Células - inseto

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Aplicação de técnicas de análise de imagens na quantificação da concentração celular no cultivo de células de inseto.

Aplicação de técnicas de análise de imagens na quantificação da concentração celular no cultivo de células de inseto.

O frasco schott deste experimento começou a agitação com 70 rpm e o mesmo foi aumentado no dia 7 para 100 rpm, com a célula voltando a crescer, atingindo 1,69.10 7 células por mL de suspensão. No dias 0 e 1 tanto a análise Wavelet quanto a análise de Densitometria superestimaram a concentração celular. Este desvio pode ter sido ocasionado pela dificuldade em reconhecer as células com um bom contraste em relação do plano de fundo no momento do processamento de imagens, principalmente nas análises de imagens com 400x de magnificação. A Figura 43 a) apresenta a curva de crescimento da célula de inseto 6 com os métodos diretos (contagem celular), e indiretos (análise dos coeficientes da transformada Wavelet e da análise de Densitometria) pela aquisição de imagens a 400x de magnificação já com reconhecimento do citoplasma celular. Seus resultados se apresentaram resultados similares às imagens adquiridas a 200x de magnificação. Observou-se, nos dias 5 e 6 uma parada na taxa de crescimento celular na agitação de 70USP, observando uma sedimentação nas células 6. Aumentou-se a agitação para 100USP e as células voltaram a crescer nos dias 7 e 8. Nas Figuras 42 b) e 43 b) estão os resultados da regressão linear das análises de Densitometria e Wavelet em função com a contagem celular. Os resultados apresentaram um tendência linear com coeficientes angulares para as magnificações de 200x e 400x abaixo de 45 graus como mostra as Tabelas 6 e 7. Procurou- se analisar se os métodos indiretos (Wavelet e Densitometria) apresentavam um comportamento linear entre si. Então foi obtida a Figura 44 a) para o estudo a 200x de magnificação e a Figura 44 b) para imagens a 400x de magnificação reconhecimento do citoplasma celular. Para imagens a 200x de magnificação mostrou-se uma tendêcia linear, observado na Tabela 8 com coeficiente angular 0,87 para 200x de magnificação e 0,81 para 400x de magnificação com correlações em torno de 0,98. Na Figura 45 a) pode-se observar a estimativa µ Max para o Experimento 2 com a célula de inseto 6 a 200x de magnificação e
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UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA MOLECULAR Toxinas recombinantes Cry2Aa e Cry11A de Bacillus thuringiensis expressas em células de inseto são tóxicas para larv

UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA MOLECULAR Toxinas recombinantes Cry2Aa e Cry11A de Bacillus thuringiensis expressas em células de inseto são tóxicas para larv

O sistema de expressão utilizando o baculovírus baseia-se na introdução do gene exógeno no genoma de um baculovírus no local de um gene que não é essencial para a replicação. Essa expressão geralmente é dirigida por um promotor forte (por exemplo, o promotor do gene da poliedrina, polh). Ao inativar o gene polh, seja por deleção ou inserção de uma seqüência de DNA, o vírus produzido será capaz de se replicar normalmente em células de inseto, contudo não haverá mais a formação da forma ocluída (OB ou poliedro), já que a poliedrina é a principal proteína do OB e é codificada por um gene não-essencial. As células infectadas pelo vírus, que não produz OB, são facilmente localizadas por microscopia óptica, pela ausência de OB intracelular característicos dos vírus normais. A expressão do gene da poliedrina é conduzida a partir de um promotor forte, por volta de 70 h após a infecção (p.i), produzindo uma quantidade de poliedrina equivalente a 20-50% de toda a proteína produzida na célula infectada. Por isso, o modelo mais simples de vetores para o sistema de expressão é a troca do gene da poliedrina por um gene heterólogo de interesse sob o controle do promotor da poliedrina (Miller et al., 1983; Smith et al., 1983 a, b).
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Quantificação de apoptose e necrose mediante corantes fluorescentes e análise de imagens, no cultivo de células de inseto : o caso da Drosophila melanogaster S2.

