Bu çalışmada, Nicotiana benthamiana bitkisinde ilk kez transient ekspresyon sistemini kullanarak kuduz virüsünün kesik bir glikoprotein (G proteini) varyantının monomerik (RG2) ve trimerik (RG3) formlarını tasarladık ve ürettik. Kuduz, yaklaşık 100 ülkede görülen ve insanlar dahil birçok memeliyi etkileyen viral bir zoonozdur (Dietzschold ve ark. 2005). İnsan kullanımı için mevcut olan kuduz insan diploid hücre aşısı, 1967'den beri kullanılan etkisizleştirilmiş bir aşı türüdür ve Pitman-Moore virüsü L503 soyundan türetilen zayıflatılmış bir aşı türüdür (Fletcher ve diğerleri, 1998).
Kuduz virüsünün tek sarmallı RNA genomu, glikoprotein (G), fosfoprotein (P), nükleoprotein (N), matris proteini (M) ve RNA'ya bağımlı enzim RNA polimeraz (L) dahil olmak üzere beş viral yapısal proteini kodlar (Macfarlan et al. .al.. 1986). Virüs nötralize edici antikorların ana hedefi olduğu gösterilen RABV glikoprotein G, RABV'nin yüzeyinde bir homotrimer formu toplar ve bir bağışıklık tepkisi ortaya çıkarır (Gaudin ve ark. 1992). G proteininin, tek bir aşı dozundan sonra bile köpeklerde, kedilerde ve farelerde yüksek titrelerde RABV nötralize edici antikorları indüklemek için yeterli olduğu bildirilmiştir (Yang ve diğerleri 2014; Koraka ve diğerleri 2014).
Şu anda insanlar ve hayvanlar için mevcut olan kuduz aşıları, virüsün etkili bir şekilde kontrol edilmesini sağlar, ancak bunlar ve bazıları, özellikle inaktive edilmiş aşılar, nispeten zayıf immünojenikliğe sahiptir (McGettigan ve ark. 2014; Huang ve ark. 2015). Geçici bitki gen ekspresyonu, özellikle ekspresyonu zor proteinlerin üretimi için alternatif bir ekspresyon sistemi haline gelmiştir (Klimyuk ve ark. 2014; Margolin ve ark. 2020a; Mamedov ve ark. 2019a, 2019b, 2021a, 2021b). ERA kuduz virüsü G proteininin daha önce transgenik bitkilerde üretildiğine dikkat edilmelidir (McGarvey ve diğerleri 1995; Loza-Rubio ve diğerleri 2012), ancak G proteininin ekspresyon seviyesi çok düşüktür.
Oral aşılamadan sonra mısır bitkisinde üretilen rekombinant kuduz virüsü G proteini, koyunlarda koruyucu bir bağışıklık tepkisi oluşturdu (Loza-Rubio ve ark. 2012).
KAYNAK TARAMASI
- Kuduz
- Kuduz aşıları
- Bitkilerde Ekspresyon Stratejileri
- Parçacık bombardımanı
- Agroinfiltrasyon
- N-bağlı glikosilasyon ve deglikosilasyon
Afrika ve Asya'da, mevcut temas sonrası profilaksi seviyeleri her yıl yaklaşık 272.000 ölümü önlemektedir (Knobel ve ark. 2005). Geçici ekspresyon hızlıdır ve protein ekspresyonu ile ilgili sonuçlar günler içinde elde edilebilir (Kapila ve ark. 1996). Agroinfiltrasyon, parçacık bombardımanından daha fazla hücreyi hedefler ve ilgilenilen gen, bakteriyel proteinler tarafından aktif olarak çekirdeğe taşınır (Kapila ve ark. 1996).
Whisker transformasyonu, elektroporasyon ve protoplast transformasyonu gibi diğer yöntemler şimdiye kadar moleküler tarım uygulamalarında kullanılmamıştır (Ma ve ark. 2003). Parçacık bombardımanı, altın parçacıkları gibi mikrokürelerin uygun DNA ile kaplanarak hızla bitki dokularına çarparak doku hücrelerine girdiği bir yöntemdir (Ma ve ark. 2003). Agroinfiltrasyon ayrıca monokotlar için de kullanılabilir, ancak teknoloji çoğunlukla seçilen örnek çeşitler için optimize edilmiştir (Ma ve ark. 2003).
