να ολοκληρωθεί αυτή η εργασία.
Οι κύριοι Ντίνος Μυλωνάς και Γιάννης Φακριάδης που με πήραν μαζί τους για τα πρώτα μου ερευνητικά ταξίδια, ο κύριος Νίκος Παπανδρουλάκης για τη βοήθειά του στις δειγματοληψίες στη Σούδα, ο Κάσπερ, η Μαρία, ο Νίκος, ο Στέλιος, ο Γιώργος και η Γιάννα όλοι πάντα με το πιο όμορφο χαμόγελο. Τον Χρήστο και τον Μιχάλη στη Μονάδα της Σούδας που κάνουν τα πάντα για να μας βοηθήσουν σε κάθε δειγματοληψία.
Δε μπορώ να ξεχάσω ανθρώπους του diversify που μου παρείχαν απλόχερα τη βοήθειά τους και το χαμόγελό τους έστω αυτό το λίγο διάστημα που τους γνώρισα, τον κύριο Γιώργο Ρήγο και τον Aldo Corriero.
Οφείλω πολλά στην οικογένεια μου για τη στήριξη, ψυχολογική και οικονομική. Στην Άττικα που είναι πάντα δίπλα μου ακόμα και στα δυσάρεστα και με το μαγικό της ραβδάκι τα κάνει ευχάριστα. Η αγάπη της και η υπομονή της μου έδωσαν τη δύναμη και με ώθησαν στην ολοκλήρωση αυτού του κύκλου σπουδών.
5 Τέλος θέλω να αναφερθώ στον άνθρωπο που αρχικά με ενέπνευσε και στη συνέχεια δείχνοντάς μου εμπιστοσύνη με δέχτηκε στο χώρο του και μου έδωσε την ευκαιρία να ασχοληθώ με αυτό το αντικείμενο. Η στήριξη που μου παρείχε απλόχερα στις δύσκολες στιγμές και η επιμονή του στις κρίσιμες, αποτέλεσαν τον θεμέλιο λίθο αυτής της διατριβής. Νομίζω ότι όσα και αν πω για τον Παντελή, δε μπορώ να εκφράσω αυτό που νιώθω. Ένα απλό ευχαριστώ είναι λίγο.
6
Περιεχόμενα
Περίληψη ... 8
Abstract ... 9
Εισαγωγή ... 10
Μεσογειακή και Ελληνική Υδατοκαλλιέργεια ... 11
Μαγιάτικο Seriola dumerili (Risso, 1810) ... 13
Ασθένειες... 14
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1. Ταυτοποίηση παρασίτου, Μορφολογία, Μοριακός χαρακτηρισμός, Στοιχεία Βιολογίας ... 17
Μονογενή ... 17
Zeuxapta seriolae ... 18
Υλικά και μέθοδοι ... 19
Μορφολογία ... 19
Μοριακός χαρακτηρισμός ... 19
Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης (SEM) ... 22
Κύκλος ζωής – Αυγά ... 22
Αποτελέσματα ... 22
Μορφολογία ... 22
Ώριμα σκουλήκια ... 23
Αυγά ... 26
Κύκλος ζωής ... 27
Μοριακός χαρακτηρισμός ... 29
Συζήτηση ... 31
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2. Μικροοικολογία και χωρική κατανομή παρασίτου ... 33
Υλικά και Μέθοδοι ... 34
Αποτελέσματα ... 34
Συζήτηση ... 41
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3. Παθολογία παρασιτισμού ... 43
Υλικά και μέθοδοι ... 43
Ιστολογική επεξεργασία ... 43
Αιματολογικές εξετάσεις ... 43
Σωρευτική Θνησιμότητα ... 44
Αποτελέσματα ... 44
Αιματολογικές εξετάσεις ... 44
7
Ιστοπαθολογία ... 45
Θνησιμότητα ... 57
Συζήτηση ... 57
Συμπεράσματα ... 59
Βιβλιογραφία ... 60
8
Περίληψη
Το εκτρεφόμενο μαγιάτικο, όπως και τα υπόλοιπα είδη ψαριών της ιχθυοκαλλιέργειας είναι ευάλωτο σε μικροβιακά παθογόνα τα οποία περιλαμβάνουν βακτήρια, ιούς και παράσιτα. Τα πλέον σημαντικά παθογόνα είναι τα παράσιτα.
Μάλιστα το μονογενές Zeuxapta seriolae προκαλεί σοβαρές θνησιμότητες και απειλεί τη βιωσιμότητα της καλλιέργειας του μαγιάτικου.
Αντικείμενο της παρούσας εργασίας ήταν η μελέτη της παρασιτικής πανίδας του εκτρεφόμενου μαγιάτικου ώστε να αποκτήσουμε τις απαραίτητες πληροφορίες που θα μας δώσουν τη δυνατότητα στο μέλλον να εφαρμόσουμε αποτελεσματικότερες στρατηγικές διαχείρισης των παρασίτων αυτών. Έμφαση δόθηκε στο μονογενές Zeuxapta seriolae καθώς αποτελεί το βασικότερο παθολογικό πρόβλημα. Μελετήθηκε η βιολογία και η μικροοικολογία του είδους σε περιόδους έξαρσης της παρασίτωσης σε συνθήκες καλλιέργειας καθώς επίσης και η παθολογία που προκαλεί στον ξενιστή του.
Η εργασία είναι οργανωμένη σε 3 αυτόνομα κεφάλαια στα οποία παρουσιάζεται η βιολογία, μορφολογία και κύκλος ζωής του παρασίτου, η μικροοικολογία που αφορά στις προτιμήσεις που έχει το παράσιτο στην επιλογή των βραγχίων και η παθολογία που προκαλεί στους ξενιστές του.
9
Abstract
The farmed greater amberjack (Seriola dumerili), like other species of farmed fish are vulnerable to microbial pathogens that include bacteria, viruses and parasites.
The most important pathogens are parasites. Indeed, the monogenean Zeuxapta seriolae causes serious mortalities and threatens the viability of the culture of greater amberjack.
The object of this work was to study the parasitic fauna of farmed greater amberjack to obtain the necessary information that will enable us in the future to implement effective management strategies for these parasites. Emphasis was given to the monogenean Zeuxapta seriolae as it is the main pathological problem. The biology and microecology of this species in outbreak periods in culture as well as the pathology causing the to host was studied.
This study is organized into three independent chapters where the biology, morphology and cycle of the parasite life, microecology on the preferences that the parasite has in the selection of gills and pathology inflicted upon their hosts are presented.
