Top PDF Purificação e caracterização parcial de uma lectina lactose-específica com ação pro-inflamatória de sementes de dioclea reflexa

Purificação e caracterização parcial de uma lectina lactose-específica com ação pro-inflamatória de sementes de dioclea reflexa

Purificação e caracterização parcial de uma lectina lactose-específica com ação pro-inflamatória de sementes de dioclea reflexa

Lectinas com afinidade de ligação a lactose isoladas de sementes de espécies vegetais filogeneticamente próximas da sub-tribo Diocleinae apresentam diferentes características quando comparadas à outras lectinas extensivamente estudadas com afinidade de ligação a glicose-manose. Nesse estudo, uma nova lectina específica a lactose extraída a partir de sementes de Dioclea reflexa (DrfL II) foi isolada por dois passos cromatográficos em colunas de Sephadex G-50 e Sepharose-lactose. A SDS-PAGE revelou uma lectina como uma banda única em torno de 29 kDa, diferindo do perfil já conhecido de lectinas ConA-like específicas a glicose/manose. A sequência parcial da lectina foi obtida por espectrometria de massa com fonte ionizadora eletrospray cobrindo cerca de 30% da sequência total da proteína. DrfL II apresentou especificidade à α-lactose e alta estabilidade a um vasto intervalo de pH. DrfL II mostrou ausência de toxicidade contra Artemia nauplii e induziu inflamação aguda (edema de pata e hipernocicepção) em camundongos com a participação do domínio da lectina e óxido nítrico. Visto que poucas informações têm sido publicadas a respeito de lectinas lactose específicas de Diocleinae, se faz necessário, portanto, que o estudo seja continuado visando a determinação completa da estrutura primária e tridimensional da lectina, para comparação com os dados existentes de lectinas ConA-like e lactose específicas.
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Purificação e caracterização parcial de uma lectina lactoseespecífica com ação proinflamatória de sementes de Dioclea reflexa dis cflóssio

Purificação e caracterização parcial de uma lectina lactoseespecífica com ação proinflamatória de sementes de Dioclea reflexa dis cflóssio

Lectinas com afinidade de ligação a lactose isoladas de sementes de espécies vegetais filogeneticamente próximas da sub-tribo Diocleinae apresentam diferentes características quando comparadas à outras lectinas extensivamente estudadas com afinidade de ligação a glicose-manose. Nesse estudo, uma nova lectina específica a lactose extraída a partir de sementes de Dioclea reflexa (DrfL II) foi isolada por dois passos cromatográficos em colunas de Sephadex G-50 e Sepharose-lactose. A SDS-PAGE revelou uma lectina como uma banda única em torno de 29 kDa, diferindo do perfil já conhecido de lectinas ConA-like específicas a glicose/manose. A sequência parcial da lectina foi obtida por espectrometria de massa com fonte ionizadora eletrospray cobrindo cerca de 30% da sequência total da proteína. DrfL II apresentou especificidade à α-lactose e alta estabilidade a um vasto intervalo de pH. DrfL II mostrou ausência de toxicidade contra Artemia nauplii e induziu inflamação aguda (edema de pata e hipernocicepção) em camundongos com a participação do domínio da lectina e óxido nítrico. Visto que poucas informações têm sido publicadas a respeito de lectinas lactose específicas de Diocleinae, se faz necessário, portanto, que o estudo seja continuado visando a determinação completa da estrutura primária e tridimensional da lectina, para comparação com os dados existentes de lectinas ConA-like e lactose específicas.
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Caracterização parcial de uma prolectina funcional de sementes de Dioclea grandiflora Benth expressa em Escherichia coli.

Caracterização parcial de uma prolectina funcional de sementes de Dioclea grandiflora Benth expressa em Escherichia coli.