Quantificação de apoptose e necrose mediante corantes fluorescentes e análise de imagens, no cultivo de células de inseto : o caso da Drosophila melanogaster S2.

Apesar da grande importância que vem ganhando a tecnologia de cultivo de células de inseto, não se encontram muitas informaçãoes na literatura que mostrem a utilidade desses corantes em cultivos desse tipo de células. A metodologia mais comum de obtenção da viabilidade celular em cultivos de células de inseto, a semelhança do que acontece com células de mamíferos, é com a utilização do microscópio óptico para contagem em hemacitômetro de células que apresentam uma membrana impermeável ao corante Azul de Tripan (FRESHNEY, 1994). Porém, esta metodologia, devido ao fato de não poder detectar células apoptóticas, superestima a viabilidade e não fornece informações sobre o tipo de morte que provoca a morte celular. Isto explica porque a combinação dos corantes YO-PRO-1 (YP) e Iodeto de Propidio (IP) vem ganhando tanto interesse entre os pesquisadores na área de cultivos celulares. Para se aproximar mais ainda do corante ideal, seria conveniente que o método de quantificação da viabilidade evitase alguns problemas encontrados no método de exclusão de azul de tripan para tornar-se um método rápido, simples, menos subjetivo e mais preciso como proposto por BITTNER et al. (1998).
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Avaliação da Toxicidade de proteínas Cry e Cyt de Bacillus thuringiensis subsp. israelensis para diferentes linhagens de células de inseto e de mamífero

Avaliação da Toxicidade de proteínas Cry e Cyt de Bacillus thuringiensis subsp. israelensis para diferentes linhagens de células de inseto e de mamífero

36 Figura 6. Representação esquemática do modo de ação de toxinas Cry de B. thuringiensis. Ao ser ingerido pela larva, o cristal paraesporal formado por proteínas Cry é dissolvido no ambiente alcalino do intestino médio do inseto e ativado por proteases do inseto. As toxinas ativas ligam-se então a um receptor primário do tipo caderina, presente na membrana das microvilosidades das células epteliais do intestino médio. Esta interação promove uma clivagem adicional da toxina, facilitando a formação de um oligômero. Este, liga-se a um segundo receptor do tipo APN ou ALP para que ocorra a inserção da estrutura oligomérica na membrana celular provocando lise osmótica. Uma outra via para ação de toxinas Cry, seria a ativação seqüencial de uma proteína G e uma adenilato ciclase, o que levaria a um aumento nas concentrações de AMP cíclico (cAMP) e resultaria na ativação da proteína quinase A (PKA) culminando na morte celular. Adaptado de http://web.utk.edu/~jurat/.
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EXPRESSÃO DE PROTEÍNA PARASPORINA 2 (PS2) DE BACILLUS THURINGIENSIS EM CÉLULAS DE INSETO E ANÁLISE DE SUA TOXICIDADE PARA CÉLULAS TUMORAIS E DE INSETOS Deborah da Costa Lamar

EXPRESSÃO DE PROTEÍNA PARASPORINA 2 (PS2) DE BACILLUS THURINGIENSIS EM CÉLULAS DE INSETO E ANÁLISE DE SUA TOXICIDADE PARA CÉLULAS TUMORAIS E DE INSETOS Deborah da Costa Lamar

84 comparado com a infecção do vírus selvagem. Saitoh et al. (2006), demonstraram que proteínas parasporina não apresentam especificidade para células de inseto como as proteínas Cry de B. thuringiensis, e sim somente para células de câncer humano. De acordo com o trabalho de Kitada et al. (2006) onde é mostrada a importância de clivagem nas porções amino e carbóxi terminal, sugere-se neste trabalho, que quando a proteína em estudo (PS2) é expressa pelo vírus dentro da célula de inseto, a mesma pode sofrer clivagem, através de proteases presentes na célula de inseto, tornando-a uma proteína ativa, permitindo-a exercer suas funções na célula, bem como levar a morte da célula. Nesse trabalho, confirmamos (Figura 28) a ausência de toxicidade de PS2 para célula de inseto após solubilização e ativação da protéina in vitro. Acredita-se então que o fato da PS2 ser expressa dentro da célula faz com que essa etapa de reconhecimento a receptores específicos localizados na superfície da membrana do inseto não seja necessária, uma vez que ela já se encontra dentro da célula, podendo então de alguma forma desencadear o processo de morte celular. Há também a possibilidade dela ser ativada proteolicamente por diversas proteases presentes nas células de inseto e essa ativação pode ser diferenciada o que permite que ela tenha tal atividade.
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Atividade de baculovírus selvagens em camundongos in vivo e in vitro e expressão da proteína do envelope do vírus da Febre Amarela (YFE) e da glicoproteína do vírus da raiva (RVGP) em células de inseto

