A TIVIDADE CINÉTICA DAS VARIANTES DE NahI

Segundo a hipótese inicialmente sugerida, a expansão do sítio catalítico de NahI, dada pela substituição de Leu156 e Phe448 por seus correspondentes em NahF, poderia favorecer a atividade da enzima sobre substratos aromáticos. Entretanto, ao contrário do que se esperava e de forma semelhante à enzima NahI, os três mutantes propostos não apresentaram atividade sobre o substrato natural de NahF, o 2-salicilaldeído, o que talvez possa ser atribuído à posição adjacente dos grupos substituintes. Assim como 2- e 3-carboxibenzaldeído são substratos fracos para XylG, dada a preferência ao 4-carboxibenzaldeído até mesmo sobre 2- HMS (Wang 2003), pode ser que o posicionamento para dos substituintes apresente melhor

alinhamento para a ligação do salicilaldeído quando comparado às posições orto e meta, que não possibilitariam um encaixe correto no sítio. Em NahF, contudo, observa-se que mudanças na posição da hidroxila em 3- e 4-salicilaldeído levam à diminuição dos valores de kcat/KM em

cerca de 6 e 15 vezes, respectivamente, em relação ao substrato natural 2-salicilaldeído. Dessa forma, é válido testar a atividade de NahI e seus mutantes sobre 4-saliciladeído, por exemplo. Entretanto, falta-lhe ainda o grupo carboxilato, identificado por Wang (2003) como essencial para a ligação do substrato. Mais ainda, para fins de comparação com a homóloga XylG, pode-se avaliar a atividade cinética de NahI e dos mutantes sobre benzaldeído e seus análogos.

O fato de NahI não apresentar atividade sobre o substrato natural de NahF sugere que estas enzimas tenham evoluído para cumprir funções específicas nas vias de degradação às quais pertencem, contribuindo talvez para a regulação do fluxo metabólico entre ambas. A observação de uma molécula de salicilaldeído localizada em um sítio atípico, entre as duas subunidades que compõem o dímero de NahF, suscita uma possível modulação alostérica para esta enzima (Coitinho 2013). Também segundo Coitinho (2013), há indícios de que salicilato, produto da reação catalisada por NahF, cause inibição não competitiva da própria enzima que o produz. Cabe, portanto, monitorar a atividade catalítica de NahI sobre 2-HMS na presença de salicilaldeído e salicilato, separadamente, a fim de avaliar uma possível comunicação do fluxo metabólico entre as vias superior e inferior.

A respeito da oxidação de 2-HMS, apenas o mutante F448S apresentou atividade. O KM elevou-se nove vezes (11,4 ± 2,0 M) enquanto o valor de kcat se manteve comparável ao

de NahI (0,9 s-1), resultando em um decréscimo de aproximadamente nove vezes no valor de kcat/KM (0,075 x 106 M-1s-1). Mais uma vez, a acessibilidade ao sítio ativo parece influenciar a

ligação ao substrato, já que o sutil alargamento da entrada do sítio catalítico em F448S foi capaz de afetar ligeiramente a afinidade da enzima ao seu substrato natural, sem perturbar, contudo, o número de renovação (turnover). Esta última observação, somada ao fato de que os outros dois mutantes L156G e L156G-F448S não apresentaram qualquer atividade sobre 2- HMS, sugere que a manutenção de Leu156 parece ser crítica para a oxidação do substrato por NahI. Ainda que não tome parte diretamente na catálise, é provável que este aminoácido favoreça o melhor posicionamento de 2-HMS no sítio catalítico para que ocorra a reação.

De fato, em PnpE, uma -hidroximuconato semialdeído desidrogenase envolvida na via de degradação de para-nitrofenol em Pseudomonas sp. WBC-3, a mutação F150A, em

posição equivalente à Leu156 de NahI, comprometeu completamente a atividade da enzima sobre o substrato -hidroximuconato semialdeído (Su et al 2013). Segundo um alinhamento de sequencias consenso das famílias de ALDHs (Perozich et al 1999), tal resíduo de leucina em NahI (Leu156) é representativo da família HMSALDH (hidroximuconato semialdeído desidrogenase), enquanto um resíduo de fenilalanina ou tirosina em posição correspondente é observado em todas as outras famílias, inclusive entre as ALDHs aromáticas. Exceção feita, contudo, para NahF. Uma vez que o resíduo de glicina possui a menor cadeia lateral dentre os aminoácidos, é provável que Gly150 de NahF favoreça a formação de um sítio catalítico mais amplo, capaz de acomodar aldeídos aromáticos estruturalmente diversos.

Quanto ao resíduo W163 de NahI, o equivalente W157 em PnpE parece contribuir para uma região hidrofóbica no sítio capaz de melhor acomodar uma pequena porção alifática da cadeia linear do substrato. Ainda que este resíduo não estabeleça contato direto com o - hidroximuconato semialdeído, a mutação W157A reduziu em 20% a atividade catalítica da enzima (Su et al 2013).

Tem-se observado que um determinado resíduo de asparagina, equivalente a Asn155 de NahI e conservado em 95% das ALDHs segundo (Perozich et al 1999), desempenha papel importante na catálise. Para a mutação N149D, PnpE perdeu sua atividade sobre - hidroximuconato semialdeído (Su et al 2013). De semelhante modo, perda de atividade também foi observada para o mutante N133A de Gox0499, uma ALDH da bactéria Gluconobacter oxydans com atividade sobre aldeídos aromáticos e alifáticos de cadeia longa (Yuan et al 2013). Tal resíduo de asparagina, que em NahI (Asn155) estabelece ligação de hidrogênio com o anel de nicotinamida do cofator (Figura 26, subseção 4.5), se posiciona na interface dos sítios de ligação ao substrato e ao cofator.

Assim, embora um mecanismo geral para ALDHs tenha sido proposto com base em análises de identidade de sequencia e estudos cristalográficos (Wymore et al 2004), e os resíduos conservados de cisteína, glutamato e asparagina (respectivamente, C288, E254 e N155 em NahI) sejam considerados essenciais para a catálise, cabe descrever o possível mecanismo catalítico específico de NahI. A elucidação de mais estruturas da enzima complexada a outros ligantes é um auxílio na identificação de resíduos conservados ou não, necessários para a catálise e a especificidade ao substrato.