Cisteíno protease

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Estudos estruturais e funcionais da Xylellaína, uma cisteíno protease da bactéria...

Estudos estruturais e funcionais da Xylellaína, uma cisteíno protease da bactéria...

A Xylella fastidiosa é uma bactéria gram-negativa que infecta o xilema das plantas causando muitas vezes a maturação precoce e a diminuição dos frutos. Ela é responsável por importantes perdas na economia, no Brasil é a causadora de doenças de Citrus Variegated Chlorosis (CVC) e a da doença de Pierce nos Estados Unidos. As proteases desempenham funções vitais no ciclo de vida de muitos parasitas, muitas estão envolvidas em processos infecciosos, a Xylellaína é uma cisteíno protease que é diferentemente expressa em cepas patogênicas a não patogênica. A compreensão de seu mecanismo catalítico, através do estudo da sua estrutura e função, pode ajudar no planejamento de inibidores seletivos, potenciais agentes contra as doenças fitopatológicas ocasionadas pela X. fastidiosa. Sua estrutura molecular foi elucidada no Laboratório de Cristalografia de Proteínas e Biologia Estrutural do Instituto de Física de São Carlos (USP), estudos estruturais mostraram que a proteína se apresenta na forma de uma pró-proteína, pois está inativa devido a uma pró-região que bloqueia o sítio catalítico. Também foi verificada a presença de um nucleotídeo na estrutura da Xylellaína próximo a pró-região, como hipótese foi considerada a relação entre o nucleotídeo e o mecanismo de ativação da proteína. A influência do nucleotídeo na atividade funcional da enzima foi constatada através da comparação de ensaios enzimáticos entre a enzima nativa e mutantes. As mutações foram planejadas com a intenção de ocasionar a desestabilização do nucleotídeo, por isso foram mutados os resíduos da pró-região que interagem diretamente com o ele. As mutações foram Fenilalanina 45 (F45), Arginina 43 (R43) e F45/R43, todos os resíduos foram mutados para Alaninas (A). Os resultados mostraram que os valores de K m obtidos para a proteína nativa e suas mutantes apresentaram
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Estudos funcionais de uma possível cisteíno protease de Xanthomonas axonopodis pv. citri.

Estudos funcionais de uma possível cisteíno protease de Xanthomonas axonopodis pv. citri.

Uma primeira análise foi feita por PCR utilizando oligonucleotídeos do gene (CYST_F e CYST_R) para verificar se a inserção do transposon ocorreu dentro da ORF ou se a mesma ocorreu na seqüência de DNA do plasmídeo. O produto da amplificação foi analisado em gel de agarose 0,8%. Os plasmídeos cujos fragmentos amplificados foram de aproximadamente 2000 pb (em número de 5), foram utilizados para mapeamento de restrição com a enzima BamHI, a qual apresenta sítio de clivagem tanto na seqüência do transposon (Figura 6) como também na seqüência do oligonucleotídeo utilizado na amplificação da cisteíno protease (Tabela 1). O mapeamento de restrição teve a finalidade de selecionar aqueles plasmídeos cujo transposon estava em uma posição central do gene. O produto da clivagem foi analisado em gel de agarose 0,8%. O plasmídeo cuja clivagem indicou para a inserção do transposon em uma região central foi seqüenciado (SANGER, NICKLEN e COULSON, 1997) para verificar o local exato dessa inserção utilizando-se os oligonucleotídeos 3FR e CYST_R. Feito o mapeamento e seqüenciamento da inserção do transposon a construção foi utilizada para transformação de Xac eletrocompetentes a fim de inativar, por recombinação homóloga, o seu gene cromossomal para cisteíno protease (item 3.16).
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Caracterização enzimática de isoformas de cisteíno protease de Anticarsia gemmatalis (Hübner, 1818).

Caracterização enzimática de isoformas de cisteíno protease de Anticarsia gemmatalis (Hübner, 1818).

