Témavezető: Dr. Héberger Károly Konzulens:Dr. Jakus Judit

BEVEZETÉS

Mivel egy új vegyület fotodinamikai aktivitását drága és munkaigényes állatkísérletek vagy sejtkultúrák határozzák meg, a kvantitatív szerkezet-aktivitás kapcsolat (QSAR) vizsgálatok fontos szerepet játszhatnak az ígéretes fényérzékenyítő és antivirális szerek kiválasztásában és fejlesztésében. Az irodalomban fellelhető szerkezet-válasz kapcsolat (SAR) vizsgálatokban végzett kísérleti munka összetettsége miatt csak kis számú szenzibilizáló molekulát mértek azonos körülmények között, így az eredmények önmagukban nem alkalmasak a hatékonyság előrejelzésére. Munkánk célja, hogy hozzájáruljunk hatékony fotoszenzibilizáló molekulák kifejlesztéséhez, amelyekhez a jövőben nagyobb számú porfinvázas vegyület fotodinamikus aktivitásának meghatározását tervezzük azonos laboratóriumi körülmények között.

Első lépésként a fenti vizsgálathoz kapcsolódó analitikai módszert kívántunk kidolgozni és olyan kemometriai módszereket választani, amelyek alkalmasak a porfirinek mennyiségi szerkezet-hatás kapcsolatának vizsgálatára. Ezek a mérési technikák és vizsgálati módszerek képezik az alapját saját kísérleti méréseinknek, beleértve a nemzetközi együttműködés keretében tervezett nagyobb molekulaszámú (35-40) molekulát és az azt követő szerkezet-hatás vizsgálatot.

IRODALMI ÖSSZEFOGLALÓ

Porfin-vázas molekulák gyógyászati alkalmazása

• Fotodinamikus terápia
• A fotodinamikus terápia története
• A PDT mechanizmusa
• Fotoszenzibilizátorok
• Vírusellenes szerek
• Porfirin koncentráció meghatározása szervekben

Ő izolálta a legaktívabb HpD-frakciót az 1980-as években, amelyet Photofrin II (QLT PhotoTherapeutics Inc.) néven hoztak forgalomba. A humán gyógyászatban elsőként és máig széles körben alkalmazott Photofrin II® több szempontból sem felel meg a fenti követelményeknek, ezért szükséges új, hatékonyabb fényérzékenyítő szerek kifejlesztése. A Photofrin II® dimerek és oligomerek keveréke, amelyben 1-7 porfirin molekula kapcsolódhat éter- vagy észterkötésekkel [9].

Előnyük a Photofrin II®-hez képest, hogy a vörös tartományban 660 nm feletti a fényelnyelésük és gyorsabban tisztulnak ki az egészséges szövetekből. Az in vivo méréseket in situ mérésekkel kiegészítve pontosabban meghatározható az egyes szervek szenzibilizálószer-tartalmának aránya.

Szerkezet-hatás összefüggés vizsgálatok

• A modern QSAR története
• Tetrapirrol-vázas vegyületek QSAR tanulmányokban
• Paraméterek
• Kísérletileg meghatározható leíró változók
• Az elméleti molekuláris deszkriptorok
• Az indikátor, vagy nemvalódi változók
• Változószelektálási módszerek
• Modellezési eljárások
• Többszörös lineáris regresszió (MLR)
• Parciális legkisebb négyzetek módszere (PLS)
• Mesterséges ideghálózatok (ANN)

Ahhoz, hogy a hatóanyag megfelelő időben és koncentrációban juthasson el a szervezetben a megfelelő helyre (pl. egy receptorhoz), különböző vizes vagy lipidben gazdag közegeken kell átjutnia. Míg kezdetben csak néhány paraméter (pl. σ, logP, π, moláris fénytörés, sztérikus Es paraméter) állt rendelkezésre, mára ezek száma több ezer [91]. 0D (0-dimenziós) leírók, amelyeket az összegképlet (pl. atomszám, különböző atomok száma, molekulatömeg) és az olyan atomi tulajdonságok alapján számítanak ki, mint az atomtömeg, atomtöltés, van der Waals-sugár, atompolarizáció. b.).

A legismertebb topológiai paraméterek a kapcsolódási (elágazási) indexek (Randich index), pl. amikor az egyes kötésekben részt vevő két atom kötésszámát megszorozzuk a hidrogénmentes molekulaváz alapján, majd összeadjuk a termékek reciprok négyzetgyökeit. Hamar kiderült, hogy nem képesek az agy utánzására, de matematikailag nehezen megoldható problémákra (pl. nemlineáris kapcsolatok vagy többváltozós folyamatok) tökéletesen használhatók.