Atividade de baculovírus selvagens em camundongos in vivo e in vitro e expressão da proteína do envelope do vírus da Febre Amarela (YFE) e da glicoproteína do vírus da raiva (RVGP) em células de inseto

células infectadas por vSynYFE ou pelo baculovírus selvagem AcMNPV por 96 hpi e células não infectadas foram coletadas e centrifugadas a 750 × g por 7 min. O pellet foi lavado em tampão PBS e este procedimento foi repetido três vezes. As células foram ressuspendidas em uma solução de PBS e soro humano e reservadas para um momento posterior. Duzentos  L de soro de dois pacientes positivamente diagnosticados para febre amarela foram diluídos 1:40 em PBS contendo 0,5% BSA (albumina bovina). Um volume de 50  L dessa amostra foi adicionado aos poços e a placa foi incubada por 1 hora em câmara úmida a 37 ° C. A placa foi lavada cinco vezes com PBS. Um volume de 50  L de antígeno foi adicionado à placa. Três diferentes antígenos foram utilizados neste ensaio conforme foi descritos acima e consistem nos 3 extratos de células de inseto :não-infectados (mock), infectados com AcMNPV e infectados com vSynYFE. A placa foi incubada overnight em câmara úmida a 4 ° C e depois lavada por 5 vezes com PBS. O anticorpo anti-FLAV conjugado à peroxidase (anticorpo monoclonal 6B6C-1 Mab, HRP Conjugated) , usado atualmente para o diagnóstico de infecção por flavivirus no LACEN, Brasília, Brasil foi adicionado aos poços diluído 1 / 3000 em PBS mais 20% soro humano. A placa foi incubada por 1 h em câmara úmida a 37 ° C e depois lavada por 5 vezes com PBS. O substrato da enzima peroxidase (100ml de H 2 O 2 e 2,2
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Expressão recombinante da canacistatina em células de inseto.

Expressão recombinante da canacistatina em células de inseto.

Este trabalho teve, como principal objetivo, o estabelecimento da metodologia de ex- pressão heteróloga de proteínas, utilizando o sistema de expressão Baculovírus/Células de Inseto, no Laboratório de Biologia Molecular da UFSCar. Além disso, este trabalho foi utilizado como base para a caracterização cinética e fisiológica deste sistema, realizado no Laboratório de Tecnologia de Cultivo Celular (LATECC), do Dept°. de Engenharia Quí- mica da Universidade Federal de São Carlos (UFSCar), pela estudante de Mestrado do Programa de Biotecnologia Mabel Karina Arantes. Para tanto, utilizou-se a proteína Cana- cistatina como modelo de estudo, uma vez que a mesma já foi bem caracterizada no pró- prio laboratório por meio do sistema bacteriano de expressão. Além disso, a proteína ex- pressa foi caracterizada quanto à sua estabilidade em diferentes temperaturas e pHs, o que ainda não havia sido realizado para a proteína expressa em bactérias.
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AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO TRANSIENTE DO GENE DA GLICOPROTEÍNA DO VÍRUS DA RAIVA (RVGP) EM CÉLULAS DE INSETO DA LINHAGEM Drosophila melanogaster S2

AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO TRANSIENTE DO GENE DA GLICOPROTEÍNA DO VÍRUS DA RAIVA (RVGP) EM CÉLULAS DE INSETO DA LINHAGEM Drosophila melanogaster S2