A pro-lectina de sementes de apresentou-se ativa quando expressa de forma recombinante (r-pro-DGL) no citoplasma do modelo procariótico . Obtida de forma solúvel a partir do vetor pET32a, a proteína recombinante apresentou massa aparente (25 kDa) e sequência (obtida por espectrometria de massas) idênticas à pro-lectina silvestre# mostrando-se atipicamente funcional em comparação a outras lectinas de leguminosas expressas de forma heteróloga, possuindo uma atividade específica de 134.217.728 (U.H./mg). Diferentemente de sua contraparte silvestre, a r-pro-DGL não reconheceu especificamente glicose, sendo apenas fracamente inibida por manose. Em decorrência da alta similaridade de sequência entre os precursores de lectinas na subtribo Diocleinae e lectinas ligantes de galactose pertencentes a outras tribos de leguminosas, há a hipótese de que o processamento pós-traducional peculiar dessa subtribo poderia influir de forma decisiva sobre a especificidade fina dessas proteínas. Entretanto, a r-pro-DGL não apresentou afinidade por galactose ou lactose, demonstrando ser a topologia do sítio de ligação, bem como a conformação das alças que o estruturam, os principais fatores determinantes da especificidade a monossacarídeos. Assim, pode-se afirmar que precursores de lectinas na subtribo Diocleinae apresentam-se ativos enquanto deglicosilados, sendo ainda capazes de formar oligômeros e estabelecer ligações cruzadas entre membranas celulares e glicoconjugados.
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Purificação e caracterização parcial de uma lectina próinflamatória de sementes de Bauhinia bauhinioides MART

Purificação e caracterização parcial de uma lectina próinflamatória de sementes de Bauhinia bauhinioides MART

As sementes de Bauhinia bauhinioides Mart, uma espécie pertencente à Família Leguminosae, Subfamília Caesalpinoideae, Tribo Cercideae, possuem uma lectina Galactose/Lactose específica, que aglutina eritrócitos de coelho e humanos nativos ou tratados com enzimas proteolíticas. A lectina de sementes de B. bauhinioides foi purificada por precipitação com sulfato de amônio seguida por cromatografias de trocas iônica em DEAE- Sephacel e em HiTrap SP, essa última acoplada a HPLC. Esse procedimento resultou na lectina purificada, nomeada de BbL. O processo de purificação de BbL foi monitorado por SDS-PAGE e observou-se que a lectina purificada é caracterizada por um perfil eletroforético composto por uma banda única, com massa molecular aparente de aproximadamente 31 kDa, tanto na presença quanto na ausência de um agente redutor. A análise por espectrometria de massas indicou que BbL possui uma massa molecular de 28305 Da e, por cromatografia de exclusão molecular, observou-se que a lectina, na sua forma nativa, parece assumir uma estrutura tetramérica. A lectina de sementes de B. bauhinioides não é uma glicoproteína e demonstrou ser bastante estável, sendo capaz de manter sua atividade hemaglutinante em uma ampla faixa de pH, após exposição a temperaturas de até 60º C por 1 hora e após diálise contra EDTA. BbL foi testada quanto a atividade pró-inflamatória utilizando o modelo de edema de pata em ratos, sendo que, foi observada uma indução significativa de edema nos animais tratados com BbL na dose de 1,0 mg/kg e esta atividade pró-inflamatória foi inibida pela incubação prévia da lectina com 0,1 M de D-galactose. Foi avaliado também o efeito causado por moduladores farmacológicos sobre a atividade pró-inflamatória e observou-se que o L-NAME, um inibidor não-seletivo da enzima Óxido Nítrico Sintase, inibiu significativamente o edema causado pela lectina, sugerindo que a atividade pró-inflamatória causada por BbL ocorre via liberação de oxido nítrico. Esses resultados reforçam a idéia da utilização de lectinas vegetais com ferramentas biotecnológicas em estudos envolvendo os mecanismos da resposta inflamatória.
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Purificação e caracterização parcial de uma lectina presente no soro do peixe tilápia (Oreochromis niloticus): atividade imunomodulatória em esplenócitos de camundongos

Purificação e caracterização parcial de uma lectina presente no soro do peixe tilápia (Oreochromis niloticus): atividade imunomodulatória em esplenócitos de camundongos