KíSÉRLETI RÉSZ

Szenzibilizátor – koncentráció meghatározás

• Mérési módszer
• Mérőműszer összeállítása
• Vizsgált vegyületek
• In situ mérések
• In vitro mérések
• Hematoporfirin koncentráció meghatározás májhomogenizátumban
• Hp kalibráció májhomogenizátumban
• Az in situ szenzibilizátor koncentráció kalibrálása
• Az ACS3 felhalmozódási és kiürülési kinetikájának vizsgálata
• Eredmények

Az érzékenyítő in situ (bőr, belső szervek, vérplazma) koncentrációját azokban a pillanatokban határoztuk meg, amikor a vizsgált szervek hatóanyagtartalma magas volt. 3 órával a gyógyszer beadása után az állatokat kimetszettük, és szervenként három helyen mértük a fluoreszcencia intenzitását in situ reflektancia szondával. A felhalmozódott szenzibilizátor mennyiségének meghatározásakor minden szervből mintát vettünk, és az adott szövetre desztillált vízzel történő homogenizálással 10, 20 és 50%-os szervhomogenizátumokat készítettünk.

Minden kezelt máj esetében a Hp-koncentrációkat a homogenizátum szervtartalmának függvényében ábrázoltuk, és az illesztési vonalból leolvastuk a 100%-os májtartalomra vonatkozó szenzibilizátor koncentráció értékét. Az in situ méréseknél a máj inhomogenitása miatt három különböző lebenyben mértük a fluoreszcencia intenzitást, majd az intenzitások átlagához rendeltük az adott állat májából in vitro becsült szenzibilizátor koncentrációt. Az in situ mért intenzitások szórása adott bőrön átlagosan 11,4%, míg az egyes állatok bőrében mért átlagos intenzitásértékek szórása azonos érzékenyítő koncentráció mellett 14,3%.

Egy állat plazmájából mért intenzitások átlaga 7,3%, míg az állatok közötti standard eltérés 13% volt azonos koncentrációjú szenzibilizátor alkalmazása mellett. Az ACS3 fotoszenzibilizátor felhalmozódásának és eliminációjának kinetikájának vizsgálatához a szenzibilizátor koncentrációjának szervhígításon alapuló meghatározását alkalmaztuk. Megállapítottuk, hogy a fluoreszcencia intenzitásának in situ mérésével nyomon tudjuk követni az egyes szervekben az érzékenyítő tartalom változását, de a hatóanyag egyes szervek közötti megoszlásáról nem kapunk információt (30. A ábra). Az ACS3 felhalmozódásának és leválásának kinetikája egerekben A) az in situ fluoreszcencia intenzitás változása és B) a koncentráció becsült változása alapján.

A szenzibilizálószer-koncentráció számszerűsítésével kapott kinetikai görbék szerint (30B. ábra) a máj mint méregtelenítő szerv rendelkezik a legmagasabb szenzibilizálószer-tartalommal az első 24 órában. A fenti mérés szerint a vizsgált fotoszenzibilizátorral végzett PDT kezelés során az optimális expozíciós idő a gyógyszer beadását követő 24-30 óra között van, amikor a daganatban még magas, a bőrben és a plazmában pedig alacsony az érzékenyítő mennyisége.

Mennyiségi szerkezet-hatás összefüggés vizsgálatok

• Számítások menete
• Geometria-optimalizálás és konformációanalízis
• Leíró változók (deszkriptorok)
• Többszörös lineáris regressziós számítások
• Részleges legkisebb négyzetek módszere
• Mesterséges ideghálózatok alkalmazása
• Modellek ellenőrzése
• Pirofeoforbidok (PF) QSAR vizsgálata
• Molekulák szerkezete
• Mért PDT aktivitás és felhalmozódás
• Biológiai aktivitás – lipofil jelleg összefüggések
• A modellépítés eredményei
• Következtetések
• Porfirin és rokon vegyületek QSAR vizsgálata
• Molekulák szerkezete
• Biológiai adatok
• Modellépítés eredményei
• Az egyes deszkriptorok és az anti-HIV-1 aktivitás közötti összefüggések
• Modellek ellenőrzése
• Modellépítési eljárások összehasonlítása
• Tervezett molekulák anti-HIV-1 aktivitásának becslése
• Következtetések

