A eletroforese bidimensional de alta resolução (2D-PAGE)

A eletroforese bidimensional, acoplada à espectrometria de massas, é uma metodologia bastante empregada na análise da expressão protéica em tecidos, células e compartimentos sub-celulares, e a resposta a agentes regulatórios, como, por exemplo, na resposta frente a um estímulo hormonal. Esta abordagem vem sendo empregada na identificação de alterações no perfil de expressão protéica relacionada a vários estados patológicos, como câncer, diabetes e doenças inflamatórias (Li et al, 2003; Jiang et al, 2003; He et al, 2003; Laz et al, 2004).

A eletroforese bidimensional de alta resolução envolve a separação das proteínas em função de seu ponto isoelétrico, em géis de poliacrilamida com gradiente de pH imobilizado, e de seu peso molecular através de eletroforese SDS-PAGE, permitindo uma alta resolução, o que faz, desta técnica uma das mais empregadas em análises proteômicas (Görg et al, 2004).

Um protocolo básico de eletroforese bidimensional, utilizando gradiente de pH imobilizado em géis de poliacrilamida foi, descrito em 1988 (Görg et al, 1988). Desde então, este tem se tornado o procedimento padrão no estudo do proteoma, permitindo uma maior resolução, maior reprodutibilidade para comparação entre diferentes laboratórios e maior capacidade de amostra (Dunn, 1997; Görg et al, 2004).

Para se visualizar as alterações na expressão protéica de forma global, a técnica de eletroforese bidimensional deve resolver e separar milhares de formas protéicas que estão presentes em linhagens celulares ou tecidos. Idealmente, este objetivo requer a extração de todos os componentes protéicos, incluindo proteínas hidrofóbicas de membrana de difícil solubilização, proteínas com pI extremo e a detecção de proteínas com baixo número de cópias na presença de proteínas mais abundantes, além de uma separação de alta resolução, evitando, assim, a presença de diversas proteínas por "spot". Mesmo com todo o poder de resolução da eletroforese bidimensional, não é possível atingir todos os objetivos listados acima. O principal problema em se visualizar um extrato celular (ou de tecidos) de proteínas totais é a grande diversidade nos níveis de expressão e de propriedades fisico-químicas das proteínas ao longo de diferentes valores de peso molecular, ponto isoelétrico e solubilidade. Devido à essa complexidade, muitas vezes é necessário um pré-fracionamento da amostra para redução da complexidade da mesma e enriquecimento de proteínas menos expressas. Este pré-fracionamento pode ser feito de várias formas, como, por exemplo, o isolamento de compartimentos ou organelas celulares, extração protéica seqüencial através da utilização de agentes com crescente poder solubilizante, ou, ainda, por cromatografia ou purificação de afinidade de complexos protéicos específicos (Görg et al, 2004; Mann & Jensen, 2003; Hebert, 1999; Celis, 1998; Weiss et al, 1992; Weiss et al, 1993; Görg et al, 1997). Mesmo com suas limitações, a técnica de eletroforese bidimensional de alta resolução ainda é a principal tecnologia no estudo do proteoma.

A tecnologia de espectrometria de massas aplicada a macromoléculas biológicas, como, por exemplo, proteínas e peptídeos, desenvolveu-se de forma significativa na última década, sendo, atualmente, a metodologia de escolha na identificação e caracterização protéica. Isto se deve ao grande avanço tecnológico dos espectrômetros de

massas atuais e, também, ao imenso acúmulo de informação nos bancos de dados de seqüências de DNA e proteína (revisto em Aebersold & Mann, 2003).

A espectrometria de massas é uma técnica empregada para a formação de íons em uma fase gasosa a partir de moléculas neutras intactas, com a subseqüente determinação de suas massas moleculares. Basicamente, os espectrômetros de massas são compostos de: a) um ionizador, o qual faz com que as moléculas a serem analisadas sejam levadas à fase gasosa e sejam ionizadas; b) um analisador de massas que resolve estas moléculas, baseando-se na relação massa/carga (m/z) das moléculas ionizadas; e c) um detector, que determina o número de íons com uma relação m/z específica (Ausubel et al, 1999).

Para análise de proteínas e/ou peptídeos, os ionizadores mais utilizados atualmente são o “electrospray” e a dessorção/ionização a laser mediada por matriz orgânica, conhecida como MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization). Os analisadores de massas empregam campos elétricos e/ou magnéticos para uma separação dependente da massa de cada íon gerado, sendo que os mais utilizados, atualmente, são o TOF (Time-Of-Flight), quadrupolo (Q), “Ion Trap” (IT) e o FT-ICRMS (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance). Esses analisadores de massas podem ser utilizados de forma isolada ou em várias combinações entre eles, sendo que cada uma destas possibilidades possui suas vantagens e desvantagens. Como, neste trabalho, foi utilizado o ionizador do tipo MALDI acoplado a um analisador de massas do tipo TOF, a descrição que se segue ficará restrita à essa configuração (revisto em Aebersold & Mann, 2003).

Na ionização do tipo MALDI, os peptídeos são co-cristalizados com um vasto excesso molar de ácidos orgânicos, usualmente referidos como matriz, que absorvem fortemente a radiação eletromagnética na região UV. O vasto excesso molar da matriz faz com que ocorra a separação das moléculas a serem analisadas, reduzindo a interação entre as mesmas. A esta matriz, são aplicados vários pulsos de laser na região UV. A matriz absorve rapidamente uma enorme quantidade de energia da radiação UV aplicada, resultando numa espécie de explosão da estrutura do cristal, fazendo com que tanto as moléculas da matriz como do analito passem para a fase gasosa. Acredita-se que a ionização ocorra na fase gasosa através da transferência de prótons das moléculas da matriz para as do analito (Ausubel et al, 1999).

O analisador de massas do tipo TOF consiste de um tubo de vôo, onde os íons gerados no ionizador são acelerados devido à aplicação de um forte campo elétrico, fazendo com que tenham essencialmente a mesma energia cinética ao entrarem no tubo. Sendo assim, a velocidade final de cada íon, e, conseqüentemente, o tempo que cada íon leva para atravessar o tubo e atingir o detector, depende da sua relação m/z (revisto em Aebersold & Mann, 2003).

Esta configuração de espectrômetro de massas MALDI-TOF tem sido uma das mais empregadas na identificação de proteínas a partir de géis 2D. Os polipeptídios presentes nos perfis 2D são retirados dos géis e submetidos à uma digestão enzimática, geralmente tríptica. Os peptídeos resultantes são extraídos e analisados por espectrometria de massas, obtendo-se um perfil de massas desta digestão tríptica, o qual pode ser utilizado na identificação de uma determinada proteína através da comparação com perfis de digestão teóricos das seqüências contidas em bancos de dados públicos (revisto em Aebersold & Mann, 2003).

1.4.2 Análise funcional da Ciclina G na reversão fenotípica das células ST1