Enzimas - purificação

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Expressão heteróloga de celulases de Myceliophthora heterothallica F.2.1.4 em Pichia pastoris e Escherichia coli com a caracterização e purificação das enzimas produzidas

Expressão heteróloga de celulases de Myceliophthora heterothallica F.2.1.4 em Pichia pastoris e Escherichia coli com a caracterização e purificação das enzimas produzidas

Os fungos termofílicos são aceitos atualmente como o grupo produtor mais eficiente de celulases termoestáveis para a degradação da biomassa celulósica (BHALLA et al., 2013). Entretanto, devido à produção ser insuficiente para a hidrólise completa deste material e a capacidade de purificação e caracterização serem complicadas pela presença de outras enzimas de atividades similares, se torna vantajoso a clonagem e expressão de genes codificantes de uma enzima hidrolítica individual, como endoglucanase, em um hospedeiro heterólogo (HUY et al., 2011)
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Clonagem, expressão e purificação das enzimas NahE e NahK de Pseudomonas putida para determinação de suas estruturas cristalográficas

Clonagem, expressão e purificação das enzimas NahE e NahK de Pseudomonas putida para determinação de suas estruturas cristalográficas

Devido ao uso do petróleo e seus derivados, diversos tipos de poluentes são liberados no meio ambiente. Alguns deles são classificados como Hidrocarbonetos Aromáticos Policíclicos (HAPs). A maioria dos HAPs, ou seus metabólitos, são capazes de interagir com bases nitrogenadas causando lesões no DNA, potencializando mutações e, consequentemente, o desenvolvimento de câncer. Como resultado disso, houve nas últimas décadas um aumento substancial na atenção dada às contaminações de solos e lençóis freáticos por HAPs. Inúmeros microrganismos possuem a capacidade de utilizar essas moléculas tóxicas como fontes de carbono e energia. O uso de determinadas bactérias (ou de suas enzimas) através de técnicas de biorremediação é uma estratégia em potencial para eliminação dos HAPs do ambiente. O HAP mais comum e tóxico é o naftaleno, e graças à capacidade da bactéria Pseudomonas putida em degradá-lo completamente, ela tem sido o foco de inúmeras pesquisas. Neste trabalho foram estudadas duas enzimas de P. putida envolvidas na degradação de naftaleno: NahE (uma hidratase-aldolase) e NahK (uma decarboxilase). O objetivo principal do trabalho foi a amplificação e clonagem dos genes nahE e nahK, expressão e purificação das respectivas enzimas para ensaios bioquímicos e estruturais. Os genes foram clonados inicialmente no vetor de expressão pET28a-TEV e expressos em Escherichia coli. A proteína recombinante NahE foi detectada em fração insolúvel e diversas estratégias foram utilizadas, sem sucesso, para obtenção da proteína expressa em fração solúvel. NahE solúvel foi obtida utilizando purificação em condições desnaturantes seguida por reenovelamento. Por outro lado, a proteína recombinante NahK foi detectada em fração solúvel e purificada por cromatografias de afinidade e de exclusão molecular. As proteínas purificadas foram submetidas a ensaios de Espalhamento Dinâmico de Luz e Dicroísmo Circular. Também foram realizados ensaios de cristalização com NahK visando o crescimento de cristais para a elucidação de sua estrutura tridimensional por Cristalografia de Raios-X.
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Identificação de genes envolvidos na degradação de xilana por meio de abordagens genômica e metagenômica

Identificação de genes envolvidos na degradação de xilana por meio de abordagens genômica e metagenômica