Essa isoforma de cisteíno protease também foi caracterizada usando inibidores específicos. Um dos inibidores mais comumente utilizados para caracterização de cisteíno proteases é o E-64, por ser um inibidor irreversível, não competitivo de tiol proteases. A análise do efeito de concentração de E-64 na Fração Solúvel (Figura 5A) mostrou que cisteíno proteases presentes nessa fração são insensíveis a esse inibidor. Na literatura. temos que legumaína é uma endopeptidase caracterizada por não ser afetada por esse clássico inibidor, porém por outras cistatinas (Alavarez-Fernandez et al., 1999). A isoforma da Fração Solúvel caracterizada nesse trabalho possivelmente pertence a essa família de enzimas, porém testes com outras cistatinas deverão ser realizados para se confirmar que as cisteíno proteases da Fração Solúvel são cisteíno proteases legumaína-like. O efeito da concentração de E-64 na Fração Insolúvel (Figura 5B) mostrou que a atividade dessas cisteíno proteases decresce consideravelmente com 100 µM de E-64 na mistura reacional, indicando uma inibição parcial dessas enzimas. Esse resultado é um indicativo da presença de cisteíno protease do tipo papaína-like no intestino de A. gemmatalis. Colebatch et al. (2001), trabalhando com
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Estabelecimento de uma cana-de-açúcar transgênica superexpressando o gene da canacistatina (CaneCPI-1), uma proteína inibidora de cisteíno-protease.

Estabelecimento de uma cana-de-açúcar transgênica superexpressando o gene da canacistatina (CaneCPI-1), uma proteína inibidora de cisteíno-protease.

A cana-de-açúcar é uma planta de grande importância econômica, principalmente no Brasil, que hoje é o maior produtor mundial desta cultura. Porém, as lavouras de cana- de-açúcar estão cada vez mais sendo atacadas e destruídas por pragas e patógenos, causando grandes perdas econômicas para os produtores. Assim, vários estudos estão focados no desenvolvimento de variedades de cana-de-açúcar mais resistentes. Nosso laboratório tem trabalhado com a proteína CaneCPI-1, uma proteína inibidora de cisteíno-protease. Baseado em estudos que indicam que insetos pertencentes à ordem Coleoptera possuem enzimas proteolíticas do tipo cisteíno-proteases em seu trato digestivo e, sabendo que algumas espécies de Coleoptera são pragas de cana-de-açúcar e que causam sérios danos aos canaviais, foi desenvolvida uma cana-de-açúcar transgênica superexpressando o gene da CaneCPI-1 sobre controle do promotor da ubiquitina do milho. A CaneCPI-1 foi também fusionada a uma his-tag para facilitar a posterior purificação por cromatografia de afinidade em coluna de níquel. Para a transformação genética dos calos foi utilizado o método de biobalística e, após isto, foi feita uma seleção das plantas transformadas através de uma reação de PCR. As plantas que apresentaram resultado positivo foram selecionadas por PCR Semi-quantitativo e ensaios de Western blotting. Uma planta transformada expressando a proteína CaneCPI- 1 com his-tag foi selecionada para a purificação da proteína recombinante em coluna de afinidade ao níquel, possibilitando a purificação da HIS CaneCPI-1 em um único passo. O
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SIMONE MICHELAN DUARTE SÃO CARLOS - SP 2008

SIMONE MICHELAN DUARTE SÃO CARLOS - SP 2008

A interação do loop de oclusão na catepsina B com o restante da molécula se dá por ligações deste em ambos os subsítios S e S’ da enzima (Illy et al., 1997). Esta interação bloqueia o acesso de inibidores reversíveis de cisteíno protease membros da família cistatina, tornando incompatível a inibição destas enzimas pela maioria destes inibidores. A inibição só é possível através de um mecanismo executado em duas etapas, onde é requerido o deslocamento do loop de oclusão antes da ligação à fenda do sítio ativo (Nycander et al., 1998; Pavlova et al., 2000). Conseqüentemente esta interação do loop acarreta a uma inibição menos efetiva contra catepsina B do que contra outros membros da família da papaína quando as cistatinas são utilizadas.
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Purificação e caracterização parciais de serino e cisteíno proteases de Sitophilus zeamais (Coleoptera: Curculionidae)

Purificação e caracterização parciais de serino e cisteíno proteases de Sitophilus zeamais (Coleoptera: Curculionidae)

A eficiência de purificação variou, entre as três populações, com nível de purificação bom para as três (entre 87,5 e 170,7x). A eficiência de purificação durante os processos de cromatografia foi maior para a população susceptível, que teve o menor rendimento e consequentemente maior atividade específica de cisteíno protease comparada com as populações resistentes. A SDS-PAGE das frações purificadas revelou uma única banda de massa molecular 74,000 daltons na população susceptível, e duas bandas de 72,000 e 83,000 daltons na população resistente com custo e 68,000 e 74,000 daltons na população resistente sem custo. Esse valor de massa molecular é semelhante ao já reportado para outras espécies de Sitophilus (Matsumoto et al., 1998) e maior do que o reportado para cisteíno proteases de outras espécies de insetos, geralmente por volta de 50,000 daltons (Homma et al., 1994; Matsumoto et al., 1995, 1997; Melo et al., 2003). Provavelmente as cisteíno proteases purificadas das três populações pertencem a família 3, as quais são maiores do que os membros das outras duas famílias, são moléclas mais complexas com massa molecular de 60 a 120 kDa.
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Propriedades bioquímicas e cinético-enzimáticas de cisteíno- proteases do intestino médio da lagarta da soja

