A validade e vantagens do uso de animais experimentais

asfixia, por pesquisadores de todo o mundo. Entre eles destacam-se: o cão (KEREM & ELSNER, 1973), o gato (DELAUNOIS et al., 1985), o macaco (MYERS, 1971), o porco (SOLAS, 2004; McCULLOCH, 2005), o carneiro (BRINKMAN III et al, 1974; WILKINSON et al., 1995), o coelho (GOUYON et al, 1987), o cobaio (BODA et al., 1976), o camundongo (TATENO et al., 1992; NAKAMURA et al., 2003), o hamster (JARSKY & STEPHENSON, 2000) e o rato (TIMO-IARIA et al., 1970; DUFFY et al., 1975; ROMIJN et al., 1991; FINK et al., 2004; DUNLEAVY et al., 2005).

Entre esses animais, o rato tem sido o animal mais freqüentemente escolhido para esta finalidade por apresentar inúmeras vantagens em relação aos animais de maior porte. Entre essas vantagens podemos destacar: fácil manuseio (alimentação, higiene e acomodação); possibilidade de se trabalhar simultaneamente com diversos grupos experimentais, sem ocupação de grandes espaços; elevada resistência às infecções, dispensando o uso de antibióticos profiláticos; possibilidade de se uniformizar a amostra, graças à facilidade de padronização da idade, peso corporal, linhagem e grau de nutrição do animal; e, por fim, menor custo dos projetos.

Além das vantagens mencionadas, o rato tem sido amplamente utilizado em estudos experimentais do sono, por apresentar o ritmo de sono-vigília muito similar ao descrito no homem (TIMO-IARIA et al., 1970;

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1990). Acresce-se a isto, que este animal apresenta, ao nascimento, um estágio precoce de maturação do SNC Por conseguinte, parece ser a espécie ideal para ser utilizado em estudos da atividade elétrica cortical.

Em nosso estudo utilizamos ratos RN, cuja resistência à hipóxia é bastante salientada na literatura (DUFFY et al., 1975; HILL, 1989). Essa característica possibilitou-nos a obtenção de um modelo experimental de asfixia, com um tempo duradouro de hipóxia, raramente possível em outras espécies, sem o aumento significativo da taxa de mortalidade.

1.5.2. A transposição dos dados obtidos no rato para os RN humanos

Fazendo-se a transposição dos dados obtidos no rato para os RN humanos pode-se deduzir que a asfixia altera o ritmo de sono-vigília promovendo aumento transitório do número de despertares e, a medida que esta condição se prolonga, os despertares se tornam cada vez menos freqüentes.

Particularmente nos bebês, onde o sono está presente a maior parte do tempo, a observação clínica e/ou eletroencefalográfica dos seus componentes fundamentais (quietude comportamental, desligamento relativo dos estímulos ambientais, adoção de posturas específicas, presença de movimentos corporais espontâneos, duração dos ciclos de sono-vigília, duração do sono REM e não-REM, descontinuidade do sono, etc) pode trazer informações valiosas sobre a integridade orgânica e funcional dos órgãos e sistemas do RN, especialmente do sistema nervoso.

Em que pese a baixa especificidade dos desvios da normalidade, possíveis de serem observados durante o sono do RN, é inegável afirmar que estas alterações têm valor preditivo positivo muito grande, especialmente em crianças cuja história fetal e materna sugere a possibilidade da ocorrência de danos ou seqüelas decorrentes da AP.

É verdade, porém, que a avaliação isolada dos elementos fisiológicos do sono tem apenas valor presuntivo, servindo, contudo, para orientar a indicação de novos exames diagnósticos e talvez, também, a

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adoção de algumas medidas preventivas de eventuais seqüelas clínicas e neurológicas surgidas no curso da asfixia, em longo prazo.

Diversos estudos clínicos e experimentais têm também comprovado os nossos achados, tanto em condições de hipóxia e asfixia aguda, como em distúrbios crônicos, incluindo a apnéia obstrutiva do sono (PAPPENHEIMER, 1976; WATANABE et al., 1980; MEGIRIAN et al., 1980; RYAN & MEGIRIAN, 1982; LOMBROSO & MATSUMIYA, 1985; LASZY & SARKADI, 1990; HORNER et al, 1998; HAMRAHI et al., 2001; SCHER et al., 2002; OSREDKAR et al., 2005).

