BSA – bovine serum albumin CD – differentiation group CR – complete response/response CT – computed tomography DB – dot hybridization DIG – digoxigenin. PBS – phosphate buffered saline PCR – polymerase chain reaction PET – positron emission tomography PR – response/partial response.
Bevezetés
A nyelőcsőrák
- Anatómia és patológia
- Etiológia és patogenézis
Az alkohol egy társkarcinogén anyag, amely megkétszerezheti a bazális sejtek proliferációs intenzitását (Mak és mtsai 1987). Intenzív sejtkárosodás léphet fel az alkohol és a dohányfüstben lévő vegyületek együttes hatására (Hoffmann et al. 1983). A magas incidenciájú területeken élők is ki vannak téve bizonyos típusú gombáknak (Fusarium moniliforme, Geotrichum candidum, Aspergillus flavus) (Bokelmann et al. 1981).
A hiányos étrend és a rossz vízminőség mellett (Lu et al. 1985) a vitaminok és nyomelemek hiánya is rákkeltő hatásokhoz vezethet. A humán papillomavírusok mellett a herpes simplex vírus rákkeltő szerepe is ismert egyes laphámrákokban (zur Hausen et al. 1982).
Terápia
- Sebészi terápia
- Neoadjuváns terápia
- Neoadjuváns radioterápia
- Neoadjuváns kemoterápia
- Neoadjuváns radio-kemoterápia (RCT)
A nyelőcsőrák genetikai és molekuláris hátterének vizsgálata a lehetséges terápia szempontjából az elmúlt években fontos kutatási területté vált (Hagymási et al. 2007). A nyelőcsőrák neoadjuváns terápiája a műtét előtti mono- vagy multimoduláris kezelés (Siewert et al. 2005; Stahl et al. 2005). Leírtak egy kísérletet, ahol laphámrákos és adenokarcinómás betegeket vegyesen vizsgáltak (Tiret et al. 1999), míg más publikációk nem mutattak szövettani vizsgálatot.
A lokális hatás mellett a nyirokcsomók vagy távoli szervek mikroszkopikus áttétei ellen is hat (Macadam et al. 2003). Egy 1996-ban publikált metaanalízis sem mutatott előnyt a műtét előtti monokemoterápiával szemben a túlélés tekintetében (Bhansali et al. 1996).
A tumorválasz (response)
A kifinomult vizsgálati módszerek, mint a PET (Bruzzi és mtsai, 2007), az endoluminális UH (Barbour és mtsai, 2007) és a perfúziós CT (Makari et al., 2007) is szerepet játszhatnak a pontosabb értékelésben. Anyagunkban az RCT-re adott tumorválaszt a klinikopatológiai eredmények és az elmúlt években elterjedt TNM stádiumbesorolás szerint értékelt változások alapján négy csoportba osztottuk (Law et al., 2006). CR, teljes válasz), amikor a posztoperatív kórszövettani tumor stádiummeghatározás pT0N0M0 vagy pT0N1M0 eredményt ad, azaz. a műtéti reszekcióban egyetlen daganatsejt sem található. Részleges remisszió (PR, részleges válasz), amikor a tumor posztoperatív hisztopatológiai UICC stádiuma alacsonyabb volt, mint a kezelés előtt.
Egyes betegek részleges remissziót mutatnak, ahol klinikailag "downstaging" figyelhető meg, ahol a daganat mérete csökken és/vagy a nyirokcsomók állapota csökken. 2007-ben Rizk az UICC/AJCC staging teljes felülvizsgálatát kérte, hogy pontosabb legyen az RCT-re adott tumorválasz értékelése.
A nyelőcsőrák prediktív és prognosztikus faktorai
- A rák angiogenézise
- VEGF
- A tumor vaszkularizációja (MVD) és a CD 34
- A tumor proliferációja és az MIB-1 (Anti Ki67)
- Az apoptózis és a bcl-2 család
- A humán papillomavírusok (HPV)
A proliferációs markerek (MIB-1, AgNOR-k, PCNA) és az angiogén faktorok (VEGF, MVD) szoros összefüggést mutattak a betegség rossz prognózisával (Kitamura és mtsai, 2000). A programozott sejthalálért felelős apoptózis faktorok (bcl-2, BAX, RBp) szerepe is ismert (Shimada et al., 1999). Ismerve a nyirokcsomók állapotának független prognosztikai értékét (Chirieac et al., 2005; Yan et al., 2006), a VEGF rossz prognosztikátornak bizonyult.
