A via do poliol e a via da PKC

Outras vias bioquímicas estão vinculadas aos efeitos adversos da hiperglicemia e as complicações cardiovasculares, como é o caso da via do poliol e da via DAG-PKC. (KEOGH; DUNLOP; LARKINS, 1997). É importante ressaltar que níveis elevados de glicose podem alterar as vias de transdução de sinal, afetando a expressão gênica e a função proteica levando a disfunção e danos celulares (GERALDES; KING, 2010).

A via do poliol é considerada a principal contribuinte do estresse oxidativo induzido pela hiperglicemia (GABBAY, 1975). A aldose redutase é a primeira enzima da via do poliol responsável por reduzir os aldeídos tóxicos celulares para álcoois inativos. Em pacientes hiperglicêmicos a aldose redutase também reduz a glicose em sorbitol, utilizando o NADPH como cofator (SHAH et al., 1997). O NADPH é um cofator essencial para a regeneração de antioxidantes intracelulares, como a glutationa reduzida pela enzima glutationa redutase. Desse modo, a utilização de NADPH pela aldose redutase pode contribuir com o aumento do

estresse oxidativo e com o desenvolvimento das complicações diabéticas, devido ao aumento do estresse osmótico, ao aumento citosólico do NADH/NAD, a diminuição do NADPH, bem como pela redução da atividade da Na/K/ATPase (BARNET et al., 1986; CHUNG; CHUNG, 2005).

A segunda enzima da via do poliol, a sorbitol desidrogenase, converte o sorbitol em frutose, utilizando como cofator o NAD +. A frutose produzida pode ser fosforilada a frutose- 3 fosfato que, por sua vez, pode ser dividida em 3-desoxiglucose e 3-desoxiglucosona. Estes dois compostos são agentes de glicação que podem resultar na produção de AGEs (MATHEBULA, 2015).

É bem conhecido que, a glicose pode ser metabolizada diretamente a diacilglicerol (DAG), por um processo envolvendo a conversão do fosfato de dihidroxiacetona, intermediário da triose fosfato, produzido quando a glicose-6-fosfato é utilizada na glicólise ou na via das pentoses fosfato (XIA et al., 1994; STEINBERG, 2008; GERALDES; KING, 2010). Este intermediário é reduzido ao glicerol-3-fosfato, o que aumenta a síntese de novo de DAG. O diacilglicerol é um cofator das isoformas clássicas da PKC, -β, -δ e –α (WOLF et al., 1991). A ativação da PKC resulta em vários efeitos na expressão gênica, como redução do óxido nítrico e aumento da endotelina-1, do fator de crescimento transformante-β, do inibidor- 1 do ativador do plasminogênio, do NF-κB e da NADPH-oxidase. A ativação da PKC também eleva a atividade da fosfolipase A2, com aumento de dois inibidores da Na/K/ATPase: o ácido araquidônico e a prostaglandina E2 (XIA et al., 1994). No diabetes, os níveis de DAG estão elevados na retina (SHIBA et al., 1993), aorta, coração (INOGUCHI et al., 1992), glomérulos renais (ISHII et al., 1996), fígado e músculos esqueléticos (VAN HERPEN; SCHRAUWEN-HINDERLING, 2008).

O excesso de glicose também pode ser desviado para a via da hexoxamina, onde é convertido em frutose-6-fosfato, substrato para a glicosilação de proteínas. A frutose-6- fosfato é transformada em N-acetilglicosamina 6-fosfato e posteriormente, convertida a uridina difosfato-N-acetil glucosamina. Esta pode modular a expressão de fatores de transcrição e alterar a expressão de várias proteínas, como o PAI-I e o fator de crescimento TGF-b, envolvidos nas complicações diabéticas (DU et al., 2000).

3 OBJETIVOS

3.1. GERAL

Avaliar a repercussão tempo dependente do estresse oxidativo e do metabolismo glicêmico e lipídico no desenvolvimento das complicações cardiovasculares na prole causadas pelo diabetes gestacional.

3.2. ESPECÍFICOS

• Induzir o diabetes gestacional em ratas Wistar pela administração de STZ e analisar na prole os seguintes parâmetros:

o a tolerância à glicose e a sensibilidade à insulina;

o as taxas plasmáticas de glicose, triglicerídeos, colesterol total e HDL; o a concentração de glicogênio hepático e muscular;

o os níveis de ROS e nitritos na aorta e no coração;

o a atividade das enzimas antioxidantes da superóxido dismutase e da catalase, bem como os níveis de glutationa reduzida e glutationa oxidada na aorta e no coração; o a expressão proteica da isoforma 4 da NADPH oxidase (Nox4) e do RAGE na aorta e

no coração;

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 ANIMAIS

Foram utilizados machos e fêmeas da linhagem Wistar, provenientes do biotério setorial do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Universidade Federal do Pernambuco, mantidos à temperatura constante de 22 ± 2°C, ciclo claro/ escuro padrão (12 horas claro/12 horas escuro), água e ração (Labina®, Presence) ad libitum. Os protocolos foram realizados obedecendo as normas preconizadas pelo Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA) e aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade Federal de Pernambuco (Processo n° 23076.011857/2014-81) (Anexo A).