AB e O (título, 8 -1 , 64 -1 , 4 -1 e 32 -1 , respectivamente); a atividade hemaglutinate foi detectada numa faixa de pH entre 7,0 e 11,0 e foi completamente preservada após o aquecimento de 10 min a 25, 30, 40, 50 e 60 °C, porém a atividade foi completamente abolidas após 70 °C. A adição de um agente quelante de Ca 2+ , EDTA, diminuiu a atividade revelando que OniL é uma lectina cálcio- dependente. O peso molecular foi de 17 kDa na SDS-PAGE em condições não redutoras; e 11 e 6,6 kDa na presença de uma agente redutor a proteína apresentou duas subnidades ligadas por pontes disulfeto; OniL apresentou-se, através de PAGE, como uma proteína ácida com banda única de polipeptídeo. Os ensaios imunológicos revelaram que OniL não é citotóxica para esplenócitos de camundongos e induziu alta produção de citocinas em relação ao controle: IFN-γ (24 h), IL-2 e IL-6 em todos os tempos analisados. Porém, a produção de IL-10 e concentrações de nitritos foram baixas quando comparadas com o controle; OniL apresentou atividade proliferativa em relação ao controle para todas as concentrações e não induz morte celular significativa nos tempos analisados. A lectina purificada do soro de tilápia (Oreochromis niloticus) é manose-específica, não apresenta citotoxidade para esplenócitos, com atividade imunomoduladora induzindo produção de citocinas para diferenciação e proliferação de células preferencialmente Th1 CD4+, assim, esta proteína pode ser utilizada como um potente agente mitogênico em mamíferos.
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Purificação, caracterização parcial e  biotecnológica de três lectinas de sementes de espécies de Leguminosae da subtribo Diocleinae

Purificação, caracterização parcial e biotecnológica de três lectinas de sementes de espécies de Leguminosae da subtribo Diocleinae

Leguminosae is recognized by the large amount of isolated and characterized lectins, especially seeds. In this group stand out proteins extracted from species belonging to subtribe Diocleinae, the number of studies in different areas of knowledge. Lectins can be defined as proteins or glycoproteins which are not originated from a body's immune response and have the ability to recognize and bind reversibly to mono or oligosaccharides particular without, however, altering their chemical structures. Different works in our group are structurally characterizing these proteins as well as elucidating some possible biotechnological applications for these molecules. In this sense, the objective of this study was to isolate and characterize lectins of different species of Leguminosae of Diocleinae subtribe and test them for toxicity to Artemia sp. naupilos, The effect on the smooth muscle of blood vessels and the detention lectin matrix agarose previously activated with cyanogenic bromide (CNBr). Were isolated and characterized the lectin Dioclea sclerocarpa, Dioclea lasiocarpa and Dioclea lasiophylla. Were also made circular dichroism studies on lectin Dioclea sclerocarpa and Dioclea lasiocarpa. The lectin Dioclea lasiophylla was tested against Artemia sp. order to assess their toxicity and was also immobilized on agarose matrix. We evaluated the effect of lectin Dioclea lasiocarpa in the smooth muscle of blood vessels. The knowledge gained from the three scientific articles published in this thesis is a major breakthrough in this promising field of study that has been continuously growing for biotechnological applications.
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Purificação, caracterização físicoquímica e biológica de SLA: uma nova lectina extraída de sementes de Swartzia laevicarpa Amshoff

Purificação, caracterização físicoquímica e biológica de SLA: uma nova lectina extraída de sementes de Swartzia laevicarpa Amshoff

A composição da tribo Swartzieae tem sido objeto de discussões na literatura, com referências de até 15 gêneros. A tribo consiste do gênero tipo (com 143 espécies) e de outros 11 gêneros (com um total de cerca de 50 espécies), todos de regiões tropicais da África e do Novo Mundo (POLHILL, 1994). O primeiro relato de lectina de uma espécie dessa tribo foi para a espécie S. pickelli (CAVALCANTE; COELHO, 1990). Os autores relatam que S. pickelli apresenta atividade hemaglutinante contra sangue de diversas espécies animais e contra o sistema ABO humano e após fracionar o extrato em pH 7,5, os autores verificam que a atividade hemaglutinante se concentra na fração de 20 a 40% de saturação com sulfato de amônio e sugerem que essa fração deve ser trabalhada futuramente a fim de purificar a referida lectina. Desde então não foram lançados novos trabalhos envolvendo lectina dessa espécie.
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Purificação e caracterização parcial de lectina obtida de couve-flor (Brassica oleracea var. Botrytis) e potenciais ações biológicas

