Índice Leydigossomático (ILS)

A fim de se quantificar o investimento em células de Leydig, em relação à massa corporal, foi calculado o índice Leydigossomático (ILS), utilizando-se a fórmula:

ILS= volume total de célula de Leydig por parênquima testicular/PC*100 PC= peso corporal.

3. Análise estatística

Os dados estão apresentados na forma de média  desvio padrão da média. Para análise dos resultados foi utilizada a Análise de Variância (ANOVA) seguida do Teste de Student-Newman-Keuls (SNK), quando foi comprovada a distribuição normal e homogeneidade dos dados, utilizando-se o programa Statistica (ANOVA/ MANOVA). Significância estatística estabelecida para p > 0,05.

4. RESULTADOS

Não houve diferença significativa entre os valores das biometrias corporais, testiculares e IGS (Tabela 1) dos morcegos tratados durante todo o período experimental (p>0,05).

Tabela 1. Média e desvio padrão dos pesos (g) corporais (PC), testiculares (PTT) e índice gonadossomático (IGS) (%) de Artibeus lituratus em animais do grupo controle (GC), tratados com espalhante adesivo 0,015 g/L (GES), endossulfam 1,05 g/L (GE I) e endossulfam 2,1 g/L (GE II).

GC GES GE I GE II

PC 75,30 ± 4,26a 70,11 ±10,79a 68,62 ±7,83a 76,07 ±8,98a PTT 0,21 ± 0,05a 0,23±0,12a 0,20±0,04a 0,22 ±0,07a

IGS 0,27 ±0,07a 0,33±0,17a 0,29±0,04a 0,24±0,14a Letras diferentes na mesma linha estatisticamente diferentes.

Na Tabela 2 encontram-se os valores referentes aos pesos da albugínea e do parênquima testicular, assim como o percentual ocupado pela albugínea. Houve

aumento do peso da albugínea nos animais do grupo tratados com a maior concentração (GEII) com relação ao controle e GES. Não houve variação no peso do parênquima testicular e do percentual ocupado pela albugínea nos testículos.

Tabela 2. Pesos (g) da albugínea (PA), do parênquima testicular total (PPT) e percentual de albugínea (A) dos testículos de Artibeus lituratus em animais do grupo controle (GC), tratados com espalhante adesivo 0,015 g/L (GES), endossulfam 1,05 g/L (GE I) e endossulfam 2,1 g/L (GE II).

GC GES GE I GE II

PA 0,0046±0,0012b 0,0050±0,0013b 0,0058±0,0015ab 0,0073±0,0013a

PPT 0,21±0,05a 0,23±0,12a 0,20±0,04a 0,22±0,07a

A 4,86±1,63a 5,14±1,89a 5,91±1,62a 7,21±2,08a

Letras diferentes na mesma linha estatisticamente diferentes.

Não houve alterações morfológicas nos componentes tubulares do testículo de A. lituratus (Figura 2).

Também não foram encontradas diferenças nas proporções volumétricas (%) e no volume (mL) dos componentes do parênquima testicular bem como no índice tubulossomático conforme pode ser observado na Tabela 3.

Figura 2: Secções transversais testiculares de Artibeus lituratus, controle e tratados com espalhante e endossulfam. A: Grupo controle (GC); B: Grupo espalhante (GES); C: Grupo endossulfam I (GEI); D: Grupo endossulfam II (GEII). CT: Compartimento tubular; L: lúmen; I: Intertubulo; : Células de Sertoli; ↓ : Túnica própria. Azul de toluidina - borato de sódio. Barra: 50µm.

Tabela 3. Proporção volumétrica e volumetria entre os componentes do parênquima testicular, em animais do grupo controle (GC), tratados com espalhante adesivo 0,015 g/L (GES), endossulfam 1,05 g/L (GE I) e endossulfam 2,1 g/L (GE II).