A 3DNET programban automatikus kihagyásos keresztellenőrzés során a modell kimeneti jel előrejelző képességét vizsgáltuk. Az anti-HIV-1 aktivitás becslésekor a változókiválasztásban részt vevő 17 vegyület közül számításonként 4 molekulát kihagytunk a modellépítési eljárásból (anélkül, hogy az adott leíró kombinációt megváltoztattuk volna), majd megbecsültük az aktivitási értékeket. Az anti-HIV-1 aktivitás előrejelzésének utolsó kontroll lépéseként megbecsültük három, a változókiválasztási és modellépítési folyamatból kihagyott vegyület aktivitási értékét minden modellnél (17 molekulával képezve).

A szerzők által közölt HIV-1-ellenes aktivitás (log 1/EC50): a porfirin koncentráció (mM) reciprojának logaritmusa, amelynél a HIV-1 P24 magfehérje termelése 50%-ra csökken a vírussal fertőzött MT-2 humán T limfocita sejtekben. Ez a modell azonban nem alkalmas az a (M8 hiányzó uroporfirin I) aktivitás értékelésére. A grafikus ábrázolás szerint a magas HIV-1-ellenes aktivitású vegyületek valószínűsége nagyobb azoknál a molekuláknál, amelyek 0,9 és 1,1 közötti hidrogénkötés savassági értékei közé esnek.

Mindazonáltal nagyon jól megbecsülte egy olyan molekula HIV-1-ellenes aktivitását, amelyet az eredeti CoMFA-vizsgálatból kihagytak Debnath és munkatársai (a protoporfirin IX dimetil-észtere, az M1 vegyület R6 és R7 pozícióiban lévő propionsav-oldalláncok metil-észtere: mért aktivitás = -1,83, számított aktivitás = -1,33). Összehasonlítottuk a négy módszerrel (MLR, PLS, ANN és ​​CoMFA) felépített modellek képességét a HIV-1 elleni aktivitás leírására és előrejelzésére. Bár a CoMFA modellek nagyon alkalmasak az anti-HIV-1 aktivitás leírására, nem kaptunk valós képet a prediktív képességükről, mivel a szerzők nem validálták a modelleket, kivéve a kihagyó keresztvalidációt.

A CoMFA-modell szerint az általunk hatékonynak talált leíró-kombinációkban az anti-HIV-1 aktivitást befolyásoló kulcsfontosságú fizikai-kémiai jellemzők, mint például az elektrosztatikus tulajdonságok, az intramolekulán belüli töltéseloszlás és a sztérikus tényezők is megjelennek. Az ANN modellek szerint azok a magas HIV-1-ellenes aktivitású hematoporfirinek várhatók, amelyekre a DF ≤ 6 és DBE ≈ 20 feltételek teljesülnek. ANN_V ANN_VI ANN_VII ANN_IX Az átlagos .. és DM7) becsült aktivitás meghaladja a protoporfirin IX anti-HIV-1 aktivitását (log1/EC50=-0,34), amely a tervezés kiindulópontja.

Az egyetlen tételes, egyet elhagyó keresztellenőrzés önmagában nem ad megbízható képet a modell aktivitás előrejelzésére való képességéről. Általánosságban elmondható, hogy mesterséges neurális hálókkal épített modelljeink alkalmasak a porfin gerincből származó nagyobb számú minta HIV-1-ellenes aktivitásának előrejelzésére, ami ebben a vizsgálatban nem szerepelt.

EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA TÉZISPONTOKBAN

A kezelt állat szervében in situ mért fluoreszcencia intenzitás és a szervből készített mintákban meghatározott érzékenyítő koncentráció alapján in situ kalibrációs görbét készítettem. Mivel az azonos családba tartozó tetrapirrol vázvegyületek fotofizikai tulajdonságai (szubsztituens hatás) közötti különbség elhanyagolható, ezért várható, hogy egy adott család egy tagjára készített in situ kalibrációt a család többi tagjára is alkalmazni fognak. A PDT aktivitás mérése során minimális állatlétszámmal rövid idő alatt meghatározható az optimális szenzibilizátor gerjesztési idő, az abszolút koncentrációk meghatározása pedig lehetővé teszi az egyes vegyületek akkumulációjának összehasonlítását.