Purificação e caracterização parcial de lectina obtida de couve-flor (Brassica oleracea var. Botrytis) e potenciais ações biológicas

As lectinas são proteínas capazes de interagir de forma seletiva e reversível com carboidratos. As interações proteína-carboidrato estão envolvidas em muitos processos biológicos, atuando como mediadoras de várias atividades celulares, que incluem: interação célula-célula, célula-matriz, controle do crescimento celular e a apoptose. Além disso, tais interações estão implicadas no desenvolvimento de doenças. Adicionalmente, as lectinas podem promover a eliminação de agentes não próprios pela opsonização e parecem ativar a resposta imune inata. Nesse estudo foi purificada e parcialmente caracterizada uma lectina de couve-flor (Brassica oleracea var. Botrytis). A atividade dessa proteína contra a viabilidade de células tumorais (MDA-MB-231, MCF-7 e HepG2) e sobre a ativação de macrófagos foi avaliada. O processo de purificação da lectina envolveu três etapas cromatográficas (por afinidade em coluna Hitrap Blue HP, por troca catiônica em coluna Hitrap CaptoS e exclusão por peso molecular em coluna Sephadex 200 HR 10/30). Sua massa molecular foi estimada por SDS-PAGE sob condições redutora e não redutora, bem como após tratamento com PNGase. A atividade da proteína sobre eritrócitos humanos e de carneiro, em diferentes temperaturas e valores de pH, na presença de diferentes cátions bivalentes, e sua capacidade de se ligar a diferentes carboidratos foi investigada. A sequência de aminoácidos da porção N-terminal da proteína foi analisada por degradação de Edman em sequenciador automático de proteína (modelo PPSQ-33A, Shimadzu). A viabilidade das células tumorais na presença da lectina pelo ensaio com MTT. Adicionalmente, foi realizado ensaio de fagocitose por macrófagos e estimada a produção de H 2 O 2 e NO - sob a influência da lectina. As etapas
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STERIODS CONSTITUENTS OF DIOCLEA REFLEXA HOOK SEEDS

STERIODS CONSTITUENTS OF DIOCLEA REFLEXA HOOK SEEDS

The methanolic extract of the D. reflexa seed, after successive column chromatography on silica gel, afforded taraxasterol and stigmasterol. These compounds were identified by comparison of their spectra data with those reported in the literature.

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Desenvolvimento, purificação e caracterização de IgC anti-lectina coagulante de sementes de Moringa oleifera (cMoL)

Desenvolvimento, purificação e caracterização de IgC anti-lectina coagulante de sementes de Moringa oleifera (cMoL)

Santos e colaboradores (2009), revelaram a presença de uma lectina coagulante de semente de M.oleifera (cMoL); essa proteína básica, mostrou estabilidade em pH entre 4,0-9,0 e termo resistência a 100°C durante 7 h. Seu isolamento foi realizado por cromatografia de afinidade utilizando em sua matriz o gel de guar, a presença dos íons Mg 2+ , Ca 2+ e K + aumentou a AH e pelo resultado da eletroforese sob condições desnaturantes ficou evidente uma única banda de 26,5 kDa e em condições reduzidas com o agente redutor β- mercaptoetanol duas subunidades de 26,5 e 14,9 kDa. LUZ e colaboradores (2013), caracterizaram estruturalmente a lectina cMoL e também seu efeito sobre parâmetros hemostáticos, revelando como uma proteína composta por 101 aminoácidos, apresentando 81% de similaridade com a lectina floculante de M. oleifera (MoL), e em seus resultados ela também agiu como uma proteína anticoagulante nos testes in vitro.
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Purificação e caracterização físico-química de lectina isolada de sementes de Dalbergia ecastophyllum (l.) Taub.

Purificação e caracterização físico-química de lectina isolada de sementes de Dalbergia ecastophyllum (l.) Taub.