A daganatok rossz prognózisa és a bcl-2 hiperexpressziója közötti összefüggés számos daganattípusban és nyelőcsőrákban is ismert (Matzumoto et al., 2001). Így a HPV hatása itt kétirányú, inaktiválja az apoptózist, miközben blokkolja az angiogenezist (Nakamura et al., 1995).
Molekulárbiológiai kimutatási eljárások
- A prediktív faktorok kimutatási eljárásai
- A human papillomavírusok kimutatási eljárásai
Először az alapmembránt fertőzik meg alfa6-integrin receptorok segítségével (Evander et al., 1997), a HPV DNS beépül a sejtmag kromatinjába (Shah és mtsai, 1992). A keratociták differenciálódása során a virális szerkezeti fehérjéket kódoló gének expresszálódnak, majd később a felső sejtrétegben megindul a vírusrészecskék képződése (Miranda et al., 1999). Az eljárás során a genomi DNS- vagy RNS-szekvenciák egyes részeit egy enzim több cikluson keresztül átírja és átírja, és az így amplifikált szekvenciák kimutathatók (Shibata et al., 1988; Saiki és mtsai, 1988, Kim et al. és munkatársai, 1991).
Az elmúlt években a HPV-típusok genomi populációját klónozással térképezték fel, és adatbankokban rögzítették (de Villiers et al., 1999). FISH = Filter - in situ - hibridizáció SBH = Southern blot hibridizáció PCR = polimeráz láncreakció EM = elektronmikroszkóp klón.
Célkitűzések
Kimutatható-e összefüggés a vizsgált proliferatív, angiogén és apoptotikus faktorok, a tumor vaszkularizáció (MVD) és a daganat neoadjuváns radiokemoterápiára adott válasza között?
Anyag és módszer
Anyag (betegek és szövettani minták)
DNS-extrakció
Az IHC vizsgálat kizárólag MIB-1 immunfestési eljárás volt, így ennek kiértékelése csak az így vizsgált proliferációs faktorra készült el (tehát összesen 45 mintán értékeltük a túlélési eredményeket). Az eluátum leöntése után 150 µl AE puffert adtunk a mintákhoz, 1 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk, és 1 percig 8000 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk.
PCR (polimerase chain reaction)
- A PCR lépései
- PCR minták előállítása
HPV-16, 18
- A kontamináció elkerülése
- Észrevételek a PCR technika kidolgozásához
- Az amplifikált DNS gélelektroforézise
- A DNS transzferje az agargélről a nylon-filterre
- Southern blot hibridizáció
- Az oligonukleotidák markírozása
- Hibridizáció
- Detekció
- Immunhisztokémia (IHC)
- Az Avidin - Biotin - Complex
- A peroxidáz enzim színreakciója
- Az antitestek karakterizálása
- Az immunhisztokémiai eljárás leírása
- Statisztika
- Felhasznált anyagok és eszközök
- Tumorszövetek
- Negatív kontrollként használt szövetek
- Oligonukleotidok
Az előhibridizációt követően 16-18 órán át hibridizáltunk 10 ml hibridizációs oldat, 10 µl/ml Poly-A oldat és 6 µl/ml jelölt oligonukleotid keverékével 56 °C-on. Ezt 30 perces inkubálás követte 20 ml konjugátumoldatban (Anti-Digoxigenin-AP-Conjugate, 1:5000 hígítás, TA pufferrel), majd a meg nem kötött konjugátumokat 15 percig mostuk Buffer1-ben. A színreakcióban részt vevő peroxidáz enzim a másodlagos antitesten keresztül az avidin-biotin komplexhez és így az elsődleges antitesthez is kötődik.
A monoklonális antigének nagy specificitása és egypontos kötődése hamis negatív eredményt adhat, ha az antigén meghatározója károsodik vagy funkcionálisan megváltozik. Az inkubálás után a metszeteket Avidin-Biotin-Complex-szel 30 percig inkubáltuk, majd mostuk, és ezt követte a peroxidáz reakció.