Propriedades bioquímicas e cinético-enzimáticas de cisteíno- proteases do intestino médio da lagarta da soja

VALASAKI et al. (2007) em estudos com cisteíno-proteases extracelulares purificadas de Lactobacillus helveticus encontraram uma temperatura ótima de 60°C utilizando como substratos Cbz-FR-pNA e Suc-FR- pNA. Estes valores de atividade foram obtidos utilizando substratos sintéticos p- nitroanilidas, como L -BApNA por nós utilizado. Valores entre 40°C e 50°C foram também encontrados por ARANISHI et al. (1997) em estudos de cisteíno-protease Catepsina B de carpas Cyprinus carpio. Nossos valores de temperatura para Fração II estão semelhantes com o encontrado por estes autores. VISESSANGUAN et al. (2003) encontraram para catepsina L purificada dos músculos de linguado um máximo de atividade na temperatura de 60 0 C o que se assemelha ao encontrado em nosso trabalho para a Fração II. O perfil de atividade dessa catepsina se assemelha muito com o perfil do presente trabalho, aumentando a atividade até 60°C. VISESSANGUEN et al. (2003) testaram outras temperaturas maiores que 60°C, demonstrando uma queda na atividade após este valor.
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In vitro characterization of jellyfish venom fibrin(ogen)olytic enzymes from Nemopilema nomurai

In vitro characterization of jellyfish venom fibrin(ogen)olytic enzymes from Nemopilema nomurai

Fibrin was used as substrate for the evaluation of fibrinolytic activity in zymography assay. For this experi- ment, fibrinogen (0.6 mg/mL) and thrombin (0.01 unit/ mL) dissolved in 20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4) was copolymerized with 12% polyacrylamide to prepare the respective zymography gel. The various venoms (20 μg) to be analyzed were prepared in non- reducing sample buffer, then run on gels at 100 V at 4 °C. After electrophoresis, SDS was removed by washing the gel twice for 30 min in 2.5% Triton X-100. Then, the gel was incubated with 20 mM Tris (pH 7.4), 0.5 mM calcium chloride, 200 mM sodium chloride at 37 °C for 16 h and the gel was stained with 0.125% Coomassie blue. Clear zones of the gel indicate regions of fibrinolytic activity. To know the effect of metal ions and protease inhibitors on fibrinolytic activity, the metal ions and protease inhibitors were added to incubation buffers [20 mM Tris (pH 7.4), 200 mM sodium chloride], and the gel stained as usual. All metal ions and inhibitors give a final concentration of 2 mM except PMSF (1 mM).
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Endosymbiotic and host proteases in the digestive tract of the invasive snail Pomacea canaliculata: diversity, origin and characterization.

Endosymbiotic and host proteases in the digestive tract of the invasive snail Pomacea canaliculata: diversity, origin and characterization.

The 30 kDa protease is ubiquitously found in the digestive tract of P. canaliculata. It is present in extracts of both the midgut gland and the isolated endosymbionts, and activity (as determined by in situ zymography) is found in the latter. The endosymbionts are released through the midgut gland ducts into the stomach vestibule, and so a 30 kDa protease activity is found downstream in the style sac and the coiled gut lumen. However, it is also found upstream in the crop content, which is explained by the lack of a sphincter separating the stomach from the posterior esophagus and, probably, by backward flux driven by pumping action of the muscular gizzard. The generation of four azocasein fragments by extracts of the crop and style sac contents suggests that both proteases, endosymbiotic of 30 kDa and salivary of 125 kDa, are indeed endopeptidases.
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Substrate-driven mapping of the degradome by comparison of sequence logos.

Substrate-driven mapping of the degradome by comparison of sequence logos.