10
Εισαγωγή
Ο πληθυσμός της γης πολλαπλασιάζεται ταχύτατα με τις εκτιμήσεις να αναφέρουν αύξηση της τάξης των 2,35 εκ. μέχρι το 2050 (United Nations, 2015). Η συνεχής αύξηση του παγκόσμιου πληθυσμού σε συνδυασμό με τον μεγάλο ανταγωνισμό για φυσικούς πόρους και την μείωση της διαθεσιμότητας αλιευμάτων έχει οδηγήσει στην ολοένα και μεγαλύτερη εξάρτησή του από την παραγωγή των υδατοκαλλιεργειών ως σημαντική πηγή πρωτεϊνών (Naylor et al, 2000). Όλα τα παραπάνω έχουν οδηγήσει στη ραγδαία ανάπτυξη του τομέα αυτού τα τελευταία χρόνια, με ρυθμούς μεγαλύτερους από κάθε άλλο τομέα παραγωγής τροφίμων και όλα δείχνουν ότι στο μέλλον βασική πηγή τροφής θα στηρίζεται σε προϊόντα που προέρχονται από τη θάλασσα (Bondad-Reantaso et al., 2005; FEAP, 2016). Τα προϊόντα των υδατοκαλλιεργειών μπορούν να αποτελέσουν σημαντικό εργαλείο στην αντιμετώπιση της μείωσης των ιχθυοαποθεμάτων και της συνεχώς αυξανόμενης ζήτησης ψαριών στη παγκόσμια αγορά (Bartley et al., 2006) και να αποτελέσουν μια σταθερή πηγή πρωτεϊνών για το μέλλον.
Αξιοσημείωτο για την ανοδική πορεία του τομέα των υδατοκαλλιεργειών είναι ότι ενώ το 1974 παρείχε το 7% των ψαριών που καταναλώνονται παγκοσμίως (ως ανθρώπινη τροφή), το ποσοστό αυτό αυξήθηκε σε 26 % μέχρι το 1994 και 39% το 2004 (FAO, 2016a). Οι υδατοκαλλιέργειες πλέον προσφέρουν το 50% των ψαριών που χρησιμοποιούνται παγκοσμίως ως ανθρώπινη τροφή και αποτελούν σημαντική πηγή εισοδήματος για εκατομμύρια ανθρώπους (FAO, 2016a). Το 2014 για πρώτη φορά η προμήθεια ιχθύων της υδατοκαλλιέργειας ήταν μεγαλύτερη από την αντίστοιχη της αλιείας όσον αφορά τα προϊόντα που προορίζονται για ανθρώπινη κατανάλωση (FAO, 2016a).
Εικόνα 1: Παγκόσμια παραγωγή αλιείας και υδατοκαλλιεργειών (Πηγή: FAO, 2016)
11 Όπως φαίνεται και στην Εικόνα 1, η αλιεία παρέμεινε σε σταθερά επίπεδα μετά το 1985 αφού τα φυσικά αποθέματα έχουν μειωθεί λόγω της υπεραλίευσης και της υποβάθμισης του υδάτινου περιβάλλοντος. Το γεγονός αυτό συνέβαλε σημαντικά στη μεγάλη ανάπτυξη του τομέα των υδατοκαλλιεργειών (FAO, 2016a).
Το ψάρι είναι μια τροφή πλούσια σε περιεκτικότητα πολυακόρεστων λιπαρών (Ω3 λιπαρών οξέων), βασική πηγή πρωτεϊνών, αμινοξέων και βιταμινών, συστατικών δηλαδή που το καταστούν μια από τις βασικότερες τροφές παγκοσμίως και με σημαντικά οφέλη για την ανθρώπινη υγεία (FAO, 2016a). Ενισχύει την όραση και την υγεία των ματιών, προστατεύει από καρδιαγγειακές ασθένειες και ορισμένα είδη καρκίνου και ενισχύει την ανάπτυξη του εγκεφάλου (Subasinghe, 2005; Tacoon, 2001) Μεσογειακή και Ελληνική Υδατοκαλλιέργεια
Στα τέλη της δεκαετίας του ’80 η Υδατοκαλλιέργεια της Μεσογείου μπήκε πλέον σε μια «μοντέρνα βιομηχανική» εποχή αφού ξεπεράστηκαν επιτυχώς συγκεκριμένες τεχνικές δυσκολίες στην αναπαραγωγή, την εκτροφή προνυμφών, τη διατροφή και την πάχυνση, που αποτελούσαν τροχοπέδη για την περαιτέρω ανάπτυξη του τομέα. Το ευνοϊκό κλίμα, και οι περιβαλλοντικές συνθήκες της Μεσογείου έδωσαν την ώθηση για την ταχύτατη ανάπτυξη του τομέα. Ιδιαίτερη έμφαση δόθηκε στη θαλάσσια καλλιέργεια, με την τσιπούρα και το λαβράκι να είναι τα κυρίαρχα είδη (Barazi-Yeroulanos, 2010; Quéméner et al., 2002) . Η Ελλάδα ειδικότερα λόγω της γεωγραφικής της θέσης και της πολύ μεγάλης ακτογραμμής με τους φυσικούς κόλπους έχει πολύ μεγάλη ανάπτυξη τα τελευταία 15 χρόνια και πλέον αποτελεί παραγωγό
‘πρωταγωνιστή’ στη Μεσόγειο (Εικ. 2).
Εικόνα 2: Παραγωγή θαλάσσιας υδατοκαλλιέργειας στην Ελλάδα 1985-2008 (Πηγή: Barazi- Yeroulanos, 2010)
12 Η Ελλάδα είναι μέσα στους κορυφαίους παραγωγούς στην Ευρώπη όπως φαίνεται στον Πίνακα 1 και ειδικότερα όσον αφορά την τσιπούρα και το λαβράκι είναι η μεγαλύτερη χώρα παραγωγής μαζί με την Τουρκία (Πίν. 2 &3), με την παραγωγή της το 2008 να φτάνει τους 148.000 τόνους (FEAP, 2015; Barazi-Yeroulanos, 2010).
Πίνακας 1: Εξέλιξη των Ιχθυοκαλλιεργειών στην Ευρώπη (σε τόνους) 2005-2014 (Πηγή: FEAP, 2015)
Πίνακας 2: Παραγωγή Τσιπούρας (Sparus aurata) (σε τόνους) 2005-2014 (Πηγή: FEAP, 2015).
Οι Υδατοκαλλιέργειες στην Ελλάδα αποτελούν έναν από τους πιο ανεπτυγμένους τομείς και αυτό δεν είναι τυχαίο, αν σκεφτεί κανείς την έκταση και την ποικιλομορφία των ακτογραμμών της χώρας (Barazi-Yeroulanos, 2010). Ενδεικτικό της ανάπτυξης είναι το γεγονός ότι το 2014 η Ελλάδα ήταν μια από τις 35 χώρες οι οποίες παρήγαγαν περισσότερα ψάρια στην ιχθυοκαλλιέργεια από αυτά που συλλέχθηκαν μέσω της αλιείας (FAO, 2016a).
Όπως αναφέρθηκε και παραπάνω, τα προϊόντα της υδατοκαλλιέργειας αντιστοιχούν σε ένα πολύ μεγάλο ποσοστό των ψαριών που καταναλώνονται παγκοσμίως και όσον αφορά την Νότια Ευρώπη μπορεί να φτάσει έως και το 35%. Από τη στιγμή που η διαθεσιμότητα των αλιευμάτων μειώνεται διαρκώς, το παραπάνω ποσοστό όπως γίνεται αντιληπτό θα αυξάνεται με το χρόνο. Για να διατηρηθεί σε τέτοια επίπεδα και να επιβληθεί στο υπόλοιπο καταναλωτικό κοινό θα πρέπει να υπάρξει διαφοροποίηση των ειδών και να συνδυαστεί με ορισμένα χαρακτηριστικά όπως είναι η άμεση διαθεσιμότητα, η ελκυστικότητα, η υψηλή ποιότητα των παραγόμενων προϊόντων και οι φιλικές προς το περιβάλλον πρακτικές παραγωγής (Harache, 2002).