GC GES GE I GE II TS (%) 87,61±2,33a 86,86±21,46a 90,16±21,97a 88,09±22,05a INT (%) 12,39±2,33a 13,14±4,12a 9,84±4,41 a 11,91±4,33a VTS (mL) 0,17±0,05a 0,19±0,09a 0,17±0,07a 0,38±0,22a VINT (mL) 0,024±0,010a 0,028±0,013a 0,018±0,012a 0,039±0,017a ITS (%) 0,23±0,06a 0,28±0,15a 0,25±0,05a 0,49±0,54a

Letras diferentes na mesma linha estatisticamente diferentes. TS: porcentagem de túbulos seminíferos; INT: porcentagem de Intertúbulo; VTTS: Volume total dos túbulos seminíferos; VINT: Volume total do intertúbulo; ITS: índice tubulossomático.

Os percentuais ocupados pelos elementos do compartimento tubular encontram- se na Tabela 4. Não foram encontrados resultados significativos quanto ao percentual representado pelo lúmen tubular, epitélio seminífero e túnica própria.

Tabela 4. Percentuais do compartimento tubular representados por lúmen (L), epitélio seminífero (ES) e túnica própria (TP) dos testículos de Artibeus lituratus em animais do grupo controle (GC), tratados com espalhante adesivo 0,015 g/L (GES), endossulfam 1,05 g/L (GE I) e endossulfam 2,1 g/L (GE II).

GC GES GE I GE II

L 9,56± 1,67a 9,58±2,74a 9,64±2,74a 9,36±2,70a ES 73,71±3,12a 74,35±17,98a 76,86±18,56a 74,77±18,66a TP 4,34±0,68a 3,36±1,32a 3,65±1,20a 3,96±1,14a

Letras diferentes na mesma linha estatisticamente diferentes.

Os resultados obtidos para proporção dos túbulos seminíferos, altura do epitélio seminífero, comprimento dos túbulos seminíferos por testículo e por grama de testículo e o comprimento total dos túbulos seminíferos não apresentaram diferenças estatísticas como pode ser observado na Tabela 5.

Tabela 5. Diâmetro tubular (DT), altura do epitélio seminífero (AES), comprimento dos túbulos seminíferos por testículo (CTST), por grama de testículo (CTSGT) e comprimento total dos túbulos seminíferos (CTTS) de testículos de Artibeus lituratus em animais do grupo controle (GC), tratados com espalhante adesivo 0,015 g/L (GES), endossulfam 1,05 g/L (GE I) e endossulfam 2,1 g/L (GE II).

GC GES GE I GE II DT (µm) 162,72±21,44a 153,77±37,47a 148,85±38,27a 160,92±40,44a AES (µm) 60,75±6,09a 56,25±14,02a 53,69±14,23a 57,83±14,82a CTST (m) 16,21±1,07a 20,17±8,24a 19,61±7,24a 41,24±25,54a CTSGT (m) 41,78±10,44a 89,52±78,54a 51,10±64,14a 44,27±56,01a CTTS (%) 8,11±0,54a 10,08±4,12a 9,80±3,62a 20,62±12,77a

Letras diferentes na mesma linha estatisticamente diferentes.

As médias das proporções volumétricas (%) e o volume (ml) dos componentes do parênquima testicular estão registrados na Tabela 6. O percentual ocupado pelo

compartimento intertubular no parênquima testicular e os volumes do intertúbulo e dos túbulos seminíferos não apresentaram alterações significativas.

Tabela 6. Proporções volumétricas (%) entre túbulos seminíferos (TS) e intertúbulo (INT) e volume (mL) dos túbulos seminíferos (VTTS) e do intertúbulo (VTI) nos testículos de Artibeus lituratus, em animais do grupo controle (GC), tratados com espalhante adesivo 0,015 g/L (GES), endossulfam 1,05 g/L (GE I) e endossulfam 2,1 g/L (GE II). GC GES GE I GE II TS (%) 87,61±2,33a 86,86±21,46a 90,16±21,97a 88,09±22,05a INT (%) 12,39±2,33a 13,14±4,12a 9,84±4,41a 11,91±4,33a VTTS (mL) 0,17±0,05a 0,19±0,09a 0,17±0,07a 0,38±0,22a VTI (mL) 0,02±0,01a 0,03±0,01a 0,02±0,01a 0,04±0,02a Letras diferentes na mesma linha estatisticamente diferentes.

