Εισαγωγή 9
Abscission 10
Οι πρωτεΐνες του συμπλέγματος ESCRT-III Chmp1b και IstI αλληλεπιδρούν και στρατολογούν τη σπαστίνη AAA-ATPases και VPS4 στο μεσαίο σώμα για να διαχωρίσουν τους μικροσωληνίσκους και να διαχωρίσουν το σύμπλεγμα ESCRT-III από τις μεμβράνες, αντίστοιχα (Lumb et al., 2012; Yang et al., 2012 al., 2008) (Εικόνα 1).
Γέφυρες DNA 12
Abscission checkpoint 14
Παρουσία χρωματίνης στο κυτταροπλασματικό κανάλι που συνδέει τα δύο θυγατρικά κύτταρα κατά τη διάρκεια της κυτταροκίνησης, το πλήρως ενεργοποιημένο Aurora B φωσφορυλιώνει την πρωτεΐνη MKLP1 για να σταθεροποιήσει την κυτταροπλασματική αύλακα (αυλάκωση διάσπασης), ενώ ταυτόχρονα ενεργοποιεί την αποκοπή της αποκοπής και ενεργοποιεί το σημείο ελέγχου της πρωτεΐνης με το phosp. σύμπλοκο που απαιτείται για τη μεταφορά-ΙΙΙ (ESCRT-III) πολυκυστιδιακή πρωτεΐνη σώματος 4C, Chmp4C, φορτωμένη με υπομονάδα μεταφοράς, σε σερίνες σε ανθρώπινα κύτταρα (Steigemann et al., 2009). Σε αυτό το σημείο, το Chmp4C αποτρέπει τη μεταφορά της AAA-ATPase Vps4 στη θέση αποκοπής για την τελική τομή του κυτταροπλάσματος, αναστέλλοντας έτσι την αποκοπή (Carlton et al., 2012; Petsalaki and Zachos, 2016; Steigemann et al., 2. Thoresen et al., 2014) (Εικόνα 2).
Actin patches 16
Η πρωτεϊνική κινάση Src 17
- Η δομή της πρωτεΐνης Src 18
- Ρύθμιση της ενεργότητας της πρωτεΐνης Src 19
- Η Src στην αναδιοργάνωση της ακτίνης 22
- Τα υποστρώματα της Chk1 25
Ο ρόλος της Chk1 στη μίτωση 26
Υλικά και μέθοδοι 28
Αντισώματα 30
Πρωτεΐνες 32
Το πλασμίδιο pEGFP/c-Src που κωδικοποιεί την ανθρώπινη πρωτεΐνη c-Src υβριδοποιημένη με EGFP στον φορέα pcDNA4/TO (Invitrogen, V102020) ήταν δώρο από τον Naoto Yamaguchi, Πανεπιστήμιο Chiba, Chiba, Ιαπωνία (Kasahara et al., 2007b). Το πλασμίδιο pEGFP-vps4-K173Q που κωδικοποιεί την ανθρώπινη πρωτεΐνη VPS4 που φέρει τη μετάλλαξη σημείου K173Q υβριδοποιημένη με EGFP στον φορέα pEGFP-C1 (Clontech) ήταν δώρο από τον Wesley Sundquist, University of Utah, Salt Lake City, ΗΠΑ (Morita et al. , 2007). Το πλασμίδιο pGEX4T1/av c-Src που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη c-Src κοτόπουλου συντηγμένη με GST στον φορέα pGEX4T1 (GE Healthcare) κατασκευάστηκε με PCR χρησιμοποιώντας ένζυμα περιορισμού BamHI και EcoRI και το πλασμίδιο pEGFP/av c-Src ως υπόστρωμα.
Μέθοδοι 38
- Βακτήρια 38
- Απομόνωση και ανάλυση πρωτεϊνών 43
- Time-lapse imaging 51
- Cell spreading assay ( Εξάπλωση κυττάρων σε υπόστρωμα) 51
- Wound healing assay 52
- Φασματομέτρια Μάζας 52
Για τη μελέτη της φωσφορυλίωσης Src στη σερίνη 51, τα κύτταρα BE επωάστηκαν με 0,5% CHAPS σε διάλυμα PHEM (60 mM PIPES, 25 mM Hepes pH 7,0, 10 mM EGTA, 4 mM MgSO4) που περιείχε 100 nM ουσία Microcystin-Hatmase (Sig) . και Ricketts, 1993) για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Σε όλες τις άλλες περιπτώσεις, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν σε αντικειμενοφόρους πλάκες επικαλυμμένες με πολυκίνη (Thermo Scientific) με 4% PFA σε ρυθμιστικό διάλυμα κυτταροσκελετού pH 6,1 (NaCl 137 mM, KCl 5 mM, Na2HPO4 1,1 mM, KH2PO4 0,4 mM, MgClYPE, MgClYPE, mM 5 mM, γλυκόζη 5,5 mM) για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, οι μεμβράνες τους διαπερατήθηκαν με 0,5% Triton X-100 σε ρυθμιστικό διάλυμα Cytoskeleton και χρωματίστηκαν με κατάλληλα αντισώματα (Zachos et al., 2007).