Existem diversos processos em desenvolvimento para a produção de etanol celulósico, havendo diferentes possíveis pré-tratamentos, com temperaturas e pH variados, além das diversas biomassas que podem ser utilizadas como fonte de açúcares fermentáveis. Dentre as enzimas importantes para a desconstrução de biomassa vegetal, destacam-se as xilanases. Estas enzimas são responsáveis pela desconstrução da estrutura hemicelulósica presente na parede celular das plantas. Há diversas maneiras para alcançar a identificação destas enzimas: purificação a partir de micro-organismo isolado sendo uma delas. No presente trabalho, foram utilizadas abordagens genômica e metagenômica a fim de realizar a prospecção dos genes responsáveis pela codificação para estas enzimas. Foram utilizados clones oriundos de duas bibliotecas para a detecção e avaliação da atividade em meio sólido suplementado com xilana e bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado com ácido. Dezenove clones de uma biblioteca metagenômica de rúmen de caprinos e cinco clones de uma biblioteca genômica da bactéria AB60, com 15.000 clones construída no presente trabalho, foram selecionados inicialmente. Quatorze clones da biblioteca metagenômica foram sequenciados completamente e tiveram as suas ORFs analisadas. Quatro clones da biblioteca genômica foram parcialmente sequenciados e um clone teve a sua sequência completa determinada e as ORFs analisadas. Das 104 ORFs obtidas de todos os clones completamente ou parcialmente sequenciados, onze ORFs apresentaram alguma similaridade com genes de importância para a degradação de polissacarídeos complexos. Dentre as ORFs de maior importância e com maior probabilidade de estarem relacionadas com a atividade detectada, estão genes codificantes para β- glicosidase, α-xilosidase e β-glicuronidase. Além disso, também foram identificadas outras ORFs com menor
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Enzimas degradadoras de parede celular de plantas produzidas por Rhizoctonia solani AG-1 IA: estudo da produção extracelular, purificação e caracterização

Enzimas degradadoras de parede celular de plantas produzidas por Rhizoctonia solani AG-1 IA: estudo da produção extracelular, purificação e caracterização

hospedeiros. Há estudos que buscam compreender tais mecanismos e uma hipótese levantada é com relação à ação das EDPCP. Rhizoctonia solani AG-1 IA é considerado um patógeno importante, afetando uma ampla gama de culturas hospedeiras de importância mundial (JONES; BELMAR, 1989; PASCUAL; HYAKUMACHI, 2000). Na América do Sul R. solani AG-1 IA causa a queima da bainha no arroz (SOUZA et al., 2007); folha bandeada e queima da bainha do milho (PERDOMO et al., 2007); queima foliar da soja (FENILLE et al., 2002), e a mela no feijão caupi (NECHET; HALFELD-VIEIRA, 2006). As enzimas microbianas podem ser tanto intracelulares como extracelulares. Do ponto de vista biotecnológico, as enzimas extracelulares são preferíveis, por serem mais fáceis de serem obtidas. Assim, a avaliação do potencial de produção extracelular das EDPCP é um grande passo para o estudo das propriedades dessas enzimas e seu real potencial de aplicação biotecnológica.
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'Beta'-D-frutofuranosidases de Fusarium graminearum: produção, purificação, imobilização e determinação das propriedades bioquímicas de enzimas solúveis e secas em Spray dryer

'Beta'-D-frutofuranosidases de Fusarium graminearum: produção, purificação, imobilização e determinação das propriedades bioquímicas de enzimas solúveis e secas em Spray dryer

As β-D-frutofuranosidases (FFases), também conhecidas como invertases, são enzimas que podem ser encontradas no interior das células ou serem secretadas para o meio, sendo uma das primeiras hidrolases a serem estudadas. Em 1828, sua atividade foi identificada pela primeira vez ao ser observado que a levedura de panificação fermentava a sacarose em meio aquoso (Barros, 1990). Em 1913 ela foi utilizada como enzima modelo para estudos de catálise enzimática por Michaelis- Menten e começou a ser comercializada, sendo uma enzima que pode ser utilizada em diversos processos industriais (Vitolo, 2004). De modo geral, essa enzima possui atividade de hidrólise sobre sacarose em concentrações abaixo de 10% (m/v), enquanto que em concentrações acima de 20% (m/v) de sacarose possui atividade transfrutosilativa (Rubio, et al., 2002), com excessão a β-D-frutofuranosidase de A.
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Produção, purificação e identificação de enzimas extracelulares de fungos nematófagos e suas atividades nematicidas