As sementes de Dalbergia ecastophyllum (L.) Taub, uma espécie pertencente á família Fabaceae, subfamília Papilionoideae, tribo Dalbergieae, e gênero Dalbergia, possuem uma lectina N-acetil-D-glucosaina/melibiose/L-rhamnose específica, que aglutina eritrócitos de coelho nativos ou tratados com enzima tripsina. A lectina, nomeada de DeL, foi purificada em um passo através da cromatografia de afinidade em matriz de Quitina, se mostrando a primeira lectina do gênero a ser purificada. O processo todo de purificação foi monitorado por SDS-PAGE, atividade hemaglutinante específica e cromatografia de exclusão molecular. Onde a DeL purificada apresentou um perfil eletroforético composto por uma banda de aproximadamente 20 kDa de massa molecular aparente. Ademais, a DeL não demonstra estabilidade em ampla faixa de pH ou temperatura. Também não apresenta toxicidade contra nauplios de Artemia sp., também não é glicoproteína.
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Uma nova lectina lactose-específica isolada do fungo Langermannia bicolor com propriedades antibiofilme

Uma nova lectina lactose-específica isolada do fungo Langermannia bicolor com propriedades antibiofilme

Essa interação entre lectinas e glicanos bacterianos não implica necessariamente em uma ação antibacteriana. O uso de lectinas como "decodificador de glicanos" tornou-se uma ferramenta útil no aprimoramento das técnicas de biomarcadores (HU; TATENO; HIRABAYASHI, 2015). A análise dos carboidratos presentes nos biofilmes está bem documentada na literatura científica, como o uso da lectina comercial do trigo Triticum vulgaris conjugada com fosfatase. Com isso foi possível determinar de forma qualitativa colorimétrica os resíduos de N-acetilglucosamina que são responsáveis pela adesão intercelular do biofilme de S. epidermis (HENDRICKSON; ZHERDEV, 2018). Devido ao desempenho não destrutivo dos glicoconjugados in situ, técnicas usando lectinas, como a FLBC (do inglês Fluorescence Lectin Bar Coding) e a FLBA (do inglês Fluorescence Lectin-Binding Analysis), estão sendo cada vez mais refinadas e direcionadas para a caracterização de biofilme (GAGLIANO et al., 2018; KRISTENSEN et al., 2017).
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Purificação da lectina de sementes de Moringa oleifera (WSMoL) e avaliação da genotoxidade

Purificação da lectina de sementes de Moringa oleifera (WSMoL) e avaliação da genotoxidade

dos sais químicos, mas eles não estavam aptos a competir efetivamente pelo fato de sua efetividade e seu mecanismo de ação não serem bem entendidos cientificamente (NDABIGENGESERE & NARASIAH, 1998). O custo e os efeitos ambientais provocados pelos sais iônicos têm aumentado o interesse no uso de coagulantes orgânicos derivado de plantas, como as sementes de M. oleifera, em países em desenvolvimento (JAHN, 1986; MUYIBI & EVINSON, 1995). A técnica foi trazida da África para o Brasil em 1994 e está sendo difundida por organizações não governamentais nas regiões brasileiras. O uso como purificador da água vem sendo divulgado principalmente por entidades ligadas a AS-PTA - ASSESSORIA E SERVIÇOS A PROJETOS EM AGRICULTURA ALTERNATIVA, que publicou uma cartilha sobre o uso de sementes de M. oleifera para o tratamento da água baseado nos trabalhos da pesquisadora alemã Dra. Samia Ao Azharia Jahn.
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Ação da lectina de Dioclea altissima sobre células tumorais: Citotoxidade e Perfil Proteômico da Linhagem PC3M

Ação da lectina de Dioclea altissima sobre células tumorais: Citotoxidade e Perfil Proteômico da Linhagem PC3M