Αποτελέσματα 54
Οι πρωτεΐνες Chk1 και Src εμποδίζουν το σπάσιμο των γεφυρών DNA στην
Time-lapse βίντεο μικροσκοπία κυττάρων ελέγχου Lap2b:RFP ή κυττάρων Lap2b:RFP μετά από προσθήκη κυττάρων PP2 ή UCN-01 (B) Lap2b:RFP μετά από προσθήκη PP2 (για 5 ώρες) ή επώαση με siRNA έναντι πρωτεϊνών Src ή Chk1.
Οι πρωτεΐνες Chk1 και Src είναι απαραίτητες για την δημιουργία actin patches σε
Τα ένθετα δείχνουν τις βάσεις των καναλιών και τη σχετική ένταση φθορισμού της F-ακτίνης (Β) Σχετική ένταση φθορισμού ακτίνης σε κύτταρα ή κύτταρα ελέγχου BE μετά από προσθήκη PP2 (για 5 ώρες) ή επώαση με siRNA έναντι πρωτεϊνών Src ή Chk1. Α) Επιθέματα ακτίνης σε κύτταρα επιμολυσμένα με αρνητικό siRNA (μάρτυρας), Src siRNA (siSrc), Chk1 siRNA (siChk1) που δείχνουν ισχυρή ή ασθενή χρώση DNA στο κυτταροπλασματικό κανάλι. Στη συνέχεια, για να δούμε εάν η εξωγενής έκφραση των πρωτεϊνών Chk1 και Src σε κύτταρα με εξάντληση Chk1 και Src μειώνει τον ρυθμό των σπασμένων γεφυρών DNA, χρησιμοποιήσαμε κύτταρα BE στα οποία δημιουργήσαμε τα ενδογενή γονίδια πρωτεΐνης Chk1 ή Src που σιγούν με siRNA (siChk1-2 και si-Src-2, αντίστοιχα) (Εικόνα 11Ε, G) και τα επιμόλυνε με πλασμίδια ανθεκτικά στο siRNA που εκφράζουν τις πρωτεΐνες GFP:Chk1 ή GFP:Src-WT ή GFP-την πρωτεΐνη (Σχήμα 11Α).
Οι σπασμένες γέφυρες DNA με μείωση της έκφρασης των Chk1 και Src δεν
Α, Β) Γεφυρώνει DNA σε κύτταρα ΒΕ που εκφράζουν εξωγενώς πρωτεΐνη GFP, ή πρωτεΐνες GFP:Src-WT ή GFP:Chk1 και καταστροφή ενδογενών πρωτεϊνών Src και Chk1 από το siRNA (siSrc-2 και αντίστοιχα siChk1-2). Ε, Ζ) Ανάλυση Western blot ολικής GFP:Src-WT ανθεκτικής σε siSrc-2 ή ολικής GFP:Chk1 ανθεκτικής σε siChk1-2 και ενδογενών πρωτεϊνών Src, Chk1 και ακτίνης. Αντίθετα, η έκφραση της πρωτεΐνης GFP:Vps4 K173Q σε κύτταρα στα οποία αναστέλλαμε το σημείο ελέγχου αποκοπής, είτε χρησιμοποιώντας τον αναστολέα TG003 είτε μειώνοντας την έκφραση της πρωτεΐνης Aurora B με siRNA (Εικόνα 12G), οδήγησε σε μείωση (Εικόνα 12Δ, Ε) σπασμένων γεφυρών DNA (σε σύγκριση με κύτταρα που εκφράζουν μόνο την πρωτεΐνη GFP (Petsalaki and Zachos, 2016; Steigemann et al., 2009).