Produção, purificação e identificação de enzimas extracelulares de fungos nematófagos e suas atividades nematicidas

Table 4 Analysis of the factors studied in the Plackett-Burman statistical design of chitinase production by nematophagous fungus Monacrosporium thaumasium (NF34).. Pág.[r]

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Repositório Institucional da UFPA: Proteína PR-4 de pimenteira-do-reino (piper nigrum l.): expressão heteróloga em sistema bacteriano e avaliação funcional

Repositório Institucional da UFPA: Proteína PR-4 de pimenteira-do-reino (piper nigrum l.): expressão heteróloga em sistema bacteriano e avaliação funcional

Inicialmente a seqüência da ORF da proteína PnPR-4 foi amplificada a partir do clone de cDNA por meio de ensaios de PCR (reação em cadeia da polimerase) utilizando-se os iniciadores contendo sítios para as enzimas de restrição Ndel e XhoI. A amplificação foi realizada em 30 ciclos no Veriti™ Thermal Cycler (Applied Biosystems, USA) sob as seguintes condições: Desnaturação inicial a 95°C por cinco minutos, seguido de 30 ciclos de: desnaturação a 95°C por um minuto, anelamento a 55°C por um minuto e elongação a 72°C por quatro minutos. O produto da PCR foi avaliado por eletroforese em gel de agarose 1% (P/V) corado com brometo de etídio e visualizado na luz ultravioleta. A purificação foi realizada com o EZ-10 Spin Column PCR Product purification Kit (Bio Basic Inc., Canadá), seguindo as orientações do fabricante.
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Sustainable development and green chemistry.

Sustainable development and green chemistry.

Os sistemas em biocatálise podem utilizar células íntegras ou enzimas. As células íntegras têm como vantagens o baixo custo e o fato de conter tanto as enzimas quanto as coenzimas necessárias ao processo. Porém, por ser um sistema multienzimático, podem ocor- rer reações laterais, além de problemas de permeabilidade do substrato pela membrana. Por outro lado, enzimas isoladas oferecem maior controle do processo, apesar do custo mais alto pela tecnologia aplica- da na purificação desta, com a menor perda de atividade possível 47 .

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Caracterização e desenvolvimento de moléculas ligantes de nucleossomo : impacto do colesterol e de peptídeos desenhados in silico sobre a cromatina

Caracterização e desenvolvimento de moléculas ligantes de nucleossomo : impacto do colesterol e de peptídeos desenhados in silico sobre a cromatina

Plasmídeo (pUC18) contendo o arranjo 197.25 e sítios de enzimas de restrição. Exemplo de etapas de purificação dos longos fragmentos de DNA ... Esquema ilustrativo das etapas realiza[r]

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Citocromo P450 2D6: variabilidade na terapêutica e na predisposição para patologias

Citocromo P450 2D6: variabilidade na terapêutica e na predisposição para patologias

A relação entre os polimorfismos das enzimas oxidativas e a predisposição para o aparecimento de problemas neurológicos, neoplasias e alérgias já é conhecida e relatada. Nos últimos anos tem-se vindo a analisar a capacidade destas variações polimorficas alterarem a forma como as enzimas metabolizam os xenobioticos e de conduzirem asism a doenças auto-imunes como é o caso da ES. Fatores ambientais externos a radiação UV, solventes orgânicos, fumo do tabaco, componentes do silicone, pesticidas e fármcos podem levar a alterações na estrutura dos cromossomas ou outras moléculas biológicas, dando início a um processo patológico. (Butler, et al., 2001) (D’Cruz, 2000)
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Immobilization of the enzymes on chromatographic supports: a tool to research of inhibitor compounds.