Recently, plant lectins have attracted great interest due to their several biological activities of which stands out the antitumoral action in vivo and in vitro that in general result in inhibition of cell growth and induction of cell death by apoptosis. In the present study, it was investigated the effect of the Dioclea altissima (DAL) lectin, a legume alfa-D-mannose ligand lectin on A549 (lung cancer), OVCAR-8 (ovarian cancer) and PC3M (prostate cancer) and normal line PBMC (cell blood tissue). DAL was isolated and purified by affinity chromatography on a Sephadex G-50 column and its cytotoxicity was evaluated by MTT assay. DAL was selectively cytotoxic to cancer cells A549, PC3M after 48 and 72 hours of incubation, and OVCAR-8 after 72 hours of treatment with DAL (CI50 values between 23.0 e 55.7 µg/mL). Moreover, it was observed cell agglutination from 24 hours of incubation. Comet assay revealed DAL does not cause direct DNA damage. The line PC3M was selected for proteomic analysis by mass spectrometry (nanoUPLC ® nanoESI-MS E ) to present the best evidence of sensitivity to DAL. PC3M line was treated with various concentrations of DAL during 24, 48 e 72 hours, it was identified a total of 837 proteins, 140 (24h), 321 (48h) e 376 (72h). The study of differential protein expression of the DAL-treated PC3M cells compared to control demonstrated apoptotic effect generated, mainly, via ER stressed-dependent.
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Lectina da esponja marinha Tedania ignis: purificação, caracterização e interação com leishmanias

Lectina da esponja marinha Tedania ignis: purificação, caracterização e interação com leishmanias

ambas as proteínas exibiram uma massa molecular de 63 kDa (em sua forma nativa) e quando submetidas a condições redutoras apresentaram massa molecular em torno de 16 kDa, sugerindo serem homotetrâmeras. Elas apresentaram dependência de cátions bivalentes e afinidade para galactosídeos. De outra esponja, Haliclona cratera, foi isolada uma lectina de 29 kDa, dependente de íons metálicos sem pontes dissulfeto e com afinidade para galactose. Essa lectina apresentou atividade citotóxica sobre células tumorais HeLa (câncer cervical) e FemX (melanoma), e atividade mitogênica em linfócitos (PAJIC et al., 2002). Efeitos mitogênicos em leucócitos também foram observados para lectinas de esponjas de várias espécies como Pellina semitubulosa (ENGEL et al., 1992), Cinachyrella alloclada (ATTA et al., 1989) e Geodia cydonium (OPRIC et al., 1996).
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Purificação e caracterização de uma α-galactosidase em sementes de Tachigali multijuga e clonagem parcial do gene da estaquiose sintase de soja

Purificação e caracterização de uma α-galactosidase em sementes de Tachigali multijuga e clonagem parcial do gene da estaquiose sintase de soja

Os galactooligossacarídeos (GO) são carboidratos presentes em leguminosas. Eles exercem funções importantes como tolerância à dessecação e fonte de energia para a germinação. Em soja, a estaquiose é biossintetizada pela enzima estaquiose sintase (STS). Este açúcar está presente em altos níveis na semente, e é responsável por distúrbios gastrointestinais em humanos. Portanto, existe interesse em estudar o gene STS de soja visando futuras manipulações genéticas para a redução do conteúdo de estaquiose em sementes. Os objetivos deste trabalho foram: quantificar o conteúdo de estaquiose durante o enchimento do grão de soja; determinar a atividade de STS; isolar um fragmento do gene STS e verificar o seu padrão de expressão. Todas as análises foram realizadas com amostras de 8 estádios de desenvolvimento, divididos de acordo com a massa fresca do grão (1º: 75, 2º: 150, 3º: 225, 4º: 300, 5º: 375, 6º: 450, 7º: 525 mg e 8º: soja madura). A quantificação de estaquiose foi feita por HPLC. Em sementes maduras de soja, o conteúdo de estaquiose foi 4,10 % e a atividade específica da enzima STS foi 2,15 nkat/mg, usando galactinol e rafinose como substratos. Um fragmento do gene STS foi isolado por PCR a partir de cDNA de semente e primers degenerados. A clonagem de um fragmento de 983 pb no vetor pGEM-T Easy foi confirmada por seqüenciamento. O alinhamento deste fragmento, usando a ferramenta BLAST, mostrou que a seqüência clonada se refere ao gene STS, até então não isolado em soja. Os resultados demonstraram que o gene STS é expresso em todos os estádios de desenvolvimento do grão, além de folhas, caule e raiz. Este trabalho abre perspectivas para pesquisas biotecnológicas visando o desenvolvimento de variedades de soja mais adequadas para o consumo humano.
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Purificação e caracterização de uma nova lectina com atividade imunomoduladora da esponja Aplysina fulva