Η Μεσογειακή Ιχθυοκαλλιέργεια έχει εστιάσει όπως προαναφέρθηκε στην παραγωγή δύο κυρίως ειδών, του λαβρακιού και της τσιπούρας με αποτέλεσμα πλέον την μείωση στην τιμή του προϊόντος αφού με την υπερπαραγωγή του έχει επέλθει
13 κορεσμός, ενώ το κόστος παραγωγής παραμένει το ίδιο υψηλό. Αυτό έφερε αρνητικά αποτελέσματα στη Μεσογειακή Ιχθυοκαλλιέργεια αφού μειώθηκαν τα κέρδη και η ανταγωνιστικότητα. Λύσεις σε αυτή τη δύσκολη κρίση αναζητούνται με την ανάπτυξη νέων τεχνολογιών και ειδικότερα με την ένταξη νέων ειδών με υψηλότερους ρυθμούς ανάπτυξης και μεγάλη εμπορική αξία (Barazi-Yeroulanos, 2010). Η διαφοροποίηση των ειδών δεν θα είναι ευεργετική μόνο για την αγορά και τον ανταγωνισμό αλλά θα δώσει ώθηση και στην ανάπτυξη του κλάδου των ιχθυοκαλλιεργειών με τον εμπλουτισμό της τεχνογνωσίας από την εκτροφή νέων ειδών ακόμα και με την μείωση του κινδύνου εξάρσεων ασθενειών όπως αυτή που συνέβη το 1995 στη Μεσόγειο όπου διακόπηκε απότομα η παραγωγή λαβρακίου και αντικαταστάθηκε με την τσιπούρα (Quèmèner, 2002; Basurco & Abellan, 2000).
Αρχικά τα είδη που θα μπορούσαν να επιλεχθούν για εκτροφή έπρεπε να πληρούν λίγα και συγκεκριμένα κριτήρια όπως, η υψηλή τιμή πώλησης και η διαθεσιμότητα γεννητόρων για σύλληψη από τη θάλασσα. Με την ανάπτυξη της τεχνογνωσίας και την ανάγκη για εισαγωγή νέων ειδών στη Μεσογειακή ιχθυοκαλλιέργεια για την διαφοροποίηση του τελικού προϊόντος, τα κριτήρια επιλογής προσαρμόστηκαν στις νέες απαιτήσεις της αγοράς. Πλέον τα νέα είδη θα πρέπει να χαρακτηρίζονται από υψηλούς ρυθμούς ανάπτυξης, να προσαρμόζονται εύκολα σε περιβάλλον ιχθυοκαλλιέργειας, να υπάρχει η δυνατότητα, να έχουν η υψηλή διατροφική και εμπορική αξία, µειωµένο κόστος εκτροφής και υψηλές βιολογικές επιδόσεις (Quèmèner, 2002). Ένα από τα είδη που πληροί τα παραπάνω κριτήρια και έχει επιλεχθεί και ερευνάται ως υποψήφιο νέο είδος είναι το Μαγιάτικο (Seriola dumerili).
Μαγιάτικο Seriola dumerili (Risso, 1810)
Βασίλειο: Animalia Φύλο: Chordata Κλάση: Actinopterygii Τάξη: Perciformes Οικογένεια: Carangidae Γένος: Seriola
Είδος: S. dumerili
14 Εικόνα 3: Seriola dumerili (Risso, 1810) (Πηγή: www.daf.qld.gov.au))
Ένα από τα είδη που μελετάται ως υποψήφιο για να ενταχθεί στη Μεσογειακή ιχθυοκαλλιέργεια είναι το Μαγιάτικο. Η επιλογή του βασίζεται σε ορισμένα σημαντικά χαρακτηριστικά που του δίνουν το πλεονέκτημα έναντι των παραδοσιακά εκτρεφόμενων ειδών, όπως είναι ο πολύ υψηλός ρυθμός ανάπτυξης, η μεγάλη διατροφική και οικονομική του αξία, το μεγάλο μέγεθός του, η εξαιρετική ποιότητα κρέατος και η κατοχυρωμένη θέση του στη παγκόσμια αγορά (Mazzola et al., 2002;
Papandroulakis et al., 2005; Nakada, 2000; Crespo et al., 1994).
Το μαγιάτικο S. dumerili (Risso 1810) είναι το μεγαλύτερο μέλος της οικογένειας των Καραγκίδων (Hoese and Moore, 1977). Είναι σαρκοφάγο επιπελαγικό και επιβενθικό ψάρι το οποίο σε μικρά μεγέθη ζει μέχρι τα 10 μέτρα βάθος και σε μεγαλύτερο έως τα 70, ενώ έχει βρεθεί και στα 360 μέτρα. Έχει παγκόσμια γεωγραφική εξάπλωση σε θερμά τροπικά και υποτροπικά νερά (Manooch & Potts, 1997; FAO, 2016b). Συναντάται συχνά σε υφάλους ή βαθιές παράκτιες τρύπες συνήθως μοναχικό ή σε μικρές ομάδες (Fisher et al., 1981; Andaloro & Pipitone, 1997).
Το μήκος του S. dumerili πλησιάζει τα 2 μέτρα και το βάρος μπορεί να φτάσει πάνω από 50 κιλά γεγονός που το καθιστά ένα από τα σημαντικότερα εμπορικά είδη ψαριών στη Μεσόγειο. Το μαγιάτικο σε πρότυπες συνθήκες καλλιέργειας παρουσιάζει ταχείς ρυθμούς ανάπτυξης μέσα σε ιχθυοκλωβούς (FAO, 2016b) φτάνοντας τα 6 κιλά σε διάστημα 2,5 χρόνων (Mazzola et al., 2002; Jover et al., 1999; FAO, 2016b) ειδικά όταν η θερμοκρασία ξεπερνάει τους 17°C (FAO, 2016b) γεγονός που ευνοεί τη καλλιέργειά του στην Ελλάδα λόγω του κλίματος. Οι υψηλοί αυτοί ρυθμοί ανάπτυξης είναι ενδεικτικοί της επικράτησης του μαγιάτικου έναντι των δύο κυρίαρχων ειδών της Μεσογειακής υδατοκαλλιέργειας, της τσιπούρας και του λαβρακιού, οι οποίοι κυμαίνονται στα 330 g σε 18 μήνες και στα 400 g στα 2 χρόνια αντίστοιχα (Quèmèner, 2002). Από τη δεκαετία του 1990 η συνολική ποσότητα αλιείας του μαγιάτικου έχει δεκαπλασιαστεί αγγίζοντας τους 2.8 τόνους to 2009 τη στιγμή που η ετήσια παραγωγή στις υδατοκαλλιέργειες είναι 2 τόνοι (Segvic-Bubic, 2016).