Pesquisas bem conduzidas em seres humanos têm demonstrado que a hipóxia e a asfixia podem determinar importantes alterações no ciclo de sono-vigília de bebês recém-nascidos. WATANABE et al., 1980, tentando estabelecer um padrão eletroencefalográfico do sono de RN de termo, vítimas de AP, observaram haver uma nítida correlação entre a desorganização do padrão normal de sono e a gravidade da depressão sofrida por estes bebês, principalmente na primeira semana do nascimento.

Por outro lado, a despeito das alterações observadas no ciclo de sono-vigília de RN asfíxicos, é discutível na literatura se estas alterações têm algum valor preditivo para prever o prognóstico dos bebês, em relação ao desenvolvimento de seqüelas neurológicas, em longo prazo.

Segundo BHATIA et al., 1980, a desorganização do ciclo de sono e a redução da duração do sono REM podem ser prejudiciais para o desenvolvimento intelectual e de funções neurointegrativas do bebê. O sono REM, segundo esses autores, é considerado ontogeneticamente primitivo e se constitui no sono mais prevalente na vida dos bebês prematuros e de termo. Este tipo de sono oferece uma estimulação intensa ao SNC, sendo considerado essencial para o desenvolvimento do cérebro. Assim, a privação de sono REM pode levar à diminuição da aquisição e/ou retenção precária dos vários tipos de aprendizado, tendo, por isso, particular interesse prático e científico.

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LOMBROSO & MATSUMIYA, 1985, ao analisarem o padrão dos ciclos de sono e vigília de 33 RN de termo, acompanhados semestralmente, do 10° dia do nascimento até o 3° ou 4° ano de idade, concluíram que a análise cega e indiscriminada dos registros EEG de todos os RN, sem o conhecimento prévio da presença ou ausência da asfixia, não teve valor prognóstico para a identificação dos bebês que desenvolveram seqüelas neurológicas pós-asfixia, em longo prazo. Por outro lado, quando a análise dos registros foi efetuada individualmente para cada RN, levando em consideração a informação prévia da asfixia e seu grupo de risco para o desenvolvimento de seqüelas neurológicas, esses autores observaram haver significante correlação positiva entre as alterações do ritmo de sono e o desenvolvimento de complicações neurológicas em longo prazo, em 13 dos 30 bebês que puderam ser acompanhados adequadamente; sendo que em 11 deles o prognóstico neurológico foi muito ruim. Em relação aos 17 RN restantes, porém, todos tiveram desenvolvimento neuro-psíquico-motor normal, a despeito das alterações observadas no padrão normal de sono observado no EEG. Os pesquisadores concluíram que a análise dos estados de sono e vigília, em bebês vítimas da asfixia, tem baixo valor preditivo para a identificação de crianças com risco de desenvolver seqüelas neurológicas, mas alto valor preditivo para prever estas complicações no grupo de crianças previamente identificadas como potencialmente de alto risco.

Em que pese as limitações da análise do ritmo do sono em RN, SCHER et al., 2002, salientaram que os mecanismos de adaptação cerebral do bebê asfíxico podem mascarar o diagnóstico de encefalopatia hipóxico-isquêmica, ou mesmo subestimar a sua gravidade. Em estudo realizado em 23 RN normais e em 10 RN vitimas de estresse fetal intra-útero, submetidos à ressuscitação neonatal, esses autores sugeriram que a observação do padrão de sono, utilizando o EEG, pode ser de grande valia para eliminar resultados falso-negativos nas avaliações clínicas efetuadas na 1a _{semana de vida. Ao realizar uma comparação do} percentual de tempo gasto nos períodos de sono ativo, quieto e

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indeterminado, entre os dois grupos de RN estudados (normais e asfíxicos), os mesmos observaram uma diminuição significativa na proporção de sono ativo e um aumento na de sono quieto e indeterminado, no grupo de crianças asfíxicas. Estas alterações foram interpretadas como uma adaptação cerebral pós-natal à asfixia, independentemente da existência ou não de sinais clínicos de encefalopatia.