Οι πρωτεΐνες Chk1/Src και Aurora B συνεργάζονται για να εμποδίσουν το
Στη συνέχεια, δοκιμάσαμε εάν η μείωση της έκφρασης της πρωτεΐνης Chk1 ή Src επηρεάζει τον εντοπισμό των πρωτεϊνών Plk1, Mklp1, Cep55, οι οποίες συμμετέχουν στη ρύθμιση της αποκοπής (Bastos and Barr, 2010· Mishima et al., 2002) στη συμμετοχή των πρωτεϊνών Chk1 και Src στην η οδός αποκοπής. Σχήμα 13: Μειωμένη έκφραση των πρωτεϊνών Chk1 και Src, αυξάνει το ποσοστό των σπασμένων γεφυρών DNA και μειώνει τα μπαλώματα ακτίνης σε κύτταρα με μειωμένο σέλας Β. Α) Κύτταρα διαμολυνθέντα με αρνητικό siRNA (έλεγχος), Aurora B siRNA (siAurora B) ή συνδυασμό Chk1 siRNA (siChk1)/ Src siRNA (siSrc) και siAurora B (siAurora B+siChk1, siAurora B+siSrc).
Η Src και πρωτεΐνες που ρυθμίζονται από τη Src εντοπίζονται στις βάσεις των
Εικόνες ομοεστιακής μικροσκοπίας κυττάρων και κυττάρων BE-μάρτυρα μετά από καταστροφή της έκφρασης Chk1 με siRNA (siChk1) ή κυττάρων μετά από επώαση με τον αναστολέα PP2 για 5 ώρες Εντοπισμός ολικής Src (A), φωσφορυλιωμένης Src σε τυροσίνη 419 (pSrc -Y419; B) , GFP:Chk1 (C), φωσφορυλιωμένο FAK σε τυροσίνη 925 (pFAK-Y925, D) και κορτακτίνη (Ε) στις βάσεις των γεφυρών DNA.
Η Chk1 απαιτείται για τον σωστό εντοπισμό και την ενεργότητα της Src 77
Η Chk1 φωσφορυλιώνει την πρωτεΐνη Src στην Σερίνη 51 in vitro 82
Μετά από μια in vitro δοκιμασία κινάσης με Chk1, το GST-avSrc αναλύθηκε με υγρή χρωματογραφία-φασματομετρία μάζας για να προσδιοριστεί το υπόλειμμα όπου η Chk1 φωσφορυλιώνει τη Src (D. Sumpton and S. Zanivan, Beatson Institute for Cancer Research, Γλασκώβη). Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήσαμε σφαιρίδια γλουταθειόνης-σεφαρόζης συζευγμένα με το αμινοτελικό άκρο του Src άγριου τύπου (GST-Src (1-256)wt) ή το αμινοτελικό άκρο του μεταλλαγμένου Src (GST-Src (1-256)S51A) και ανασυνδυασμένη Chk1 σε in vitro προσδιορισμούς κινάσης.
Η φωσφορυλίωση της Σερίνης 51 της Src από την Chk1 οδηγεί σε ενεργοποίηση
Το ίδιο παρατηρήσαμε σε μια in vitro δοκιμασία κινάσης χρησιμοποιώντας ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες GST-Chk1 και His-Src, παρουσία ή απουσία UCN-01, όπου μια αύξηση στην αυτοφωσφορυλίωση της τυροσίνης 419 Src συνέπεσε με μια αύξηση στη φωσφορυλίωση. της Σερίνης 51 της Src από Chk1 in vitro (Εικόνα 23C). Α) in vitro προσδιορισμός της κινάσης Chk1. Ανάλυση στυπώματος Western Src φωσφορυλιωμένης σε Σερίνη 51 (pSrc-S51), χρησιμοποιώντας αντισώματα αντι-pS51 και ολικό GST. Β) Δοκιμασία in vitro κινάσης χρησιμοποιώντας ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες GST-Chk1 και His-Src, και GST-FAK ως υπόστρωμα. Ανάλυση στυπώματος Western του φωσφορυλιωμένου FAK-Y925 (pFAK-Y925) και του φωσφορυλιωμένου pSrc-S51 χρησιμοποιώντας ειδικά φωσφοαντισώματα και χρώση ponceau για ολικές πρωτεΐνες GST-FAK και His-Src. Γ) Δοκιμασία in vitro κινάσης χρησιμοποιώντας ανασυνδυασμένο GST-Chk1 και His-Src.