Sequence logos are frequently used to illustrate substrate preferences and specificity of proteases. Here, we employed the compiled substrates of the MEROPS database to introduce a novel metric for comparison of protease substrate preferences. The constructed similarity matrix of 62 proteases can be used to intuitively visualize similarities in protease substrate readout via principal component analysis and construction of protease specificity trees. Since our new metric is solely based on substrate data, we can engraft the protease tree including proteolytic enzymes of different evolutionary origin. Thereby, our analyses confirm pronounced overlaps in substrate recognition not only between proteases closely related on sequence basis but also between proteolytic enzymes of different evolutionary origin and catalytic type. To illustrate the applicability of our approach we analyze the distribution of targets of small molecules from the ChEMBL database in our substrate-based protease specificity trees. We observe a striking clustering of annotated targets in tree branches even though these grouped targets do not necessarily share similarity on protein sequence level. This highlights the value and applicability of knowledge acquired from peptide substrates in drug design of small molecules, e.g., for the prediction of off-target effects or drug repurposing. Consequently, our similarity metric allows to map the degradome and its associated drug target network via comparison of known substrate peptides. The substrate-driven view of protein-protein interfaces is not limited to the field of proteases but can be applied to any target class where a sufficient amount of known substrate data is available.
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MATERIALS AND METHODS Organism

MATERIALS AND METHODS Organism

Protease production by thermophilic Bacillus sp strain SMIA-2 cultivated in liquid cultures containing trisodium citrate reached a maximum in 9h, with levels of 1.93U/mg protein. The microorganism utilized several carbon sources for the production of protease. Starch was the best substrate, followed by trisodium citrate, citric acid and sucrose. Among the various organic and inorganic nitrogen sources, ammonium nitrate was found to be the best. Studies on the protease characterization revealed that the optimum temperature of this enzyme was 60ºC. The enzyme was stable for 2h at 30ºC, while at 40ºC and 80ºC, 14% and 84% of the original activities were lost, respectively. The optimum pH of the enzyme was found to be 8.0. After incubation of crude enzyme solution for 24h at pH 5.5, 8.0 and 9.0, a decrease of about 51%, 18% and 66% of its original activity was observed respectively. A stronger inhibitory effect was observed in the presence of K + , Hg 2+ and Cu 2+ . Hg + resulted in the complete loss of activity at 1mM concentrations.
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Isolation, purification and characterization of extracellular protease produced by marine-derived endophytic fungus Xylaria psidii KT30

Isolation, purification and characterization of extracellular protease produced by marine-derived endophytic fungus Xylaria psidii KT30

mL) of serine protease from Termitomyces albuminosus [35] . Protease enzymes particularly with thermostabile property have been used widely for their usefulness in biotechnological and biomedical applications. This present research is the first study reporting about proteases isolated from marine-derived endophytic fungi and its characterization. Our further study will also focus on the characterization of protease gene to gain more information about the function of this fungal protease in X. psidii KT30 growth and development.

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Trypsin-like serine proteases in Lutzomyia longipalpis--expression, activity and possible modulation by Leishmania infantum chagasi.

Trypsin-like serine proteases in Lutzomyia longipalpis--expression, activity and possible modulation by Leishmania infantum chagasi.

Soluble protein samples were separated by 12% SDS-PAGE co- polymerized with protein substrates (gelatin, casein, hemoglobin and albumin) at 0.1% final concentration under non-reducing conditions [24]. Samples were loaded in the gel in non reducing buffer (125 mM Tris pH 6.8, 4% SDS, 20% glycerol and 0.002% bromphenol blue). Electrophoresis was carried out under constant voltage (100 V) at 4uC. The gels were washed in 2.5% Triton X-100 at 4uC under agitation during 1 hour to remove SDS. To test for best conditions, proteolysis of copolymerized proteins was performed by incubating the gel in different buffers: 0.1 M citrate (pH 4), or 0.1 M sodium phosphate (pH 6 and 8), or 0.2 M glycine (pH 10 and 12) for 18 hours at 37uC. All further zymography experiments were performed at pH 8. The proteolytic classes were determined by incubation of the gels at pH 8 buffer supplemented with the following specific protease inhibitors: trans-epoxysuccinyl L-leucylamido- (4-guanidino) butane (E-64) (10 m M) for cysteine-peptidases, pep- statin A (1 m M) for aspartic-peptidases, 1,10-phenanthroline (10 mM) for metallo-peptidases, phenyl-methyl sulfonyl-fluoride (PMSF) (1 mM) for serine-peptidases, tosyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK) (100 m M) for chymotrypsins, tosyl-lysyl-chloromethylketone (TLCK) (100 m M), benzamidine (1 mM), and 4-aminobenzamidine (1 mM) for trypsins. The gels were stained for 1 hour with 0.1% Coomassie blue R-250 in methanol:acetic acid:water (30:10:60) and destained in the same solvent.
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Clinics  vol.70 número2