Immobilization of the enzymes on chromatographic supports: a tool to research of inhibitor compounds.

um termo genérico empregado para descrever a retenção de uma biomolécula no interior de um reator ou de um sistema analítico. A imobilização de enzimas a suportes cromatográficos apresenta diver- sas vantagens, sobre a utilização de enzimas livres em solução, entre as quais destacamos: a utilização de pequenos volumes de amostra (pL-nL); aumento do tempo de vida e da estabilidade da enzima em relação à temperatura, aos solventes orgânicos e à variação de pH sem perda considerável da atividade catalítica; reutilização; pequeno manuseio da amostra, evitando contaminações; fácil separação da enzima dos produtos da reação. 16,17 Essas vantagens são úteis nos
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Caracterização parcial de mananases produzidas por Clonostachys byssicola cultivado em casca de soja

Caracterização parcial de mananases produzidas por Clonostachys byssicola cultivado em casca de soja

As mananases microbianas são principalmente enzimas extracelulares, cuja produção é grandemente influenciada por fatores nutricionais e fisioquímicos, como fonte de nitrogênio, carbono, pH, temperatura, agitação e concentração de oxigênio dissolvido. Dada a propriedade de atuar em uma ampla faixa de pH e temperatura, as mananases microbianas apresentam uma variedade de aplicações, podendo ser empregadas na produção de etanol de segunda geração, indústrias têxteis, como também no melhoramento do valor nutricional de alguns alimentos. Neste trabalho, o fungo filamentoso Clonostachys byssicola foi utilizado para produção de mananases tendo a casca de soja como fonte de carbono. C. byssicola, foi cultivado em meio submerso contendo casca de soja 1% por sete dias. O extrato bruto, concentrado por ultrafiltração (EBC) com membrana de retenção de 30 kDa, apresentou atividade de mananase de 4,18 UI/mL. As amostras de mananases presentes no EBC foram semi-purificadas por dois tipos de cromatografia de troca aniônica: DEAE Sepharose Fast Flow (DEAE) e Q Sepharose Fast Flow (QFF). O EBC e a fração semi-purificada (ManQFF) apresentaram
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Cylindrocladium spathiphylli de espatifilo (Spathiphyllum wallisii Rengel): detecção de enzimas extracelulares em isolados normais e alterados por temperatura.

Cylindrocladium spathiphylli de espatifilo (Spathiphyllum wallisii Rengel): detecção de enzimas extracelulares em isolados normais e alterados por temperatura.

O inóculo de cada isolado normal do fungo foi produzido em placas de Petri de vidro, de 90 mm de diâmetro, contendo meio de batata-dextrose-ágar (BDA), que foram mantidas em estufa tipo BOD, a 23ºC, na ausência de luz, por oito dias. Após o preparo dos meios específicos para a detecção das enzimas, um disco de meio BDA contendo cada isolado do fungo foi transferido para o centro de cada placa ou para tubo de ensaio contendo os meios específicos das enzimas. A amilase foi detectada em meio (6 g de NaNO 3 ; 1,5 g de KH 2 PO 4 ; 0,5 g de KCl; 0,5 g de MgSO 4 .7H 2 O; 0,01 g de FeSO 4 ; 0,01 g de ZnSO 4 ; 15 g de ágar; 1 L de água destilada) contendo 1% de amido solúvel, em pH 6,8. Adicionaram-se 5 mL de solução de lugol, por 10 minutos, em cada placa, após manter as mesmas em BOD, a 23°C, por 5 dias, no escuro, para verificar a atividade amilolítica. Resultado positivo refere-se a um halo amarelado ao redor da colônia em contraste com um fundo roxo (34).
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POTENCIAL ENZIMÁTICO DE LEVEDURAS ISOLADAS DE FOLHAS EM DECOMPOSIÇÃO