A raiva é uma enfermidade causada por um vírus do gênero Lyssavirus que afeta várias espécies de mamíferos. Esta doença apresenta um alto custo social e econômico principalmente em países em desenvolvimento. Na superfície do vírus da raiva está localizada a glicoproteína do vírus, reconhecida como antígeno capaz de conferir resposta imunológica contra a raiva, sendo, o foco de pesquisas no desenvolvimento de uma vacina recombinante. Células da linhagem Drosophila melanogaster S2 estavelmente transfectadas têm sido usadas na produção de muitas proteínas heterólogas e tem sido estudada para a produção da glicoproteína do vírus da raiva (RVGP) em nosso laboratório. A abordagem para a obtenção de linhagens recombinantes estáveis envolve a seleção de populações celulares altamente produtoras; sendo um processo que requer consideráveis períodos de tempo (meses), uma elevada manipulação e altos custos de produção. Neste sentido, nas últimas décadas, muitos sistemas focados na expressão de proteínas heterólogas através da expressão transiente de genes foram analisados, porque eles permitem a obtenção de quantidades consideráveis de proteína recombinante em um curto período de tempo (semanas). Para o uso da tecnologia de transfecção transiente pode ser encontrada uma variedade de métodos e agentes disponíveis, tais como eletroporação, lipídeos catiônicos, polímeros catiônicos e fosfato de cálcio. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão transiente do gene da glicoproteína do vírus da raiva (RVGP) em células de inseto da linhagem Drosophila melanogaster S2, avaliando os veículos de transfecção fosfato de cálcio, lipídeo catiônico (Cellfectin) e polímero catiônico (ExGen500 e JetPEI). A fim de determinar o agente de transfecção mais eficiente, foram feitos experimentos em placa de 6 poços e frasco de cultivo de 100mL, onde foram analisados a influência da densidade celular; a concentração de DNA, o volume do reagente de transfecção sobre a expressão da RVGP analisada através do método de ELISA. Quantidades de RVGP que variaram entre 50-90 ng/10 7 cel foram obtidas nos diferentes experimentos
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Baculovírus como vetor para expressão da glicoproteína do vírus da raiva em células de inseto e de mamífero e análise transcricional de células infectadas com vírus da dengue

Baculovírus como vetor para expressão da glicoproteína do vírus da raiva em células de inseto e de mamífero e análise transcricional de células infectadas com vírus da dengue

Muitas outras glicoproteínas foram expressas em células de inseto utilizando o baculovírus. No entanto, algumas mesmo sendo eficientemente produzidas in vitro, não apresentaram bons resultados nos testes in vivo. A glicoproteína do corona vírus (SARS) foi expressa em células de inseto, mas não conferiu proteção imunológica a camundongos (Bisht et al., 2005). A glicoproteína B do pseudorabies vírus, um herpesvírus, também foi expressa em células de inseto e não apresentou proteção imunológica em camundongos (Xuan et al., 1995). Em ambos os trabalhos, novos baculovírus recombinantes foram construídos, adicionando-se um promotor ativo em mamífero. As proteínas foram eficientemente expressas em células de mamíferos e conferiram proteção contra os patógenos específicos. A glicoproteína B do pseudorabies vírus foi expressa sob o comando do promotor CAG. A proteína foi expressa em células CPK e BHK e, posteriormente, o vírus foi inoculado através da via intramuscular (i.m.). A produção de anticorpos neutralizantes foi alta, comparada aos controles (Aoki et al., 1999). Já a glicoproteína do corona vírus foi clonada sob o comando do promotor CMV e expressas em células BHK através de um baculovirus recombinante. O trabalho demonstrou que houve uma forte resposta tanto humoral, quanto celular (Bai et al., 2007).
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Nova abordagem para expressão da partícula sSHbsAg do antígeno HBsAg do vírus da Hepatite B em células de inseto

Nova abordagem para expressão da partícula sSHbsAg do antígeno HBsAg do vírus da Hepatite B em células de inseto