Ασθένειες
Ένα από τα σημαντικότερα εμπόδια για την επέκταση των ιχθυοκαλλιεργειών είναι η διαχείριση και αντιμετώπιση των ασθενειών. Η εντατικοποίηση της ιχθυοκαλλιέργειας μπορεί να έχει σημαντικά αποτελέσματα όσον αφορά την αύξηση της παραγωγής, περιέχει όμως σημαντικούς κινδύνους και αρκετό ρίσκο (Ernst, 2002).
15 Σε ένα περιβάλλον όπου διαβιούν μεγάλοι αριθμοί ψαριών σε πολύ περιορισμένο χώρο όπως είναι αυτός των κλουβιών, είναι αναμενόμενο να αυξάνονται σημαντικά οι πιθανότητες ασθενειών και επιδημιών εξαιτίας παθογόνων οργανισμών. Τέτοιοι μολυσματικοί παράγοντες μπορεί να είναι τα παράσιτα, τα βακτήρια και οι ιοί (Subasinghe, 2005; Bondad-Reantaso et al., 2005; Rigos & Troisi, 2005; Ernst, 2002).
Η παθολογία των εκτρεφόμενων ψαριών μελετάται πλέον σε βάθος αφενός γιατί πλέον τα περιστατικά ασθενειών γίνονται άμεσα αντιληπτά (σε αντίθεση με τα περιστατικά σε άγριους πληθυσμούς) και αφετέρου υπάρχουν σημαντικές επιδράσεις στο παραγόμενο τελικό προϊόν, όπως επίσης στη βιωσιμότητα και την οικονομική αποδοτικότητά του. Επηρεάζεται η ανάπτυξη των ψαριών, προκαλείται μείωση της παραγωγής σε ενδεχόμενη θνησιμότητα και αύξηση του κόστους λόγω των απαραίτητων θεραπειών αλλά και της απώλειας ιχθυοτροφών καθώς τα άρρωστα ψάρια συνήθως χαρακτηρίζονται από μειωμένη όρεξη. Πολλές ασθένειες προκαλούνται από την επαφή των εκτρεφόμενων ειδών με άγριους πληθυσμούς και την μεταφορά αποθεμάτων που οδηγούν στην ανταλλαγή παθογόνων (McVicar, 1997;
Murray & Peeler, 2005).
Κατά την εκδήλωση μιας έξαρσης κάποιας ασθένειας σε ψάρια είναι δύσκολο να εξακριβωθεί η βασική αιτία αφού στην ουσία οφείλεται σε ένα συνδυασμό γεγονότων όπως οι περιβαλλοντικές συνθήκες (π.χ. υποβαθμισμένη ποιότητα νερού, υψηλή πυκνότητα ψαριών στα κλουβιά), οι καταπονημένοι ξενιστές με μειωμένο ανοσοποιητικό σύστημα λόγω των συνθηκών και η παρουσία του παθογόνου (Εικ. 4) (Snieszko, 1974;McVivar, 1997; Subasinghe, 2005;). Ενώ στο φυσικό περιβάλλον τα παθογόνα είναι δύσκολο να οδηγήσουν σε εκδήλωση σημαντικής ασθένειας, στην ιχθυοκαλλιέργεια οι πιθανότητες αυτές αυξάνονται πολύ αφού οι περιβαλλοντικοί παράγοντες αλλάζουν δραματικά. Η κακή διατροφή, η υψηλή πυκνότητα ψαριών στα κλουβιά και η έλλειψη τακτικής αλλαγής διχτυών είναι ορισμένοι ενδεικτικοί παράγοντες που προκαλούν στρες στους εκτρεφόμενους οργανισμούς και τους καθιστούν ευάλωτους σε ένα μεγάλο αριθμό παθογόνων (Reed et al., 2009; Roberts, 2012).
Εικόνα 4. Η σχέση ευκαιριακού παθογόνου με το περιβάλλον και τον ξενιστή. Στις περισσότερες περιπτώσεις για να εκδηλωθεί ασθένεια απαιτείται πέραν του παθογόνου η ύπαρξη και άλλου στρεσογόνου παράγοντα όπως το υποβαθμισμένο περιβάλλον και η καταπόνηση του ξενιστή (Πηγή Snieszko, 1974)
16 Το εκτρεφόμενο μαγιάτικο, όπως και τα υπόλοιπα είδη ψαριών της ιχθυοκαλλιέργειας είναι ευάλωτο σε μικροβιακά παθογόνα τα οποία περιλαμβάνουν βακτήρια, ιούς και παράσιτα. Τα πλέον σημαντικά παθογόνα είναι τα παράσιτα.
Μάλιστα το μονογενές Zeuxapta seriolae προκαλεί σοβαρές θνησιμότητες και απειλεί τη βιωσιμότητα της καλλιέργειας του μαγιάτικου.
Αντικείμενο της παρούσας εργασίας ήταν η μελέτη της παρασιτικής πανίδας του εκτρεφόμενου μαγιάτικου ώστε να αποκτήσουμε τις απαραίτητες πληροφορίες που θα μας δώσουν τη δυνατότητα στο μέλλον να εφαρμόσουμε αποτελεσματικότερες στρατηγικές διαχείρισης των παρασίτων αυτών. Έμφαση δόθηκε στο μονογενές Zeuxapta seriolae καθώς αποτελεί το βασικότερο παθολογικό πρόβλημα. Μελετήθηκε η βιολογία και η μικροοικολογία του είδους σε περιόδους έξαρσης της παρασίτωσης σε συνθήκες καλλιέργειας καθώς επίσης και η παθολογία που προκαλεί στον ξενιστή του.
Η εργασία είναι οργανωμένη σε 3 αυτόνομα κεφάλαια στα οποία παρουσιάζεται η βιολογία, μορφολογία και κύκλος ζωής του παρασίτου, η μικροοικολογία που αφορά στις προτιμήσεις που έχει το παράσιτο στην επιλογή των βραγχίων και η παθολογία που προκαλεί στους ξενιστές του.