5’ GAAAAATAAACTGTAAATCA 3’
A felhasznált tumorszövetek mind formalinnal fixált és paraffinba ágyazott biopsziákból és sebészeti készítményekből származtak, amelyeket a Freiburgi Albert Ludwig Egyetem Sebészeti Klinikáján kezeltek 1997 és 1999 között.
5’ CAACTTCATCCACGTTCACC 3’
Oligonukleotid-szondák (hibridizációhoz)
Kitek
- QIAamp DNA Mini Kit a DNS extrakcióhoz
- Qiagen - PCR - Kit
- DIG Oligonukleotid Tailing Kit, Boehringer, Mannheim
- DIG Nukleotid Acid Detection Kit, Boehringer Mannheim
- ABC-Kit, Vector Burglingame, CA, USA
Pufferek és alapoldatok
- Pufferek és alapoldatok a PCR-hez és a hibridizációhoz
- Immunhisztokémiai pufferek és alapoldatok
DNS-hosszméterek
PCR Nukleotid Mix
Eredmények
- A vizsgált betegek kliniko-patológiai paraméterei
- Klinikai adatok
- A neoadjuváns kezelésre adott tumorválasz
- Perioperatív és posztoperatív kórlefolyás
- HPV - prevalencia
- Betaglobin
- HPV-kimutatás consensus primerekkel
- HPV-16 kimutatás
- HPV-18 kimutatás
- Összefüggések a klinikai paraméterekkel
- Immunhisztokémiai eredmények
- VEGF
Egy beteg kivételével, akinek aplasia miatt meg kellett szakítania a kezelést, minden beteg jól tolerálta az RCT-t. A CR csoportban minden nyirokcsomó daganatmentessé vált/maradt (7/7), a PR csoport 10 betegénél az N0 stádiumok száma 3-ról 8-ra nőtt. A remissziót nem mutató esetekben az N státusz stagnált, míg a progressziót mutató esetekben két esetben N1 stádium, egy esetben pedig távoli metasztázis jelent meg.
Annak ismeretében, hogy az RCT utáni nyirokcsomó-stádium független prognosztikai tényezőnek számít (Chirieac et al., 2005; Yan et al., 2006; Aiko et al., 2007), érthető a remissziót mutató betegek csoportjának kedvező nyirokcsomó-státusza. . További három beteg halt meg két hónapon belül: kettő a légzési elégtelenségben, egy pedig a többszörös szervi elégtelenség (MOF) tünetei miatt. Minden fent említett tesztben először 110 bp-os primerekkel kellett igazolnunk a béta-globin jelenlétét, amely minden emberi sejtben megtalálható, alkalmas a DNS-ellenőrzésre.
Valamennyi laphámsejtes karcinóma közepesen differenciált (G2), a Barrett-nyálkahártyában kialakult adenokarcinóma erősen differenciált volt.
Immunhisztokémiai eredmények
Az értékeléshez fénymikroszkóp alatt, 100-szoros nagyítás mellett megkerestük azokat a területeket, ahol nagy az erek sűrűsége (hot spot területek), majd 200-szoros nagyítással értékeltük azokat.
A CD34 index összefüggése a klinikai paraméterekkel
VEGF és CD34 expresszió korrelációja
MIB-1
- Immunhisztokémiai eredmények
- A proliferácó index összefüggése a klinikai paraméterekkel
A proliferáció index és a VEGF /CD34 expresszió közötti korreláció
A szignifikáns különbségek arra engednek következtetni, hogy ha a PI : VEGF index aránya nagyobb, mint 5, az előrejelzi az RCT-re adott tumorválaszt. Átlag±SD-átlag±SD-átlag±SD-átlag±SD-átlag±SD-átlag±SD-átlag±SD-átlag±SD-átlag±. MVD CR VEGF CR MIB1 CR MVD PR VEGF PR MIB1 PR MVD NRP VEGF NRP MIB1 NRP.
A bcl –2
- Immunhisztokémiai eredmények
- Összefüggés a klinikai paraméterekkel
Anyagunkban a bcl-2 expresszió korrelált (nem szignifikánsan) a daganat szövettani differenciálódásával (G-státusz), de nem a nyirokcsomó-státussal (N-státus).