Sızma için ilgili gen, uygun Agrobacterium suşlarına dönüştürülür ve bir bakteri süspansiyonu yoluyla yapraklara enjekte edilir (An, 1985; Kapila ve diğerleri, 1996). Ek olarak, agroinfiltrasyon düşük bir transgen susturma insidansına sahiptir ve hatta uzun T-DNA uzantılarını (> 150 kb) tolere edebilir (Veluthambi ve ark. 2003). Bu ifade stratejisi kullanılarak, insan Furin, faktör IX, heptamerize edilmiş Bacillus anthracis PA63 formu (Mamedov ve ark. 2019a), Plasmodium falciparum'un tam uzunluktaki Pfs48/45 proteini (Mamedov ve ark. 2019b), insan immün yetmezlik virüsü ( HIV) ve gp140 (Margolin ve ark. 2020b), SARS-CoV-2 Spike protein reseptör bağlanma alanları (RBD) (Mamedov ve ark. 2021a, 2021b) ve diğer fonksiyonel olarak aktif monoklonal gibi ifade edilmesi zor birçok protein antikorlar (Klimyuk ve ark. 2014) N'nin kompleks proteinleri.
Bu aşamada, Plasmodium falciparum'un (Milek ve ark. 1998) Pfs48/45 proteini veya koruyucu antijeni (PA), N-bağlı glikanları taşımaz (Milek ve ark. 1998; Frank ve ark. 2008), ancak yine de bitki sisteminde eksprese edilen proteinler, anormal şekilde glikosile olabilen potansiyel N-bağlı glikosilasyon bölgeleri içerir. Bunlardan biri, N-glikozilasyonu bloke etmek için asetilglukosamin fosfatı (GlcNAc-1-P) dolikol fosfata (Dol-P) transfer eden enzimin spesifik bir inhibitörü olan tunikamisin kullanımıdır (Yoo ve ark. 2018).
PNGase F ile birlikte ifade edilerek üretilen deglikosile edilmiş proteinler, glikosile edilmiş muadillerine göre üstün fonksiyonel özellikler gösterse de (Mamedov ve ark. 2012), PNGase F ile in vivo veya in vitro deglikosilasyon, glikosilasyon bölgesinde (NXS/T) bir amino asit değişikliğine neden olur ) asparajinin aspartata deamidasyonundan kaynaklanır (Mamedov ve ark. 2012; HaÈgglund ve ark. 2014). Bu sorun, hedef proteinler PNGase F (Mamedov ve diğerleri 2012) veya Endo H (Mamedov ve diğerleri 2017) ile in vivo deglikosilasyon teknolojisi geliştirilerek çözüldü. Endo-H-deglikosilasyon stratejisi, reseptör bağlanma bölgesi olan Bacillus anthracis'ten (Mamedov ve ark. SARS-CoV-2 virüsünün Spike proteininin (Mamedov ve diğerleri, 2021a, 2021b) ve insan ACE2 enzimi (Mamedov ve diğerleri 2021c) gibi kompleks proteinlerin fonksiyonel olarak aktif glikosile edilmiş formlarının üretimi için.
MATERYAL VE METOT
- Tamponlar ve Süspansiyonlar
- Western blot ve SDS –PAGE tamponları
- Bakteri Büyümeleri ve Ortamları
- Protein Saflaştırma (His-tag) Tamponları
- Elisa Tamponları
- G proteininin farklı varyantlarının mühendisliği, optimizasyonu ve klonlanması
- Klonlanmış G protein genleri içeren bitki ifade plazmidlerinin Agrobacterium
- N. Benthamiana’da bitki bazlı rekombinant G protein varyantlarının ekspresyon
- SDS-PAGE ve Western Blot Analizi
- RG2’nin PNGase F ve Endo H ile birlikte ifade edilmesi
- N. Benthamiana bitkisinden üretilen RG2 ve RG3 proteininin saflaştırılması
- Farelerde bitki tarafından üretilen RG2 ve RG3 proteininin immünojenisite
- Enzim Bağlı İmmünosorbent Testi (ELISA)
RABV'nin G protein geni (ERA suşu, GenBank: J02293.1), N. benthamiana kodonları kullanılarak kodon optimize edildi, His6 etiketi ve ER tutma peptidi, C terminalinde KDEL ve PR-la sinyali ile de novo ifade edildi.Üç G varyantı pEAQ-RG1-His6-KDEL, pEAQ-RG2-His6-KDEL ve pEAQ-RG3-His6-KDEL'i üretmek için bitki ekspresyon vektörü pEAQ'ya (Sainsbury ve diğerleri 2009) klonlandı. Yaprak örnekleri, daha önce tarif edildiği gibi pEAQ-RG1-His6-KDEL, pEAQ-RG2-His6-KDEL veya pEAQ-RG3-His6-KDEL plazmitleri ile sızdı.