17
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1. Ταυτοποίηση παρασίτου, Μορφολογία, Μοριακός χαρακτηρισμός, Στοιχεία Βιολογίας
Μονογενή
Τα μονογενή παράσιτα είναι έλμινθες (σκουλήκια) τα οποία συνήθως βρίσκονται στα βράγχια, το δέρμα ή τα πτερύγια των ψαριών, ενώ σπανιότερα μπορεί να εισέλθουν στο κυκλοφορικό σύστημα, τον ουρητήρα προκαλώντας σημαντικά προβλήματα όσον αφορά την παθολογία των ψαριών. Τα προβλήματα αυτά τείνουν να είναι εντονότερα και συχνότερα σε εκτρεφόμενα ψάρια. Αυτό οφείλεται σε ένα συνδυασμό παραγόντων. Τα μονογενή παράσιτα έχουν άμεσο κύκλο ζωής με μοναδικούς ξενιστές, δεν χρειάζεται δηλαδή κάποιος ενδιάμεσος οργανισμός για την αναπαραγωγή τους. Όπως σημειώνουν οι Murray & Peeler το 2005 τα παράσιτα με άμεσο κύκλο ζωής μπορούν να αναπτυχθούν και να μονιμοποιηθούν σε ένα σύστημα πιο εύκολα από αυτά που χρησιμοποιούν κάποιον ενδιάμεσο ξενιστή. Επίσης το ανοσοποιητικό σύστημα των εκτρεφόμενων οργανισμών είναι καταπονημένο, γεγονός που οφείλεται στη μεγάλη πυκνότητα που χαρακτηρίζει τις δεξαμενές εκτροφής και τους στρεσογόνους παράγοντες που αναπόφευκτα δημιουργούνται σε ένα τέτοιο περιβάλλον (επιθετικότητα, χαμηλή ποιότητα τροφής και νερού κ.ά.). Ο παραπάνω συνδυασμός δίνει τη δυνατότητα στα μονογενή παράσιτα να πολλαπλασιάζονται πάρα πολύ γρήγορα και να βρίσκουν τους ξενιστές πολύ εύκολα σε ένα τέτοιο κλειστό σύστημα (Snieszko, 1974; Thoney & Hargis, 1991; Ogawa, 1996; Ernst et al., 2002;
Rubio-Godoy, 2007; Reed et al., 2009) σε αντίθεση με τα άγρια ψάρια όπου δεν υπάρχουν ενδείξεις μαζικών θανάτων είτε λόγω της δυσκολίας να παρατηρηθεί κάτι τέτοιο στην ανοικτή θάλασσα είτε γιατί απουσιάζουν οι περιβαλλοντικοί και οι στρεσογόνοι παράγοντες που ισχύουν στις εκτροφές (Roberts, 2012; Williams &
Bunkley-Williams, 1996). Τα μονογενή παράσιτα χωρίζονται σε 2 υποκλάσεις: τα Monopisthocotylea και τα Polyopisthocotylea και οι διαφορές τους εστιάζονται κυρίως στο όργανο προσκόλλησης το οποίο στα Polyopisthocotylea αποτελείται κυρίως από πολυάριθμους σφιγκτήρες σε αντίθεση με τα Monopisthocotylea στα οποία το όργανο προσκόλλησης έχει κυρίως άγκιστρα αλλά και στη βιολογία και τις επιδράσεις που έχουν στους ξενιστές τους. Τα Polyopisthocotylea δεν είναι τόσο κοινά όσο τα Monopisthocotylea τα οποία έχουν μελετηθεί σε μεγαλύτερο βάθος (Rubio-Godoy, 2007; Reed et al., 2009; Roberts, 2012).
Τα είδη των ελμινθοειδών παρασίτων που έχουν αναγνωριστεί ως τώρα και αφορούν τα ψάρια ξεπερνά σε πολύ μεγάλο βαθμό τον αντίστοιχο των ψαριών (Rubio- Godoy, 2007). Έχουν αναγνωριστεί έως τώρα περίπου 4000-5000 είδη μονογενών (Reed et al., 2009) και εκτιμάται ότι ίσως φτάνουν και τα 25.000 (Whittington, 1998).
Τα μονογενή παράσιτα αντέχουν σε ένα μεγάλο εύρος θερμοκρασιών, μπορούν να βρεθούν είτε σε ψάρια αλμυρού είτε γλυκού νερού (Reed et al., 2009) και συσσωρεύονται σε μεγάλες ποσότητες στους ξενιστές τους (Thoney & Hargis, 1991) Προσκολλώνται στον υποψήφιο ξενιστή με ένα όργανο που εμφανίζεται στο οπίσθιο τμήμα του σώματός τους και ονομάζεται οπίσθιος άπτορας, haptor ή opisthaptor . Είναι εξοπλισμένο με άγκιστρα, σφιγκτήρες και μυζητήρες, όργανα που το βοηθούν να
18 διεισδύει στο επιθήλιο και να συγκρατείται στον ξενιστή . Ορισμένα είδη ενδέχεται να έχουν και στο πρόσθιο τμήμα ένα όργανο πρόσδεσης.
Zeuxapta seriolae
Βασίλειο: Animalia Φύλο: Platyhelminthes Υπόφυλο: Neodermata Κλάση : Monogenea
Υποκλάση: Polyopisthocotylea Τάξη: Mazocraeidea
Οικογένεια: Heteraxinidae Γένος: Zeuxapta
Είδος: Zeuxapta seriolae
Εικόνα 5. Ώριμο άτομο του είδους Z.seriolae
Όπως έχει αναφέρει και ο Rohde σε εκτενή μελέτη του σε μονογενή παράσιτα το 1978, το Z. seriolae έχει εντοπιστεί όχι μόνο στο μαγιάτικο αλλά σε διάφορα είδη του γένους Seriola και γενικότερα της οικογένειας Carangidae.
Η μορφολογία μελετάται για να καταγραφεί η ομοιότητα (ή η διαφορετικότητα) μορφολογικών χαρακτηριστικών μεταξύ των οργανισμών με σκοπό την ταυτοποίηση και ταξινόμησή τους.
Όμως οι παραδοσιακές μορφολογικές μέθοδοι έχουν κάποια όρια. Όπως συμβαίνει μεταξύ πολλών οργανισμών να έχουν πολλά όμοια χαρακτηριστικά, έτσι και στην ταυτοποίηση των ελμίνθων υπάρχει το πρόβλημα ότι υπάρχουν περισσότερα από ένα είδη που έχουν παρόμοια χαρακτηριστικά μεταξύ τους. Η κλασσική παρασιτολογία χρησιμοποιούσε κυρίως μορφολογικούς χαρακτήρες αλλά τα τελευταία χρόνια
19 χρησιμοποιούνται ευρέως μοριακοί δείκτες όπως είναι η κυτοχρωμική οξειδάση (subunit 1) και το γονίδιο 28s.
Όπως προτείνουν οι Schlick-Steiner et al. το 2010, η ολοκληρωμένη ταξινομική θα πρέπει να περιλαμβάνει τρία ανεξάρτητα σύνολα δεδομένων: μορφολογίας, μοριακών αναλύσεων και δεδομένα από ένα τρίτο ξεχωριστό κλάδο που θα μπορούσε να είναι τα χαρακτηριστικά ζευγαρώματος, η μελέτη του οικολογικού θώκου, της κυτταρογενετικής κ.ά.
Έτσι και η ταξινομική των παρασίτων του μαγιάτικου δεν έχει ξεκαθαρίσει ακόμα αφού βασίζεται σε εξωτερικά μορφολογικά χαρακτηριστικά και υπάρχουν ορισμένα σκουλήκια που έχουν πολλά κοινά χαρακτηριστικά και προσβάλλουν το μαγιάτικο. Αυτά είναι παράσιτα του γένους Heteraxine, του γένους Allencotyle και του γένους Zeuxpata.
Στόχος λοιπόν αυτής της ενότητας της εργασίας είναι η ταυτοποίηση αυτού του παρασίτου που εντοπίζεται σε καλλιέργειες της Ελλάδας, σε επίπεδο είδους.