A proteína recombinante HBsAg produzido neste trabalho, pelo sistema de expressão baseado em baculovírus e células de inseto, pode ser utilizada para produzir testes diagnósticos do tipo ELISA (EIA) diretos ou indiretos. O HBsAg recombinante pode ser fixado no fundo da placa de ELISA e servir de antígeno para ligação dos anticorpos presentes no soro dos pacientes infectados pelo HBV (ELISA direto), ou, através da inoculação do HBsAg recombinante em cobaias e produção de anticorpos, ser usado no fundo do poço da placa de ELISA para detectar antígenos presentes no soro de pacientes infectados com o HBV. Takehara et al. (1988) em seu trabalho, fabricou dois testes de ELISA utilizando HBsAg recombinante produzido pelo sistema de expressão em baculovírus. No primeiro teste o HBsAg recombinante foi utilizado como antígeno (ELISA indireto), e no segundo teste o HBsAg recombinante foi inoculado em cobaias e os anticorpos produzidos é que foram utilizados (ELISA direto). Ambos os testes foram feitos para detecção de anticorpos e antígenos, respectivamente, presentes no soro de pacientes infectados com o HBV. testes hoje comercializados também foram testados com o mesmo soro humano e utilizados como controle. A comparação entre o teste recombinante e o comercial mostrou boa concordância, demonstrando que o HBsAg recombinate e seus anticorpos produzidos em cobaias são capazes de reconhecer antígenos e anticorpos do soro de pacientes com Hapatite B.
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Caracterização de promotores de genes virais durante a infecção de células de inseto com baculovírus recombinantes

Caracterização de promotores de genes virais durante a infecção de células de inseto com baculovírus recombinantes

127 Outra diferença observada entre os dois vírus ocorreu na linhagem Chch em que os níveis de expressão do vírus AcMNPV foram 100 vezes menores que os observados na infecção com AgMNPV. Ambos os vírus causam apoptose nesta linhagem celular como foi observado por microscopia de luz a partir de 24 h p.i.. Uma das diferenças mais estudadas entre estes dois vírus é que o AcMNPV utiliza como agente antiapoptótico o gene p35 (Clem & Miller, 1993) e o AgMNPV utiliza o gene iap3 (Carpes et al., 2005). Estes possuem alvos distintos na via metabólica que induz a apoptose que podem ter impactos distintos sobre a expressão gênica. A alta expressão gênica do vírus AgMNPV aponta na direção de maior eficiência antiapoptótica do gene iap3. A infecção de células Sf21 com AcMNPV contendo o gene p35 deletado foi caracterizada como abortiva, com atraso na expressão gênica precoce e tardia. Além de não ter sido detectada nenhuma expressão de genes muito tardios mas sim uma inibição da síntese protéica em momentos tardios do processo apoptótico (Clem & Miller, 1993). Desta forma, a apoptose torna-se uma defesa muito eficiente para eliminar a formação de OBs ao afetar a expressão muito tardia. Por outro lado, não inibe completamente a formação do primeiro fenótipo, os BVs. Em Bm5 ambos baculovírus possuem um perfil de expressão similar com expressão de prIE1 e prGP64 mas bloqueio na expressão dos promotores tardios (Figura 10). Apenas na infecção com o AcMNPV ocorreu uma leve ativação dos promotores tardios VP39 e GP64, mas muito próximo ao sinal basal de luminescência (Figura 24).
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Atividade espontânea e estimulação do inseto (T. molitor)

Atividade espontânea e estimulação do inseto (T. molitor)

A ativação elétrica dispara o processo contrátil cardíaco de modo que o sangue possa ser ejetado adequadamente para circulação. No átrio direito, está localizado o nódulo sinoatrial (NSA), que é o marcapasso primário. As células marcapasso são auto-excitáveis e possuem habilidade para gerar espontaneamente PAs. A despolarização se inicia no NSA e se propaga para células atriais vizinhas. A atividade elétrica encontra rapidamente o nódulo atrioventricular (NAV), situado próximo à base do átrio direito. A partir do NAV saem fibras especializadas na condução elétrica que formam o feixe de His-Purkinje, que segue para ao ápice do coração. A onda de despolarização, por fim, atinge as fibras de Purkinge, que penetram nas paredes ventriculares, dirigindo-se ao epicárdio e à base ventricular (Silverthorn, 2008).
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS CURSO DE AGRONOMIA ANA CAROLINA FERREIRA MARTINS

UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS CURSO DE AGRONOMIA ANA CAROLINA FERREIRA MARTINS

No Brasil, a Embrapa Milho e Sorgo em parceria com a empresa VitaeRural, irão lançar, com comercialização prevista para atender a safra 2017/2018, o primeiro inseticida à base de Baculovirus Spodoptera contra a lagarta-do-cartucho. A recomendação de aplicação do produto na lavoura é após as 16 horas, já que a luz do sol destrói o baculovírus, tornando-o ineficaz contra a lagarta e o pH da calda deve estar entre 5 e 7, pois o pH alcalino também destrói o SfNPV. De acordo com a Embrapa, as avaliações de campo comprovaram a eficiência do produto, apresentando taxa de mortalidade entre 75% e 95% das lagartas com até cinco dias de idade (até quase 1 cm de comprimento) e como diferenciais, apresenta baixo número de aplicações (em geral duas), além da preservação de inimigos naturais e recursos hídricos (EMBRAPA, 2017). Os baculovirus são classificados como vírus específicos a artrópodes. Possuem nucleocapsídeo no formato de bastão de 30-60 nm x 250-300 nm. Dois gêneros de virions são normalmente encontrados, os occlusion-derived virions (ODV) e os budded virions (BV). Os ODVs ficam oclusos em uma matriz proteica cristalina (poliedrina ou granulina), que recebe o nome de corpo de oclusão (Occlusion Body – OB), o qual inicia a infecção no hospedeiro através das células epiteliais do mesêntero dos insetos. Já os BVs são produzidos depois da infecção inicial e proliferam através da membrana plasmática de células infectadas para outras não infectadas. Normalmente o BV contém apenas um nucleocapsídeo dentro de um envelope derivado da membrana plasmática do hospedeiro que é modificada por uma ou mais proteínas virais. Os ODVs podem conter um ou vários nucleocapsídeos sendo classificados como simples ou de múltiplos nucleocapsídeos. Dessa forma, os BVs transmitem a infecção de célula a célula e os ODVs de inseto para inseto (JEHLE et al., 2006).
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Aplicação de estratégias moleculares visando o controle da broca-gigante da cana-de-açúcar (Telchin licus licus, Drury 1770) (Lepidoptera: Castiniidae)

Aplicação de estratégias moleculares visando o controle da broca-gigante da cana-de-açúcar (Telchin licus licus, Drury 1770) (Lepidoptera: Castiniidae)

Uma vez que está envolvido em diversas funções no organismo, como digestão, proteção mecânica e defesa imunológica, o intestino dos insetos tem sido alvo de muito estudo (PAUCHET et al., 2010). O conhecimento da composição gênica pode facilitar o entendimento da participação de receptores na resistência de alguns insetos a inseticidas (PIGOTT e ELLAR, 2007), vias de detoxificação (KARATOLOS et al., 2011; MITTAPALLI et al., 2010), interações com microorganismos (BOISSIERE et al., 2012), genes que codificam enzimas de degradação de parede celular de plantas e fungos (PAUCHET et al., 2009) além de quais as alterações podem ser causadas quando há o distúrbio da constituição básica da fisiologia e morfologia do intestino (BROEHAN et al., 2010). De fato, o intestino é uma via de comunicação direta entre o organismo do inseto e o ambiente em que se encontra e é tão sensível que quaisquer alterações na composição do homogenato intestinal podem afetar a atividade de diversas enzimas digestivas (VINOKUROV et al., 2006). Vários trabalhos sugerem o sistema digestório como um alvo possível a ser utilizado em programas de manejo de pragas (CHRISTOU et al., 2006; HAKIM; BALDWIN; SMAGGHE, 2010; RODRIGUEZ-CABRERA et al., 2010; WHYARD; SINGH; WONG, 2009; ZHU et al., 2011), já que as alterações na atividade e composição enzimática do homogenato e o uso de inibidores podem modificar o metabolismo do inseto, levando-o a reduzir a alimentação e causando problemas de desenvolvimento. Além disso, como mencionado no capítulo II do presente estudo, as toxinas Cry apresentam capacidade de interagir com receptores presentes na membrana de células do epitélio intestinal (PARDO-LOPEZ; SOBERON; BRAVO, 2013), o que reforça a estratégia de utilizar o intestino como alvo para o controle de insetos-praga.
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Caracterização e avaliação do papel da degradação de hisitdina na bioenergética de...