A kvantitatív szerkezet-hatás összefüggés során felépített modellek aktivitás-leíró és prediktív képességeinek összehasonlításával egynemű pirofeoforbid sorozat háromdimenziós szerkezete és a daganatban való felhalmozódása, valamint fotodinamikus aktivitása között megmutattuk, hogy a vizsgált szenzibilizáló modellsorozat akkumulációs foka jól leírható mind a felépített szekciós modellsorozatunkkal, mind a felépített hálózatunkkal. A felhalmozódás előrejelzésének legfontosabb paramétere a logP, amely egy mesterséges neurális hálózat segítségével önmagában is elegendő leíró változó. Számításaink szerint a PDT aktivitás leírására és előrejelzésére alkalmas modell nem építhető fel lineáris módszerrel, míg a mesterséges neurális hálózattal nagyon jó modellek építhetők.

Nagyszámú, szerkezetileg változatos porfin fotoszenzibilizátor nem fotodinamikus anti-HIV-1 aktivitását három módszerrel (többszörös lineáris regresszió, részleges legkisebb négyzetek módszere és mesterséges neurális hálózat) modellezve azt találtuk, hogy a lineáris módszerekkel (MLR, PLS) épített modellek is jól leírják az aktivitást, de az n-elem hiányzó n-elem alapján az n-elem alapján. Az egyes ANN modellek szerint a HIV-1 elleni aktivitás előrejelzésének legfontosabb paramétere a kémiai kötés forgási szabadságfoka (DF). Ez a változó önmagában nem alkalmas a vizsgált aktivitás becslésére, legalább még egy hozzájárulás, a kettős kötés ekvivalens leíró (DBE) vagy az elektrosztatikus teljes hidrogénkötés-biztonsági leíró (ESTA) szükséges.

A számítások megfeleltek a várakozásoknak, a modellek a nagy aktivitású molekulák aktivitását magasra, míg az alacsonyabb aktivitású molekulák alacsonyra becsülték. Számításaink alapján elmondható, hogy az MLR és a PLS nem, míg a mesterséges neurális hálók alkalmas módszerek kis és nagyszámú tetrapirrol keretes molekulák mennyiség-szerkezet-hatás kapcsolatának vizsgálatára, mind homogén és heterogén vegyületek, mind pedig a szerkezeti paraméterektől lineárisan és nemlineárisan függő biológiai aktivitások esetén.

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

IRODALOMJEGYZÉK

Structural requirements for and consequences of binding of an antiviral porphyrin to the V3 loop of the human immunodeficiency virus (HIV-1) envelope glycoprotein gp120. Porphyrin bleaching and PDT-induced spectral changes are irradiance-dependent in normal mouse skin sensitized by ALA in vivo. Van Leengoed E., Versteeg J., Van der Veen N., Van der Berg-Lock A., Marijnissen H., Star W. Tissue localization properties of some photosensitizers studied by in vivo fluorescence imaging.

A Comparative Study of Tissue Distribution and Photodynamic Therapy Selectivity of Chlorine e6, Photofrin II and ALA-Induced Protoporphyrin IX in a Colon Carcinoma Model. Evaluation of quantitative structure-activity relationship methods for large-scale prediction of chemicals binding to the estrogen receptor. The synthesis, photophysical and photobiological properties and in vitro structure-activity relationships of a set of silicon phthalocyanine PDT photosensitizers.

A comparative analysis of silicone phthalocyanine photosensitizers for in vivo photodynamic therapy of RIF-1 tumors in C3H mice. A quantitative in vivo structure-activity relationship for a congeneric series of pyropheophorbide derivatives as photosensitizers for photodynamic therapy. Quantitative parabolic structure-activity relationships and photodynamic therapy: application of a three-compartment model with purification to in vivo quantitative structure-activity relationships of a congeneric series of pyropheophorbide derivatives used as photosensitizers for photodynamic therapy.

Three-dimensional structure-activity analysis of a series of porphyrin derivatives with anti-HIV-1 activity targeting the V3 loop of the gp120 envelope glycoprotein of the human immunodeficiency virus type 1. The structure, catalytic activity and reaction mechanism modeling for halogenated iron-tetraphenylporphyrin complexes. In vitro and in vivo efficacy of Photofrin and pheophorbide a, a bacteriochlorin, in photodynamic therapy of colon cancer cells. Molecular structures – Perception, autocorrelation descriptor and SAR studies – system of atomic contributions for the calculation of the normal-octanol-water partition coefficients.

SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE