(1)

ТЕЗИСЫ ДОКЛАДОВ

ежегодной научной конференции ИНСТИТУТА БИОХИМИИ

имени А.Н.Баха РАН

2012

(2)

1

КОНФОРМАЦИОННОЕ РАВНОВЕСИЕ И РН-ЗАВИСИМОСТЬ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ КРАСНОГО ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО БЕЛКА KFP А.С.Горященко¹, А.Л.Русанов¹, В.А.Миронов², Б.Л.Григоренко², А.В.Немухин², А.П.Савицкий¹

1 Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН

2 МГУ им. М.В.Ломоносова, Химический факультет

Публикации

1. Rusanov, A.L., Mironov, V.A., Goryashenko, A.S., Grigorenko, B,L., Nemukhin, A.V., Savitsky, A.P., Conformational Partitioning in pH-Induced Fluorescence of the Kindling Fluorescent Protein (KFP).

J. Phys. Chem. B (2011), Vol. 115(29), pp. 9195-9201.

Резюме работы

Флуоресцирующие белки широко применяются как генетически кодируемые флуоресцентные маркеры экспрессии генов и локализации белков в клетках, а также как биосенсоры. Особенностью хромопротеина KFP является существенное увеличение его флуоресценции при облучении зеленым светом. Однако, к росту флуоресценции могут привести и другие факторы, одним из которых является изменение рН. Целью данной работы было изучение влияния рН на флуоресцентные свойства KFP.

Изменение рН привело к сдвигу положения максимума поглощения, возбуждения и эмиссии флуоресценции KFP. Анализ рН-зависимости спектров поглощения и флуоресценции KFP позволил выдвинуть предположение, согласно которому рост флуоресценции при щелочных рН обусловлен смещением конформационного равновесия между различными формами белка в растворе. Основываясь на данных о кристаллической структуре KFP и результатах молекулярного моделирования, было предположено, что появление новых форм белка вызвано изменениями в структуре водородных связей в окружении хромофора, но не в нем самом. Согласно полученным результатам, наиболее существенными являются изменения структуры взаимодействий, связанных с боковыми цепями остатков Cys62 и Ser158. Таким образом, флуоресцентные свойства KFP зависят от конформационного состояния белка и его ионизации при щелочных рН.

(3)

2

FRET-FLIM ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕНЕТИЧЕСКИ-КОДИРУЕМЫХ СЕНСОРОВ

НА ОСНОВЕ ЦВЕТНЫХ БЕЛКОВ

В.В.Жердева¹, А.Л.Русанов¹, Л.Р.Арсланбаева¹, М.Г.Хренова², А.В.Немухин², Т.В.Городничева³, Т.В.Ивашина⁴, Л.М.Винокуров⁴, А.П.Савицкий¹

1 Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН

2 МГУ им. М.В.Ломоносова, Химический факультет

3 ЗАO « Евроген», Москва

4Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН

1. Л.Р.Арсланбаева, В.В.Жердева, Т.В.Ивашина, Л.М.Винокуров, В.Б.Морозов, А.Н.Оленин, А.П.Савицкий. Индуктивно-резонансный перенос энергии между тербийсвязывающим пептидом и красными флуоресцентными белками DsRed2 и TagRFP. Биофизика, 2011, том 56, вып. 3, с. 389-395.

2. Alexander P. Savitsky, Alexander L. Rusanov, Victoria V. Zherdeva, Tatiana V. Gorodnicheva, Maria G. Khrenova and Alexander V. Nemukhin. FLIM-FRET Imaging of Caspase-3 Activity in Live Cells Using Pair of Red Fluorescent Proteins. Theranostic, 2012 (принята в печать).

Визуализация и количественная оценка белок-белкового взаимодействия в клетке являются актуальными задачами современного биоимиджинга. Флуоресцентная микроскопия, в основе которой лежит получение изображений с распределением времен жизни флуорофора, (FLIM) и метод флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) обеспечивают высокое пространственное (нанометры) и временное разрешение (наносекунды) сигнала, что позволяет улавливать молекулярные события.

В нашей работе была осуществлена регистрация протеолитической активности каспазы- 3, ключевого фермента апоптоза, в живых клетках с использованием FRET-FLIM технологии и конфокальной микроскопии. Объектом исследований являлась клеточная трансдуцированная опухолевая линия A549, полученная путем лентивирусной трансфекции и экспрессирующая генетически-кодируемый субстрат каспазы-3 (TagRFP-23-KFP) на основе цветных флуоресцирующих белков TagRFP и KFP. Для расчета эффективности переноса энергии и анализа возможных стерических затруднений между субстратом TagRFP-23-KFP и димером каспазы-3 была проведено компьютерное моделирование. Имиджинг протеолитической активности каспазы-3 был получен как распределение усредненного времени жизни молекулы TagRFP (донора), которое изменялось от 1.8-2.1 нс для нерасщепленной конструкции до 2.4-2.6 нс для расщепленной каспазой-3 конструкции. Появление долгоживущей компоненты при расщеплении соответствовало времени жизни TagRFP в несвязанном состоянии. Анализ распределения времени жизни в клетках позволил дискриминировать апоптотические клетки от живых клеток в пределах одной клеточной популяции. Данный подход является высокоинформативным и не зависит от концентрации флуорофора и фоновой флуоресценции.

Поскольку, как это было показано нами ранее, мыши обладают фоновой флуоресценцией с временем жизни порядка 1.5 нс, для повышения чувствительности нами начаты работы по разработке генетически-кодируемых сенсоров на основе лантанидных хелатов и флуоресцентных цветных белков. В качестве донора во FRET-паре был использован тербий-связывающий пептид (Tb³⁺-СП), в котором триптофан являлся сенсибилизатором флуоресценции лантанидов, а в качестве акцептора был использован красный флуоресцентный белок DsRed2 или TagRFP. Были изучены условия FRET, рассчитаны значения эффективности FRET для двух пар Tb³⁺-СП-DsRed2 и Tb³⁺-СП-TagRFP. Уникальным свойством таких сенсоров является миллисекундная флуоресценция акцептора вследствие переноса энергии с лантанидов, что имеет важное преимущество перед другими сенсорами, проявляющееся в увеличении соотношения сигнал/фон за счет минимизации наносекундного фонового сигнала.

Разработанные сенсоры и выбранные подходы в регистрации флуоресцентного сигнала являются высокоинформативными инструментами для детекции молекулярных событий in vitro и in vivo, что предполагает их использование в высокоэффективном скрининге лекарственных соединений и молекулярном биоимиджинге.

(4)

3

ВЛИЯНИЕ 2-ГИДРОКСИПРОПИЛ-БЕТА-ЦИКЛОДЕКСТРИНА НА АГРЕГАЦИЮ БЕЛКОВ

О.И.Малолеткина¹, К.А.Маркосян¹, С.Ю.Клейменов¹, В.Ф.Макеева¹, Н.А.Чеботарева¹, Б.И.Курганов¹, Л.В.Белоусова², Р.А.Асриянц³, П.И.Семенюк³, В.Н.Орлов³, Н.Б.Полянский⁴, К.О.Муранов⁴

2 МГУ им. М.В.Ломоносова, Биологический факультет

3 Институт физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ им.

М.В.Ломоносова

4 Институт биохимической физики им. Н.М.Эмануэля РАН

1. Maloletkina O.I., Markossian K.A., Belousova L.V., Kleimenov S.Y., Orlov V.N., Makeeva V.F., Kurganov B.I. (2010) Thermal stability and aggregation of creatine kinase from rabbit skeletal muscle.

Effect of 2-hydroxypropyl-beta-cyclodextrin. Biophys. Chem., v. 148, p.121-130.

2. Maloletkina O.I., Markossian K.A., Asryants R.A., Semenyuk P.I., Makeeva V.F., Kurganov B.I.

(2010) Effect of 2-hydroxypropyl-beta-cyclodextrin on thermal inactivation, denaturation and aggregation of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from rabbit skeletal muscle. Int. J. Biol.

Macromol., v. 46, p. 487-492.

3. Maloletkina O.I., Markossian K.A., Chebotareva N.A., Asryants R.A., Kleymenov S.Y., Poliansky N.B., Muranov K.O., Makeeva V.F., Kurganov B.I. (2012) Kinetics of aggregation of UV-irradiated glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from rabbit skeletal muscle. Effect of agents possessing chaperone-like activity. Biophys. Chem., in press.

Изучено влияние 2-гидроксипропил-бета-циклодекстрина (ГПЦД) на тепловую денатурацию и агрегацию креатинкиназы (КК) и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы

(ГАФД) из скелетных мышц кролика. По данным дифференциальной сканирующей

калориметрии (ДСК) термостабильность КК не изменялась в присутствии ГПЦД. Влияние ГПЦД на тепловую агрегацию КК, исследованное методом динамического светорассеяния, было объяснено в рамках механизма, согласно которому начальной стадией процесса агрегации является образование стартовых агрегатов. Характеристикой скорости агрегации служит параметр t2R (интервал времени, за который происходит увеличение значения гидродинамического радиуса агрегатов белка в два раза). Чем выше значение 1/t2R, тем выше скорость агрегации. Подавление агрегации КК под действием ГПЦД происходило в результате увеличения длительности лаг-периода кинетических кривых агрегации и уменьшения значения 1/t2R. В присутствии 76 мМ ГПЦД наблюдалось 10-кратное снижение значения 1/t2R. Гидродинамический радиус стартовых агрегатов возрастал от 30 нм в отсутствие ГПЦД до 140 нм в присутствии 76 мМ ГПЦД.

Форма ДСК профилей ГАФД, полученных в присутствии ГПЦД, показывает, что ГПЦД снижает тепловую стабильность ГАФД. Именно снижение стабильности ГАФД является причиной усиления тепловой агрегации ГАФД в присутствии ГПЦД. Начальные участки зависимостей гидродинамического радиуса (Rh) белковых агрегатов от времени линейны.

Увеличение скорости агрегации ГАФД в присутствии ГПЦД вызвано уменьшением длительности лаг-периода кинетических кривых агрегации и увеличением скорости изменения значений Rh во времени. Таким образом, главным фактором, определяющим характер влияния ГПЦД на тепловую агрегацию ГАФД, является уменьшение термостабильности ГАФД в присутствии ГПЦД.

Разработана новая тест-система для скрининга антиагрегационных агентов, основанная на агрегации УФ-облученной ГАФД. Показано, что в результате УФ-облучения в растворе присутствуют развернутые молекулы белка, что дает возможность исследовать влияние различных агентов, обладающих шапероноподобной активностью, непосредственно на стадию агрегации белка в условиях, близких к физиологическим (37 С). С помощью данной тест- системы показан защитный эффект ГПЦД на агрегацию ГАФД.

(5)

4

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МАЛЫХ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА С БЕЛКОВЫМ СУБСТРАТОМ В УСЛОВИЯХ КРАУДИНГА

Н.А.Чеботарева¹, С.Г.Роман¹, Т.Б.Еронина¹, В.Ф.Макеева¹, С.Ю.Клейменов¹, К.О.Муранов², Н.Б.Полянский², Н.Б.Гусев³, Б.И.Курганов¹

2 ИБХФ РАН

3 МГУ им. М.В.Ломоносова, Биологический факультет, кафедра биохимии Публикации

1. Roman S.G., Chebotareva N.A., Eronina T.B., Kleymenov S.Yu., Makeeva V.F., Poliansky N.B., Muranov K.O., Kurganov B.I. Does crowded cell-like environment reduce the chaperone-like activity of

-crystallin? Biochemistry, 2011, 50, 10607-10623

2. Chebotareva N.A., Makeeva V.F., Bazhina S.G., Eronina T.B., Gusev N.B., Kurganov B.I. Interaction of Hsp27 with native phosphorylase kinase under crowding conditions. Macromolecular Bioscience, 2010, 10(7):783-789

Главной функцией малых белков теплового шока (sHsp), одного из классов молекулярных шаперонов, является предотвращение агрегации денатурированных белков. В основе шапероно-подобной активности sHsp лежит их взаимодействие с развернутыми формами белков-субстратов, образующихся в условиях стресса (например, при тепловом или УФ-индуцированном стрессе). Ожидается, что в клетке краудинг усиливает белок-белковые взаимодействия, в том числе и агрегацию белков. Влияние краудинга на шапероно-подобную активность -кристаллина, представителя семейства sHsp, было изучено на тест-системе, основанной на агрегации УФ-облученной гликогенфосфорилазе b (Phb). Эта тест-система позволяет исследовать влияние разных агентов непосредственно на стадию агрегации белка.

Методом динамического лазерного светорассеяния (ДЛС) было показано, что раствор Phb , денатурированной УФ-облучением, содержит первичные агрегаты со средним гидродинамическим радиусом 10 нм, которые относительно стабильны при 20С. На примере предложенной тест-системы экспериментально продемонстрировано стимулирующее действие краудинга на стадии агрегации белков. При изучении агрегации УФ-облученной Phb при 37С в присутствии краудинг-агентов (ПЭГ 20000, Фикол 70000 и триметиламин-N-оксид) методом ДЛС показано уменьшение анти-агрегационной способности -кристаллина в условиях краудинга. Методом скоростной седиментации показано образование комплексов при 30 и 37С между диссоциированными формами sHsp и белковым субстратом. На основании данных аналитического ультрацентрифугирования, гель-фильтрации (SEC) и электрофореза в ПААГ предложена схема взаимодействия УФ-облученной Phb и -кристаллина. Предполагается, что образуются комплексы двух типов между шапероном и белком-субстратом: 1) комплексы, образованные диссоциированными формами sHsp и денатурированным белком, которые относительно устойчивы в условиях краудинга; 2) высокомолекулярные комплексы между - кристаллином и денатурированной Phb. Комплексы второго типа характеризуются более низкой скоростью агрегации по сравнению с УФ-облученной Phb, однако, краудинг стимулирует агрегацию этих комплексов, что приводит к уменьшению шапероно-подобной активности -кристаллина.

Методами скоростной седиментации и ДЛС изучено при 20С взаимодействие нативной киназы фосфорилазы (PhK) и sHsps (Hsp27 дикого типа и его 3D мутанта) в условиях краудинга. Краудинг провоцирует образование крупных ассоциатов как PhK, так и Hsp27.

Однако, взаимодействие Hsp27 and PhK в условиях краудинга приводит к диссоциации больших гомо-олигомеров каждого из белков и образованию комплексов Hsp27-PhK относительно небольшого размера

(6)

5

РЕГУЛЯЦИЯ ЦИКЛИЧЕСКОГО ТРАНСПОРТА ЭЛЕКТРОНОВ ЧЕРЕЗ ФОТОСИСТЕМУ I В КЛЕТКАХ ЦИАНОБАКТЕРИИ

SYNECHOCYSTIS SP. PCC 6803 Ю.В.Болычевцева¹, Н.В.Карапетян¹, И.В.Еланская²

2 МГУ им. М.В.Ломоносова, Биологический факультет, кафедра генетики

1. Регуляция циклического транспорта электронов через фотосистему I в клетках дикого штамма и мутантов цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803, лишенных дыхательных дегидрогеназ.

Биохимия, 76, 526-537, 2011 Резюме работы

Исследовали циклический перенос электрона вокруг фотосистемы 1 (ФС1) в клетках дикого типа цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803 и мутантов, лишенных дегидрогеназы

NDH-1 (М55) или сукцинатдегидрогеназы (SDH^-). Фотоиндуцированные изменения

поглощения P700 в присутствии диурона и индукцию флуоресценции измеряли при помощи импульсного флуориметра РАМ101. Для регулирования уровня NADP⁺ в строме клетки выдерживали 30 мин на свету (25 μE м^-2с^-1) или 2 ч в темноте. Клетки дикого типа и мутантов, выдержанные 30 мин на свету, характеризуются одинаковой кинетикой переменной флуоресценции (Fv) в присутствии DCMU, что указывает на одинаковое содержание ФС2.

Сравнение «редокс» состояния пула PQ у дикого типа и обоих мутантов, оцененное по отношению площади над кривой индукции флуоресценции с DBMIB к площади над кривой индукции флуоресценции с DCMU, выявило одинаковые значения соотношений площадей для дикого типа и мутанта SDH^- и более низкое соотношение у мутанта M55 по сравнению с диким типом. Эти данные указывают на ускоренный перенос электронов из стромы мутанта M55 в пул пластохинонов на свету.

В отсутствие дегидрогеназ скорость темнового восстановления P700⁺ у обоих мутантов не снижалась, а у мутанта, лишенного NDH-1, даже возрастала по сравнению с таковой у дикого типа. DBMIB замедлял темновое восстановление P700⁺. Следовательно, независимо от присутствия дегидрогеназ, клетки способны осуществлять циклический перенос электронов через пул пластохинонов на P700⁺. Снижение уровня конечных акцепторов фотосинтеза и дыхания (NAD(P)⁺ и кислорода) в результате 30 мин предосвещения или при анаэробиозе замедляло фотоокисление P700 и ускоряло темновое восстановление P700⁺. Таким образом, скорость «редокс» превращений P700 при циклическом транспорте электронов в клетках дикого типа и мутантов Synechocystis определяется уровнем NADP⁺ и кислорода в строме.

Рассматривается возможность оценки уровня этих акцепторов по соотношению площади над кривой фотоокисления P700 к скорости темнового восстановления P700⁺.

(7)

6

ИССЛЕДОВАНИЕ ТРИПЛЕТНОГО СОСТОЯНИЯ ХЛОРОФИЛЛА D:

ФОСФОРЕСЦЕНЦИЯ И ГЕНЕРАЦИЯ СИНГЛЕТНОГО КИСЛОРОДА К.В.Неверов¹, С.Сантабарбара², А.А.Красновский¹

1 Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

2 Институт биофизики, Национальный Совет Научных Исследований, Милан, Италия

1. K.V.Neverov, S.Santabarbara, and A.A.Krasnovsky (2011) Phosphorescence study of chlorophyll d photophysics. Determination of the energy and lifetime of the photo-excited triplet state. Evidence of singlet oxygen photosensitization. Photosynth Res., 108:101-106.

Фотосинтез одноклеточной цианобактерии Acariochloris marina служит необычным примером альтернативного оксигенного фотосинтеза, при котором основным пигментом, вместо обычного для цианобактерий хлорофилла а, служит более длинноволновый пигмент - хлорофилл d (Хл d), который доминирует в фотосинтетических антенных комплексах этой цианобактерии и обнаружен в реакционных центрах (РЦ) фотосистем 1 и 2. Хл d был химически охарактеризован еще 1948 г., но считался химическим артефактом, продуктом деградации хлорофилла а. Домини- рующая роль этого пигмента в фотосинтезе Acariochloris marina была обнаружена лишь несколько лет назад и в настоящее время его исследование привлекает ведущие лаборатории. В частности, большое внимание уделяется изучению триплетного состояния Хл d, которое заселяется в результате конверсии из синглетно- возбужденного состояния. В настоящей работе, с помощью уникальных приборов нашей лаборатории, была обнаружена и исследована низкотемпературная фосфоресценция, сопровождающая излучательную дезактивацию триплетно-возбуждённых молекул Хл d в эфирe и водно-детергентной смеси (2% Тритон Х-100) в жесткой матрице замороженных растворов при 77K, когда возможность тушения триплетного состояния растворенным кислородом полностью отсутствует. Главный максимум фосфоресценции находился при 978 нм (полуширина пика 67 нм), что соответствует величине энергетического уровня триплетного состояния в 1,26 eV, время жизни фосфоресценции – около 1 мс. Таким образом, фосфоресценция Хл d смещена на 30-40 нм в длинноволновую сторону по сравнению с Хл а.

При комнатной температуре, когда триплетные молекулы Хл d сильно затушены кислородом воздуха, освещение растворов Хл d приводило к появлению фосфоресценции синглетного кислорода при 1270 нм, который образуется в результате переноса энергии на кислород от триплетных молекул пигмента. Исследования показали, что квантовый выход фотосенсибилизированной Хл d генерации синглетного кислорода весьма высок - около 65%.

Это позволяет предположить возможность активного участия триплетных молекул Хл d и синглетного кислорода в фотоокислительных процессах, являющихся причиной фотоингибирования фотосинтетического аппарата у Хл d-содержащих организмов.

(8)

7

ИНГИБИТОРЫ СЕРИНОВЫХ ПРОТЕИНАЗ ИЗ КЛУБНЕЙ КАРТОФЕЛЯ И ИХ РОЛЬ В ЗАЩИТНОЙ СИСТЕМЕ КАРТОФЕЛЯ

Т.А.Валуева, С.В.Беневоленский, Е.Л.Гвоздева, Н.Г.Герасимова, Е.В.Иевлева, Н.Н.Кудрявцева, Е.В.Морозкина, И.А.Парфенов, А.В.Софьин, Т.А.Ревина

Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН Публикации

1. Ревина Т.А., Парфенов И.А., Гвоздева Е.Л., Герасимова Н.Г., Валуева Т.А. Ингибитор химотрипсина и трипсина из клубней картофеля. Прикладная биохимия и микробиология. 2011.

Т. 47. № 3. С. 265-271.

2. Valueva T.A., Parfenov I.A., Revina T.A., Morozkina E.V., Benevolensky S.V. Structure and properties of the potato chymotrypsin inhibitor. Plant Physiology and Biochemistry. 2012, V. 52. № 1. P. 83-90.

3. Valueva T.A., Kudryavtseva N.N., Sof’in A.V., Revina T.A., Gvozdeva E.L., Ievleva E.V. Comparative analysis of exoproteinases produced by of three phytopathogenic microorganisms. The Journal of Pathogens. 2011. doi:10.4061/20011/947218

Клубни картофеля содержат белки, которые ингибируют сериновые протеиназы и и принадлежат к подсемейству PKPI (potato Kunitz-type proteinase inhibitors). Новый высокоочищенный белок был выделен из покоящихся клубней картофеля (Solanum tuberosum L., сорт Юбилей Жукова). Белок с молекулярной массой 23 кДа, обозначенный как PKCI (potato Kunitz-type chymotrypsin inhibitor) состоял из одной полипептидной цепи. Определены его 20 N- концевых аминокислотных остатков, анализ которых позволил отнести PKCI к группе PKPI-B.

Белок PKCI с одинаковой степенью эффективности подавлял активность химотрипсина и трипсина, образуя с ферментами эквимолярные комплексы. Белок PKCI содержит два независимо действующих реактивных центра и способен одновременно связывать молекулы обоих ферментов. Из генома картофеля выделена кДНК, обозначенная как PKPIJ-B, и установлена ее нуклеотидная последовательность. Показано, что кДНК PKPIJ-B кодирует белок PKCI, что позволило восстановить его полную аминокислотную последовательность.

Ингибитор PKCI в различной степени угнетал рост и развитие патогенных микроорганизмов Fusarium culmorum и Phytophtora infestans (Mond.) de Bary, поражающих картофель. Это свидетельствовало об участии белка PKCI в защитной системе растения картофеля.

Для того, чтобы определить, зависит ли секреция протеолитических ферментов от условий окружающей среды и филогенетического положения болезнетворного микроорганизма, были изучены протеиназы, секретируемые оомицетом Phytophthora infestans и грибами Rizoctonia solani и Fusarium culmorum, которые принадлежат к различным семействам грибов и вызывают серьезные заболевания картофеля. Специфичность действия внеклеточных протеиназ этих патогенных микроорганизмов на белковые и синтетические субстраты свидетельствует о том, что они содержали трипсино- и cубтилизиноподобные ферменты независимо от состава культуральной среды. Соотношение этих протеиназ зависело от состава культурной среды и формы доступного азота, особенно в случае экзоферментов, продуцируемых R. solani. Филогенетические исследования показали, что экзопротеиназы аскомицета ближе по своим свойствам к псевдогрибу оомицету, несмотря на то, что они более отдаленные родственники, чем к базидиомицету. На основании наших данных можно предположить, что протеиназы, секретируемые патогенными грибами, должны играть различную роль в патогенезе, увеличивая адаптивность и ареал, используемых растений-хозяев, а также участвовать в биохимических процессах, обеспечивающих выживание патогена вне растения-хозяина в различных экологических нишах.

(9)

8

ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ PAECILOMYCES LILACINUS – ГРИБОВ-ЭКСТРЕМОФИЛОВ ЧЕРНОБЫЛЬСКОЙ ЗОНЫ

А.С.Егорова¹, Н.Н.Гесслер¹, Т.А.Белозерская¹, А.Е.Иванова², К.Б.Асланиди³, Ю.В.Карпенко⁴, С.В.Олишевская⁴

1 Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН

2МГУ им. М.В.Ломоносова, факультет почвоведения

3 Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН

4 Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К.Заболотного НАН Украины, Киев Публикации

1. Т. Belozerskaya , K. Aslanidi, А. Ivanova, N. Gessler, A. Egorova, Yu. Karpenko, and S. Olishevskaya.

Characteristics of Extremophylic Fungi from Chernobyl Nuclear Power Plant. MICROBIOLOGY BOOK SERIES – NUMBER 2 Vol. 1 "Current Research, Technology and Education Topics in Applied Microbiology and Microbial Biotechnology". Environmental Microbiology, Geomicrobiology, Soil Microbiology, Biocontrol. P. 88-94. Formatex Research Center Spain, 2010, ISBN (13): 978-84-614- 6194-3, Editor: Antonio Mendez –Vilas. Publisher: Formatex Research Center

2. Егорова А.С., Гесслер Н.Н.; Белозерская Т.А. Меланиновые пигменты у гриба Paecilomyces lilacinus. Доклады РАН. 2011, Т. 437, № 3, С. 413-415.