Caracterização e avaliação do papel da degradação de hisitdina na bioenergética de...

ao tempo. Esta fase é caracterizada por uma densidade celular entre 4,5 e 6,5 x 10 7 células por ml. Na medida em que a cultura prolifera e aumenta sua densidade, os nutrientes e as moléculas relevantes para o crescimento presentes no meio começam a ser mais escassos e o parasita entra em uma fase onde cessa a proliferação, denominada fase estacionária do crescimento. Em geral, consideramos que uma cultura de epimastigotas atingiu a fase estacionária quando a mesma possui uma densidade celular em torno de 8-10,5 x 10 7 cél/ml. Como observado por Camargo e colaboradores (Camargo, 1964), culturas de epimastigotas em fase estacionária podem dar origem a tripomastigotas metacíclicos, o seguinte estágio no ciclo biológico do T. cruzi. Na natureza, o estado que mencionamos como fase estacionária nas culturas in vitro pode se corresponder com aqueles parasitas presentes no intestino do inseto vetor, aonde a disponibilidade de nutrientes diminui na medida em que os epimastigotas transitam até atingir o ponto onde a diferenciação às formas metacíclicas acontece. Vários trabalhos foram publicados descrevendo as características bioquímicas e morfológicas presentes na fase estacionária de crescimento em epimastigotas. Em seguida serão brevemente comentadas ditas características:
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Avaliação preliminar da viabilidade de produção in vitro de um isolado brasileiro de baculovírus Spodoptera frugiperda MNPV

Avaliação preliminar da viabilidade de produção in vitro de um isolado brasileiro de baculovírus Spodoptera frugiperda MNPV

É possível a utilização de vírus derivados de poliedro (VDP) como fonte de virions infeciosos, porém estes devem ser liberados dos poliedros utilizando-se soluções alcalinas. No entanto, quando poliedros são dissolvidos em soluções alcalinas antes de serem usados para infectar linhagens de células de inseto, o nível de infecção é baixo (Vail; Romine; Vaughn, 1979; Elam; Vail; Schreiber, 1990). Porém, utilizando-se proteinases este processo pode ser melhorado. McIntosh et al (1988) obtiveram melhores resultados de infectividade quando utilizaram um tratamento com proteinase K para dissolver poliedros de Helicoverpa zea nucleopoliedrovírus (HzSNPV) para infectar células homólogas. O mesmo resultado foi obtido por Lynn (1994) utilizando tripsina na dissolução de poliedros de Lymantria dispar nucleopoliedrovirus (LdMNPV).
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AMPLIFICAÇÃO, CLONAGEM E EXPRESSÃO DE PROTEÍNA RECOMBINANTE DO VÍRUS DA DOENÇA DE AUJESZKY EM SISTEMA DE BACULOVÍRUS PARA UTILIZAÇÃO EM PROGRAMA DE CONTROLE E ERRADICAÇÃO

AMPLIFICAÇÃO, CLONAGEM E EXPRESSÃO DE PROTEÍNA RECOMBINANTE DO VÍRUS DA DOENÇA DE AUJESZKY EM SISTEMA DE BACULOVÍRUS PARA UTILIZAÇÃO EM PROGRAMA DE CONTROLE E ERRADICAÇÃO