Για το λόγο αυτό πραγματοποιήθηκαν δειγματοληψίες σε 3 περιστατικά μόλυνσης εκτρεφόμενου μαγιάτικου από μονογενή παράσιτα βραγχίων σε διαφορετικές περιοχές της Ελλάδας, με στόχο τη μελέτη της μορφολογίας του παρασίτου αλλά και της μοριακής διάγνωσης για την ταυτοποίηση σε επίπεδο είδους.
Υλικά και μέθοδοι
Μορφολογία
Για τη μελέτη της μορφολογίας πραγματοποιήθηκε δειγματοληψία μαγιάτικων (S. dumerili) από τους ιχθυοκλωβούς της πειραματικής μονάδας του ΕΛ.ΚΕ.Θ.Ε. στη Σούδα των Χανίων. Τα ψάρια αφού αποθηκεύτηκαν μέσα σε πάγο μεταφέρθηκαν στο ΕΛ.ΚΕ.Θ.Ε. στο Ηράκλειο. Με τη βοήθεια λαβίδας και ψαλιδιού αφαιρέθηκαν τα βράγχια και έπειτα έγινε λήψη των παρασίτων από αυτά.
Τοποθετήθηκαν βράγχια σε τρυβλία πετρί με αποστειρωμένο θαλασσινό νερό και έγινε παρατήρησή τους στο στερεοσκόπιο και στο οπτικό μικροσκόπιο. Έπειτα τα παράσιτα αποθηκεύτηκαν σε 2 μονιμοποιητικά ανάλογα με την ανάγκη παρατήρησης. Για την παρατήρηση στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης αποθηκεύτηκαν σε 2,5 % glutaraldehyde σε sodium cacodylate buffer 0,1 M ενώ για την ιστολογία σε μονιμοποιήθηκαν σε διάλυμα 4% φορμαλδεΰδη : 1% γλουταραλδεΰδη.
Μοριακός χαρακτηρισμός
Πραγματοποιήθηκαν δειγματοληψίες μαγιάτικων (S. dumerili) από τις 3 εξής περιοχές:
Α. Τους ιχθυοκλωβούς της πειραματικής μονάδας του ΕΛ.ΚΕ.Θ.Ε. στη Σούδα των Χανίων.
Β. Την μονάδα Ιχθυοκαλλιεργειών Αργοσαρωνικός Α.Ε. στη Σαλαμίνα
20 Γ. Τη μονάδα Θαλάσσιες Καλλιέργειες Α.Ε. στο Γαλαξίδι.
Με τη βοήθεια λαβίδας και ψαλιδιού αφαιρέθηκαν τα βράγχια και έπειτα έγινε λήψη των παρασίτων από αυτά.
Αφαιρέθηκαν 6 άτομα Z. seriolae (2 από κάθε περιοχή) από τα βράγχια του μαγιάτικου και αφού έγινε ταυτοποίησή τους με τη χρήση στερεοσκοπίου τοποθετήθηκαν το κάθε ένα ξεχωριστά σε 1.5 ml Eppendorf tube με 95% αιθανόλη για εξαγωγή DNA.
Για την μοριακή διάγνωση προτιμήθηκε το μιτοχονδριακό DNA και συγκεκριμένα ο πολλαπλασιασμός της κυτοχρωμικής οξειδάσης υπομονάδα 1(Cox1 ή CO1). Θεωρείται ένα αποτελεσματικό εργαλείο για το διαχωρισμό των ειδών σε οργανισμούς που η ταυτοποίηση μέσω μορφολογίας είναι δύσκολη (Hebert, 2003)
Τα δείγματα αφυδατώθηκαν από την αιθανόλη σε φούρνο στους 37 ℃ για μια νύχτα. Στη συνέχεια έγινε εξαγωγή του γενετικού υλικού με χρήση kit (DNeasy Blood
& Tissue Kit της QIAGEN) σύμφωνα με τις υποδείξεις του κατασκευαστή. Στη συνέχεια το μιτοχονδριακό γονίδιο κυτοχρωμική οξειδάση 1 (COI) πολλαπλασιάστηκε για όλα τα δείγματα με την τεχνική της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) με πρόσθιο εκκινητή τον JB3 (5 ′ -TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-3 ′ ) των Bowles et al. (1993) και οπίσθιο τον COX1 (5 ′ AATCATGATGCAAAAGGTA-3 ′ ) των Kralova-Hromadova et al. (2008). Η κάθε αντίδραση πραγματοποιήθηκαν σε τελικό 25μl που περιείχε συγκεκριμένα: 1 μl DNA, 12.5 μl Taq PCR Master Mix (Qiagen), 0.5 μl από κάθε εκκινητή και 10.5 μl ddH2O. Οι συνθήκες της PCR περιείχαν μια αρχική αποδιάταξη στους 95 ℃ για 2 λεπτά ακολουθούμενη από 40 κύκλους με:
πολλαπλασιασμό στους 95 ℃ για 30 δευτερόλεπτα, 48 °C για 40 δευτερόλεπτα and 72
°C για 1 λεπτό, με ένα τελικό βήμα επιμήκυνσης στους 72 °C για 10 λεπτά. Οι αντιδράσεις διεξήχθησαν στο Bio-Rad MJ Mini Personal Thermal Cycler. Τα αποτελέσματα ελέγχθηκαν σε γέλη αγαρόζης με χρήση βρωμιούχου αιθιδίου και στη συνέχεια τα προϊόντα καθαρίστηκαν με τη χρήση kit (QIAquick PCR Purification Kit της QIAGEN) σύμφωνα με τις υποδείξεις του κατασκευαστή. Ο προσδιορισμός των αλληλουχιών έγινε μετά από αντίδραση αλληλούχισης με τη μέθοδο Sanger, με χρήση του ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit v. 3.1 και την ηλεκτροφόρηση του προϊόντος που προέκυψε, σε αυτοματοποιημένη συσκευή αλληλούχισης ABI3730xl sequencer (Applied Biosystems).
Κατόπιν πραγματοποιήθηκε η στοίχιση των αλληλουχιών με το πρόγραμμα CodonCode Aligner έκδοση 6.0.2 (www.codoncode.com) ώστε να είναι δυνατός ο προσδιορισμός των ομόλογων θέσεων μεταξύ των ατόμων και οι πιθανές διαφορές τους οι οποίες θα αποτελέσουν τη βάση για τον υπολογισμό των εξελικτικών σχέσεων των αλληλουχιών. Η εκτίμηση των γενετικών αποστάσεων έγινε με το πρόγραμμα Geneious έκδοση 10.0.3 (http://www.geneious.com, Kearse et al., 2012).
Στη μελέτη εκτός από τα είδη που μελετώνται συμπεριλήφθηκαν και άλλα είδη πολυοπισθοκοτύλων. Οι αλληλουχίες της κυτοχρωμικής οξειδάσης των επιπλέον αυτών οργανισμών που χρησιμοποιήθηκαν στις αναλύσεις ανακτήθηκαν από τη βάση δεδομένων GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) και παρατίθενται στον πίνακα χ.