4.2 FÁRMACOS E REAGENTES

Os fármacos utilizados neste estudo foram: a epinefrina (Sigma Chem. Co., St Louis, EUA), a insulina humana regular (Humulin® R, LillyFrance S.A.S., Fegersheim, França), o pentobarbital sódico (CEVA Santé Animale, Rutherford, NJ, EUA) e a STZ (Sigma Chem. Co., St Louis, EUA).

Os anticorpos primários: anti-Nox4, anti α-actinina e GAPDH foram adquiridos da Santa Cruz Biotechnology (Califórnia, EUA), enquanto que o anti-RAGE da Cell Signaling (Beverly, MA). Os anticorpos secundários: anti-rabbit, anti-goat e anti-mouse também foram obtidos da Santa Cruz Biotechnology (Califórnia, EUA).

Os reagentes listados foram utilizados para os experimentos descritos nas seções subsequentes: 2'7'diacetato de diclorofluoresceína (DCFH-DA) (Sigma Chem. Co., St Louis, EUA), aprotinina (Sigma Chem. Co., St Louis, EUA), ácido benzoico (Sigma Chem. Co., St Louis, EUA), ácido etilenodiamino tetra-acético - EDTA (Vetec Química Fina LTDA, Rio de Janeiro, RJ), álcool absoluto (Sigma Chem. Co., St Louis, EUA), álcool etílico (Isofar, Duque de Caxias, RJ), carbonato de sódio (Vetec Química Fina LTDA, Rio de Janeiro, RJ), citrato de sódio (Isofar, Duque de Caxias, RJ), cloreto de sódio (Isofar, Duque de Caxias, RJ), cloreto de magnésio (Vetec Química Fina LTDA, Rio de Janeiro, RJ), diclorofluoresceína (Sigma Chem. Co., St Louis, EUA), dodecil sulfato de sódio - SDS (Amresco, Solon, EUA), eletoquimioluminescência - ECL (GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, Reino

Unido), formol (Sigma Chem. Co., St Louis, EUA), fosfato de sódio (Vetec Química Fina LTDA, Rio de Janeiro, RJ), glicerol (Amresco, Solon, EUA), glicose (Isofar, Duque de Caxias, RJ), glutationa reduzida (Sigma Chem. Co., St Louis, EUA), glutationa oxidada (Sigma Chem. Co., St Louis, EUA), hidróxido de potássio - KOH (Vetec Química Fina LTDA, Rio de Janeiro, RJ), hidróxido de sódio – NaOH (Vetec Química Fina LTDA, Rio de Janeiro, RJ), kit ELISA para dosagem de insulina (Millipore©, Abacus AIS, Brisbane, Queensland. Austrália), kits para análise da glicose, triglicerídeos, colesterol total e colesterol HDL (Labtest Diagnóstica – Lagoa Santa-MG, Brasil), leupeptina (Sigma Chem. Co., St Louis, EUA), membrana de Fluoreto Polivinidileno - PVDF (GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, Reino Unido), N-etillmaleimida (Sigma Chem. Co., St Louis, EUA), nitrito de sódio (Sigma Chem. Co., St Louis, EUA), ortovanadato de sódio (Sigma Chem. Co., St Louis, EUA), O-ftalaldeído - OPT (Sigma Chem. Co., St Louis, EUA), pepstatina (Sigma Chem. Co., St Louis, EUA), N-etilmaleimida - NEM (Sigma Chem. Co., St Louis, EUA), peróxido de hidrogênio - H2O2 (Merck, Darmstad, Alemanha), fenil-metil sulfonil fluoreto -

PMSF (Sigma Chem. Co., St Louis, USA), reagente de bradford (Sigma Chem. Co., St Louis, EUA), reagente de Griess (Sigma Chem. Co., St Louis, EUA), reativo de antrona (Sigma Chem. Co., St Louis, EUA), sulfato de sódio - Na2SO4 (Vetec Química Fina LTDA – Rio de

Janeiro, RJ), TRIS-Base (Amresco, Solon, EUA), Tween-20 (Amresco, Solon, EUA), xilol (Sigma Chem. Co., St Louis, EUA). A água utilizada nos experimentos foi a deionizada (Benzoquímica©, Olinda, PE).