1 prof. dr hab. Barbara Klajnert-Maculewicz Łódź, dn. 10 marca 2023 r.
Katedra Biofizyki Ogólnej
Wydział Biologii i Ochrony Środowiska Uniwersytet Łódzki
ul. Pomorska 141/143 90-236 Łódź
Recenzja rozprawy doktorskiej Pani mgr Adrianny Cytryniak
pt. „Nanostrukturalne ciekłokrystaliczne lipidowe nośniki chemioterapeutyków oraz emiterów promieniowania korpuskularnego do zastosowań w celowanej terapii nowotworów”
wykonanej pod kierunkiem Pani prof. dr hab. Renaty Bilewicz i Pani dr hab. Ewy Nazaruk oraz Pana prof. dr hab. Aleksandra Bilewicza
na Wydziale Chemii Uniwersytetu Warszawskiego
Rozprawa doktorska Pani mgr Adrianny Cytryniak dotyczy zastosowania kubosomów jako transporterów doksorubicyny (DOX) i radionuklidów. W pracy opisano otrzymanie i charakterystykę tych ciekłokrystalicznych lipidowych nośników oraz badania biologiczne z użyciem linii komórek nowotworowych HeLa w hodowlach 2D i 3D.
Praca zawiera część literaturową, część doświadczalną, wyniki badań, podsumowanie i wnioski oraz bibliografię. Spis literatury obejmuje 223 pozycje, w zdecydowanej większości z okresu ostatnich 20 lat.
Wstęp teoretyczny zawiera podstawowe informacje dotyczące terapii nowotworów oraz nanośników leków, ze szczególnym uwzględnieniem kubosomów. W tej części pracy znalazły
2 się także opisy podstaw teoretycznych zastosowanych metod badawczych. Na uznanie zasługuje bardzo staranne przygotowanie tej części pracy od strony językowej (dotyczy to zresztą całej rozprawy doktorskiej). W tekście jest bardzo mało błędów literowych bądź stylistycznych. Moja jedyna drobna uwaga merytoryczna do wstępu teoretycznego dotyczy tabeli przedstawionej na stronie 11, która zestawia nośniki DOX zatwierdzone do stosowania w terapii, bądź będące w trakcie badań klinicznych. Tabela ta powstała w oparciu o pracę opublikowaną w Drug Discovery Today w 2017 roku1. Należy przypuszczać zatem, że informacje te są przynajmniej częściowo nieaktualne.
W części doświadczalnej nie jest dla mnie jasny podział na rozdział 3.2. Aparatura i wykonanie pomiarów, oraz rozdział 3.3. Metodyka badań. Co więcej, nie została zachowana chronologia przeprowadzonych badań, bo przygotowanie kubosomów wieńczy tę metodyczną część rozprawy, zamiast ją rozpoczynać.
Mocną stroną przedstawionej do oceny pracy doktorskiej jest zastosowanie bardzo zróżnicowanych metod, takich jak rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego pod małymi kątami do badań strukturalnych faz kubicznych i kubosomów, dynamiczne rozpraszanie światła do charakterystyki kubosomów, pomiary elektrochemiczne oraz spektrofotometryczne do zbadania profilu uwalniania leku z faz kubicznych, pomiary radioaktywności i wreszcie badania in vitro z użyciem linii komórkowej HeLa.
Sposób opisu wyników jasno wskazuje, że Doktorantka miała pełne zrozumienie zastosowanych metod i powodów, dla których przeprowadzała kolejne doświadczenia. Tę część pracy czyta się bardzo dobrze, przebija z niej naukowa dojrzałość Doktorantki.
W przedstawionej do oceny pracy doktorskiej bardzo zabrakło mi osobnego rozdziału poświęconego dyskusji wyników. Częściowo tę rolę spełnia rozdział 5. Podsumowanie i wnioski. Niemniej, ma on rzeczywiście bardziej charakter podsumowania, zatem zawiera niekiedy powtórzenia stwierdzeń zawartych w rozdziale 4. Wyniki badań. Co więcej, aż dziewięć wniosków zamieszczonych na stronach 118 i 119 jest w większości syntetycznym zebraniem poczynionych w pracy obserwacji.
Moim zdaniem, podstawowym celem, jaki powinna postawić sobie Doktorantka, jest odpowiedź na pytanie, czy przenoszenie w jednym nośniku dwóch różnych substancji terapeutycznych (tj. DOX i emiterów promieniowania b- lub a), co stanowi sporą część rozprawy doktorskiej, jest obiecującą strategią.