Não houve alterações morfológicas nos componentes intertubulares do testículo de A. lituratus (Figura 2).

Na Tabela 7 encontram-se os percentuais ocupados pelos elementos constituintes do compartimento intertubular. Não foram observadas diferenças entre os grupos para os percentuais de vaso sanguíneo e tecido conjuntivo. Porém, os animais do GES e GEI apresentaram menor percentual de célula de Leydig em relação aos animais dos grupos GC e GEII. Foram observadas também diferenças no espaço linfático, que se apresentou maior em todos os tratamentos se comparado ao GC.

Figura 3: Secções transversais testiculares de Artibeus lituratus, controle e tratados com espalhante e endossulfam. A: Grupo Controle (GC); B: Grupo espalhante (GES); C: Grupo endossulfam I (GEI); D: Grupo endossulfam II (GEII).T: túbulo seminífero; I: intertúbulo; VS: vaso sanguíneo; CL: células de Leydig; C: citoplasma de célula de Leydig; * espaço linfático; ↓: tecido conjuntivo. Azul de toluidina - borato de sódio. Barra: 20µm.

Tabela 7. Percentual de célula de Leydig (CL), vasos sanguíneos (VS), espaço linfático (EL) e tecido conjuntivo (TC) no compartimento intertubular dos testículos de Artibeus lituratus em animais do grupo controle (GC), tratados com espalhante adesivo 0,015 g/L (GES), endossulfam 1,05 g/L (GE I) e endossulfam 2,1 g/L (GE II).

GC GES GE I GE II

CL (%) 88,21±14,15b 70,04±21,4a 77,43±20,54a 85,22±20,84b VS (%) 1,22±0,27a 1,32±0,48a 1,63±0,85a 2,02±0,90a EL (%) 4,76±2,01b 20,88±9,42a 11,48±6,06a 8,31±4,54a TC (%) 5,81±1,65a 7,76±2,29a 9,46±2,79a 4,45±2,70a

Letras diferentes na mesma linha estatisticamente diferentes.

Na Tabela 8 são apresentados os percentuais dos elementos do intertúbulo com relação ao testículo. Os percentuais ocupados por células de Leydig, vasos sanguíneos e

tecido conjuntivo não apresentaram resultados significativos. Porém, o espaço linfático aumentou no grupo GES.

Tabela 8. Percentual de célula de Leydig (CL), vasos sanguíneos (VS), espaço linfático (EL), tecido conjuntivo (TC) e de intertúbulo (INT) no testículo de Artibeus lituratus em animais do grupo controle (GC), tratados com espalhante adesivo 0,015 g/L (GES), endossulfam 1,05 g/L (GE I) e endossulfam 2,1 g/L (GE II).

GC GES GE I GE II

CL (%) 10,93±2,27a 9,14±3,12a 7,62±3,36a 10,15±3,42a VS (%) 0,15±0,07a 0,17±0,08a 0,16±0,05a 0,24±0,09a EL (%) 0,59±0,07b 2,72±0,42a 1,13±0,06b 0,99±0,04b TC (%) 0,72±0,25a 1,01±0,39a 0,92±0,29a 0,53±0,31a Letras diferentes na mesma linha estatisticamente diferentes.

Os resultados referentes ao volume médio dos elementos do intertúbulo por parênquima testicular estão demonstrados na (Tabela 9). O volume das células de Leydig, vasos sanguíneos e tecido conjuntivo não sofreram variações significativas quando foram comparados com o GC. Porém, o volume médio do espaço linfático apresentou diferença estatística entre os grupos, sendo maior no GES quando comparado com GC, GE I e GE II.