Οι αλληλουχίες ευθυγραμμίστηκαν με το πρόγραμμα ClustalΧ και έπειτα πραγματοποιήθηκε trimming. Το φυλογενετικό δέντρο καθώς και ο πίνακας των
21 γενετικών αποστάσεων κατασκευάστηκαν σύμφωνα με την μέθοδο neighbor joining (1000 bootstraps).
Πίνακας 3: Τα είδη που χρησιμοποιήθηκαν στην φυλογενετική ανάλυση για το γονίδιο της κυτοχρωμικής οξειδάσης (COI). Αναφέρεται το είδος ο κωδικός που αντιστοιχεί στην αλληλουχία που προέρχεται από τη βάση δεδομένων GenBank, οι περιοχές από τις οποίες προήλθαν τα άτομα και οι συγγραφείς.
Είδος GenBank Περιοχή Αναφορά
Z.seriolae KP119330.1 Χιλή Sepulveda & Gonzalez,
2015
Z.seriolae KP119296.1 Χιλή Sepulveda & Gonzalez,
2015
Z.seriolae KP119284.1 Χιλή Sepulveda & Gonzalez,
2015
Z.seriolae KP119274.1 Χιλή Sepulveda & Gonzalez,
2015
Z.seriolae KP119314.1 Χιλή Sepulveda & Gonzalez,
2015
Sparicotyle cryshophryii GQ240265.1 Κροατία Mladineo et al., 2009 Sparicotyle cryshophryii AY009161.1 Γαλλία Jovelin & Justine, 2001 Wetapolystoma almae AM913868.1 Γαλλία Du Preez et al., 2007 Pseudokuhnia minor KU380078.1 Κίνα Yan et al., 2016
Pseudaxine trachuri AY009168.1 Γαλλία Jovelin & Justine, 2001 Polystomatidae sp FR822561.1 Γαλλία Verneau et al., 2011 Polystoma dawiekoki AM913856.1 Γαλλία Du Preez et al., 2007 Octoplectanocotyla
obscurum
AY009170.1 Γαλλία Jovelin & Justine, 2001 Neopolystoma sp. FR822549.1 Γαλλία Verneau et al., 2011 Neoheterobothrium sp. FJ480947.1 Ιαπωνία Yoshinaga et al., 2009 Mazocraeoides gonialosae JF773482.1 Κίνα Li et al., 2011
Kuhnia scombri KU380241.1 Κίνα Yan et al., 2016
Haliotrema aurigae EU008816.1 Ηνωμένο Βασίλειο
Plaisance et al., 2008 Gyrodactylus thymalli AY486547.1 Νορβηγία Hansen et al., 2006 Gyrodactylus salaris AY486543.1 Νορβηγία Hansen et al., 2006 Gotocotyla sawara KF739594.1 Κίνα Shi et al., 2014 Gotocotyla sawara KF739592.1 Κίνα Shi et al., 2014 Gotocotyla sawara KF739566.1 Κίνα Shi et al., 2014
Gastrocotyle trachuri AY009167.1 Γαλλία Jovelin & Justine, 2001 Euryhaliotremadoides
grandis
EU008802.1 Ηνωμένο Βασίλειο
Plaisance et al., 2008 Discocotyle sagittata AY009164.1 Γαλλία Jovelin & Justine, 2001 Diplozoon nipponicum AY009163.1 Γαλλία Jovelin & Justine, 2001 Choricotyle chrysophrii AY009165.1 Γαλλία Jovelin & Justine, 2001
22 Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης (SEM)
Η επεξεργασία των δειγμάτων για παρατήρηση στο SEM πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριο ηλεκτρονικής μικροσκοπίας του Πανεπιστημίου της Κρήτης, Οι παρατηρήσεις έγιναν με χρήση του ηλεκτρονικού μικροσκοπίου σάρωσης JEOL JSM- 6390LV στα 15 kV.
Κύκλος ζωής – Αυγά
Πραγματοποιήθηκε πείραμα για τον κύκλο ζωής του Z. seriolae. Σε πρώτη φάση έγινε προσπάθεια για την επιτυχή εκκόλαψη των αυγών του στο εργαστήριο. Για το σκοπό αυτό έγινε δειγματοληψία 2 ατόμων μαγιάτικου από τους ιχθυοκλωβούς της πειραματικής μονάδας του ΕΛ.ΚΕ.Θ.Ε. στη Σούδα Χανίων. Με τη βοήθεια λαβίδας και ψαλιδιού αφαιρέθηκαν ζωντανά δείγματα των σκουληκιών από τα βράγχια των ψαριών. Αφού τοποθετήθηκαν σε πετρί με αποστειρωμένο θαλασσινό νερό με τη βοήθεια στερεοσκοπίου έγινε συλλογή των αυγών που τα παράσιτα είχαν αρχίσει να αποθέτουν και τοποθετήθηκαν σε multiwell plates με αποστειρωμένο θαλασσινό νερό.
Τα πιάτα τοποθετήθηκαν σε επωαστήρα και σε θερμοκρασία 18.5 °C. Καθημερινά γίνονταν 2 πλύσεις με αποστειρωμένο θαλασσινό νερό και παρατήρηση σε μικροσκόπιο και στερεοσκόπιο για να καταγραφεί ο χρόνος εκκόλαψης και τα διάφορα στάδια ανάπτυξης.
Αποτελέσματα
Μορφολογία
Στην παρακάτω εικόνα (Εικ. 6) φαίνεται η μεγάλη ομοιότητα των παρασίτων του γένους Heteraxine (Εικ. 6 Γ), του γένους Allencotyle (Εικ. 6 Δ) και του γένους Zeuxpata (Εικ. 6 Α, Β)
23 Εικόνα 6. Αριστερά (Α): Άτομο Z.seriolae όπως περιγράφεται από τον Rohde (1978), (Β) Το υπό μελέτη παράσιτο από τα δείγματά μας, (Γ) Heteraxine heterocerca (http://fishparasite.fs.a.u-tokyo.ac.jp) και (Δ) Allencotyla mcintoshi όπως περιγράφεται από τους Montero et al. (2003).
Ώριμα σκουλήκια
Τα ώριμα παράσιτα Z.seriolae έχουν μήκος περίπου από 5 έως 7 mm και πλάτος από 0.80 έως 1.20 mm.
Μέσω της μορφολογίας παρατηρήσαμε αρχικά ότι το παράσιτο που μελετάμε ανήκει στα Polyopisthocotylea αφού έχει μεγάλη ουρά με σφιγκτήρες που είναι χαρακτηριστικό τους αλλά και 2 μυζητήρες στην περιοχή της κεφαλής. (Εικόνα 6 σχήμα Β και εικόνα 7). Άλλο ένα ταξινομικό χαρακτηριστικό του Z. seriolae που παρατηρήθηκε είναι και ο γονοπόρος που βρίσκεται σε κοντινή απόσταση από τους μυζητήρες. Στην εικόνα 7 παρουσιάζεται ο γονοπόρος από φρέσκο παρασκεύασμα ενώ στην εικόνα 8 διακρίνεται σε ιστολογική τομή καθώς και με τη χρήση ηλεκτρονικού μικροσκοπίου στην εικόνα 9.