1 Cagel, M., Grotz, E., Bernabeu, E., Moretton, M.A., Chiappetta, D.A. Doxorubicin:
nanotechnological overviews from bench to bedside. Drug Discovery Today 2017, 22, 270-281
3 Wyznakowanie kubosomów radionuklidami wymagało wprowadzenia makrocyklicznego ligandu (DOTAGA-OA). Już wcześniejsze badania zespołu wskazywały na fakt, iż zastosowanie domieszek może wpływać na szybkość uwalniania DOX2. Te obawy znalazły potwierdzenie w badaniach Doktorantki (rysunki 60 i 65). Jednocześnie Doktorantka postuluje, że wbudowanie DOX w kubosomy zwiększa aktywność cytotoksyczną leku i pozwala na zastosowanie mniejszych dawek chemioterapeutyku (str. 98 rozprawy).
Mechanizm działania DOX wymaga leku w uwolnionej postaci, aby mógł on wniknąć pomiędzy nici DNA. Jak zatem Doktorantka wyjaśniłaby ową zwiększoną cytotoksyczność?
Doktorantka wyznacza w pracy wartości IC50 dla DOX unieruchomionej w kubosomach, nie przeprowadza jednak analogicznych badań dla wolnej DOX. Powołuje się w tym miejscu na badania innego zespołu wykonane zbliżoną metodą MTT, gdzie otrzymano wartość 13 µg/mL3. Warto przy okazji nadmienić, że w literaturze można znaleźć bardzo różne wartości IC50 DOX dla linii HeLa, dla różnych czasów inkubacji, często znacznie krótszych niż stosowała w swoich badaniach Doktorantka (np. 4,8±0,8 µM4; 0,2±0,11µg/mL5). Powinno to zachęcać do samodzielnego wykonania badań kontrolnych.
Doktorantka zaobserwowała, że zastosowanie bimodalnych kubosomów (z DOX i znakowanych lutetem-177) dało pożądany efekt jedynie przy krótkim czasie inkubacji i dużej dawce promieniowania (rysunek 71). Nie znalazłam jednak próby wyjaśnienia, czemu efektu tego nie obserwowano dla dłuższych czasów inkubacji. Nie jest też dla mnie jasne, czemu brak efektu addytywności, bądź synergii dla DOX i aktynu-225 jest tłumaczony długim czasem połowicznego rozpadu aktynu-225, podczas gdy efekt cytotoksyczny dla kubosomów z samym
225Ac jest obserwowany (rysunek 75). Ponadto zastosowanie krótkożyciowego emitera promieniowania a (bizmutu-213) wiele w tym względzie nie zmieniło, tj. w dalszym ciągu nie obserwowano ani efektu addytywności, ani synergii (rysunek 76).
2 Nazaruk, E., Górecka, E., Osornio, Y.M., Landau, E.M., Bilewicz, R. Charged additives modify drug release rates from lipidic cubic phase carriers by modulating electrostatic interactions. J. Electroanal.
Chem. 2018, 819, 269-274
3 Lalitha, L.J., Sales, T.J., Prince, P., Clarance, P., Agastian, P, Kim, Y.O., Mahmoud, A.H., Elshikh, M.S., Tack, J.C., Na, S.W., Kim, H.J. In-vitro phytopharmacological and anticancer activity of Loranthus Longiflorus Desv. Var. Falcatuskurz against human lung cancer cells. J. King Saud Univ. – Science 2020, 32, 1246-1253
4 Huang, Y, Yang, T., Zhang, W., Lu, Y, Ye, P., Yang, G., Li, B., Qi, S., Liu, Y., He, X., Lee, R.J., Xu, C., Xiang, G. A novel hydrolysis-resistant lipophilic folate derivative enables stable delivery of targeted liposomes in vivo. Int. J. Nanomedicine 2014, 9, 4581-4595
5 Yang, T., Xu, L., Li, B., Li, W., Ma, X, Fan, L., Lee, R.J., Xu, C., Xiang, G. Antitumor activity of folate receptor-targeted immunoglobulin G-doxorubicin conjugate. Int. J. Nanomedicine 2017, 12, 2505-2515
4 Za najbardziej wartościową część pracy uważam tę poświęconą sekwencyjnemu podawaniu kubosomów zawierających DOX i kubosomów z 213Bi. Pożądany efekt takiego skojarzonego podawania został potwierdzony szeregiem metod (testem MTS, badaniem rodzaju śmierci komórki, analizą cyklu komórkowego, wreszcie badaniami na sferoidach).
Podsumowując, w moim przekonaniu przedstawiona mi do oceny rozprawa doktorska spełnia warunki określone w Ustawie z dnia 20 lipca 2018 r. Prawo o szkolnictwie wyższym i nauce (tekst jednolity Dz. U. z 2022 r. poz. 574 z późn. zm.). Wnoszę zatem do Rady Naukowej Dyscypliny Nauki Chemiczne Uniwersytetu Warszawskiego o dopuszczenie Pani mgr Adrianny Cytryniak do dalszych etapów postępowania o nadanie stopnia doktora w dziedzinie nauk ścisłych i przyrodniczych w dyscyplinie nauki chemiczne.