Постоянное нарастание антропогенного влияния на окружающую среду приводит к формированию резистентных микроорганизмов, способных выживать в экстремальных условиях.

200 видов микроскопических грибов 83 родов выявлено в загрязненных радионуклидами почвах 10-км зоны отчуждения ЧАЭС. У этих грибов утеряно половое воспроизведение, они способны сорбировать радионуклиды и осуществлять химическую модификацию техногенных загрязнений.

В последнее время показано, что действие радиоактивного излучения на живые организмы приводит к повышению образования в клетках активных форм кислорода (АФК).

Известно, что у грибов-экстремофилов Чернобыльской зоны большую роль в антиоксидантной защите играют меланиновые пигменты.

Эвритопный вид P.lilacinus, обладающий гиалиновым мицелием и совершенно не изученный с точки зрения защиты от стресса привлек наше внимание ввиду следующих особенностей: широкого распространения как в аэробных, так и в анаэробных условиях существования; способностью паразитировать как на насекомых и рыбах, так и на людях;

способностью служить индикатором высокого радиоактивного загрязнения почв чернобыльской зоны (3,7х10⁶-3,7х10⁷ Бк/кг), способностью адаптироваться к высокой концентрации меди в среде обитания,

значительно превышающей ПДК.

Исследованию стрессоустойчивости 11 штаммов этих грибов и посвящена данная работа.

Нами впервые выявлено, что:

1. Устойчивость к окислительному стрессу у чернобыльских штаммов на порядок выше, чем у штаммов из фоновых местообитаний.

2. Это свойство чернобыльских изолятов обеспечивается, по-видимому, за счет пигментов, в первую очередь, меланиновых. Содержание меланинов у «фоновых» штаммов гораздо ниже.

3. Ферментативные механизмы защиты штаммоспецифичны: у ряда штаммов чернобыльской зоны СОД реагирует на стресс, а у других – каталаза.

4. Устойчивость к окислительному стрессу максимально проявляется у чернобыльских изолятов и у штаммов, адаптированных к повышенной концентрации меди при 0,2%

глюкозы в среде, несмотря на их способность существовать при концентрации глюкозы в среде от 0,001% до 20% (олигокарботолерантность).

5. 5. Защиту от стресса обеспечивает и агрегированный рост гиф.

На основании полученных характеристик рассмотренные штаммы можно считать пригодными для биоремедиации. В тоже время эти микроорганизмы являются перспективными моделями для понимания эволюции стрессоустойчивости и выявления тенденций формирования новых биотопов, в том числе, новых паразитических форм микроскопических грибов.

(10)

9

СТИМУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ МЕХАНО-РОСТОВОГО ФАКТОРА МИОФИБРИЛЛЯРНЫМИ БЕЛКАМИ

В.А.Фуралёв, И.В.Кравченко, В.О.Попов Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН Публикации

1. Kravchenko IV, Furalyov VA, Lisitsina ES, Popov VO. Stimulation of mechano-growth factor expression by second messengers. Arch Biochem Biophys. 2011; 507(2):323-31.

2. Kravchenko IV, Furalyov VA, Popov VO. Stimulation of mechano-growth factor expression by myofibrillar proteins in murine myoblasts and myotubes. Mol Cell Biochem. 2011 Dec 9. [Epub ahead of print].

Механо-ростовой фактор (МРФ) представляет собой продукт, образующийся в мышечных клетках в результате альтернативного сплайсинга РНК гена инсулино-подобного фактора роста 1. МРФ стимулирует пролиферацию миобластов и миграцию клеток - миогенных предшественников. Экспрессия данного ростового фактора резко возрастает в ответ на интенсивную мышечную нагрузку и при повреждении мышечной ткани. Механизмы активации синтеза МРФ до сих пор остаются малоизученными.

В нашей лаборатории ранее было показано, что гомогенат мышечной ткани стимулирует экспрессию МРФ в культурах миобластов, однако природа индукторов осталась неизвестной.

Нами была разработана методика выделения и очистки до электрофоретически гомогенного состояния белков мышечной ткани, стимулирующих синтез МРФ. С помощью этой методики было выделено три белка – индуктора МРФ. Методами МАЛДИ и иммуноблоттинга они были идентифицированы как миофибриллярные белки титин, миомезин и миозин-связывающий белок С. Было установлено, что все три белка стимулируют экспрессию МРФ путём активации аденилатциклазы и стимуляции синтеза цАМФ.

В результате совместной работы с Европейской молекулярно-биологической лабораторией (Гамбург) было установлено, что в структуре миомезина за стимуляцию экспрессии МРФ отвечают участки, содержащие фибронектиновые домены типа III и иммуноглобулиноподобные домены.