A tecnologia para a construção de baculovírus vetores é feita com base em plasmídeos de transferência (JARVIS, 1997), inserindo uma seqüência que codifica uma proteína de interesse dentro de vetor de transferência. Após a inserção do gene de interesse no vetor plasmideal, esse é introduzido em células de inseto juntamente com o DNA viral, e espera-se que através da recombinação homóloga entre seqüências virais no vetor e o DNA viral, ocorra a troca entre o gene viral não-essencial e o gene de interesse presente no vetor. A freqüência de recombinantes é de aproximadamente 0,1% e a progênie é usualmente selecionada por testes de placa, o qual pode levar de 4 a 6 semanas. O clone recombinante é identificado por microscopia através do fenótipo distinto (corpos de oclusão / occ) nas células infectadas (LUCKOW et al., 1993). Segundo Kost, Condreay e Jarvis (2005) e Zhao, Chapman e Jones (2003), a seleção por testes de placa de vírus recombinantes além de morosa é difícil de identificar quando se usa o fenótipo sem corpos oclusos (sem poliedros = occ - ).
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Análise da expressão heteróloga de uma serino protease (RnTrypsin) e de um inibidor de serino protease (RnKazalPI) salivares de Rhodnius neglectus, vetor da Doença de Chagas

Análise da expressão heteróloga de uma serino protease (RnTrypsin) e de um inibidor de serino protease (RnKazalPI) salivares de Rhodnius neglectus, vetor da Doença de Chagas

O triatomíneo Rhodnius neglectus (Hemiptera: Reduviidae) é um vetor potencial do protozoário Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas. O R. neglectus apresenta em sua saliva moléculas importantes que neutralizam os mecanismos hemostáticos do hospedeiro, auxiliando na alimentação sanguínea e, de forma indireta, na transmissão do protozoário. Assim, a saliva desse inseto hematófago se torna um relevante alvo de pesquisas devido à presença de moléculas com elevado potencial farmacológico, como por exemplo serino proteases e inibidores de serino protease. Este estudo teve por objetivo a expressão heteróloga da serino protease do tipo tripsina (RnTrypsin) e do inibidor de serino protease tipo Kazal (RnKazalPI) salivares de R. neglectus. As sequências nucleotídicas das proteínas foram obtidas a partir do transcriptoma de R. neglectus, clonadas no vetor pET100/D-TOPO e expressas em bactérias Escherichia coli da linhagem BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS e Rosetta(DE3)pLysS. A serino protease do tipo tripsina (RnTrypsin) recombinante foi observada somente na fração insolúvel após a lise das bactérias, sendo então purificada por cromatografia de afinidade e usada para a produção de anticorpos policlonais em camundongos. Após a otimização do protocolo de expressão, o inibidor de serino protease tipo Kazal (RnKazalPI) foi expresso na fração solúvel do lisado bacteriano. Como perspectiva, é pretendido utilizar o sistema de expressão de proteínas recombinantes em células de inseto/baculovírus para expressar a serino protease do tipo tripsina (RnTrypsin) recombinante na fração solúvel, e também determinar a caracterização do inibidor de serino protease tipo Kazal (RnKazalPI) recombinante solúvel, buscando contribuir na compreensão das interações entre vetor e hospedeiro e potenciais atividades farmacológicas.
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UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA FACULDADE DE MEDICINA PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA MOLECULAR

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A infecção pelos baculovirus começa quando o inseto ingere alimento contaminado com o vírus na forma ocluída, o OB (poliedro no caso de NPV e grânulo no caso de GV) constituindo a rota natural de infecção. O OB pode compreender um ou mais vírions que se encontram protegidos do meio ambiente e da degradação ambiental pela matriz protéica cristalina que os envolve (Benz, 1986). Uma vez digeridos, seguem pelo trato intestinal da larva do inseto até chegar ao intestino médio onde o ambiente é altamente alcalino (pH 9,5 a 11,5) o que leva à dissolução do OB e liberação das partículas virais. Essas partículas virais dão início à infecção das células colunares epiteliais do intestino médio pela fusão dos nucleocapsídeos virais com a membrana das microvilosidades (Horton & Burand, 1993). Essa infecção é denominada primária e a partir dessa progênie viral é estabelecida a infecção secundária, ou seja, a disseminação do vírus para os outros tecidos do inseto que serão infectados subseqüentemente (Volkman & Hom, 2000) (Figura 6).
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