MEiN Mój wkład w powstanie tej pracy polegał na współudziale w opracowaniu koncepcji i metodologii badań oraz uczestnictwie we wszystkich fazach eksperymentu, które obejmowały: przygotowanie mikroorganizmów, przygotowanie pożywek i odczynników, organizację stanowiska badawczego, produkcję i czyszczenie. celuloza bakteryjna, wdrożenie i optymalizacja procesu modyfikacji celulozy bakteryjnej, ocena efektywności procesu modyfikacji, analiza właściwości fizykochemicznych modyfikowanej celulozy bakteryjnej, tj. ocena MEiN składu pożywki hodowlanej, przygotowanie mikroorganizmów, produkcja i oczyszczanie celulozy bakteryjnej, ocena żywotności komórek bakteryjnych podczas hodowli, analiza zmian składu pożywki hodowlanej podczas hodowli, analiza właściwości fizykochemicznych otrzymana celuloza bakteryjna tj. MEiN Mój wkład w powstanie tej pracy polegał na opracowaniu koncepcji i metodologii badań oraz udziale we wszystkich fazach eksperymentu, które obejmowały: przygotowanie mikroorganizmów, przygotowanie pożywek testowych i odczynników, organizację stanowiska badawczego, produkcję i oczyszczanie celulozy bakteryjnej , wdrożenie procesu modyfikacji celulozy bakteryjnej, impregnacja materiałów celulozowych środkiem antyseptycznym, wykonanie analiz: wchłaniania i retencji środka antyseptycznego, wchłaniania sztucznego wysięku, uwalniania środka antyseptycznego do sztucznego łożyska rany (spektroskopia UV-VIS), ocena działania przeciwbakteryjnego i aktywności antybiofilmu (metoda krążkowa, testy żywotności komórek), przygotowanie próbek do analizy cytotoksyczności pod mikroskopem konfokalnym oraz udział w opracowaniu uzyskanych wyników, wykonaniu analiz statystycznych i napisaniu manuskryptu.
3 z 4 prac wchodzących w skład cyklu składającego się na niniejszą rozprawę doktorską (publikacje D-2, D-3, D-4) zostały opublikowane w Open Access. Oświadczenia współautorów publikacji naukowych wchodzących w skład cyklu stanowiącego rozprawę doktorską wraz z określeniem ich indywidualnego udziału. Celuloza bakteryjna (BC), znana również jako bionanoceluloza, jest polimerem o unikalnych właściwościach, dzięki którym znajduje zastosowanie w wielu gałęziach przemysłu i dziedzinach nauki.
Wprowadzenie
Do produkcji materiałów opatrunkowych stosuje się polimery syntetyczne (poli(alkohol winylowy), poli(N-winylopirolidon, poli(kwas akrylowy), glikol polietylenowy)) lub polimery naturalne (chitozan, chityna, alginian, celuloza, kolagen, pektyna) (Massarelli et al., 2020; Zheng et al., 2020. Za jednego z najbardziej wydajnych producentów BC uważa się Gram-ujemną bakterię tlenową należącą do gatunku Komagataeibacter xylinus (dawniej Gluconacetobacter xylinus) (Lahiri et al.) al., 2021).Czaja et al. 2019), BC, zwłaszcza w postaci silnie uwodnionej błony, która nigdy nie była wysuszona, jest z powodzeniem stosowana jako materiał opatrunkowy na rany przewlekłe i oparzenia.
Istnieje tylko kilka publikacji naukowych opisujących zastosowanie B.C. częściowo lub całkowicie wysuszone jako materiał powłokowy (Wei i in., 2011; Portela i in., 2019). Do najczęściej stosowanych modyfikacji należą modyfikacje chemiczne, tworzenie kompozytów z innymi materiałami/substancjami, zmniejszanie krystaliczności czy liofilizacja (Rajwade i in., 2015; Torres i in., 2019; He i in., 2021). Z tego powodu poszukuje się alternatywnych źródeł składników odżywczych dla bakterii syntetyzujących celulozę (Revin et al., 2018; Abol-Fotouh et al., 2020).