Στη συνέχεια εκφράσαμε GFP:Src-WT, GFP:Src-S51A και GFP:Src-S51D σε κύτταρα χωρίς Chk1, ανοσοκαταβυθίσαμε με αντισώματα GFP και τα χρησιμοποιήσαμε σε έναν in vitro προσδιορισμό κινάσης με GST-FAK ως «υπόστρωμα». Ανάλυση στυπώματος Western του FAK φωσφορυλιωμένου σε τυροσίνη 925 (pFAK-Y925) και GFP:Src-WT, GFP:Src-S51A και GFP:Src-S51D χρησιμοποιώντας αντισώματα GFP και χρώση ponceau για GST-FAK B) Κύτταρα που έχουν επιμολυνθεί εκ νέου με GST-FAK :Src-WT και Src siRNA (siSrc-2) για να καταρριφθεί η ενδογενής έκφραση γονιδίου Src επιστρώθηκαν σε πλάκες φιμπρονεκτίνης παρουσία ή απουσία.
Η φωσφορυλίωση της Σερίνης 51 ενισχύει την καταλυτική ενεργότητα της Src
Η Chk1 είναι απαραίτητη για την φωσφορυλίωση της Σερίνης 51 της Src σε
Α) Εντοπισμός Src φωσφορυλιωμένης σε σερίνη 51 (pSrc-S51) σε μεμβρανικά βολάν κυττάρων μεσοφάσης χωρίς γέφυρες DNA, σε κύτταρα διαμολυνθέντα με αρνητικό siRNA (μάρτυρας), Chk1 siRNA (siChk1) ή Src siRNA (siSrc) και τοποθετημένα σε δίσκους ινονεκτίνης .
Η φωσφορυλίωση της Σερίνης 51 της Src εμποδίζει το σπάσιμο των γεφυρών
PICH is required for BLM recruitment to anaphase bridges ( Ke et al., 2011 ); however, in control and Chk1-deficient cells, PICH was localized to chromatin bridges (supplemental material Fig. S1C). Furthermore, GFP-BLM-S502D accumulated to similar levels in the absence or presence of Chk1 inhibitor (Fig. 2F). In addition, similar levels of WT or S646A GFP-BLM associated with pS502 suggesting that BLM-S502 phosphorylation is not dependent on BLM-S646 phosphorylation (Fig. 3D; Kaur et al., 2010).
However, Chk1-deficient or control cells showed similar overall BLM staining on chromatin bridges (Fig. 4F). In the absence of spindle poisons, depletion of Chmp4c reduced the localization of ZW10, Rod, Mad1, and Mad2:GFP to prometaphase kinetochores compared with control cells ( Fig. 4, A – F ). However, Chmp4c-deficient cells showed similar levels of total Aurora B at centromeres or phosphorylated Aurora B-S331 at kinetochores, a marker of Aurora B activation (Petsalaki et al., 2011), compared to controls (Fig. S4, A-C). ).
Chmp4c-depleted cells exhibited reduced mitotic index after prolonged nocodazole treatment compared with controls ( Fig. 5 A and Fig. S4 D). However, Chmp4c-deficient cells or control cells displayed similar levels of ZW10 at kinetochores in the presence of taxol (Fig. S4 G). In prometaphase ( Fig. 8 E ), Chmp4c localizes to unattached kinetochores and promotes localization of RZZ and Mad1-Mad2 to kinetochores to activate the spindle checkpoint.
In cells lacking Src or Chk1, expression of GFP-Vps4-K173Q did not prevent DNA bridge breaking compared with cells expressing GFP (Fig. 4, D and E). Aurora B-deficient cells show premature abscission (Steigemann et al., 2009), and Aurora B-deficient cells showed an increased frequency of broken chromatin bridges compared to controls, despite similar actin patches (Fig. 5, A–C). Control cells with intact DNA bridges also showed disassembled midbody microtubules (midbody remnants) despite the abscission delay ( Fig. 5A ), consistent with previous findings ( Steigemann et al., 2009 ).
Phosphorylated FAK-Y925 (a phosphorylation substrate of Src; Brunton et al., 2005) and cortactin (Tehrani et al., 2007) also localized to actin patches in control cells (Fig. 6, C and E). Depletion of Chk1 reduced wound closure of a monolayer of cells compared with controls ( Fig. 7, E and F ). Furthermore, GFP-Src-S51D is localized to actin patches in Chk1-deficient or control cells (Fig. 10 A).
In contrast, expression of the nonphosphorylating Src-GFP-S51A mutant induced chromatin breakage and reduced actin patch formation in the absence or presence of siChk1 ( Fig. 10, A–D ). However, expression of Chmp4c GFP rescued ZW10-kinetochore localization after depletion of endogenous Chmp4c compared with GFP alone (Online Resource Fig.S4i; Petsalaki et al.2018).