Túlélési analízis
A laphámrákos esetek 64,3%-áért a remissziós válasz (CR+PR) volt felelős, míg az adenocarcinoma esetek 42,8%-áért.
Az első hazai eredmények
Megbeszélés
- Neoadjuváns terápia és progresszió
- HPV-fertőzés és tumorválasz
- VEGF/CD34 és MIB-1
- Apoptózis
- HPV- fertőzöttség és az immunhisztokémiai eredmények
Csökkenti a tumor méretét ("downsizing") és/vagy stádiumát ("downstage"), és növeli az R0 reszekció esélyét, ami elengedhetetlen a túléléshez (Siewert et al., 2005). A CR csoportban minden betegnél R0 reszekciót végeztek, ami önmagában is jelentős prognosztikai tényezőként ismert (Siewert et al., 2005). A normál és rosszindulatú szöveteken végzett vizsgálatok arra is utalnak, hogy a vírusok felelősek a rosszindulatú átalakulásért (Fidalgo et al., 1995).
Az alkoholmetabolizmus során keletkező acetaldehid a vírus DNS hipometilációjához vezethet, és fokozza annak expresszióját, ezáltal a daganatképződés előrehaladását idézheti elő (Arany et al., 1995). Az RCT utáni magasabb perioperatív morbiditás és mortalitás miatt megvizsgáltuk, hogy van-e összefüggés a HPV fertőzés és a tumorválasz között. A HPV-negatív méhnyakrákos betegeknél 2-6-szor nagyobb a kiújulás kockázata és 4-5-ször nagyobb a távoli metasztázisok kockázata a HPV-pozitív betegekhez képest (Riou és mtsai, 1990).
Más szerzők nem találtak összefüggést a HPV-fertőzés és a prognózis között (Sebbelof et al., 1991; Kentner és mtsai, 1993). A HPV DNS-sel fertőzött méhnyakrák sejtvonalakról számoltak be, hogy in vitro nem reagáltak a sugárterápiára (Rantanen et al., 1998), de a betegek in vivo kemoterápiát is kaptak. Pozitív korrelációról számoltak be a tumor státusza és a VEGF expressziója között, de a VEGF rossz előrejelzője volt az 5 éves túlélésnek (Ogata et al., 1996).
A VEGF kedvezőtlen prognosztikai hatása más gasztrointesztinális daganatok esetében is igazolódott: hasnyálmirigy (Ikeda et al., 1999), gyomor (Maeda és mtsai, 1998) vagy vastagbél (Kang és mtsai, 1997) esetében. . Ha a magas proliferatív aktivitás, a csökkent VEGF-expresszió és a tumor vascularitás (MVD) a jó prognózis mutatói, a HPV-fertőzés mellett nem meglepő, hogy a fenti értékek HPV-pozitív betegekben is megtalálhatók voltak. Együtt vagy külön-külön a HPV fertőzés és az angiogén/proliferatív faktorok megfelelő aránya prognosztikai és prediktív tényezők.
Következtetések
- A HPV-fertőzöttség prediktív hatása
- Az immunhisztokémiailag vizsgált (proliferáció-, angiogenézis-, apoptózis-) faktorok prediktív hatása
- A vizsgált faktorok és a túlélés közötti összefüggés
Elméletileg felmerül a "tyúk vagy tojás" kérdés, hogy vajon a HPV jelenléte a felelős a proliferáció és az angiogén faktorok ilyen kedvező arányáért, vagy a fenti faktor expressziójának ilyen aránya. lehetővé teszi a vírusfertőzést. Az alacsony betegszám ellenére a HPV-fertőzés és az RCT-re adott remissziós válasz között összefüggés feltételezhető, így a HPV-fertőzés prediktív tényezőnek tekinthető. Az általunk mért adatok azt mutatják, hogy az alacsonyabb vaszkularizációs és angiogén aktivitású daganatok, valamint a nagyobb proliferatív aktivitású daganatok jobban reagálnak az RCT-re.
A túlélésben szignifikáns különbséget igazoltak a reagálók és a nem reagálók, valamint a kontroll betegek között, akik nem kaptak RCT-t. A részleges remissziót mutató betegek hasonlóképpen szignifikánsan jobb túlélést mutattak a fenti kontroll és nem reagáló csoportokhoz képest.