Hipotezy
Wykazano np., że w wyniku ekspozycji mikroorganizmów na działanie pola magnetycznego mogą wystąpić zmiany kształtu komórek bakteryjnych, przepuszczalność błony komórkowej, a nawet utrata jej integralności, prowadząc do ich zniszczenia (Luo i wsp. al., 2005; Konopacki i in., 2019). Wykazano, że RMF może wpływać na zmiany w fizjologii i morfologii komórek bakteryjnych oraz ruch naładowanych cząstek, a w konsekwencji procesy mieszania i dyfuzji (Rakoczy i in., 2017, Konopacki i in., 2019, Publikacja A -10 ). Znane są metody wytwarzania BC z wykorzystaniem podłoży produkcyjnych opartych na surowcach naturalnych lub odpadowych, w tym sokach i skórkach owocowych, serwatce, łuskach ryżowych czy kukurydzy (Kongruang, 2007; Revin i in., 2018).
Jednak w celu wydajnej biosyntezy BC pożywki te muszą być dodatkowo uzupełniane lub poddawane energochłonnym i kosztownym etapom obróbki wstępnej (Goelzer i in., 2009; Kurosumi i in., 2009; Revin i in., 2018). Materiały na bazie BC wytwarzane w pożywce z sokiem komórkowym bulw ziemniaka, modyfikowane reakcją sieciowania z użyciem kwasu cytrynowego i mieszaniny wodorofosforanu disodu i wodorowęglanu sodu jako katalizatorów, charakteryzują się wydłużonym czasem uwalniania środka antyseptycznego ( dichlorowodorek oktenidyny), w porównaniu z niemodyfikowanym BC (Publikacja D-3). RMF zwiększa szybkość uwalniania antyseptyka (dichlorowodorku oktenidyny) z nośnika na bazie BC i jego penetrację przez kolejne warstwy biofilmu utworzonego przez S.
Cel badawczy
Materiały na bazie BC, wytwarzane na podłożu z soków komórkowych bulw ziemniaka, modyfikowane reakcją sieciowania z użyciem kwasu cytrynowego i mieszaniny wodorofosforanu disodu i wodorowęglanu sodu jako katalizatorów oraz impregnowane środkiem antyseptycznym (dichlorowodorkiem oktenidyny), charakteryzują się wysoką aktywność przeciwdrobnoustrojowa wobec S. RMF zwiększa skuteczność środka antyseptycznego (dichlorowodorku oktenidyny) uwalnianego z nośnika na bazie BC wobec biofilmów bakteryjnych wytwarzanych przez S. Ocena kinetyki uwalniania środka antyseptycznego (dichlorowodorku oktenidyny) z materiałów na bazie BC wytworzonych w pożywkę z soku komórkowego z bulw ziemniaka i zmodyfikowaną metodą sieciowania krzyżowego z użyciem kwasu cytrynowego i mieszaniny wodorofosforanu disodu i wodorowęglanu sodu jako katalizatorów (publikacja D-3).
Ocena właściwości przeciwdrobnoustrojowych materiałów na bazie BC wytworzonych w pożywce z soku komórkowego bulw ziemniaka, modyfikowanych reakcją sieciowania z użyciem kwasu cytrynowego oraz mieszaniny wodorofosforanu disodu i wodorowęglanu sodu jako katalizatorów, impregnowanych kwasem cytrynowym antyseptyczny (dichlorowodorek oktenidyny), przeciwko bakteriom w hodowlach na podłożach stałych, płynach i biofilmach (Publikacja D-3). Ocena wpływu RMF na szybkość uwalniania środka antyseptycznego (dichlorowodorku oktenidyny) z nośnika na bazie BC i jego późniejsze przenikanie przez warstwy biofilmu bakteryjnego in vitro (Publikacja D-4). Ocena wpływu RMF na skuteczność środka antyseptycznego (dichlorowodorku oktenidyny) uwalnianego z nośnika na bazie BC wobec biofilmów bakteryjnych wytwarzanych przez S.