Clinics vol.70 número2

For the above reasons, trypsin inhibitors have been studied. So far, few studies have been performed in humans. Hill et al. (5) evaluated the effect of a potato proteinase inhibitor (POT II) on food intake in 11 lean individuals. A double-blind study was carried out and the authors observed that the use of POT II 5 minutes before lunch significantly reduced energy consumption by 17.5%. In neonatal rats administered soybean trypsin inhibitor (1 mg in 230 mL saline), an 87% increase in CCK plasmatic concentrations was observed (36). Komarnytsky et al. (24) also reported that the oral administration of a potato- derived protease inhibitor concentrate (PPIC) was effective in reducing food intake and weight gain in healthy rats by increasing circulating CCK levels through a trypsin-depen- dent mechanism.
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A Chlamydomonas-derived Human Papillomavirus 16 E7 vaccine induces specific tumor protection.

A Chlamydomonas-derived Human Papillomavirus 16 E7 vaccine induces specific tumor protection.

coli, the Chlamydomonas chloroplast allows the formation of disulfide bonds and is able to perform some types of phosphorylation. In addition, it contains low protease levels as well as several molecular chaperones aiding protein folding [11]. Unlike higher plants, that present several hundreds of chloroplasts per cell, each with up to 100 genome copies, C. reinhardtii has a single chloroplast, with about 80 genome copies. Consequently, conversion of all copies of the chloroplast genome to the recombinant form (homoplasmy) is facilitated. C. reinhardtii has been used for the expression of recombinant vaccines [13–15], fully functional antibodies [16,17], therapeutics [18] and other proteins of biotechnological relevance [19], with yields ranging from undetectable levels to about 5% of Total Soluble Proteins (TSP) [8]. A comparative work done with 7 different therapeutic proteins expressed in the C. reinhardtii chloroplast demonstrates the high variability in expression levels, indicating that protein yields depend primarily on the intrinsic properties of each protein expressed [18]. Studies on chloroplast gene expression and regulation in C. reinhardtii for molecular pharming are still in their infancy: the first biopharmaceutical was expressed in 2003 [16] and a large knowledge and technology gap needs to be filled in order to bring microalgal productivity to a level similar to that of plants or other well established platforms.
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Estudo comparativo das características bioquímicas funcionais e especificidade catalítica de aspartil, cisteíno e serino peptidases fúngicas

Estudo comparativo das características bioquímicas funcionais e especificidade catalítica de aspartil, cisteíno e serino peptidases fúngicas

Além disso, não foi observada grande interferência de ureia sobre a atividade proteolítica nas distintas concentrações ensaiadas para aspartil, cisteíno e serino peptidases. De forma divergente, guanidina foi mais efetiva no rompimento de ligações de hidrogênio e consequente redução da atividade enzimática. Sugere-se que a diferença de cargas entre ureia (agente caotrópico de carga neutra) e guanidina (agente caotrópico catiônico) é responsável pelo efeito distinto entre estes agentes químicos na desnaturação das três peptidases.
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Partial Purification of Milk Clotting Protease

Partial Purification of Milk Clotting Protease

Effects of pH on Protease Activity and Stability Protease activity was measured at different pH values using azoalbumin as substrate. The azoalbumin solution was prepared in range pH 3.5 – 8.5 in various buffer at 25º C, such as: 100 mM citrate–phosphate buffer (pH 3.5 – 5.8), 100 mM phosphate buffer (pH 5.8 – 7.5), and 100 mM Tris– HCl buffer (pH 7.0 – 8.5). The pH stability was determined by incubation at different pH values (pH 3.5 – 8.5) as described above, with incubation time varying from 30 to 120 minutes. After this time, the protease activity was measured at 25ºC, using azocasein as substrate in100 mM Tris-HCl buffer, pH 7.6, as described previously. Effect of Temperature on Protease Activity and Stability
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Avaliação da produção de amilase e protease por bactérias da Antártica