Tabela 9. Valor médio do volume total (mL) das células de Leydig (CL), vaso sanguíneo (VS), espaço linfático (EL), tecido conjuntivo (TC) e de intertúbulo (INT) dos elementos do compartimento intertubular por parênquima testicular de Artibeus lituratus em animais do grupo controle (GC), tratados com espalhante adesivo 0,015 g/L (GES), endossulfam 1,05 g/L (GE I) e endossulfam 2,1 g/L (GE II).

GC GES GE I GE II

CL (mL) 0,0219± 0,0094a 0,0205±0,0108a 0,0142±0,0097a 0,0341±0,0150a VS (mL) 0,0004±0,0001a 0,0003±0,0001a 0,0003±0,0001a 0,0010±0,0004a EL (mL) 0,0012±0,0007b 0,0056±0,0021a 0,0022±0,0016b 0,0029±0,0014b TC (mL) 0,0014±0,0006a 0,0022±0,0010a 0,0016±0,0010a 0,0019±0,0012a

Letras diferentes na mesma linha estatisticamente diferentes.

Na Tabela 10 encontram-se as médias da morfometria das células de Leydig. Não houve alteração significativa no diâmetro do núcleo das células de Leydig, no volume nuclear e no volume de uma célula de Leydig. No entanto, o percentual nuclear

apresentou aumento nos grupos tratados, quando foi comparado com o GC. Por outro lado, o percentual representado pelo citoplasma foi menor nos grupos que receberam tratamentos. O volume do citoplasma da célula de Leydig reduziu no grupo GEII comparado aos outros grupos.

Tabela 10. Morfometria das células de Leydig: diâmetro nuclear (DNCL), percentuais (%) de núcleo (NCL) e citoplasma de CL (CCL), volumes (mL) de núcleo (VNCL) e citoplasma (VCCL) de CL e volume (mL) de CL (VCL) nos testículo de Artibeus lituratus em animais do grupo controle (GC), tratados com espalhante adesivo 0,015 g/L (GES), endossulfam 1,05 g/L (GE I) e endossulfam 2,1 g/L (GE II).

GC GES GE I GE II DNCL (µm) 6,11±0,35a 6,14±0,63a 5,97±0,46a 5,82±0,31a NCL (%) 22,43± 3,89b 31,07± 4,34a 28,92±2,08a 34,76±6,07a CCL (%) 77,57± 3,89b 68,93±5,28a 71,08± 4,18a 65,24±3,17a VNCL (μm3 ) 120,59±20,74a 124,78±38,67a 112,84±26,11a 104,07±16,53a VCCL (μm3) 433,63±155,60a 304,18±169,90ab 286,64±100,46ab 209,55±85,32b VCL (μm3) 560,22±173,41a 428,96±208,63a 399,47±124,15a 313,62±96,79a

Letras diferentes na mesma linha estatisticamente diferentes.

O número total de células de Leydig por testículo, por grama de testículo e o ILS (Tabela 11), não apresentaram diferenças significativas entre os tratamentos com endossulfam.

Tabela 11. Número total de células de Leydig (NTL), número de CL por grama de testículo (NGT) e índice leydigossomático (ILS) em Artibeus lituratus em animais do grupo controle (GC), tratados com espalhante adesivo 0,015 g/L (GES), endossulfam 1,05 g/L (GE I) e endossulfam 2,1 g/L (GE II).

GC GES GE I GE II

NTL (%) 4,3x107±2,5x107a 4,8x107±2,3x107a 3,9x107±2,2x107a 1,2x108±9,9x107a

NGT (%) 2,1x108±7,2x107a 2,4x108±7,6x107a 2,1x108±1,5x108a 3,6x108±2,0x108a

ILS (%) 0,03±0,01a 0,02±0,01a 0,01±0,01a 0,03±0,01a Letras diferentes na mesma linha estatisticamente diferentes.