Estudo recente realizado por OSREDKAR et al., 2005, também enfatizou a influência da isquemia/hipóxia sobre o ciclo de sono-vigília e o valor prognóstico da utilização deste parâmetro para prever as chances de desenvolvimento de seqüelas neurológicas em RN vítimas da AP. Esses autores avaliaram 171 RN de termo com diagnóstico clínico de encefalopatia hipóxico-isquêmica e observaram que os ciclos de sono estavam presentes em 95,4% dos RN que sobreviveram e em apenas 8,1% daqueles que morreram. O tempo decorrido entre o nascimento e o início dos ciclos de sono-vigília também foi significativamente diferente em bebês com diversos graus de encefalopatia (I, II e III); sendo este tempo extremamente aumentado no grupo III (7, 33 e 62 horas, respectivamente).

O início precoce dos ciclos de sono-vigília também esteve associado ao bom prognóstico neurológico dos RN; o mesmo podendo ser dito para a presença dos ciclos e a sua qualidade.

Em nosso estudo, ficou evidente que os movimentos corporais do sono são afetados pelo estresse produzido pela asfixia.

Contrariamente à escassez de estudos a respeito dos movimentos corporais espontâneos em animais, vários trabalhos clínicos têm comprovado que a hipóxia e a asfixia podem alterar a atividade motora de crianças RN, durante os diversos estados do sono.

Estudos preliminares realizados por HAKAMADA et al., 1982, demonstraram que crianças com anormalidades no EEG, como depressão moderada e acentuada, apresentavam alterações significativas na quantidade e na qualidade dos movimentos corporais durante o sono. Estes autores observaram os movimentos corporais em 14 RN de termo, acometidos por diversas enfermidades, incluindo: asfixia perinatal,

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meningite, síndrome de aspiração meconial, hidroencefalia, etc., tendo demonstrado que a redução ou ausência dos movimentos corporais, ou ainda, o aumento dos movimentos corporais generalizados do sono, estavam usualmente relacionados a um prognóstico ruim do RN, em longo prazo. Por outro lado, a presença de movimentos corporais, mesmo que localizados e em pequena quantidade, indicaram boa preservação das funções corticais.

Todavia, a validade da utilização dos movimentos corporais do sono como marcador prognóstico de lesões neurológicas em RN foi colocada em dúvida nos estudos de VECCHIERINI-BLINEAU et al., 1986, ao observarem que bebês normais, e naqueles cujos irmãos foram acometidos pela síndrome da morte súbita, não apresentavam mudanças significativas no número de movimentos corporais nos diversos estágios do sono (ativo, quieto e indeterminado).

ERKINJUNTTI, 1988, também colocou em dúvida a validade da observação dos movimentos corporais ao estudar 16 RN saudáveis e 21 neurologicamente doentes, utilizando o leito estático sensitivo (“static charge sensitive bed”), onde observou que embora RN doentes apresentassem uma tendência ao decréscimo do número e duração dos movimentos corporais, quando comparados a crianças normais, nenhuma diferença estatística foi observada entre os dois grupos. À época, os autores concluíram que o estudo quantitativo dos movimentos corporais não tem valor preditivo para diferenciar bebês normais e aqueles com seqüelas neurológicas decorrentes de complicações perinatais.

Todavia, em estudo publicado posteriormente pelo grupo de Nantes - França (VECCHIERINI-BLINEAU et al., 1989), concluíram haver significante diminuição dos movimentos corporais generalizados nos diversos estágios do sono, com a progressão da idade do RN, tendo salientado as dificuldades de se comparar os resultados desta pesquisa, como os seus resultados anteriores, e dos demais estudos existentes na literatura, em razão das diferentes técnicas empregadas para monitorar os movimentos corporais. As conclusões destes autores, todavia, vieram

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ratificar a importância de não se negligenciar as potencialidades do monitoramento dos movimentos corporais do sono, no período neonatal, como uma ferramenta de avaliação do status funcional do SNC em recém-nascidos.