Materiały i metody badawcze
- Mikroorganizmy
- Bioreaktory wspomagane wirującym polem magnetycznym
- Wytwarzanie celulozy bakteryjnej
- Określenie ilości i żywotności komórek K. xylinus podczas wytwarzania celulozy
- Oczyszczanie i wstępna charakterystyka celulozy bakteryjnej
- Modyfikacja celulozy bakteryjnej
- Analiza właściwości fizykochemicznych celulozy bakteryjnej
- Ocena makro- i mikrostruktury
- Skład pierwiastkowy powierzchni
- Skład chemiczny
- Parametry związane z absorpcją i utrzymaniem cieczy
- Gęstość
- Właściwości mechaniczne
- Cytotoksyczność
- Impregnacja celulozy bakteryjnej antyseptykiem oraz analiza jej podstawowych
- Zdolność do pochłaniania wysięku
- Kinetyka uwalniania antyseptyku w sztucznym łożysku rany
- Analiza aktywności przeciwdrobnoustrojowej celulozy bakteryjnej
- Hodowle bakteryjne na podłożu stałym
- Hodowle bakteryjne w podłożu płynnym
- Hodowle bakteryjne w formie biofilmu
- Wpływ wirującego pola magnetycznego na wybrane parametry związane
- Analiza ilości uwolnionego antyseptyku i szybkości jego penetracji przez
- Analiza efektu przeciwdrobnoustrojowego
- Analiza morfologiczna bakterii tworzących biofilm
- Analiza zawartości cukrów w macierzy biofilmu
- Analiza statystyczna
Wszystkie opisane poniżej testy przeprowadzono stosując BC zmodyfikowane przez reakcję sieciowania i niezmodyfikowane BC jako kontrolę. Powyższe metody wykorzystano również do oceny wychwytu i retencji OCT modyfikowanych reakcjami sieciowania BC (Publikacja D-3). Żywe i martwe fibroblasty wizualizowano za pomocą mikroskopu konfokalnego (Leica SP8, Leica Microsystems, Niemcy) (Publikacje D-1, D-2, D-3).
Wizualizacja wpływu RMF i OCT uwalnianych z nośnika na bazie BC na żywotność komórek w biofilmie została przeprowadzona przez barwienie barwnikami SYTO-9 i jodkiem propidyny (Thermo Fisher Scientific, USA) i ocenę wybarwionych próbek za pomocą mikroskopu konfokalnego. (Leica SP8, Leica Microsystems, Niemcy). Próbki biofilmu wystawione na działanie RMF oczyszczono z komórek bakteryjnych, dializowano i analizowano za pomocą chromatografii gazowej połączonej z pojedynczym kwadrupolowym spektrometrem masowym (GC-MS/MS, Shimadzu, QP2010, Japonia). Różnice statystyczne między próbami wyznaczono za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) oraz testu post hoc Tukeya (publikacje D-1, D-2, D-3, D-4).
Wyniki
Biorąc pod uwagę obiecujące wyniki moich badań opublikowane w publikacji D-1, postawiłem hipotezę, że opracowany przeze mnie materiał może sprostać wymaganiom nowoczesnych bandaży. Ponieważ jednak wykazałem, że każdorazowe suszenie zmodyfikowanego BC zmniejsza jego właściwości sorpcyjne, w badaniach wykorzystałem również materiał, który nie został wysuszony po procesie wypłukiwania odczynników użytych w procesie modyfikacji (MBCw, mokra, modyfikowana celuloza bakteryjna) . W wyniku tych analiz uzyskałem dwa profile uwalniania – jeden wspólny dla materiałów modyfikowanych, a drugi dla materiałów niemodyfikowanych.
W dalszych etapach badań potwierdziłem nietoksyczność opracowanych przeze mnie materiałów i ustaliłem, że charakteryzują się one dobrą adhezją do zakrzywionych powierzchni, w przeciwieństwie do OCT-BCd. Dlatego w ramach kolejnej pracy (publikacja D-4) podjąłem się analizy wpływu RMF (częstotliwość 5 i 50 Hz) na uwalnianie OCT z nośnika na bazie suchego, niezmodyfikowanego BC i jego przenikanie przez biofilm . warstwy. Przeprowadziłam również analizy wpływu RMF na matryce biofilmu, które wykazały, że w wyniku ekspozycji na RMF zwiększa się ich porowatość.
Wnioski
Cytowana literatura
Water retention and release properties of bacterial cellulose obtained by in situ and ex situ modification. Evaluation of the anti-biofilm activities of bacterial cellulose-tannic acid-magnesium chloride composites using an in vitro multispecies biofilm model. Production and characterization of nanospheres of bacterial cellulose from Acetobacter xylinum from processed rice husk.
Use of different fruit juices as carbon source for bacterial cellulose production by Acetobacter xylinum NBRC 13693. Production of nano bacterial cellulose from candied jujube processing industry wastewater using Acetobacter xylinum. Physical structure variations of bacterial cellulose produced by different Komagataeibacter xylinus strains and carbon sources under static and agitated conditions.
Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo-badawczych
Osiągnięcia naukowe związane z produkcją i wykorzystywaniem celulozy
Wyniki tych badań wykazały, że immobilizowane na BC drożdże Yarrowia lipolytica zużywały w procesie fermentacji więcej glukozy w porównaniu z wolnymi komórkami, a ich aktywność metaboliczna, a co za tym idzie produkcja CA, utrzymywała się na stabilnym poziomie przez 4 kolejne cykle fermentacji, podczas gdy w w przypadku komórek wolnych z każdym kolejnym cyklem obserwowano spadek aktywności metabolicznej i produkcji CA. Od początku swojej działalności naukowej w Katedrze Mikrobiologii i Biotechnologii zajmowałem się również badaniami nad obniżeniem kosztów produkcji BC czy zwiększeniem wydajności jej biosyntezy. Jednym ze sposobów, które badałem w celu zwiększenia wydajności produkcji BC na dużą skalę, było użycie bioreaktora powietrznego z zewnętrzną pętlą (RMF) (EL-ALB) do przygotowania inokulum K.
Fermentacja prowadzona w takim bioreaktorze pozwoliła na uzyskanie inokulum o ponad 200-krotnie większej gęstości komórek w porównaniu z metodami klasycznymi, przy zachowaniu zdolności do wydajnej produkcji BC o powtarzalnych właściwościach. Znacząca poprawa produkcji kwasu cytrynowego przez Yarrowia lipolytica unieruchomioną w bakteryjnym nośniku na bazie celulozy. Przygotowanie inokulum Komagataeibacter xylinus do biosyntezy celulozy bakteryjnej z wykorzystaniem bioreaktora powietrznego z zewnętrzną pętlą wspomagania magnetycznego.
Osiągnięcia naukowe związane z zastosowaniem celulozy bakteryjnej jako nośnika
Jednym ze sposobów, które badałem w celu zwiększenia wydajności produkcji BC na dużą skalę, było zastosowanie bioreaktora powietrznego z zewnętrzną pętlą (RMF) (EL-ALB) do przygotowania inokulum K, w którym uzyskano inokulum o ponad 200 razy większej liczbie komórek gęstość w porównaniu z metodami klasycznymi, przy zachowaniu możliwości wydajnego wytwarzania BC o powtarzalnych właściwościach. Zagadnieniami związanymi z biofilmem interesowałem się jeszcze przed rozpoczęciem pracy doktorskiej, uczestnicząc w badaniach, których celem była analiza m.in. Biorąc pod uwagę skomplikowany charakter biofilmu bakteryjnego oraz wiele czynników, które mogą wpływać na jego parametry, takie jak ilość biomasy czy aktywność metaboliczna, brałam udział w badaniach, których wyniki wykazały duży wpływ zastosowanej pożywki hodowlanej na wymienione parametry dla gronkowców biofilm.
Praca ta pozwoliła mi zwrócić szczególną uwagę na czynniki, które należy wziąć pod uwagę przy badaniu skuteczności opatrunków antybiofilmowych, które wykorzystałam w swoich badaniach. W badaniach, w których brałem udział, wykazano również, że BC może być dobrym nośnikiem substancji naturalnych. Oprócz standardowego procesu nasycania/impregnacji nośnika BC środkiem przeciwbakteryjnym, można również stworzyć dwufunkcyjny system, w którym komórki roślinne produkujące substancje lecznicze są zaszczepiane BC.
Osiągnięcia naukowe związane z wytwarzaniem przeciwdrobnoustrojowych filtrów
Osiągnięcia naukowe związane z wpływem wirującego pola magnetycznego na
Data are shown as mean±standard error of the means (SEM) obtained from at least three different measurements (plus technical replicates). It is worth noting that in the case of sample M7 (modified in the presence of sodium hypophosphite), the phosphorus content was Effect of drying process on the properties of bacterial cellulose films from Gluconacetobacter hansenii.
All measurements were performed as previously described in section 3.2 (Determination of pH, protein and carbohydrate concentration in potato juice medium). Then, 1.5×1.5 cm OCT-MBC and OCT-BC materials were placed in the center of the plate. In the next step, the OCT-MBC and OCT-BC materials (5×5 cm) were gently placed in the center of the plate.
In the process of drying, the structure of the unmodified BC material irreversibly collapses (and significantly loses its thickness). In turn, in the case of the M and B discs, the differences in viability inhibition depending on the RMF frequency were approx. Following this last observation, we performed a parametric analysis of the RMF-induced changes in the pseudomonal and staphylococcal biofilm matrix.
It was found that the application of RMF (5 and 50 Hz) changed the saccharide composition of both biofilms analyzed (Table 1). In the case of the experimental model applied in this research, the environment is microbiological medium and agar discs. For the case of M7, although SR (%) reached the highest values at the mass ratio of 2:1, further increase did not result in statistically significant differences (also between and 3:1).
The surface microstructure of modified and unmodified (control) BC samples (magnification 10,000x, SEM, Auriga 60, Zeiss, Oberkochen, Germany).