POTENCIAL ENZIMÁTICO DE LEVEDURAS ISOLADAS DE FOLHAS EM DECOMPOSIÇÃO

As enzimas são amplamente utilizadas no mercado industrial e inúmeros trabalhos têm apresentado o potencial de leveduras isoladas de diversas fontes para a produção de diversas enzimas. O objetivo desse trabalho foi avaliar o potencial de leveduras isoladas de folhas em decomposição, provenientes de 3 córregos no município de Taquaruçu, estado do To- cantins, para a produção de enzimas. Foram testadas 205 linhagens quanto à produção de amilase, lipase, celulase e xilanase, utilizando meios sólidos específicos com incubação a 25°C no período de 5 a 15 dias. Os resultados foram dados como Índice Enzimático (IE), que representa a relação entre o diâmetro do halo de hidrólise e o diâmetro da colônia. Das 205 linhagens avaliadas, 143 (69,8%) apresentaram resultado positivo para pelo menos uma das enzimas, sendo 83 para lipase (40,5%), 59 para celulase (28,8%), 30 para xilanase (14,6%) e 35 para amilase (17,1%). Os valores de IE variaram de 1,19 (celulase) a 7,63 (lipase).
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Lectina da esponja marinha Tedania ignis: purificação, caracterização e interação com leishmanias

Lectina da esponja marinha Tedania ignis: purificação, caracterização e interação com leishmanias

Uma lectina foi purificada e caracterizada da esponja marinha Tedania ignis. O procedimento de purificação foi conduzido a partir do extrato bruto obtido por solubilização em tampão Bórax 50mM, pH 7,5 e precipitação protéica com 30% de sulfato de amônio (FI). O precipitado foi dissolvido no tampão de extração e fracionado com 1,0 volume de acetona (F1,0). A lectina foi purificada desta fração por meio de cromatografia de afinidade em Sepharose 6B. A proteína apresentou uma massa molecular de 45 kDa, conforme determinada por eletroforese em poliacrilamida em SDS, e se mostrou estável até a temperatura de 40ºC, por 1 hora. Uma curva de pH foi conduzida entre os valores de pH 2,5 a 11,5, onde observou-se uma maior atividade em pH 7,5. Dentre os eritrócitos humanos testados ela aglutinou preferencialmente os do tipo B tratados com papaína. A atividade hemaglutinante da lectina foi dependente do cátion bivalente Mn +2 e foi inibida pelos carboidratos galactose, xilose e frutose. Formas promastigotas de Leishmania chagasi coradas com Coomassie blue R-250 foram aglutinadas por F1,0 e na presença de galactose essa interação não foi observada. Esses resultados indicam que essa lectina pode estar envolvida no processo de defesa e que pode vir a ser utilizada como ferramenta biológica nos estudos com esse protozoário.
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Biossensor nanoestruturado construído através da imobilização multicamada de enzimas

Biossensor nanoestruturado construído através da imobilização multicamada de enzimas

o Adsorção física: este método envolve adsorção do elemento de biorreconhecimento formando um filme de moléculas ou átomos, sem haver difusão dos mesmos para o sólido. As forças presentes na fixação destas moléculas ou átomos são de natureza fraca (van der Waals), interações iônicas e interações hidrofóbicas entre o substrato e a elemento de biorreconhecimento. No caso de enzimas esta estratégia geralmente ocasiona mudanças conformacionais gerando diminuição das suas funções, além disso, a desorção das enzimas acontece em condições “amenas” de uso devido à baixa intensidade das forças envolvidas neste tipo de imobilização (SHELDOM, 2007);
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LOS MAPAS CONCEPTUALES COMO INSTRUMENTOS EVALUATIVOS DEL NIVEL DE CONSTRUCCIÓN INTEGRATIVA DE SIGNIFICADOS EN EL LABORATORIO  DE BIOQUÍMICA BAJO UN ENFOQUE CONSTRUCTIVISTA

LOS MAPAS CONCEPTUALES COMO INSTRUMENTOS EVALUATIVOS DEL NIVEL DE CONSTRUCCIÓN INTEGRATIVA DE SIGNIFICADOS EN EL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA BAJO UN ENFOQUE CONSTRUCTIVISTA

