A resistência aos antibióticos

A resistência dos microrganismos aos antibióticos é uma forma de defesa do microrganismo à ação do antibiótico.

Os microrganismos considerados resistentes, incluindo os multirresistentes, são responsáveis pelas contaminações nos centros de saúde, pelas contaminações em doentes que não estão em ambiente hospitalar e pelas infeções dos animais destinados à alimentação, podendo pertencer à flora bacteriana dos seres vivos saudáveis [20].

Segundo os estudos científicos publicados [21], a resistência das bactérias aos antibióticos tem evoluído de uma forma drástica e preocupante.

Alguns estudos científicos [22,23] revelam que adição de antibióticos nos animais destinados para consumo humano, aumenta a possibilidade de criação de superbactérias resistentes.

No caso das bactérias, como a E. coli, estas já são naturalmente resistentes a alguns antibióticos (resistência intrínseca ou inerente), mas outras bactérias desenvolvem resistência com a ocorrência de alterações genéticas com o contacto com o antibiótico (resistência adquirida) ou por meio de troca de material genético no interior do organismo do ser vivo [20].

A aquisição e a propagação da resistência antibacteriana podem advir de diversos mecanismos. Os vários tipos de mecanismos podem ser por resistência natural ou intrínseca, por resistência adquirida, por elementos genéticos móveis, por mecanismos de transmissão genética ou por mecanismos bioquímicos de resistência [24].

No caso da resistência antibacteriana através da bactéria E. coli, a resistência é obtida por mecanismos bioquímicos de resistência, mais concretamente, inativação ou modificação enzimática. Uma das enzimas responsáveis por este acontecimento na bactéria E. coli é a beta-lactamase. Esta enzima contém o essencial mecanismo de resistência aos antibióticos beta-lactâmicos vulgarmente associada aos microrganismos Gram-negativo (Figura 3.9) [24].

Figura 3.9 - Mecanismos de resistência aos agentes antimicrobianos beta-lactâmicos em microrganismos Gram-negativo como membros da família Enterobacteriaceae [24].

Algumas bactérias causadoras de doenças reagem à medicação utilizada, tornando-se resistentes a ela. Este processo pode ser rápido ou lento, por isso, a vida útil dos antibióticos fica limitada. Por este motivo, o uso incorreto dos antibióticos potencia o aparecimento da resistência das bactérias. Esta questão, apesar de ser económica, é muito importante para a saúde pública, porque uma simples infeção comum pode passar a ser uma infeção fatal para o ser humano [25].

Se não forem tomadas medidas contra o uso inadequado dos fármacos, corremos o risco enfrentar uma era pós-antibiótica, em que as infeções deixam de ter cura e haverá a necessidade de descobrir “novos antibióticos”.

A evolução das resistências dos microrganismos é um processo natural que vai acontecer, mais tarde ou mais cedo, com todos os fármacos. Independentemente da escolha do antibiótico, da infeção, da dose ingerida ou do tempo de tratamento, a o microrganismo ajusta-se ou falece através de um fenómeno conhecido por “pressão seletiva” [26].

Esta problemática tem uma enorme importância socioeconómica, porque custa incontáveis quantias de dinheiro e prejudica imensas vidas humanas, podendo causar uma crise global no sector dos fármacos [13].

É necessário tomar medidas urgentes para evitar a evolução das resistências de forma tão acelerada.

Este trabalho visa contribuir para a compreensão deste fenómeno nas estações de tratamento de águas residuais, onde contactam prolongadamente microrganismos e antibióticos. Descrevem-se de seguida alguns dos testes de sensibilidade dos microrganismos aos antibióticos que poderiam ser usados.

Teste de sensibilidade dos microrganismos aos antibióticos (TSA)

Os TSA podem ser realizados aos seguintes microrganismos:

 Enterobactérias;

 Pseudomonas spp.,

 Acinetobacter spp.;

 Staphylococcus spp.;

 Enterococcus spp.;

 Streptococcus pneumoniae;

 Streptococcus do grupo viridans e beta-hemolítico;

 Haemophilus influenzae;

 Complexo Burkholderia cepacia;

 Stenotrophomonas maltophilia;

 Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis.

Os testes podem ser realizados de diversas formas:

 Macrodiluição em tubos;

 Teste em Microplacas;

 Diluição em agar;

 Etest;

 Automação;

 Difusão por disco.

A macrodiluição em tubos foi uma das primeiras técnicas disponíveis a ser usada para a realização dos TSA. Consiste numa preparação de diluições seriadas e logarítmicas de antibióticos em meio de cultura líquido, permitindo o crescimento bacteriano (Figura 3.10) [27].

A vantagem da macrodiluição em tubos é a descoberta de um resultado quantitativo sobre a concentração mínima de inibição de crescimento bacteriano.

As desvantagens desta técnica são:

 Grande quantidade de reagente utilizado (grande custo);

 Espaço necessário para a conservação dos tubos;

 Enorme possibilidade de ocorrerem erros experimentais durante a preparação das concentrações dos antibióticos;

 Muito trabalho manual e muito tempo necessário para a preparação deste TSA [27].

Figura 3.10 - TSA por método de macrodiluição em tubos [27]

O Teste por Microplacas (Figura 3.11) é uma réplica em pequena escala da técnica anterior, em que se substitui os tubos utilizados na macrodiluição por placas plásticas estéreis. Estas placas contêm 96 poços e um fundo em formato em “U”, permitindo uma melhor visualização do crescimento bacteriano. Em cada placa é colocado um número de antibióticos, próximo de 12, em diversas concentrações [27].