(11)

10

РЕКОМБИНАНТНЫЙ МЕХАНО-ЗАВИСИМЫЙ ФАКТОР РОСТА (MGF) ЧЕЛОВЕКА: ЭКСПРЕССИЯ И ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА Е.В.Морозкина, С.С.Зацепин, С.В.Беневоленский, Я.С.Керученько, И.Д.Керученько, В.П.Хотченков, В.О.Попов

Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН Публикации

1. Morozkina E.V., Marchenko A.N., Keruchenko J.S., Keruchenko I.D., Khotchenkov V.P., Popov V.O, Benevolensky S.V.(2010) Proteinase B disruption is required for high level production of human mechano growth factor (MGF) in Saccharomyces cerevisiae. JMMB, 2010, 18(3):188-94

Открытый в последние десятилетия механо-зависимый фактор роста (MGF) продуцируется в активных мышечных тканях и отвечает за контроль над их восстановлением и поддержанием. MGF имеет значительный терапевтический потенциал, поскольку повышает силы нормальных и атрофированных мышц, а так же обладает важной нейропротекторной функцией.

Дрожжи Saccharomyces cerevisiae являются перспективным организмом, используемым для продукции белков медицинского назначения. Сконструирован штамм дрожжей – продуцент секреторного рекомбинантного MGF человека. Однако продукт был не стабилен и подвергался протеолизу в культуральной жидкости. Идентифицирован фермент – протеиназа Б (PrB), обеспечивающая деградацию MGF. Стабилизацию продукции и увеличение ее уровня удалось достичь введением делеции Δprb1 в геном штамма-продуцента. В результате оптимизации процесса культивирования выход целевого белка составил 10 мг/л.

Разработана процедура выделения фармацевтически-валидированной субстанции MGF человека и наработана пилотная партия препарата для проведения доклинических испытаний.

По результатам проведенных испытаний на здоровых животных и животных с моделями нескольких патологий продемонстрирована высокая фармакологическая эффективность препарата рекомбинантного MGF человека.

(12)

11

НОВЫЕ ИГРОКИ В ПРОЦЕССЕ РЕАКТИВАЦИИ ПОКОЯЩИХСЯ ФОРМ МИКОБАКТЕРИЙ

М.О.Шлеева¹, Ю.К.Кудыкина¹, Г.Н.Вострокнутова¹, А.В.Гончаренко¹, Г.Р.Демина¹, В.Д.Никитушкин¹, Е.Г.Салина¹, Ю.А.Жогина², Г.М.Сорокоумова², А.А.Селищева², А.Л.Мулюкин³, А.М.Анучин¹, Н.Е.Сузина⁴, В.Н.Данилевич⁴, В.И.Дуда⁴, Г.И.Эль-Регистан³, Е.В.Назарова¹, Н.С.Морозова², А.О.Ружицкий¹, В.И.Швец², В.Ю.Арцатбанов¹, Г.В.Мукамолова¹, A.Ruggiero⁵, В.А.Макаров¹, M.Young⁶, А.С.Капрельянц¹

1 Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

2 Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова

3 Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН

4 Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

5 Institute of Biostructures and Bioimaging, CNR, Naples, Italy

6 Institute of Biological, Environmental and Rural Sciences, Aberystwyth, Wales, UK Публикации

1. Шлеева М.О., Салина Е.Г., Капрельянц А.С. Покоящиеся формы микобактерий. 2010. Микробиология, 79,1, 3-15.

2. M. O. Shleeva, Yu. K. Kudykina, G. N. Vostroknutova, N. E. Suzina, A. L. Mulyukin, A. S. Kaprelyants. Dormant ovoid cells of Mycobacterium tuberculosis formed in response to gradual external acidification. 2011. Tuberculosis, 91, 2, 146-154.

3. Салина Е.Г., Жогина Ю.А., Шлеева М.О., Сорокоумова Г.М., Селищева А.А., Капрельянц А.С. Биохимические и морфологические изменения в покоящихся («некультивируемых») клетках Mycobacterium smegmatis. 2010.

Биохимия. 75, 1, 88-98.

4. А.Л. Мулюкин, Ю.К. Кудыкина, М.О. Шлеева, А.М. Анучин, Н.Е. Сузина, В.Н. Данилевич, В.И. Дуда, А.С.

Капрельянц, Г.И. Эль-Регистан. Внутривидовое разнообразие покоящихся форм Mycobacterium smegmatis.

2010. Микробиология, 79, 4, 486-497.

5. Ю. К. Кудыкина, М. О. Шлеева, В. Ю. Арцатбанов, Н. Е. Сузина, А. С. Капрельянц. Образование покоящихся форм M. smegmatis в длительной стационарной фазе при постепенном закислении среды. 2011. Микробиология, 80, 5, 625-636.

6. Е.В.Назарова, М.О.Шлеева, Н.С.Морозова, Ю.К.Кудыкина, Г.Н.Вострокнутова, А.О.Ружицкий, А.А. Селищева, Г.М.Сорокоумова, В.И.Швец, А.С.Капрельянц. Роль липидных компонентов в процессах образования и реактивации «некультивируемых» форм Mycobacterium smegmatis. 2011. Биохимия, 76, 6, 781-791.

7. Кудыкина Ю.К., Шлеева М.О., Капрельянц А.С. Покоящиеся формы микобактерий. Латентный туберкулез.