Εικόνα 7: Περιοχή της κεφαλής όπου διακρίνονται οι 2 μυζητήρες (κόκκινο βέλος). Διακρίνεται επίσης ο γονοπόρος (μαύρο βέλος) το οποίο είναι ένα ακόμη ταξινομικό χαρακτηριστικό. Φωτογραφία από οπτικό μικροσκόπιο.
24 Εικόνα 8. Ιστολογική τομή Z. seriolae. Με κόκκινο βέλος διακρίνεται ο γονοπόρος.
Εικόνα 9. Εικόνα από Ηλεκτρονικό Μικροσκόπιο Σάρωσης όπου διακρίνεται ο γονοπόρος του Z.
seriolae (κόκκινο βέλος).
Το Z. seriolae όπως περιγράφεται από τον Rohde (1978) έχει σώμα επίπεδο, λείο, ο φάρυγγας βρίσκεται μεταξύ δύο στοματικών μυζητήρων και το πρόσθιο τμήμα του οπίσθιου άπτορα είναι πιο πλατύ (Εικόνα 10)
25 Εικόνα 10. Φωτογραφία από ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης όπου φαίνεται το πιο πλατύ πρόσθιο τμήμα του opisthaptor, ενώ διακρίνεται η συστοιχία των σφιγκτήρων (κόκκινο βέλος)
O Meserve (1938), σημειώνει στην περιγραφή του ότι το κεντρικό κομμάτι στο πλαίσιο του οπίσθιου σφιγκτήρα έχει σχήμα Y, σε αντίθεση με άλλα συγγενικά είδη όπου το σχήμα αυτό είναι σχήμα τρίαινας και οι παρατηρήσεις μας συμφωνούν με αυτό (Εικόνα 11)
Εικόνα 11: Κεντρικό κομμάτι στο πλαίσιο του οπίσθιου σφιγκτήρα που έχει σχήμα Y χαρακτηριστικό του είδους του Ζ. seriolae.
26 Αυγά
Τα αυγά του Z.seriolae έχουν σχήμα ωοειδές και βρίσκονται πάνω σε ένα επίμηκες νημάτιο (Rohde, 1978). Χαρακτηριστικό είναι ότι διαθέτουν ένα νημάτιο από τη μια πλευρά μόνο, γεγονός που τα διαφοροποιεί από άλλα αυγά μικροκοτυλιδών όπου διαθέτουν νημάτιο και στις 2 πλευρές.
Στις παρακάτω εικόνες φαίνονται αυγά του παρασίτου όπου σχηματίζουν μεγάλες συστάδες που μοιάζουν με ‘τσαμπί’ σταφυλιών (Εικ12,13,14).
Εικόνα 12: Εικόνα από στερεοσκόπιο όπου φαίνονται οι συστάδες των αυγών του Z.seriolae.
Εικόνα 13: Εικόνα από ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης όπου φαίνεται αυγό από Z.seriolae.
27 Εικόνα 14: Εικόνα από ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης όπου διακρίνονται αυγά Z.seriolae καθώς και το νημάτιο προσκόλλησης το οποίο βρίσκεται στη μια μόνο πλευρά των αυγών Καταγραφή στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο.
Κύκλος ζωής
Μέσω του πειράματος που πραγματοποιήθηκε για να μελετηθεί ο κύκλος ζωής και τα διάφορα αναπτυξιακά στάδια του παρασίτου έγινε δυνατή η παρατήρηση του πολύ μεγάλου αριθμού των αυγών που είναι ικανό να εναποθέσει το Z. seriolae. Αυτά σχηματίζουν μεγάλες συστάδες που μοιάζουν με ‘τσαμπί’ σταφυλιών. Έγινε λήψη βίντεο στο στερεοσκόπιο με την καταγραφή των αρχικών σταδίων του παρασίτου όπου φαίνεται η προνύμφη να κινείται μέσα στο αυγό έχοντας μπει στη φάση εκκόλαψης (Εικόνα 15).
28 Εικόνα 15: Συστάδες αυγών του Z. seriolae. (α) Η προνύμφη κινείται μέσα στο αυγό έτοιμη να εκκολαφθεί. (β) Αυγό που έχει σπάσει και έχει γίνει η εκκόλαψη.
Στη συνέχεια το παράσιτο εκκολάπτεται σπάζοντας το αυγό (Εικόνα 16). Τα νέα ογκομιρακίδια (παράσιτα στο προνυμφικό στάδιο) διαθέτουν βλεφαρίδες για περίπου 48 ώρες τις οποίες χρησιμοποιούν για να κινούνται στο χώρο (Εικόνα 17).
Εικόνα 16: Προνύμφη Z. seriolae τη στιγμή της εκκόλαψης.
29 Εικόνα 17: Ογκομιρακίδιο Z. seriolae στο κολυμβητικό στάδιο. Διακρίνονται οι βλεφαρίδες περιμετρικά του σώματος.
Ακολουθεί η φάση όπου το ογκομιρακίδιο μετά το πέρας των περίπου 48 αυτών ωρών έχει χάσει τις βλεφαρίδες δε μπορεί πλέον να κολυμπήσει και έχουν αναπτυχθεί πλέον οι δομές των αγκίστρων (Εικόνα 18). Στη παρούσα φάση και με την απουσία τροφής για το παράσιτο, στο συγκεκριμένο πείραμα, τα παράσιτα κάποια πέθαναν.
Εικόνα 18: Ογκομιρακίδιο Z. seriolae το οποίο έχει χάσει τις βλεφαρίδες και έχει αναπτύξει άγκιστρα, τα οποία διακρίνονται κάτω δεξιά με κόκκινα βέλη.
Μοριακός χαρακτηρισμός
Με τη χρήση του BLAST τα 6 υπό μελέτη παράσιτα ταυτοποιήθηκαν ως Zeuxapta seriolae με κάλυψη από 93-98% και ποσοστό ομοιότητας 84-85%.
30 Βλέπουμε ότι τόσο τα 6 υπό μελέτη παράσιτα όσο και τα 5 Z.seriolae από τη Χιλή ομαδοποιούνται με 99% στατιστική υποστήριξη μαζί.
Παρόλα αυτά τα 6 υπό μελέτη παράσιτα σχηματίζουν με 100% στατιστική υποστήριξη μια ξεχωριστή φυλογενετική ομάδα. Συγκεκριμένα σχηματίζουν
ξεκάθαρα δύο μονοφυλετικά τάξα τα οποία αποτελούνται από τα Souda 1, Galaxidi1, Galaxidi 2, Salamina2 και το άλλο Souda2, Salamina1 το οποίο φαίνεται και από τον πίνακα των γενετικών αποστάσεων.
Με βάση τη φυλογενετική ανάλυση και τη τοπολογία του δέντρου τα υπό μελέτη παράσιτα ομαδοποιούνται ξεχωριστά από τα Χιλιανά.
Εικόνα 19. Το φυλογενετικό δέντρο το οποίο κατασκευάστηκε σύμφωνα με την μέθοδο neighbor joining (1000 bootstraps). Όπου * υπάρχει στατιστική υποστήριξη μεγαλύτερη ή ίση του 95%.