Purificação e caracterização de uma nova lectina com atividade imunomoduladora da esponja Aplysina fulva

As esponjas marinhas se apresentam como uma rica fonte de novos compostos bioativos de grande interesse biotecnológico, vimos, neste trabalho, relatar a purificação e caracterização de uma lectina da espécie Aplysina fulva, denominada AFL com atividade imunomoduladora, bem como avaliar se a mesma possue efeito citotóxico sobre células em cultura (normais, tumorais e leishmanias). As proteínas totais foram extraídas da esponja com tampão Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, e fracionadas por precipitação com acetona. A fração obtida com 1 volume de acetona possuía maior atividade hemaglutinante e foi submetida a uma cromatografia em matriz de goma guar com tampão tetraborato de sódio 20 mM, pH 7,5. Em seguida foi aplicada em uma coluna de Superdex 75 (FPLC-AKTA) contendo tampão Tris- HCl 20 mM, pH 7,5. A pureza da lectina foi atestada em uma coluna HILIC (HPLC). A sequência de 15 resíduos de aminoácidos do N-terminal da lectina foi determinada por degradação de Edman e não apresentou similaridade com nenhuma outra proteína dos bancos de dados mais conhecidos. A massa foi estabelecida em 62 kDa, por gel filtração em Superdex 75. Análise após tratamento com agentes redutores permitiu deduzir que AFL é uma proteína homotetramérica. Sua atividade hemaglutinante foi reduzida quando a lectina foi exposta em meio ácido (pH < 4) ou quando submetida a temperaturas acima de 60 ºC. AFL apresentou especificidade para lactose e parcial para D-glicose e D-galactose. A lectina purificada AFL não apresentou efeito citotóxico para as linhagens de células cancerígenas (PANC, HeLa, HT-29, Bf16F10, A549) e de fibroblastos (MRC5). AFL foi capaz de aglutinar formas promastigotas vivas de Leishmania amazonensis e Leishmania. braziliensis,e teve sua atividade revertida pela adição de lactose ao ensaio. AFL não diminuiu de forma significante a viabilidade de Leishmania amazonensis. A lectina AFL apresentou atividade mitogênica em concentrações a partir de 40 µg/mL para célula mononucleares do sangue periférico (monócitos e linfócitos). A lectina AFL foi capaz de induzir na linhagem de macrófagos (RAW264.7) de murinos a liberação de TNF- α, mas não de IL-6, na concentração de 10,0 µg/mL. Quando AFL foi incubada com células esplênicas de camundongos BALB/c, foi capaz de estimular a produção de IFN-γ e promover a diferenciação de células T para uma resposta imune celular do tipo Th1. A capacidade de modular a resposta imune do tipo Th1 jamais foi relatada em lectinas de esponjas marinhas. Todos os resultados corroboram com o alto potencial que a lectina AFL apresenta como uma nova molécula capaz de modular o sistema imune, podendo ser utilizada como adjuvante de vacinas contra microrganismos, dentre eles, os do gênero leishmania.
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Purificação, caracterização e avaliação de atividade imunomoduladora de lectina de inflorescência de Alpinia purpurata

Purificação, caracterização e avaliação de atividade imunomoduladora de lectina de inflorescência de Alpinia purpurata