2011. Вестник уральской медицинской академической науки, 4/1, 38, 11-12

8. Nikitushkin V.D.; Demina G.R.; Shleeva M.O.; Kaprelyants A.S. Muropeptides of mycobacterial peptidoglycan are the factors of dormant mycobacteria resuscitation. 2011. FEBS JOURNAL Volume: 278 Special Issue, Pages: 309-310 9. Kaprelyants A.S., Mukamolova G.V., Ruggiero A., Makarov V.A., Demina G.R., Shleeva M.O., Potapov V.D.,

Shramko P.A. Resuscitation promoting factor (RPF). In search of inhibitors. Protein & Peptide Letters, 2012, in press.

10. Shleeva M., Kudykina Yu., Goncharenko A., Young M., Kaprelyants A. Free fatty acids and cAMP - new inducers of dormant mycobacterial cell reactivation. PLOS pathogens, submitted.

Несмотря на значительные успехи в изучении механизмов покоящегося состояния микобактерий in vitro, до сих пор остается неясным какой из факторов окружающей среды может запускать процессы, приводящие к переходу из активного состояния в покоящееся и обратно при попадании бактерий в организм хозяина. В частности известно, что при захвате макрофагами бактериальные клетки прежде всего испытывают стресс от сниженных значений рН. Эта ситуация была смоделирована in vitro в условиях контролируемого постепенного снижения рН окружающей среды в пост-стационарных культурах микобактерий (Mycobacterium tuberculosis и Mycobacterium smegmatis). В этих условиях происходило образование особого типа переживающих клеток, которые по своим характеристикам значительно отличались от вегетативных клеток и обладали всеми характеристиками покоящихся форм (измененной морфологией; сниженным уровнем метаболизма, дыхания и АТФ, устойчивостью к воздействиям повышенных температур и антибиотиков). Таким образом, значение рН среды может быть тем самым фактором, который запускает образование покоящихся микобактерий in vivo.

Впервые найдено, что свободные ненасыщенные жирные кислоты (СНЖК) и цАМФ в низких концентрациях являются факторами реактивации НК M. smegmatis. В ходе настоящей работы впервые было установлено участие мембраносвязаной аденилатциклазы M. smegmatis MSMEG_4279 в процессе реактивации микобактерий жирными кислотами. В тоже время обнаружено, что в присутствии олеиновой кислоты экспрессия гена rpfA у M.smegmatis увеличивается в 3 раза.

Впервые найден стимулирующий эффект фрагментов пептидогликана, образуемых в процессе гидролиза под действием белка Rpf на процесс реактивации покоящихся клеток микобактерий.

Предложена новая схема, в которой реактивация покоящихся клеток M. smegmatis происходит под действием СНЖК через цАМФ–зависимый синтез белков Rpf и фрагментов пептидогликана, образующихся под действием Rpf.

(13)

12

ИНАКТИВАЦИЯ ВАКУОЛЯРНОЙ КАЛЬЦИЕВОЙ АТФАЗЫ PMC1 ПРИВОДИТ К ЗАДЕРЖКЕ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА НА СТАДИИ G2

У ДРОЖЖЕЙ HANSENULA POLYMORPHA

А.В.Фокина¹, С.С.Соколов², H.A.Kang ³, Т.С.Калебина², М.Д.Тер-Аванесян¹, М.О.Агафонов¹

1 Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

2 МГУ им. М.В.Ломоносова, Биологический факультет, кафедра молекулярной биологии

3 Department of Life Science, Chung-Ang University, Korea

1. Fokina A.V., Sokolov S.S., Kang H.A., Kalebina T.S., Ter-Avanesyan M.D., Agaphonov M.O.

Inactivation of Pmc1 vacuolar Ca²⁺ ATPase causes G2 cell cycle delay in Hansenula polymorpha. Cell Cycle (in press).

Вакуолярная кальциевая АТФаза Pmc1 вовлечена в поддержании концентрации Са²⁺ в цитозоле на низком уровне. Нами было обнаружено, что у дрожжей Hansenula polymorpha увеличение концентрации Са²⁺ в цитозоле в результате инактивации Pmc1 приводит к чувствительности клеток к додецилсульфату натрия (SDS). Чтобы изучить механизмы этого эффекта был проведен поиск мутаций, супрессирующих чувствительность к SDS у мутанта pmc1 H. polymorpha. В результате было выявлено три гена. Два из них были обозначены как их ортологи из Saccharomyces cerevisiae, ССН1 и HOG1, кодирующие высокоаффинный кальциевый канал плазмалеммы и МАР киназу, вовлеченную в осморегуляцию, соответственно. Третий ген, обозначенный WEE1, кодирует киназу Wee1/Swe1, регулирующую клеточный цикл путем ингибирования перехода G2/М. В результате более детального анализа было выяснено, что нарушение гена WEE1 супрессирует чувствительность мутанта pmc1 к SDS только на фоне неохарактеризованной хромосомной перестройки, возникшей при получении мутанта wee1. Экспрессия химерного белка, состоящего из N-концевой части Wee1 и β- галактозидазы в клетках мутанта pmc1 вызывала изменения морфологии клеток, характерные для задержки клеточного цикла на стадии G2. Полученные данные показывают, что увеличение концентрации Са²⁺ в цитозоле приводит к чувствительности к SDS в результате Hog1- зависимой активации Wee1. В работе обсуждены механизмы влияния полученных мутаций на переход G2/M.