Estudos anteriores, realizados por PEIRANO et al., 1986, já haviam demonstrado esse fato ao observarem que RN prematuros (< 38 semanas de gestação) não apresentavam diferença significante do tempo total gasto em movimentos corporais, durante as diversas fases do sono, em contraste aos bebês de termo (> 39 semanas de gestação), onde houve significante queda dos movimentos corporais durante o sono, especialmente no período de sono ativo. Neste estudo, os autores enfatizaram a importância de se conhecer as diferenças no grau de maturação do SNC entre RN de termo e prematuros, as quais poderiam explicar diferentes respostas obtidas pelos pesquisadores durante a análise das diversas variáveis fisiológicas do sono, em particular dos movimentos corporais.

PRECHTL et al., 1993, analisando o valor preditivo do monitoramento dos movimentos corporais generalizados, presentes no sono de bebês de termo, vítimas de AP, observaram redução significante dos movimentos globais, bem como dos movimentos da boca e extremidades, durante os primeiros dias de vida, tendo observado também correlação positiva destes achados como o desenvolvimento neuro-psiquico-motor destas crianças.

Estudos publicados por FREUDIGMAN & THOMAN, 1993, também vieram corroborar o valor prognóstico do método ao monitorar continuamente os movimentos corporais e respiratórios de 36 RN saudáveis, durante as primeiras 48h de vida, tendo encontrado nítida correlação dos achados com o desenvolvimento neurológico destes bebês, aos 6 meses de idade, usando o “score” motor de Bayley.

van KRANEN-MASTENBROECK et al., 1994 também salientaram a importância da observação qualitativa dos movimentos corporais do sono, ao identificarem cinco padrões diferentes de movimentos

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espontâneos em crianças, com peso normal e peso baixo ao nascimento, dos quais, dois foram apenas encontrados em crianças pequenas para a idade gestacional. Os autores concluíram que as repercussões sobre a atividade motora de RN desnutridos também poderiam ser verificadas em outras condições patológicas observadas nos períodos pré e pós-natal, incluindo a asfixia perinatal.

De fato, estudo realizado em nosso meio por PADULA, 1999, em seu trabalho de Doutorado, veio comprovar que RN de termo, que sofreram algumas intercorrências no período perinatal, incluindo: baixo peso ao nascimento, o uso de fórceps, o sofrimento fetal detectado pela cardiotocografia, a circular de cordão e a depressão moderada pós- parto, apresentavam alterações na arquitetura do sono, detectadas pela vídeo-polissonografia, representadas pela constatação de movimentos corporais ou “abalos” numa freqüência maior que a observada no seu grupo controle.

Clinicamente, é importante o reconhecimento precoce de sinais que indiquem a ocorrência de asfixia, uma vez que é clara a necessidade deste conhecimento e a dificuldade de obtê-lo devido a todos os motivos aqui já colocados.

Deste ponto de vista, o claro aumento dos movimentos corporais do sono que se segue à asfixia poderia ser utilizado como indicador de que este agravo ocorreu.

Tentando responder se o monitoramento desta alteração poderá constituir-se em um procedimento rotineiro, eficaz e de baixo- custo para o diagnóstico de asfixia e suas alterações, podemos tecer algumas considerações:

Como o estudo foi realizado em animais RN (ratos) que são extremamente resistentes à asfixia, seria de interesse perguntar se caso o agravo fosse provocado de forma mais prolongada, se a resposta encontrada não seria diferente. É razoável pensar, porém, que uma asfixia mais prolongada poderia acarretar uma redução definitiva dos movimentos corporais.

Discussão 103

Assim, os resultados obtidos no presente estudo atentam somente para a possibilidade de se utilizar a observação dos elementos fisiológicos presentes na vida de todos nós, desde o nascimento: o sono e os movimentos corporais. Todavia, apesar dos interessantes resultados observados, e pelas suas próprias características, o estudo ainda carece de novas investigações para testar a sua validade, principalmente na fase que sucede a asfixia.

Se o indicador diagnóstico da AP, ora proposto, conseguirá acrescentar alguma contribuição às limitações dos métodos hoje existentes, só o tempo e novas pesquisas em animais, e em séries controladas de pacientes, poderão dizer. A falta de potencial, simplicidade, disponibilidade, exeqüibilidade e inocuidade, por certo, não serão os obstáculos.