Yaprak numuneleri 5 dpi'de (sızmadan sonraki gün) toplandı ve ardından 1X fosfat özütleme tamponunda öğütüldü. 100 °C'de 5 dakika inkübe edildi ve ardından numuneler SDS-PAGE üzerinde çalıştırıldı ve Western blot analizi için hidrofobik bir poliviniliden florid (PVDF) membrana aktarıldı. Primer antikor olarak anti-His-tag antikoru (Kat. No. 652502, BioLegend) ve HRP-konjuge keçi anti-fare IgG antikoru (Kat. No. 405306, BioLegend) kullanılarak membran üzerinde bitki üretimi rekombinant RG1, RG2 ve RG3 proteinleri , ABD) sekonder antikor olarak. görüntülendi.
Yıkama sonrası jel Comassie boyama tamponu ile 1 saat boyandı ve boyama tamponu ile 15-20 dakika aralıklarla boyandı. Proteinler, transfer tamponu kullanılarak zara aktarıldıktan sonra, anti-His6 etiketli monoklonal antikor ile işlenmiş zar bloke edici tampon (%0.5 I-Block in 1xTBS (Applied Biosystems, Carlsbad, CA)) ile oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edildi. (Kat. No. 652502, BioLegend).
Membranlar daha sonra 3 kez 5 dakika süreyle %0.5 I-Blok ile 5 dakika süreyle yıkandı ve ardından HRP-konjuge sekonder antikor (Kat. No., Abcam) ile işlendi. Ertesi gün kuyucuklar bloke edildikten sonra farklı serum dilüsyonları kuyucuklara aktarıldı ve plak oda sıcaklığında 2 saat inkübe edildi. Serum numunelerindeki anti-RG2 ve anti-RG3 antikor seviyeleri, daha önce tarif edildiği gibi enzime bağlı immünosorbent deneyi (ELISA) ile belirlendi (Miura ve ark. 2008).
Damıtılmış su içinde 15 mM sodyum karbonat ve 35 mM sodyum bikarbonat içeren kaplama tamponu, oda sıcaklığında (RT) saklandı. Gerektiğinde PBS içinde %0,1 Tween-20 içinde %5 (w/v) süt tozu içeren bloke edici tampon + 4°C'de saklandı. Hedef proteinlerle kaplı plakalar, 200 ul/oyuk yıkama tamponu ile 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 3 kopya halinde yıkandı. Yıkamadan sonra, 0.4 mg/ml'lik bir OPD konsantrasyonuna sahip substrat tablet(ler), %30 hidrojen peroksit, pH 5.0 içeren 0.05 M fosfat-sitrat tamponuna ilave edildi ve karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edildi.
BULGULAR VE TARTIŞMA
- G proteininin farklı varyantlarının mühendisliği, optimizasyon ve klonlanması
- N. Benthamiana bitkilerinde RG2’nin ifade edilmesi ve ekspresyon tayini
- N. Benthamiana bitkisinde deglikosile RG2 protein formlarının üretimi
- N. Benthamiana bitkilerinden rekombinant RG2’nin saflaştırılması
- N. Benthamiana bitkilerinde RG3’nin ekspresyonu ve ekspresyon onayı
- N. Benthamiana bitkilerinden rekombinant RG3 proteininin saflaştırılması
- RG2 ve RG3 proteininin bitki infiltrasyonu, saflaştırılması ve protein miktar
- RG2 proteininin farelerde immunojenisite çalışmaları
- RG3 proteininin farelerde immunojenisite çalışmaları
RG2 proteininin deglikosile edici enzimler PNGase F (dP) veya Endo H (dE) ile birlikte ifadesinin Western blot analizi. Bitki tarafından üretilen ve Endo H enzimi ile deglikosile edilen PA83 proteini (Mamedov ve ark. 2017) 25 ng ve 100 ng olarak yüklenmiş ve standart protein olarak kullanılmıştır. RG3 proteininin kısmen saflaştırılmış, toplanmış ve konsantre fraksiyonunun Western blot analizi, Şekil 4.9'da gösterilmektedir.