5. DISCUSSÃO

Estudos relacionando à ação do inseticida organoclorado endossulfam sobre a biologia reprodutiva em machos são conhecidos somente em animais de laboratório (Edwards et al., 1984), e estão relacionados principalmente à produção de andrógenos (Singh & Pandey, 1990; Chitra et al., 1999). Portanto, torna-se necessário a realização de estudos experimentais para avaliar e identificar as possíveis consequências decorrentes da exposição aos agroquímicos, no que se refere a seus efeitos no sistema reprodutor masculino de animais silvestres, expostos a compostos organoclorados como o endossulfam. Não foram encontrados na literatura trabalhos que tenham avaliado os parâmetros morfométricos tubulares após exposição ao endossulfam em testículo de morcegos no tocante a este parâmetro.

O peso corporal médio dos morcegos neste trabalho (76 g) corrobora o encontrado por Miranda (2012) (77 g) quando tratou A. Lituratus com mancozeb (2 g/L) e tebuconazol (1 mL/L), durante sete e/ou 30 dias consecutivamente, e também não registrou diferença entre os tratamentos.

O endossulfam não interferiu no peso testicular, que é diretamente relacionado com a produção espermática segundo França & Russell (1998). Morcegos da mesma espécie que receberam com mancozeb (2g/L) e tebuconazol (1mL/L) (Miranda, 2102), também não mostraram diferença nesse parâmetro. As mesmas considerações podem ser aplicadas com relação ao IGS, ao peso do parênquima testicular e à proporção de albugínea, que não sofreram alterações com a aplicação de endossulfam (neste trabalho), e de mancozeb e tebuconazol (Miranda, 2012). Porém, ratos submetidos à ação do tebuconazol na concentração de 175 mg/kg/dia apresentaram redução no peso testicular (Joshi & Gulati, 2005).

O aumento da albugínea testicular observado neste trabalho não foi visto por em A. lituratus que receberam mancozeb e tebuconazol (Miranda, 2012). Johnson et al., (1981) descreveram que a albugínea compõe a morfofisiologia do testículo, embora não participe diretamente da função espermatogênica ou androgênica. Assim, entende-se que, apesar de aumentada, a albugínea não interferiu no funcionamento normal do testículo, mesmo porque o peso do parênquima testicular não mostrou alterações.

A proporção volumétrica dos componentes do parênquima testicular de mamíferos varia bastante entre as espécies, principalmente os percentuais referentes aos túbulos seminíferos e às células de Leydig (França & Russell, 1998). Os valores médios

referentes à túnica própria, ao epitélio seminífero e ao lumem e intertúbulo não variaram no presente trabalho. Porém, Miranda (2012), trabalhando com A. lituratus submetidos a dois tipos de fungicidas, observou redução da proporção volumétrica de túbulos seminíferos e aumento na proporção de intertúbulo, nos animais que receberam tebuconazol.

Os morcegos deste trabalho não apresentaram alterações na volumetria do parênquima testicular. Este achado corrobora aquele encontrado por Miranda (2012), utilizando a mesma espécie de morcegos que receberam tratamento com fungicidas. O índice tubulossomático, que depende do percentual de túbulos seminíferos, não sofreu variação neste trabalho. Porém, morcegos que receberam tebuconazol apresentaram redução do ITS (Miranda, 2012).

A ausência de alterações na morfometria tubular observada neste trabalho também foi registrada por Miranda (2012), trabalhando com a mesma espécie de morcego ofertando dois tipos de fungicida. Porém, esta autora observou redução no diâmetro tubular em animais que receberam tebuconazol. Pelo exposto, entendemos não ter havido prejuízo para o processo espermatogênico.