As vantagens desta técnica são:

 Utilização de pouco espaço de armazenamento e de poucos reagentes;

 Grande reprodutibilidade dos resultados;

 Geração de um resultado quantitativo face à concentração mínima de inibição bacteriana;

 Possibilidade de utilizar placas pré-fabricadas e sistemas informáticos, fornecidos pelos fabricantes das placas, para a análise dos resultados obtidos.

As desvantagens deste método são:

 Custo elevado das placas de microdiluição;

 Inflexibilidade na escolha dos antibióticos a testar quando se utilizam placas pré-fabricadas.

Figura 3.11 - TSA por método de teste em microplacas [27]

O TSA pelo método diluição em agar consiste em ensaios com concentrações seriadas e logarítmicas de um antibiótico. Cada placa de Petri com meio de cultura só contém uma única concentração de antibiótico (Figura 3.12) [27].

As vantagens deste método são:

 Possibilidade de testar um número elevado de amostras em simultâneo;

 Custo baixo de operação;

 Determinação quantitativa da concentração mínima de inibição de crescimento bacteriano;

As desvantagens deste método são:

 Muito tempo e trabalho necessários para a preparação desta técnica;

 Possibilidade de perda da potência/concentração dos antibióticos;

Figura 3.12 - TSA por método de Agar-Diluição [27]

A técnica de Etest® consiste numa fita plástica disponível no mercado (Figura 3.13) que contém concentrações de antibióticos crescentes numa face e a marcação da escala de concentrações na outra face, com o intuito de facilitar a leitura dos resultados. Baseia-se na difusão do gradiente do antibiótico no meio de cultura, com o objetivo de determinar a concentração mínima de inibição (CMI) do microrganismo em teste [27].

As vantagens deste método são:

 Flexibilidade de escolha dos antibióticos em teste;

 Determinação quantitativa da concentração mínima de inibição de crescimento bacteriano;

 Fácil operação.

As desvantagens deste método são:

 Custo elevado;

 Limitação do número de antibióticos em teste por placa de Petri.

Figura 3.13 - TSA por método de Etest® [27]

O TSA por automação é um sistema automático. Os métodos mais utilizados para a realização dos TSA são:

 Vitek®;

 Vitek-2® (bioMérieux, Hazelwood, MO);

 Walk-Away® (DADE, West Sacramento, CA);

 BD Phoenix®.

Esta técnica permite uma execução eficaz e rápida, visto que os equipamentos possibilitam sistemas de deteção óticas, capazes de detetar alterações discretas no crescimento bacteriano. Também é possível juntar num só relatório, os resultados dos TSA com a identificação do Gram das bactérias, em simultâneo. Os resultados obtidos desta técnica são semi-quantitativos, por isso, não mudam as informações obtidas pelos métodos de TSA com resultados quantitativos [27].

As principais vantagens desta técnica são as seguintes:

 Emissão mais rápida dos resultados;

 Padronização intralaboratorial e interlaboratorial;

 Disponibilidade de programas de computador (software) adicionais para facilitar a emissão dos relatórios e redução do trabalho manual.

O TSA por difusão por disco consiste em colocação de antibióticos em forma de disco, numa placa de Petri com meio de cultura, após aplicado inóculo bacteriano com 1E+08 a 2E+08 UFC/mL. Os discos com antibióticos têm uma concentração fixa e são comerciais. Uma placa de Petri com diâmetro 150 mm consegue ter 12 discos, enquanto uma placa de Petri com 90 mm de diâmetro pode conter 4 a 5 discos (Figura 3.14). As placas ficam incubadas entre 16 a 24 horas à temperatura favorável ao desenvolvimento do microrganismo em teste [27].

O método de difusão por disco foi descrito por Bauer e Kirby em 1966. É o método mais simples e mais confiável para a realização do TSA. Esta técnica fornece um resultado qualitativo em vez de um resultado quantitativo [27].

Para a utilização deste método para TSA, é necessário um controlo de qualidade rigoroso, visto que há imensas variáveis existentes que podem afetar o resultado final do TSA. As possíveis variáveis em causa são as seguintes:

 Preparação do meio de cultura;

 Controlo do pH do meio de cultura;

 Tempo do TSA;

 Temperatura e atmosfera da incubação das placas;

 Concentração do inóculo bacteriano;

 Colocação dos discos com antibióticos;

 Rigor na execução da técnica.

Esta técnica apresenta as seguintes vantagens:

 Facilidade na execução da técnica;

 Reprodutibilidade dos resultados;

 Baixo custo;

 Fácil interpretação dos resultados obtidos;

 Flexibilidade de escolha dos antibióticos em teste;

 Não há exigência de equipamentos próprios/especiais.

Todavia, esta técnica também possui desvantagens:

 Não-padronização do método para combinações entre microrganismos e antibióticos;

 Concentração mínima de inibição não detetada;

 Não adequada para deteção de mecanismos de resistência resultantes da produção de β-lactamases e de outros mecanismos mais complexos.

Figura 3.14 - TSA por método de difusão por disco [27]

Nesta dissertação, o TSA será realizado à bactéria E. coli, pertencente às bactérias enterobactérias e a técnica selecionada para a realização do teste foi a difusão por disco [27].