Las actividades de laboratorio se desarrollaron de la siguiente manera: (a) se realizó un taller sobre elaboración de mapas conceptuales y diagrama V al inicio del curso; (b) los estudiantes elaboraron diagramas V con mapas conceptuales (versión de avance) antes de ejecutar cada TPL para recibir la respectiva revisión docente; (c) se desarrollaron los primeros cuatro TPL como actividades investigativas por pares (equipos) de estudiantes y se entregaron los informes respectivos en diagrama V contentivo de un mapa conceptual; (d) luego cada equipo de estudiantes discutió y decidió qué hacer como proyecto de investigación final sobre enzimas, con el respectivo aval docente; (e) se aplicó una prueba de conocimientos previos sobre enzimas en la fase de pre- laboratorio del proyecto; (f) cada estudiante elaboró el diagrama V con un mapa conceptual integrado (versión de avance) antes de ejecutar el proyecto (g) se ejecutó el proyecto; y (g) cada estudiante elaboró su informe respectivo en forma de diagrama V con el mapa conceptual final incluido. El mapa conceptual debía integrar conceptos teóricos y metodológicos pertinentes a la situación-problema particular planteada; la versión final se usó para fines investigativos.
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TECNOLOGIAS PARA A PRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO DO PVC

TECNOLOGIAS PARA A PRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO DO PVC

O policloreto de vinila (PVC) é um dos mais importantes polímeros e pode ser produzido por alguns métodos, dentre os quais, a polimerização em emulsão, a polimerização em massa, a polimerização em solução e em suspensão. No processo de polimerização em suspensão, o mais utilizado, a conversão normalmente assume valores entre 83 e 90%. Sendo assim, faz-se necessário uma posterior purificação com o objetivo de aumentar ainda mais a pureza da suspensão ou lama de PVC. Além disso, o cloreto de vinila é um agente cancerígeno. Várias técnicas são empregadas para reduzir o teor do monômero de cloreto de vinilo (MVC) no PVC produzido, sendo possível classificar essas técnicas em duas categorias. Na primeira, que envolve métodos químicos, o monômero não reagido é induzido a reagir, gerando novos compostos que devem apresentar uma maior facilidade de remoção e ser não tóxicos, ou, até mesmo, menos voláteis do que o MVC. Já na segunda categoria, constituída por métodos físicos, o MVC é retirado do PVC por volatilização ou por extração com um solvente, ou, ainda, com o auxílio de uma resina de troca iônica. O objetivo desta revisão é apresentar as principais tecnologias de produção e purificação de PVC, uma vez que tais tecnologias, em especial as de remoção do MVC, são pouco conhecidas e divulgadas principalmente por meio de patentes de modo superficial.
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de enzimas dos sucos de graviola e caju

de enzimas dos sucos de graviola e caju

As peroxidases são geralmente as enzimas mais termoestáveis encontradas em frutos e vegetais, o que faz com que ela seja utilizada como um indicador de inativação enzimática após determinados tratamentos térmicos (ANTHON et al ., 2002), sendo essa estabilidade dependente do tecido e da espécie (ROBINSON, 1991). Estudos que avaliaram o comportamento cinético da atividade de peroxidases de extratos de couve-flor ( Brassica oleracea var. Botrytis) submetidos a tratamento térmico mostraram que esta enzima mantém 100% de sua atividade inicial (atividade residual) mesmo após uma exposição por 30 min a 50 °C. Quando a temperatura aumenta para 85 °C, a atividade cai para 11,6%, restando apenas 2,1% a 100 °C (RAYAN et al ., 2011). Anthon et al . (2002) observaram que a peroxidase de suco de tomate da cultivar CXD 199 foi rapidamente inativada a 72 °C, apresentando menor estabilidade térmica que PME e PG desse mesmo suco. Já a peroxidase de suco de cenoura apresenta uma alta termoestabilidade, mantendo-se ativa mesmo após 150 min de exposição a 70 °C (JAKOB et al ., 2010).
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