Animais tratados com endossulfam no presente trabalho não apresentaram variações nas proporções volumétricas e no volume de túbulos seminíferos e de intertúbulo. Porém, morcegos que receberam tebuconazol por 30 dias apresentaram redução no percentual de túbulos seminíferos e aumento no intertúbulo (Miranda, 2012). A ação do endossulfam não comprometeu os compartimentos testiculares de forma global, neste estudo.

As células de Leydig usualmente constituem os componentes mais abundantes do intertúbulo, e sua população varia de acordo com a espécie e idade. Tais células são responsáveis pela síntese de testosterona, manutenção da libido, do processo espermatogênico, funcionamento das glândulas acessórias e características sexuais secundárias (Payne et al., 1996). Neste trabalho houve redução do percentual de célula de Leydig, com relação ao intertúbulo, no grupo GEII. O aumento do espaço linfático em todos os tratamentos pode indicar maior fluxo de líquidos nesse local, podendo interferir na função parácrina do intertúbulo. Em A. lituratus que receberam tebuconazol, houve redução do espaço linfático, acompanhada de aumento nos vasos sanguíneos que, neste trabalho não demonstraram alterações (Miranda, 2012).

O aumento do espaço linfático com relação ao intertúbulo foi acompanhado do aumento deste local quando avaliamos sua distribuição por testículo. Miranda (2012) observou aumento nas células de Leydig e vasos sanguíneos em animais que receberam

tebuconazol. O presente trabalho esses parâmetros não demonstraram alteração. O aumento do volume do espaço linfático em GES refletiu o mesmo aumento observado nesse parâmetro com relação ao testículo e ao intertúbulo, nesse mesmo grupo. O mesmo não ocorreu para os grupos GEI e GEII. Animais que receberam mancozeb e tebuconazol não mostraram alterações na volumetria dos elementos intertubulares (Miranda, 2012), à semelhança do presente estudo para todos os parâmetros, exceto para espaço linfático.

O aumento do percentual de núcleo das células de Leydig foi acompanhado da redução de citoplasma em todos os grupos tratados. O menor percentual de citoplasma em GEII refletiu na diminuição do volume citoplasmático das células de Leydig nesse grupo. Apesar dessas alterações, não houve redução no volume das células de Leydig, o que implica na não interferência do endossulfam no principal componente do intertúbulo. Miranda (2012), trabalhando com morcegos, observou redução do diâmetro nuclear, volume nuclear, volume citoplasmático e volume de células de Leydig em animais tratados com tebuconazol.

O número total de células de Leydig, número de células de Leydig por grama de testículo e índice Leydigossomático em A. lituratus, que representa o percentual de massa corporal alocado em células de Leydig, não apresentaram diferença significativa entre os tratamentos. Miranda (2012), utilizando a mesma espécie de morcegos, observou aumento no número de célula de Leydig por grama de testículo em animais que receberam tebuconazol (1 ml/L).

O endossulfam tem sido classificado como um desregulador endócrino, estando associado a diversas alterações súbitas ou permanentes, nas vias de sinalização endócrina, atividade reprodutiva, síntese e secreção de diversos hormônios (Singh & Pandey, 1989; Singh & Pandey, 1990; Vos et al., 2000; De Falco et al., 2007; Eustache et al., 2009). Brinati (2011) avaliou as concentrações totais de testosterona em morcegos tratados com o organoclorado endossulfam, nas mesmas doses deste trabalho, não encontrando alterações nos níveis de testosterona plasmática. Assim, entendemos que as pequenas alterações ocorridas nos elementos constituintes do intertúbulo não tenham sido suficientes para interferir efetivamente na função desse compartimento testicular.

6. CONCLUSÕES

Contrariando nossa hipótese, a ausência de alterações na morfometria tubular e intertubular nos permitiu inferir que o endossulfam, nas concentração da calda 1,05 e 2,1 gramas por litro, durante 35 dias e na forma de oferecimento, não interfere nos padrões espermatogênicos de Artibeus lituratus.

7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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