Összefoglalás
Ugyanakkor tudta, hogy néhány magas HPV-fertőzött karcinóma több mint 90%-os teljes remisszióval reagál a neoadjuváns kezelésre.
Irodalomjegyzék
Absence of human papillomavirus DNA detected by polymerase chain reaction in French patients with esophageal carcinoma. Detection of human papillomavirus DNA in cytological specimens obtained from esophageal precancerous lesions and cancer. Detection of human papillomavirus DNA in esophageal squamous cell carcinoma by polymerase chain reaction using general consensus primers.
An interlaboratory study to determine the presence of human papillomavirus DNA in esophageal carcinoma from China. Prospective seroepidemiological evidence that human papillomavirus type 16 infection is a risk factor for esophageal squamous cell carcinoma. High prevalence of human papillomavirus in squamous cell carcinoma and corresponding normal esophageal mucosa: assessment by polymerase chain reaction.
Prognostic significance of human papillomavirus genomes (type and aberrant expression of p53 protein in human esophageal cancer. Human papillomavirus type 16 in tumor tissue of low-stage squamous cell carcinoma of the cervix in relation to ploidy and prognosis. Detection of human papillomavirus in formalin-fixed, invasive squamous carcinomas using polymerase chain reaction.
There is no evidence of known types of human papillomavirus in low-risk esophageal squamous cell carcinoma. The presence of human papillomavirus in esophageal squamous cell carcinoma in Hong Kong is a Chinese anxiety disorder association with p53 gene mutation. Detection of human papillomavirus DNA in prostate tissue using a polymerase chain reaction amplification assay.
Low prevalence of human papillomavirus infection in esophageal squamous cell carcinomas from North America: analysis by a highly sensitive and specific polymerase chain reaction-based approach. In situ hybridization study of human papillomavirus DNA expression in benign and malignant esophageal squamous cell lesions.
Saját publikációk jegyzéke
- Az értekezéshez kapcsolódó közlemények
- Az értekezéshez nem kapcsolódó közlemények
Ledniczky Gy, Bognár G, Fiore N, Grosfeld JL, Ondrejka P.(2006)
Bognár G, Forgács B, István G, Bereczky B, Berczi L, Ondrejka P.(2008) A posztoperatív mesenterialis panniculitisről egy sikerrel kezelt eset kapcsán
- Az értekezés témájához kapcsolódó előadások
Extended gastric tube fabricated in situ for reconstruction after oesophagectomy Ondrejka P., Ráth Z., Bognár G., Sugár I., Bereczky B. Prognosztikai faktorok szerepe neoadjuváns terápiával kezelt betegeknél a nyelőcsőrákos betegek progressziója és válaszreakciója szempontjából ( immunhisztokémiai vizsgálatok).
Magyar Sebész Társaság Coloproctologiai Szekciójának Kongresszusa - Zalakaros
Magyar Gastroenterologiai Társaság – Balatonaliga 2004, jun.1-4
- Az értekezés témájából nemzetközi folyóiratban megjelent absztraktok (téma releváns)
Az IASGO (Nemzetközi Sebészek és Gasztroenterológusok és Onkológusok Szövetsége) Magyarországi Tagozatának Kongresszusa, Eger, 16.-17. 2008. május Onkológusok) Magyar Szövetség Kongresszusa, Eger, 2008.
The Role of Predicting Factors in Progression and Response of Patients with Oesophageal Cancer Undergoing Neoadjuvant Therapy (An
Humán papillomavírus (HPV-16) kimutatása a colon laphámsejtes carcinomájából és annak nyirokcsomó-metasztázisaiból
Korábban igazolt prediktív faktorok hazai vizsgálatainak első eredményei neoadjuvans kezelésen átesett nyelőcsőrákos betegeknél
- Nemzetközi folyóiratban megjelent absztraktok (nem táma-releváns)
Spontaneous subhepatic biloma caused by permeable common bile duct associated with choledocholithiasis and constricted gallbladder
DNA Flow cytometry and clinicopathology of intraepithelial neoplasm of the pancreas
Köszönetnyilvánítás