Avaliação da produção de amilase e protease por bactérias da Antártica

A caracterização morfológica foi realizada com os isolados produtores das enzimas de interesse (formação de halo) nos experimentos de triagem das enzimas amilase e protease. Os isolados positivos foram cultivados em meio NA (ágar nutriente), sendo as placas incubadas a uma temperatura de 4 °C durante 14 dias. As análises macroscópicas foram realizadas com auxílio de um estereoscópio NIKON SMZ 745 Modelo C-LEDS (China), sendo avaliadas as características de crescimento, cor, forma e brilho das colônias. As análises microscópicas dos isolados foram realizadas pela técnica de coloração de Gram. Um esfregaço de cada isodado foi preparado em uma lâmina de vidro e corado com uma solução de cristal violeta por 60 segundos, seguido de uma lavagem com água corrente. Após lavagem, o esfregaço foi corado com uma solução de Lugol por mais 60 segundo, seguido de uma descoloração com uma solução de álccol 95%/acetona por 20 segundos. Após lavagem, o esfregaço foi corado com uma solução de Fuccina durante 20 segundos. O material preparado foi observado com auxílio de um microscópio óptico NIKON Eclipse E200MVR (China). As bactérias coradas em roxo e vermelho, foram caracterizadas como gram-positivas e gram-negativas, respectivamente (Madigan et al., 2016).
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Clonagem e expressão de protease mitogênica de Carica candamarcensis

Clonagem e expressão de protease mitogênica de Carica candamarcensis

A estrutura primária de CMS2MS2 foi recentemente relatada por Gomes e colaboradores (2007), indicando ser uma proteína de 214 aminoácidos, com cerca de 23.590,76 Da, sem sítios de glicosilação e com diversos motivos estruturais primários e terciários comuns a cisteino-proteases. Como relatado para outras proteínas de Vasconcellea (Walraevens et al., 1999; Kyndt et al., 2007), CMS2MS2 não possui um “loop” extra entre os resíduos 168-169 (numeração da cadeia da papaína), como ocorre com as cisteíno-proteases quimopapaína, caricaína e glicil- endopeptidase de Carica papaya (Kyndt et al., 2007; Gomes et al., 2007). A atividade proteolítica dessa enzima contra o substrato BAPNA é a maior entre as proteases da fração CMS2 e há uma preferência de clivagem em aminoácidos com características hidrofóbicas na posição P2 do substrato (Gomes, 2008).
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Expressão e caracterização de uma protease de interesse biotecnológico clonada da...

Expressão e caracterização de uma protease de interesse biotecnológico clonada da...

Snake venom serine proteases (SVSPs) act on specific points of the circulatory system and are promising for the treatment of a variety of hemostatic disorders. In the present study, we describe the expression of a serine protease from Crotalus durissus collilineatus (Collineina- 1) in Pichia pastoris, the purification of the native toxin from C. d. collilineatus venom and the structural and enzymatic characterization of Collineina-1 in native and recombinant forms. The cDNA encoding the serine protease was amplified from cDNA library of C. d. collilineatus venom gland and cloned into pPICZ αA vector. KM71H P. pastoris strain was transformed with the recombinant plasmid and colonies were selected by zeocin resistance. Heterologous expression was carried out in minimal medium supplemented with methanol, resulting in a yield of 56 mg of protein per liter of culture. The recombinant protein was purified by ion exchange and reverse phase chromatography. Purification of the native serine protease was accomplished by combining techniques of molecular exclusion, ion exchange and reversed phase, and resulted in the isolation of two isoforms, named Collineina-1 and 2. When analyzed by mass spectrometry, the recombinant Collineina-1 showed a molar mass of 28,868 Da, while Collineina-1 and 2 presented masses of 29,475 and 29,388 Da, respectively. The alignment of partial sequences of the enzymes resulted in 100% of amino acid identity between native and recombinant Collineina-1. The multiple alignment of deduced amino acid sequence of Collineina-1 indicates structural similarity with other snake venom serine proteases. The native and recombinant forms of the enzyme showed similar effects on bovine fibrinogen by cleaving preferentially Aα chain, releasing fibrinopeptide A. Both enzymes induced coagulation of bovine plasma in a dose-dependent way, though recombinant Collineina-1 presented a higher coagulant potential, with a minimum coagulant dose (MCD) of 0.08 mg/uL against 0.225 mg/uL for the native form. The serine proteases hydrolyzed S- 2222, S-2238 and S2302 chromogenic substrates, although both enzymes demonstrated increased activity upon S-2302. The esterase activity on TAME was evaluated at different temperatures and in the presence of divalent ions. Both enzymes showed high thermostability and their activity were inhibited in the presence of Zn 2+ and Cu 2+ . The enzyme kinetics of both serine proteases followed Michaelis-Menten model. The native Collineina-1 showed a K m value of 1.43 mM, against 1.682 mM for the recombinant form, indicating that the native
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