Conclusões 105

Baseados nos resultados obtidos e nas condições experimentais do presente trabalho, podemos concluir que:

1. O monitoramento dos movimentos corporais do sono e do ritmo de sono-vigília, de ratos RN, parece ser de grande valia no diagnóstico da asfixia, merecendo, por isso, mais estudos para determinar a sua viabilidade de uso.

2. Com a metodologia utilizada foi possível a obtenção de um modelo experimental de asfixia, que se mostrou adequado para reproduzir as condições enfrentadas por animais RN nas fases pré, intra e pós- asfixia;

3. Os movimentos corporais observados durante o sono foram adequadamente monitorados, através do aparato técnico utilizado para a obtenção dos registros da atividade muscular esquelética de ratos RN;

Resumo 107

As limitações dos métodos diagnósticos da asfixia perinatal levaram-nos a investigar se o monitoramento dos movimentos corporais do sono (MCS) e do ritmo de sono-vigília (S/V) pode ser utilizado como marcador diagnóstico deste processo patológico. Para tanto, os registros eletromiográfico e eletrocardiográfico de 8 ratos recém-nascidos, Wistar, com 6 a 48h de vida, foram obtidos durante 4 períodos experimentais: período controle – com ratos respirando ar atmosférico, por 30min; período de asfixia – com ratos submetidos a dois períodos de asfixia de 30min (T1 e T2), com seus corpos inteiramente envolvidos por filme de polivinil (PVC); e período de recuperação – com ratos respirando ar ambiente novamente, por 30min. A asfixia determinou um aumento significante (P<0,001) no tempo de vigília, nos 30min iniciais da asfixia (T1), com redução na fase T2, ao nível controle. Conseqüentemente, o tempo de sono foi significantemente diminuído em T1, quando comparado aos momentos pré e pós asfixia. O número de movimentos corporais do sono diminuiu de modo significante no período de asfixia (T1=11,00 ± 0,62 e T2=9,00 ± 0,44) comparativamente à fase controle (ARpré= 12,5 ± 0,50), aumentando significantemente no período de recuperação (15,0 ± 0,49). A freqüência cardíaca diminuiu significantemente durante a asfixia, em relação à fase controle. Nós concluímos que o monitoramento dos MCS e do ritmo de sono-vigília se mostrou um parâmetro promissor no diagnóstico da asfixia perinatal e de suas complicações. Este fato, todavia, requer novas investigações para se estabelecer a real viabilidade do método para o uso rotineiro na prática clínica.

Palavras-chave: asfixia perinatal; modelos experimentais; movimentos corporais do sono; ritmo de sono-vigília; ratos.

Summary 109

The limitations of current diagnostic methods of perinatal asphyxia induced to investigate if monitoring of body movements and of the sleep-wake rhythm can be used as diagnostic marker of this pathologic process.

So, electromyogram and electrocardiogram records of 8 newborn Wistar rats, 6 to 48 hours postnatal, were obtained throughout 4 experimental periods: control period – with rats breathing room air for 30 min (ARpre); asphyxia periods – with rats submitted to two 30 min asphyxia periods (T1 and T2) with Its entire body covered with a polyvinyl sheet (PVC); and recovering period – with rats breathing room air for 30 min again. Asphyxia determined a significant increase (P<0,001) of time spent awake at the T1 asphyxia period with subsequent decrease to the control level at the T2 phase. Consequently, time spent asleep was significantly lower at T1 asphyxia period than in pre-and post-asphyxia periods. Sleeping body movements (SBM) markedly reduced at the T1 (11,00 ± 0,62) and T2 (9,00 ± 0,44) asphyxia periods when compared to control phase (ARpre = 12,5 ± 0,49), being significantly increased at the recovery phase (15,0 ± 0,49). Heart rate was significantly decreased all over the asphyxia period compared with the control phase. In conclusion the monitoring of SBM, and of the sleep-wake rhythm seems to be of utmost value to the perinatal asphyxia diagnosis and its complications. This fact, however, requires new investigations to establish the real viability of the method for clinical practice routine.

Key words: perinatal asphyxia, experimental models, sleeping body movements, sleep-wake rhythm, rats.

Referências 111

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