RG2 ve RG3 proteinlerinin saflaştırılması için, bitkide üretilen RG2 ve RG3 proteinleri, bir Ni-reçine kolonu kullanılarak saflaştırıldı. RG2 ve RG3 proteinleri yeterince saf olmadığından, immünojenisite çalışmalarında kullanılmak üzere protein miktarını belirlemek için RG2 ve RG3 proteinlerinin Western blot analizi yapıldı (Şekil 4.10). Numuneler 42. günde (aşılama sonrası) toplandı ve bir IgG ELISA ile anti-RG2 antikor tepkileri açısından değerlendirildi.ELISA sonucuna göre, farelerde bitki tarafından üretilen RG2 antijeni tarafından indüklenen IgG tepkilerinin, önemli ölçüde indükleyebildiğini gösterdi. farelerde şap adjuvanı ile daha yüksek antikor titreleri (Şekil 4.11).
Fareler, 0 ve 21. çalışma günlerinde 5 ug (şap ile birlikte) bitki kaynaklı RG2 proteini ile IM olarak aşılanmıştır. Bitki kaynaklı RG3 proteini ile aşılanmış farelerin serumlarında üretilen anti-RG3 antikor tepkisi, ELISA ile değerlendirilmiştir. Bitki tarafından üretilen antijen RG3 tarafından indüklenen IgG tepkileri, bunun önemli ölçüde daha yüksek antikor titrelerini indükleyebileceğini gösterdi (Şekil 4.12).
Bir adjuvan olarak Alhidrojel kullanılarak bitki kaynaklı RG3 proteini ile aşılanmış farelerde ortaya çıkan IgG tepkileri. Fare serumundaki IgG titreleri, bitki tarafından üretilen RG2 proteinine özgü farklı dilüsyonlarla ELISA ile belirlendi.
SONUÇLAR
KAYNAKLAR
Construction and immunogenicity of a recombinant pseudotype baculovirus expressing the glycoprotein of rabies virus in mice. Production of recombinant antigens and antibodies in Nicotiana benthamiana using 'scale-up' technology: GMP-compliant facilities for small- and large-scale manufacturing. Induction of a protective immune response against rabies virus in sheep after oral immunization with transgenic maize, expressing the rabies virus glycoprotein.
Stimulation of cytotoxic T-lymphocyte responses by rabies virus glycoprotein and identification of an immunodominant domain. Production of non-glycosylated recombinant proteins in Nicotiana benthamiana plants by co-expression of bacterial PNGase F. Production of functionally active and immunogenic non-glycosylated protective antigen from Bacillus anthracis in Nicotiana benthamiana by co-expression with peptide-glycosidase F (PNGase F ) of Flavobacterium meningosepticum.
In vivo production of non-glycosylated recombinant proteins in Nicotiana benthamiana plants by co-expression with Endo-β-N-acetylglucosaminidase H (Endo H) of Streptomyces plicatus. Plant-produced in vivo full-length deglycosylated Pfs48/45 as a transmission-blocking malaria vaccine candidate. Production and characterization of nucleocapsid and RBD cocktail antigens of SARS-CoV-2 in the plant Nicotiana benthamiana as a candidate vaccine against COVID-19.
Soluble human angiotensin-converting enzyme 2 as a potential therapeutic tool for COVID-19 is produced at high levels in Nicotiana benthamiana plant with potent anti-SARS-CoV-2 activity. Coexpression of human calreticulin significantly enhances the production of HIV gp140 and other viral glycoproteins in plants. Safety and serological response to a matrix gene-deleted rabies virus-based vaccine vector in dogs.
Poly(lactide-co-glycolide) microspheres: a potent oral delivery system to elicit systemic immune response against inactivated rabies virus. 2011. Expression and solubilization of insect cell-based rabies virus glycoprotein and assessment of its immunogenicity and protective efficacy in mice. Rabies virus glycoprotein with a consensus amino acid sequence and a lysosome targeting signal causes efficient production of antibodies in DNA-immunized mice.