Alpinia purpurata é uma planta ornamental também conhecida como fonte de moléculas bioativas. Lectinas são proteínas capazes de se ligar a carboidratos e exercerem diversas atividades biológicas. O presente estudo descreve o isolamento de uma lectina extraída das inflorescências de A. purpurata (ApuL) e a avaliação de seu potencial imunomodulador. Proteínas foram extraídas da farinha das brácteas através de homogeneização (16 h, 4ºC) em NaCl 0,15 M. Após filtração e centrifugação, o extrato obtido foi tratado com sulfato de amônio (40% de saturação) durante 4 h a 28ºC. As frações de proteínas precipitadas (FP) e sobrenadante (FS) foram dialisadas e avaliadas quanto à concentração de proteínas e atividade hemaglutinante (AH). A fração com maior AH específica (FS) foi submetida à cromatografia de gel filtração em coluna de Sephadex G-75. Frações de 5 mL foram coletadas e avaliadas quanto a absorbância a 280 nm e AH. O primeiro pico obtido nessa cromatografia correspondeu à lectina, que foi caracterizada quanto à massa molecular nativa, composição em subunidades, especificidade de ligação a carboidratos e estabilidade da AH frente a variações de temperatura e pH. A ação imunomoduladora foi avaliada investigando a produção de citocinas e liberação de óxido nítrico por células mononucleares de sangue periférico humano incubadas ou não com a lectina (12,5 µg/mL). Além disso, a diferenciação e ativação de linfócitos foram avaliadas por ensaios de imunofenotipagem. ApuL é uma proteína acídica, com massa molecular nativa de 34 kDa, e oligomérica (formada por subunidades de 7,4 kDa). AH da lectina foi inibida pelas glicoproteínas fetuína e ovoalbumina; resistente ao aquecimento a 100 °C por 20 min; estimulada na presença de íons cálcio e magnésio; e maior em pH 7,5. ApuL induziu as células de sangue periférico a liberarem citocinas pertencentes aos perfis Th1 (IFN-γ, TNF-α e IL-6) e Th17 (IL- 17A), bem como óxido nítrico, estimulando um ambiente pró-inflamatório. Além disso, ApuL estimulou a produção de IL-10, uma citocina anti-inflamatória com papel regulador. A incubação com a lectina promoveu diferenciação e ativação dos subconjuntos de linfócitos T CD8+ e CD4+, como evidenciado pela maior expressão da molécula CD28. Em conclusão, a inflorescência de A. purpurata é fonte de uma lectina com ação imunomoduladora e potencial aplicação biomédica, o que adiciona valor biotecnológico a esta planta ornamental.
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Clonagem,  e caracterização parcial dos genes relacionados à lectina de Vatairea macrocarpa

Clonagem, e caracterização parcial dos genes relacionados à lectina de Vatairea macrocarpa

As isolectinas de PHA também representam uma família de cinco proteínas tetraméricas com variedade nas proporções de duas classes de subunidades, E e L. Eles diferem em carboidrato e especificidade celular., tanto quanto nas suas propriedades biológicas: E4 (E-PHA) é uma potente hemaglutinina, L4 (L-PHA) tem uma atividade leucoaglutinina e tem efeito mitogênico; as formas intermediárias (E1L3, E2L2 ou E3L) possuem níveis inferiores das atividades citadas. Misturas similares de isoformas são encontradas nas sementes de Vicia villosa e na casca de Maackia amurensis, Robinia pseudoacacia e Sophora japonica (VAN DAMME, PEUMANS, et al., 1998). Nas sementes de Datura stramonium três isolectinas estão presente, duas das quais são homodímeros, compostas também de subunidades A ou B, enquanto que a terceira é um heterodímero abrangendo ambas subunidades. Os dois tipos de lectinas (toxina e aglutinina) encontradas, entre outras, em sementes de Ricinus communis e de Abrus precatorius podem ser consideradas como um caso especial de isolectinas (SHARON e LIS, 2003).
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Purificação Parcial e Caracterização da Apirase Salivar de Rhodnius prolixus

Purificação Parcial e Caracterização da Apirase Salivar de Rhodnius prolixus

A apirase salivar dos insetos hematófagos interfere na sinalização plaquetária clivando o ADP, importante agonista da ativação e agregação de plaquetas. A purificação da apirase de R. prolixus, objetivo deste trabalho, foi o primeiro passo para a caracterização desta enzima e conhecimento de suas potenciais propriedades farmacológicas e biotecnológicas. Com o procedimento de duas etapas adotado para a purificação nesse estudo, cromatografia de exclusão molecular seguida por cromatografia de afinidade, foi possível obter a purificação parcial da apirase salivar de R. prolixus. A partir desta purificação foi possível observar que a apirase é uma proteína estável, pois a atividade em gel se manteve até 72h depois da eletroforese nas condições do protocolo utilizado. Testes em placa demonstraram a ausência de atividade na presença de íons magnésio, cobalto, zinco e cobre (dados não mostrados).
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